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Juni 2008

ICS 13.040.20 VDI-RICHTLINIEN June 2008

VEREIN Biologische Messverfahren zur Ermittlung und VDI 3957


DEUTSCHER Beurteilung der Wirkung von Luftverunreinigungen auf
Pflanzen (Bioindikation)
INGENIEURE Nachweis genotoxischer Effekte mit dem Blatt 16 / Part 16
Tradescantia-Kleinkern-Test
Former edition: 06/07 Draft, in German only

Biological measuring techniques for the determination


Frühere Ausgabe: 06.07 Entwurf, deutsch

and evaluation of effects of air pollution on plants


(bioindication)
Determination of genotoxic effects with the Tradescantia Ausg. deutsch/englisch
MCN test Issue German/English

Der Entwurf dieser Richtlinie wurde mit Ankündigung im Bundes- The draft of this guideline has been subject to public scrutiny
anzeiger einem öffentlichen Einspruchsverfahren unterworfen. after announcement in the Bundesanzeiger (Federal Gazette).
Die deutsche Version dieser Richtlinie ist verbindlich. The German version of this guideline shall be taken as authorita-
tive. No guarantee can be given with respect to the English trans-
lation.

Inhalt Seite Contents Page

Vorbemerkung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Preliminary note . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2


Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1 Anwendungsbereich . . . . . . . . . . . . . . 2 1 Scope . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
2 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 Fundamentals . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.1 Prinzip des Verfahrens . . . . . . . . . . . 3 2.1 Principle of the procedure . . . . . . . . . 3
2.2 Hintergrund des Verfahrens . . . . . . . . . 4 2.2 Background of the procedure . . . . . . . . 4
2.3 Eignung des Verfahrens . . . . . . . . . . . 4 2.3 Suitability of the procedure. . . . . . . . . 4
3 Durchführung des Verfahrens . . . . . . . . . 5 3 Procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
3.1 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 3.1 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
3.2 Anzucht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3.2 Cultivation . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.3 Pflanzenschutzmaßnahmen . . . . . . . . . 9 3.3 Plant protection measures . . . . . . . . . 9
3.4 Vorbereitung der Exposition . . . . . . . . 9 3.4 Preparation for exposure . . . . . . . . . . 9
3.5 Exposition . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 3.5 Exposure . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.6 Fixierung und Lagerung . . . . . . . . . . 11 3.6 Fixation and storage . . . . . . . . . . . . 11
3.7 Mikroskopische Auswertung . . . . . . . . 12 3.7 Microscopic evaluation . . . . . . . . . . . 12
4 Kenngrößen des Verfahrens . . . . . . . . . . 14 4 Parameters of the procedure . . . . . . . . . 14
5 Maßnahmen zur Qualitätssicherung . . . . . 15 5 Quality assurance measures . . . . . . . . . 15
6 Bewertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 6 Evaluation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Anhang A Bezugsquellen . . . . . . . . . . . . . 17 Annex A Sources . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Anhang B Formblätter. . . . . . . . . . . . . . . 18 Annex B Forms . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Anhang C Auswertebeispiel . . . . . . . . . . . . 20 Annex C Example of evaluation . . . . . . . . . 21

Schrifttum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 Bibliography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Kommission Reinhaltung der Luft im VDI und DIN – Normenausschuss KRdL


Arbeitsgruppe Wirkungen von Luftverunreinigungen auf Höhere Pflanzen (Bioindikation)

VDI/DIN-Handbuch Reinhaltung der Luft, Band 1a: Maximale Immissions-Werte


–2– VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

Vorbemerkung Preliminary note


Der Inhalt dieser Richtlinie ist entstanden unter Be- The content of this guideline has been developed in
achtung der Vorgaben und Empfehlungen der Richt- strict accordance with the requirements and recom-
linie VDI 1000. mendations of the guideline VDI 1000.
Alle Rechte, insbesondere die des Nachdrucks, der All rights are reserved, including those of reprinting,
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VDI-Merkblättern geregelt sind, möglich.
Allen, die ehrenamtlich an der Erarbeitung dieser We wish to express our gratitude to all honorary con-
VDI-Richtlinie mitgewirkt haben, sei gedankt. tributors to this guideline.

