PRÁCTICA 2B

LECTINAS

 OBJETIVOS

 Adquirir los conocimientos teórico-prácticos para la obtención de

compuestos proteicos con la actividad hemoaglutinante a partir de extractos
vegetales.
 Determinar la actividad hemoaglutinante de los extractos obtenidos
 Investigar el método de conservación no destructivo para las lectinas
obtenidas (LIOFILIZACIÓN)
 Confirmar las características reportadas en las referencias para los
compuestos obtenidos, tales como pesos moleculares.

 INTRODUCCIÓN

Las moléculas que tienen la capacidad de descifrar la información contenida en

los carbohidratos son las lectinas. Las lectinas (del latín legere = seleccionar o
escoger) son proteínas que unen a mono- y oligosacáridos específicamente y
de manera reversible, no son enzimas y en contraste con anticuerpos, no son
producto de una respuesta inmune. Las lectinas típicamente contienen uno o
más sitios de combinación de carbohidratos por moléculas, esto es, son
divalentes o polivalentes. Por lo tanto, la unión de una lectina a carbohidratos
en la superficie celular, por ejemplo eritrocitos, puede causar una unión
cruzada de las células y su subsiguiente precipitación, fenómeno que se refiere
como aglutinación celular. La aglutinación de eritrocitos o hemaglutinación, es
una característica principal de estas proteínas y sirve para su detección y
caracterización rutinaria. De hecho, gracias a esta actividad fue que se
detectaron por primera vez, a principios del siglo XIX en extractos de plantas.
Por lo que se les denominó por mucho tiempo, “fitohemaglutininas” (Sharon y
Lis,1989 1997, 2001).

Se sabe que las lectinas se encuentran presentes en todos los organismos

incluyendo virus, bacterias, plantas hongos y animales, aunque el
descubrimiento de lectinas en animales se realizó con el descubrimiento de las
selectinas, a finales de los 1980´s .

La gran importancia de las lectinas radica en el reconocimiento y comunicación

celular, como se ilustra en la figura.

Interacciones entre lecitinas de superficie y carbohidratos.

Las lectinas son el medio de fijación de diferentes tipos de células, bacterias,

virus o toxinas. En algunos casos las lectinas de superficie de las células se
unen a glicoproteínas, mientras que en otros casos los carbohidratos en la
superficie de las células que se pueden encontrar solos o acoplados a
 Pesar 50 g, de frijol lo
Escoger una especie de mas fresco posible, Y mantenerla durante
En nuestro caso FRIJOL
leguminosa que sea lavarlo, poner a toda la noche en un
PERUANO
produtora de lectinas. remojar en sol. volumen 1:1 v/m
isotónica

Las cascarillas se
Colocar el endospermo
Las cascarillas se dejan colocan en un tubo Descascarillar 50 g de
en la licuadora con 50 -
reposar 1 h. falcon de 50 mL y se frijol remojado.
100 ml PBS
cubren con PBS.

Mezclar suavemente
Añadir el molido del el cual se mezcla con
Esto es 50 g de frijol en durante 5 min.
endospermo en un 100 mL de acetona fría
100 mL de acetona. CUIDANDO liberar los
embudo de separación, en proporción 2:1 .
gases en c/mezclado.

Al tener las fases

Dejar reposar las fases NOTA: la función de la Abriendo la llave del
separadas en nuestro
15 min. y recuperar la acetona es arrastrar los embudo o quitando la
embudo recuperar las
acetona. lípidos. tapa.
lectinas

que se encuentrar en la Los cuales se van a

Se vacian en un 2 tubos Este proceso se repite
parte inferior del centrifugar durante 5
falcon de 15 mL de 2 a 3 veces.
embudo de separación. minutos a 3500 rpm.

El otro tubo que Uno de los tubos se

se utiliza para la Ambos tubos se dejan
contiene las lectinas DILUYE CON 10 mL DE
electroforesis SDS- abiertos para que se
endosperma SIN SOL. SOL. SALINA 0.85% ó
PAGE dentro 15 días. evapore la acetona.
SALINA Buffer PBS.

Hemoaglutinación se
La cascarilla del frijol donde se obtiene el 1 gota sangre + 1 gota
toma 1 gota de sangre
que se dejo remojando epitelio del frijol el cual de lectina epitelio
+ 1 gota lectina
se licua y se filtra. se deja a 4 °C filtrado.
endospermo diluido

Observar si hay
presencia de
aglutinación.
  CUESTIONARIO
1. Que son las lectinas y cuál es su función.