Einleitung Introduction
Unter dem Begriff Genotoxizität werden alle Schädi- The term genotoxicity refers collectively to all kinds
gungen auf genetischer Ebene bei Organismen zu- of genetic damage to organisms. Genotoxic damage
sammengefasst. Ein genotoxischer Schaden kann can arise from mutation or from impairment of gene
seine Ursache in einer Mutation oder einer Beein- function or gene expression, i. e. of gene activity. A
trächtigung der Genfunktion oder Genexpression, substance that causes a significant increase in the rate
das heißt der Genaktivität, haben. Als genotoxisch of mutation relative to the number of mutations oc-
wird eine Substanz bezeichnet, die im Vergleich zur curring spontaneously is designated as genotoxic.
Anzahl der spontan auftretenden Mutationen eine si- Mutagenic or genotoxic substances often also exert a
gnifikant erhöhte Mutationsrate verursacht. Muta- carcinogenic action. They can trigger or promote can-
gene bzw. genotoxische Stoffe haben oft auch eine cer or tumour formation.
karzinogene Wirkung. Sie können eine Krebs- bzw. 
Tumorbildung auslösen oder begünstigen.
Luftverunreinigungen können Stoffe enthalten, die Air pollutants may contain substances possessing ge-
ein genotoxisches Potenzial besitzen, z. B. Dioxine notoxic potential, e. g. dioxins and various polycyclic
und verschiedene polyzyklische Aromaten. Der Grad aromatic compounds. The extent of such damage will
der Schädigung wird maßgeblich von den Stoffeigen- depend largely upon the properties of the substances,
schaften, dem Auftreffen am Wirkort und der dort whether they reach the site of action, and the biolog-
ausgelösten biologischen Reaktion bestimmt. ical reaction induced at that site.
Für den Wirkungsnachweis genotoxischer Substan- Sensitive organisms are used in various test proce-
zen werden sensitive Organismen in verschiedenen dures for detecting the effect of genotoxic substances
Testverfahren eingesetzt, um Risikopotenziale zu er- in order to assess potential risks. As a proven group of
fassen. Zu einer bewährten Gruppe von Testverfahren test procedures, the micronucleus tests utilise the for-
gehören die Kleinkernteste, die sich als Wirkungskri- mation of gene fragments in various test organisms in
terium die Bildung von Genfragmenten als Reaktion response to genotoxic substances as a criterion of ac-
auf genotoxische Stoffe bei verschiedenen Testorga- tivity.
nismen zu eigen machen.
Diese Genfragmente können je nach Testorganismus Depending upon the test organism, these gene frag-
an verschiedenen Wirkorten, z. B. Wurzelzellen und ments may become visible as so-called micronuclei
Pollenzellen, als sogenannte Kleinkerne sichtbar at various sites of action, e. g. root cells and pollen
werden. cells.

1 Anwendungsbereich 1 Scope
Mit dem Tradescantia-Kleinkern-Test (Tradescantia- The Tradescantia micronucleus test (Tradescantia
MCN-Test) können immissionsbedingte genotoxi- MCN test) allows determination of genotoxic effects
sche Wirkungen in Form erhöhter Kleinkernraten in of airborne pollutants in the form of elevated micro-
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den Pollenzellen der Dreimasterblume (Tradescantia nucleus formation rates in the pollen cells of spider-
sp.) erfasst und somit eine Aussage über das genoto- wort (Tradescantia sp.) and thus permits assessment
xische Gefährdungspotenzial luftgetragener Schad- of the genotoxic hazard potential of such pollutants
stoffe auf die belebte Umwelt getroffen werden. Tra- for the living environment. Tradescantia provides di-
descantia wird hierbei als Reaktionsindikator einge- rect proof of a biological effect after a given exposure
setzt, der nach einer definierten Expositionszeit einen time [1].
direkten Wirkungsnachweis ermöglicht [1].

2 Grundlagen 2 Fundamentals
2.1 Prinzip des Verfahrens 2.1 Principle of the procedure
Das Prinzip des Tradescantia-Kleinkern-Tests beruht The Tradescantia micronucleus test is based on the
auf der Erfassung von Keimzellenmutationen in den determination of pollen germ cell mutations. In the
Pollen. In der frühen Prophase der Meiose reagieren early prophase of meiosis, the pollen mother cells of
die Pollenmutterzellen von Tradescantia sp. (siehe Tradescantia sp. (see Section 3.1.1) are extremely
Abschnitt 3.1.1) sehr empfindlich auf genotoxische sensitive to genotoxic effects [2 to 4]. Such damage
Einflüsse [2 bis 4]. Als Folge einer Schädigung kön- can lead to chromosome breakage or loss of entire
nen Chromosomenbrüche und das Herauslösen gan- DNA fragments from the nucleus, which manifest
zer DNA-Fragmente aus dem Kern auftreten, die sich themselves as micronuclei in the cells of later devel-
in den Zellen späterer Entwicklungsstadien als Klein- opmental stages (Figure 1). These accumulations of
kerne manifestieren (Bild 1). Diese außerhalb des DNA outside of the cell nucleus in the cytoplasm can
Zellkerns im Zytoplasma liegenden DNA-Ansamm- be readily observed and counted under a microscope.
lungen können mit dem Mikroskop erfasst und ge- The frequency of such chromosome aberrations in
zählt werden. Die Häufigkeit derartiger Chromoso- the form of micronuclei represents the criterion for
menaberrationen in Form von Kleinkernen stellt das the biological effect. It is investigated both in control

Bild 1. Entwicklung einer Pollenzelle (Meiose) von Tradescantia Figure 1. Development of a pollen cell (meiosis) of Tradescantia
sp. vom Einzellstadium zum Vierzellstadium (Tetrade) unter Bil- sp. from the single-cell to the tetrad stage with formation of a
dung eines Kleinkerns micronucleus
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Wirkungskriterium dar. Sie wird sowohl in den Kon- plants in order to determine the rate of naturally oc-
trollpflanzen untersucht, um die natürlich vorkom- curring spontaneous mutation and also in plants lo-
mende Spontanmutationsrate zu bestimmen, als auch cated at individual measuring points. Statistical com-
in den Pflanzen an den einzelnen Messpunkten. Ein parison of the micronucleus formation rates found,
statistischer Vergleich der ermittelten Kleinkernra- i. e. the number of micronuclei formed per given
ten, das heißt der Anzahl aufgetretener Kleinkerne number of pollen cells, provides information about
pro definierter Anzahl an Pollenzellen, gibt Auf- the extent of genotoxic action at the locations investi-
schluss über die Höhe der genotoxischen Wirkung an gated. Several sequential exposures have to be per-
den untersuchten Standorten. Zur besseren statisti- formed at a given measuring point to assure statistical
schen Absicherung der Ergebnisse müssen mehrere reliability of the results.
zeitlich aufeinander folgende Expositionen an einem 
Messpunkt durchgeführt werden.