Las lectinas son proteínas o glicoproteínas de origen no inmune, fijadoras de carbohidratos con
capacidad para aglutinar células y precipitar glicoconjugados.5
Cualquier definición deberá tener en cuenta los siguientes aspectos:
 Las lectinas son glicoproteínas.
 No son de origen inmunológico.
 La relación de las lectinas con varias glicoproteínas que contienen sitios de combinación.

http://glosario_crohn.espacioblog.com/post/2006/12/17/lectina

2. Donde están presentes las lectinas.

Las lectinas están presentes en casi todo lo vivo, pues se han encontrado en el reino vegetal, animal
y en microorganismos.
En las plantas se han detectado, principalmente en los cotiledones y endospermos de las semillas y
constituyen del 2 al 10 % del total de las proteínas de éstas. En el reino animal se han encontrado en
invertebrados, tales como cangrejos, camarones, caracoles, lombrices y moluscos.
Están presentes fundamentalmente en la hemolinfa y órganos sexuales.

3. Como actúan las lectinas.

Las lectinas típicamente contiene uno o más sitios de combinación de carbohidratos por moléculas
esta es son divalentes o polivalentes.
Las lectinas constituyen un interesante grupo de proteínas de origen no inmune que comparten en
común la propiedad de enlazarse de forma específica y reversible a carbohidratos, ya sean libres o
que formen parte de estructuras más complejas.
Contienen al menos 2 sitios de unión, de ahí que puedan enlazarse en primer lugar a un azúcar
específico y en forma secundaria a una molécula glicosilada. Poseen interesantes propiedades que
convierten a esta clase de proteínas en herramientas invalorables en los laboratorios biológicos, por
lo que se utilizan en numerosas investigaciones que incluyen: estudio de la estructura de las
membranas, detección de transformaciones malignas, purificación de glicoconjugados, estudios
citogenéticos, así como también en ensayos histoquímicos, enzimáticos y en el tipaje de grupos
sanguíneos.
 4. A que se refiere el efecto microgénico.

5. Como se emplean las lectinas y que utilidad tienen como reactivo de diagnostico.

Las lectinas se consideran armas valiosas en el campo de la Genética, la Biomedicina y la

Inmunología. Su utilidad está basada en la propiedad que tienen de combinarse con varios tipos de
glicoconjugados presentes en las superficies celulares y fluidos corporales.
Sus propiedades mitogénicas permiten que se utilicen en estudios que tienen como base la
proliferación de linfocitos en cultivos, como son:
- La evaluación de la producción de citoquinas (interferón e interleuquinas) y la expresión de sus
receptores en sobrenadantes de cultivos de linfocitos provenientes de pacientes con enfermedades
de alto impacto social como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la tuberculosis y la
leishmaniasis, entre otras.
- La caracterización de algunos aspectos relacionados con la respuesta inmune y fenómenos
asociados con ellas como la inmunosupresión.
- La interacción entre virus, como por ejemplo entre el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y el
virus de la hepatitis B, así como la susceptibilidad y resistencia a éstos.
- Evaluación de la efectividad de terapias antirretrovirales de acuerdo con la respuesta de los
linfocitos a la estimulación con las lectinas antes y después de la terapia, como por ejemplo en
terapias contra el VHI.
- Análisis de funciones linfoproliferativas y citotóxicas en células mononucleares causadas por
algunas drogas.
- Estudios acerca de la influencia nutricional en la proliferación de linfocitos y su cinética de
proliferación.
- La inducción de genes en linfocitos.
- La detección de anormalidades cromosómicas.