2.2 Hintergrund des Verfahrens 2.2 Background of the procedure


Der Tradescantia-Kleinkern-Test wurde von Prof. The Tradescantia micronucleus test was developed
T.-H. Ma an der Western Illinois University, Ma- by Prof. T.-H. Ma at Western Illinois University, Ma-
comb, in den USA Mitte der 1970er Jahre zur Erfas- comb, in the USA during the mid-1970s in order to
sung der Wirkung luftgetragener Schadstoffe und der assess the effect of airborne pollutants and the effect
Wirkung radioaktiver Strahlung entwickelt und spä- of ionising radiation, and subsequently also for stud-
ter auch für die Untersuchung wässriger Medien ein- ying aqueous media [1]. In the early 1990s, these
gesetzt [1]. Anfang der 1990er Jahre wurden diese studies were supplemented by the first experiments
Arbeiten durch erste Versuche mit Tradescantia in with Tradescantia in Europe [5 to 8]. The test proce-
Europa ergänzt [5 bis 8]. Das Testverfahren wird dure is nowadays applied by industry, government
heute von Industrie, Behörden und Forschungsein- agencies, and research establishments to study envi-
richtungen zur Untersuchung von Umweltproben aus ronmental water, soil, and air samples for the effects
Wasser, Boden und Luft, für Chemikalien sowie für of chemicals as well as ionising radiation. Both labo-
verschiedene Strahlungsarten eingesetzt. Dabei wer- ratory and field exposure are performed. Studies of
den sowohl Labor- als auch Freilandexpositionen air pollution by the Tradescantia micronucleus test
durchgeführt. Untersuchungen von Luftbelastungen have been reported in the literature, e. g. in [9 to 18].
mit dem Tradescantia-Kleinkern-Test finden sich in 
der Literatur u. a. bei [9 bis 18].
Grundlage für die im Folgenden beschriebene Vorge- The procedure described in the following is based on
hensweise ist das Testprotokoll der Ringstudie des the test protocol of the round robin test conducted by
International Programme on Chemical Safety (IPCS) the International Programme on Chemical Safety
von 1994 [1]. (IPCS) which was published in 1994 [1].

2.3 Eignung des Verfahrens 2.3 Suitability of the procedure


Tradescantia besitzt als pflanzlicher Bioindikator Tradescantia possesses many advantages as a plant
viele Vorteile. So ermöglicht sie aufgrund ihrer aus- bioindicator. Thus, owing to its exclusively vegeta-
schließlich vegetativ-klonalen Reproduktion den tive-clonal reproduction it permits the use of consist-
Einsatz gleich bleibenden homogenen Testmaterials. ently homogeneous test material. In addition to its
Neben ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber geno- pronounced sensitivity towards genotoxic effects in
toxischen Einflüssen in der frühen Prophase der mei- the early prophase of meiotic pollen mother cell de-
otischen Pollenmutterzellenentwicklung besitzt sie velopment, it possesses six sufficiently large chromo-
sechs ausreichend große Chromosomenpaare, die un- some pairs, which are readily visible and amenable to
ter dem Mikroskop bei geringer Vergrößerung gut an- staining under a microscope at low magnification,
färbbar und sichtbar sind, sodass die Auswertung der thus obviating the need for any special equipment for
Kleinkerne keine Spezialapparaturen erfordert. scoring of the micronuclei.
Eine weitere Besonderheit ist die Einsatzmöglichkeit Another special feature is the possibility of using Tra-
von Tradescantia als Reaktionsindikator in Freiland- descantia as an indicator sensitive to biological ef-
expositionen, wogegen die meisten genotoxischen fects in field exposure, whereas most other genotoxic
Testsysteme ausschließlich in wässrigen Medien ex- test systems can only be exposed to aqueous media.
poniert werden können. Das Wirkungsprinzip der The principle of micronucleus formation is exploited
Kleinkernbildung wird in vielen Verfahren mit unter- in many procedures utilising a very wide range of test
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schiedlichsten Testorganismen genutzt und der Tra- organisms. In comparison with other micronucleus
descantia-Kleinkern-Test zeigt im Vergleich zu ande- tests (such as the Allium test, the Vicia test, and the
ren Kleinkerntesten (wie u. a. Allium-Test, Vicia- Salmonella test), the Tradescantia micronucleus test
Test, Salmonella-Test) ein gutes Detektionspotenzial shows good detection potential for genotoxic activity
genotoxischer Wirkungen [5; 19 bis 25]. [5; 19 to 25].
Die Handhabung des Pflanzenmaterials (Pflanzen- The entire procedure, including handling of the plant
schnittlinge) sowie des Verfahrens ist einfach, und material (plant cuttings), is straightforward and ex-
die Betrachtung der Pollenzellen ist weder zeitlich amination of the pollen cells can be conducted inde-
noch räumlich an die Exposition gebunden, da die pendently of exposure because the buds of the plants
Knospen der Pflanzen am Ende der Exposition fixiert are fixed at the end of exposure and the test result is
werden und die Testaussage durch eine später erfol- not impaired by microscopic evaluation at a later
gende Auswertung am Mikroskop nicht beeinträch- point in time. Such evaluation, just like cultivation of
tigt wird. Diese Auswertung, ebenso wie die Anzucht the plants, can be performed by third persons if there
der Testpflanzen, kann durch Dritte erfolgen, wenn is a lack of qualified personnel, greenhouse capacity,
kein qualifiziertes Personal, keine Gewächshäuser and laboratory facilities.
und Labore zur Verfügung stehen.
Es gibt Hinweise, dass äußere Einflussfaktoren, bei- External influences, such as extremes of temperature
spielsweise extreme Temperaturen oder UV-Strah- or UV radiation, are reported to affect the formation
lung, die Bildung von Kleinkernen beeinflussen kön- of micronuclei [26]. These interfering parameters
nen [26]. Diese Störparameter sollen durch die be- should by largely eliminated by the present experi-
schriebene Versuchsdurchführung weitgehend aus- mental protocol.
geschlossen werden.

3 Durchführung des Verfahrens 3 Procedure


3.1 Materialien 3.1 Materials
3.1.1 Pflanzenart 3.1.1 Plant species
Die Tradeskantie, auch Spinnwurz oder Dreimaster- Tradescantia, also known as spiderwort, belongs to
blume genannt, gehört zur Familie der Commeli- the Commelinaceae family. The procedure is per-
naceae. Für das Verfahren wird der Klon Tradescan- formed with Tradescantia sp. # 4430 clone, a hybrid
tia sp. # 4430 eingesetzt, ein Hybrid aus T. hirsuti- of T. hirsutiflora and T. subacaulis from Brookhaven
flora und T. subacaulis aus dem Brookhaven National National Laboratory, United States of America
Laboratory, United States [1; 27]. Die Pflanzen sind [1; 27]. The plants are infertile and are propagated
infertil und vermehren sich nur vegetativ durch exclusively vegetatively by taking cuttings. It can
Stecklingsteilung, sodass davon auszugehen ist, dass therefore be assumed that genetic uniformity is
die genetische Einheitlichkeit weitestgehend erhalten largely retained. The clusters of cuttings, which reach
bleibt. Aus den Stecklingshorsten, die eine Höhe von a height of ca. 20 cm to 40 cm, constantly form new
ca. 20 cm bis 40 cm aufweisen, bilden sich stetig neue inflorescences with ca. 10 to 16 individual buds at
Blütenstände (Infloreszenzen) mit ca. 10 bis 16 Ein- different stages of maturity; as a rule, one of these
zelknospen unterschiedlicher Reifestadien, von de- buds per day will cease flowering (Figure 2).
nen in der Regel jeden Tag eine abblüht (Bild 2).

Bild 2. Tradescantia-Pflanzen Figure 2. Tradescantia plants


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3.1.2 Substrat 3.1.2 Substrate


Zur Anzucht der Pflanzen wird handelsübliche Ein- ED 73 or also LD 80 standard potting soil is used for
heitserde ED 73 oder auch LD 80 verwendet, die bei cultivation of the plants, and is commercially availa-
Betrieben des Einheitserden-Werkverbands e.V. be- ble, e. g., from companies belonging to the German
zogen werden kann (siehe Anhang A). standard soil association (Einheitserden-Werkver-
band e.V.; see Annex A).