Actualmente se han estudiado en detalle 9 lectinas con efecto mitogénico sobre los linfocitos, entre
las que se destacan las provenientes de Phaseolus vulgaris (PHA), Canavalia ensiformis (Con A),
Pisum sativum (PSA) y Fitolaca americana (PWM). Estos mitógenos pueden activar de forma
diferente los linfocitos T y B, por ejemplo la PHA y Con A inducen mitogenicidad en células T,
mientras que el mitógeno de carmín (PWM) estimula ambos tipos de células. No se conoce lectina
alguna que estimule sólo a los linfocitos B humanos.
Las lectinas forman parte de conjugados como lectina-lectina, lectina-enzimas y lectina-anticuerpos,
lo que ha permitido el desarrollo de técnicas cromatográficas como la cromatografía de afinidad para
la
purificación de glicoproteínas. Ejemplo de ellas es la purificación de IgG utilizando anti-IgG acoplada
a la Con A-Sepharose y la purificación de IgM usando Con ASepharose, así como también la
purificación de enzimas y de las propias lectinas.
Las interacciones de estas proteínas con células pueden ser inhibidas en muchos casos por
azúcares, por lo que se ha llegado a la conclusión de que ellas se enlazan a sacáridos de la
superficie celular, lo que ha provisto a los científicos de útiles marcadores para emplearlos en
técnicas histoquímicas y en la microscopia electrónica para estudiar la estructura y función de la
membrana plasmática. Generalmente se utilizan lectinas conjugadas con marcadores fluorescentes
como la biotina y las más usadas para estos fines son la PHA-L, PHAE y las provenientes de Pisum
sativum (PSA), Triticum vulgare (WGA), Solanum tuberisum (STL), Arachis hypogae (PNA), Datura
strmonium (DSL), Lens culinaris (LCA) y de Griffonia simplicifolia (GSL).1
Dentro de los estudios de membrana se ha reportado en la literatura el uso de lectinas para estudiar
cambios estructurales en los glicoconjugados presentes en las superficies celulares25 y en
ocasiones de esta forma detectar cambios morfológicos ocurridos, para analizar la distribución
subcelular de epitopes y terminales glicoproteicos, además para detectar alteraciones en la
expresión de moléculas presentes en la superficie celular.
Otra área importante en la cual se emplean las lectinas es la detección de transformaciones
malignas en células, a través de la aglutinación preferencial que muestran las lectinas con células
transformadas.
Además se han realizado investigaciones para utilizar las lectinas y polímeros sintéticos enlazados a
ellas como agentes anticancerígenos in vivo e in vitro, ya que se ha visto que disminuyen el
crecimiento de las células tumorales. Se utilizan también para la inmunización contra virus
productores de inmunodeficiencia y algunos tumores y como medicamentos para prevenir
metástasis.35 Las propiedades citotóxicas de algunas lectina como la Ricina y Abrina hacen también
que éstas brinden interés como potenciales armas terapéuticas en el tratamiento del cáncer humano.
Las lectinas se emplean igualmente en la caracterización de grupos sanguíneos humanos, así como
en la identificación de nuevos grupos sanguíneos.
Algunas de las lectinas son específicas en sus reacciones con los grupos sanguíneos ABO, MN, A1
y A2 de humanos, por esto han sido utilizadas en la determinación del tipo de sangre de los
individuos.
La mayoría de las lectinas aglutinan los eritrocitos de todos los grupos sanguíneos en humanos y
actúan a similares concentraciones, éstas son lectinas no específicas (no significa que no sea
específica a los azúcares); el resto son lectinas específicas.

http://bvs.sld.cu/revistas/hih/vol15_2_99/hih02299.pdf
  RESULTADOS

Tabla 1. Reactivos utilizados para la elaboración del Buffer PBS 1 X

Masa
Reactivo
(g) Este se preparó en 800 mL de H2O, se aforó hasta llegar a 1 L
NaCl 8 posteriormente se procedió ajustar el pH hasta llegar a un pH = 7.4
KCl 0.2 con una sol. de HCl
Na2HPO4 1.44
KH2PO4 0.24

Tabla 2. Prueba de hemoaglutinación.

Prueba de Hemoaglutinación
1 gota de sangre + 1 gota de lectina endospermo 1 gota de sangre + 1 gota de lectina del epitelio
diluido filtrado
Presencia de aglutinación Presencia de aglutinación

+ +

Figura 1. Figura 2.
  HOJA DE CÁLCULO
Para preparar el Persulfato de Amonio al 10% se tomo como base el siguiente
cálculo.

1000 µ𝑙 → 100%

𝑥 µ𝑙 → 10%
𝒙 = 𝟏𝟎𝟎 µ𝒍 (𝑵𝑯𝟒 )𝟐 𝑺𝟐 𝑶𝟖

1 𝑔 → 1000µ𝑔

𝑥 𝑔 → 100 µ𝑔

𝒙 = 𝟎. 𝟏 𝒈 (𝑵𝑯𝟒 )𝟐 𝑺𝟐 𝑶𝟖

Por lo tanto preparamos:

𝒙 = 𝟎. 𝟏 𝒈 (𝑵𝑯𝟒 )𝟐 𝑺𝟐 𝑶𝟖 + 𝟗𝟎𝟎 µ𝒍 𝒅𝒆 𝑯𝟐 𝑶 para preparar el gel separador SDS-
PAGE %

Nota: tanto el Persulfato de Amonio como el TEMED se deben preparar justo

antes de hacer el gel.
  ANÁLISIS DE RESULTADOS

Figura 2. Tipos de frijol

Mediante esta práctica se analizaron las propiedades del frijol peruano (Phaseolus
Vulgaris), este contiene proteínas como las lectinas las cuales constituyen un
interesante grupo de origen no inmune que comparten en común la propiedad de
enlazarse de forma específica y reversible a carbohidratos, ya sean libres o que
formen parte de estructuras más complejas.
Contienen al menos 2 sitios de unión, de ahí que puedan enlazarse en primer
lugar a un azúcar específico y en forma secundaria a una molécula glicosilada el
cual tiene la capacidad de producir una aglutinación.
Como se observa en la Tabla 2. La cual revela que al interactuar las lectinas del
frijol y los eritrocitos de humano se produce la aglutinación, esto nos quiere decir
que contiene gran concentración de lectinas, para producir dicha a aglutinación.