3.1.3 Nährstoffe 3.1.3 Nutrients


Die in der Anzuchterde enthaltenen Nährstoffe rei- The nutrients present in the cultivation soil are only
chen nur für die anfängliche Entwicklung der Pflan- sufficient for initial development of the plants, mean-
zen aus, sodass im Laufe der Anzucht zusätzlich ing that additional fertiliser solutions have to be used
Düngelösung eingesetzt werden muss. Hierzu emp- in the course of cultivation. Commercially available
fiehlt sich handelsüblicher Dünger, der neben dem fertilisers promoting both plant growth and flowering
Wachstum auch die Blütenbildung fördert, wie bei- are recommended. An example is the NPK liquid fer-
spielsweise die NPK-Düngerlösung Kamasol£ rot 5- tiliser Kamasol£ rot 5-8-10 (COMPO GmbH & Co.
8-10 (COMPO GmbH & Co. KG, siehe Anhang A), KG, see Annex A), used according to the manufac-
die nach Gebrauchsanweisung eingesetzt wird. turer’s instructions.
Während der Exposition (siehe Abschnitt 3.5) wer- During exposure (see Section 3.5) the cuttings are
den die Schnittlinge über eine 1 : 3 verdünnte Nähr- supplied with nutrients in a 1 : 3 diluted nutrient solu-
lösung nach [28] mit Nährstoffen versorgt. Die un- tion according to [28]. The undiluted nutrient solu-
verdünnte Nährlösung wird aus 100-fach konzent- tion is produced from 100-fold concentrated stock so-
rierten Stammlösungen hergestellt, die für bis zu drei lutions, which can be stored for up to three months in
Monaten im Kühlschrank bei 4 °C haltbar sind. Zur a refrigerator at 4 °C. To produce one litre of nutrient
Herstellung von einem Liter Nährlösung werden in solution, 10 m" of each of the five stock solutions is
950 m" Wasser je 10 m" der fünf Stammlösungen added to 950 m" of water and thoroughly mixed
überführt und gut durchmischt (Tabelle 1). Der pH- (Table 1). The pH value of the nutrient solution is
Wert der Nährlösung wird mit HCl/KOH auf pH 5,5 adjusted to pH 5,5 with HCl/KOH. In the test proce-
eingestellt. Im Testverfahren wird diese Nährlösung dure this nutrient solution is diluted in a 1 : 3 ratio.
dann in einer 1 : 3-fachen Verdünnung eingesetzt.

Tabelle 1. Herstellung von Stammlösungen und End- Table 1. Preparation of stock solutions and final con-
konzentrationen für die Nährlösung centrations of the nutrient solution
Stamm- Chemikalie Einwaage Endkon- Stock Chemical Weigh-in Concentra-
lösung für 1 " zentration solution for 1 " tion in 1 "
100-fach in 1 " ferti- of 100-fold of final
konz. ger Nähr- conc. nutrient
Stamm- lösung stock solution
lösung solution
in mg in mg

1 NH4H2PO4 11,51 g 115,10 1 NH4H2PO4 11,51 g 115,10

2 KNO3 60,60 g 606,60 2 KNO3 60,60 g 606,60

3 Ca(NO3)2 · 4 H2O 94,43 g 944,30 3 Ca(NO3)2 · 4 H2O 94,43 g 944,30

4 MgSO4 · 7 H2O 49,26 g 492,60 4 MgSO4 · 7 H2O 49,26 g 492,60

5 H3BO3 286 mg 2,86 5 H3BO3 286 mg 2,86

MnCl2 · 4 H2O 181 mg 1,81 MnCl2 · 4 H2O 181 mg 1,81

ZnSO4 · 7 H2O 22 mg 0,22 ZnSO4 · 7 H2O 22 mg 0,22

CuSO4 · 5 H2O 8 mg 0,08 CuSO4 · 5 H2O 8 mg 0,08

Na2Mo7O24· 2 H2O 2 mg 0,02 Na2Mo7O24· 2 H2O 2 mg 0,02

3.1.4 Wasser 3.1.4 Water


Als Gießwasser wird für die Anzucht der Pflanzen Lei- Tap water of medium hardness (8...14)° German
tungswasser verwendet, das im Härtegradbereich II hardness degrees; (1,4...2,5) mol/m3 is used for water-
(mittelhartes Wasser, (8...14)° dH, (1,4...2,5) mol/m3) ing the plants during cultivation. Water of higher de-
VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 –7–

liegen sollte. Bei höheren Härtegraden sollte das Gieß- grees of hardness should be mixed with appropriate
wasser mit deionisiertem Wasser entsprechend ge- amounts of deionised water.
mischt werden.

3.1.5 Anzuchtgefäße 3.1.5 Cultivation vessels


Für die Anzucht der Pflanzen werden handelsübliche Commercially available black plastic plant pots are
schwarze Kunststofftöpfe verwendet. Die Maße rich- used for cultivating the plants. The sizes depend upon
ten sich nach der jeweiligen Größe der Pflanzen- the actual size of the plant clusters, with freshly re-
horste, sodass für frisch umgetopfte Pflanzen bei- potted plants requiring pots with a bottom diameter of
spielsweise Töpfe mit einem Bodendurchmesser von 22 cm and further-developed plant pots with a diam-
22 cm und für weiter entwickelte Pflanzen Töpfe mit eter of 35 cm.
Durchmesser 35 cm benutzt werden können.

3.1.6 Expositionsgefäße 3.1.6 Exposure vessels


Die Schnittlinge werden in der Regel in Bechergläser As a rule, the cuttings are placed in glass beakers (see
(siehe Abschnitt 3.5) positioniert und mit der Nährlö- Section 3.5) and supplied (see Section 3.1.3) with
sung nach Hoagland (siehe Abschnitt 3.1.3) mit water and nutrients in the form of Hoagland’s solu-
Wasser und Nährstoffen versorgt. tion.
Die Bechergläser werden in Styroporbehälter ge- The beakers are inserted in Styrofoam holders which
stellt, in denen sie am Messplatz im Expositionsge- are placed in an exposure frame at the measuring
stell eingesetzt werden (Bild 3). point (Figure 3).

3.1.7 Fixierlösung 3.1.7 Fixative


Um die abgeschnittenen Infloreszenzen zu fixieren, A 3 :1 mixture of ethanol (at least 90 %; denatured
wird eine Fixierlösung, ein Gemisch aus Ethanol ethanol can also be used) and glacial acetic acid
(mind. 90%ig, auch vergälltes Ethanol einsetzbar) (conc. acetic acid, at least 95 %) is prepared as fixa-
und Eisessig (konz. Essigsäure, mind. 95%ig) im tive to fix the harvested inflorescences. This solution
Verhältnis 3 : 1, hergestellt. Diese Lösung muss für has to be freshly prepared for each harvest. The
jede Ernte frisch hergestellt werden. Die Blütenknos- flower buds are fixed for ca. 24 h in this solution.
pen werden für ca. 24 h in dieser Lösung fixiert.
Zur Aufbewahrung der Infloreszenzen in einer Kon- After fixation the inflorescences are transferred to a
servierungslösung wird eine 70%ige Ethanollösung 70 % ethanol solution to store the flower buds. Dena-
hergestellt, in welche die Blütenknospen nach der Fi- tured ethanol can again be used.
xierung eingelegt werden. Es kann wiederum vergäll- 
tes Ethanol verwendet werden.

Bild 3. Expositionsgefäße mit Pflanzenschnittlingen Figure 3. Exposure vessels with plant cuttings
–8– VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

3.1.8 Färbelösung 3.1.8 Staining solution


Zur Anfärbung der Pollenzellen wird eine Färbe- An acetocarmine staining solution is prepared for
lösung aus Acetokarmin hergestellt. staining the pollen cells.
Hierzu wird 1 g zerriebenes Karminrot in 100 m" ei- For this purpose, 1 g of powdered carmine red is
ner 45%igen Essigsäure für ca. 10 min gekocht und boiled for ca. 10 min in 100 m" of 45 % acetic acid
nach dem Erkalten dekantiert. Die Aufbewahrung er- and decanted after cooling. The solution can be
folgt in einem verschließbaren Glasgefäß mit bis zu stored for up to one year without decomposition in a
einem Jahr Haltbarkeit. closed glass vessel.