Es una leguminosa resistente a climas áridos y a enfermedades provocadas por

bacterias y virus, esto se debe a que las lectinas de origen vegetal, como las del
frijol peruano, son resultado de un proceso de evolución en el sistema de defensa,
el cual les permite contrarrestar efectos nocivos provocados por hongos, bacterias
e insectos.
  CONCLUSIONES

 Poseen interesantes propiedades que convierten a esta clase de proteínas

en herramientas invalorables en los laboratorios biológicos, por lo que se
utilizan en numerosas investigaciones que incluyen: estudio de la estructura
de las membranas, detección de transformaciones malignas, purificación de
glicoconjugados, estudios citogenéticos, así como también en ensayos
histoquímicos, enzimáticos y en el tipaje de grupos sanguíneos.

 BIBILOGRAFÍA
http://dieumsnh.qfb.umich.mx/glicobiologia.htm
http://bvs.sld.cu/revistas/hih/vol15_2_99/hih02299.pdf
http://glosario_crohn.espacioblog.com/post/2006/12/17/lectina

En la sesión anterior se dejaron en refrigeración a 4°C, 2 tubos falcón los cuales

contienen las lectinas endospermo y lectinas epitelio filtrado, estas se transfirieron
cada una por separado a un tubo ependorf se toman 100 µL de muestra y esta se
transfieren a una membrana la cual tiene un diámetro de poro de 0.45 µm, de este
filtrado se recuperan 10 µL de muestra para correr el gel y así realizar la
electroforesis.
Para hacer el gel nos basamos en la siguiente tabla 3.
Hicimos un gel para correr proteínas qué diferencias hay varias, los geles que
podemos utilizar son más delgados es diferente el material para DNA el material
utilizado para hacer la electroforesis usamos la agarosa a un porcentaje de 0.11%
el porcentaje de agarosa podía ir variando dependiendo del tamaño del poro que
queríamos ya que si lo que íbamos a correr era muy pesado entonces hacíamos
una agarosa más laxa, por eso nosotros al correr un DNA genómico usamos la
agarosa al 0.11% y si es más pequeño se utiliza una agarosa más concentrada
queda más dura pero el poro es más cerrado y por lo tanto no se va tan rápido la
muestra dependiendo de lo que queramos correr es como vamos a hacer al
porcentaje nuestros geles.
En este caso para correr las proteínas vamos a utilizar dos tipos de geles uno que
se le conoce como Gel Separador SDS-PAGE 10% el cual va en la parte de abajo
del gel este se adiciona un poco mas abajo de donde llega el peine, después
vamos a adicionar un Gel Concentrador SDS-PAGE 4%, el cual va a concentrar la
muestra este se adiciona justamente donde va el peine, en ambos se usa una
solución de monómeros al 30% los cuales van a polimerizar, en este caso es la
acrilamida y la poliacrilamida estos dos ya vienen juntos por que son altamente
tóxicos cuando aún no han polimerizado, y una vez que polimeriza el gel pierden
su toxicidad.
La profesora mandara los fundamentos de las soluciones utilizadas en el lab.
La solución de monómeros se encuentra en forma líquida, y para que estos
polimericen se necesita de la presencia de un catalizador que en este caso va a
ser el Persulfato de Amonio y el TEMED el cual es un iniciador de la reacción, de
igual manera el TEMED es altamente tóxico, al momento de poner el Persulfato de
Amonio y el TEMED en ese momento empieza la reacción y empieza a
polimerizar.
También se puso en nuestra mezcla un buffer el cual para el separador lleva un
pH de 8.0 lo cual produce un gel desnaturalizado esto quiere decir que la proteína
que está en estructura terciaria la vamos a desnaturalizar para que quede laxa y
pueda correr a través del gel las cuales se separan en base a su carga.
Esta se carga negativamente con el SDS para que corra las proteínas ya que
tienen diferentes cargas esto es que tienen un punto isoeléctrico el cual va a llegar
a una neutralidad dependiendo del buffer que pongamos, en este caso para el
separador a un pH = 8 y para el concentrador a un pH = 4

Para haces esto tenemos dos vidrios lo cuales lo vamos a empalmar por que por
que no esta parejo y por lo tanto nos permite adicionar la solución no va a ser
como el gel de agarosa el cual se vació la agarosa en el carrito
En este caso lo que se hace es el gel el cual tiene un grosor de los empaques que
contienen aproximadamente de 0.2 mm se pone el vidrio abajo se pon en los
empaques en los extremos del vidrio en ambos lados y se pegan con un aparato
el cual los deja derechos para evitar que se salga el gel