3.1.9 Referenzsubstanzen (Positivkontrolle) 3.1.9 Reference substances (positive control)


Zur Sensitivitätskontrolle der Testpflanzen können Various chemicals can be used to monitor the sensi-
verschiedene Chemikalien genutzt werden. Um die tivity of the test plants. In order to protect the experi-
humanrelevante Belastung gering zu halten, wird menter, maleic hydrazide in used at a concentration
hierzu Maleinsäurehydrazid in einer Konzentration of 2 mM. For this purpose, 280 mg of maleic hy-
von 2 mM eingesetzt. Hierzu werden 280 mg Male- drazide is dissolved in 5 m" of dimethyl sulphoxide
insäurehydrazid in 5 m" Dimethylsulfoxid (DMSO) (DMSO). It must be assured that the substance is
gelöst. Es muss sichergestellt werden, dass die Sub- completely dissolved before 1 m" of the solution is
stanz vollständig in Lösung gegangen ist, bevor hier- added to 250 m" of nutrient solution for each test.
aus 1 m" zu 250 m" Nährlösung je Testansatz zuge- The dissolution process can be accelerated by use of
geben wird. Um den Lösungsvorgang zu beschleuni- an ultrasonic bath; however, the solution may not be
gen, kann ein Ultraschallbad genutzt werden, jedoch heated. After addition of the reference substance it is
darf die Lösung nicht erhitzt werden. Nach Zugabe essential that the nutrient solution be adjusted to
der Referenzsubstanz muss der pH-Wert der Nähr- pH 5,5 by means of KOH or HCl in order to assure
lösung unbedingt mittels KOH bzw. HCl auf pH 5,5 activity of the substance.
eingestellt werden, um eine Wirksamkeit der Sub- 
stanz sicherzustellen.

3.2 Anzucht 3.2 Cultivation


Die Stecklingshorste von Tradescantia sp. werden in The clusters of cuttings of Tradescantia sp. are contin-
Pflanztöpfen mit Einheitserde unter Gewächshausbe- uously regenerated and propagated in plant pots con-
dingungen kontinuierlich verjüngt und vermehrt. taining standard soil under greenhouse conditions.
Ziel der Anzucht ist es, gesunde und gut wachsende The goal of cultivation is to obtain healthy, well-
Tradescantia-Pflanzen zu erhalten, die ausreichend formed Tradescantia plants producing adequate num-
Blütenstände mit gut entwickelten Infloreszenzen her- bers of well-developed inflorescences and a low rate
vorbringen und eine geringe Spontanmutationsrate of spontaneous mutation of the pollen cells. Flower
der Pollenzellen aufweisen. Die Blütenbildung wird formation is assured by an adequate supply of nutri-
durch die ausreichende Versorgung mit Nährstoffen ents and a light/dark photoperiod of 16/8 h, which
und einer Hell/Dunkel-Fotoperiode von 16/8 h, die in usually requires an additional lighting unit. Standard
der Regel eine zusätzliche Beleuchtungseinheit erfor- HQI lamps, such as are used in horticulture, are suit-
dert, sichergestellt. Als Lichtquellen eignen sich bei- able light sources. In addition, regular trimming of in-
spielsweise Standard-HQI-Lampen, wie sie im Gar- florescences that have already bloomed and are thus
tenbau eingesetzt werden. Zusätzlich fördert das re- no longer suitable for exposure promotes formation
gelmäßige Abschneiden bereits aufgeblühter und da- of new inflorescences.
mit für die Exposition nicht mehr geeigneter Inflores- 
zenzen die Bildung neuer Blütenstände.
Die Temperatur während der Anzucht sollte 30 °C The temperature should not exceed 30 °C during cul-
nicht übersteigen und die Pflanzen sind vor direkter tivation and the plants have to be protected from di-
Sonneneinstrahlung durch geeignete, dem An- rect sunlight by appropriate shading systems. Over-
zuchtort entsprechend handhabbare Schattierungs- night lowering of the temperature to ca. 16 °C is
vorrichtungen zu schützen. Eine Nachtabsenkung der recommended.
Temperatur auf ca. 16 °C ist empfehlenswert.
Zur Verjüngung der Pflanzen werden die Stecklings- The plants are regenerated by removing the clusters
horste aus den Pflanztöpfen herausgenommen und from the plant pots and dividing the root material into
VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 –9–

der Wurzelbereich wird nach Bedarf in zwei bis vier two to four parts, each of which is planted in fresh
Teile geteilt, die jeweils wieder in frische Erde einge- potting soil. Strongly developed root balls can be
setzt werden. Hierbei können auch stark entwickelte trimmed.
Wurzelballen beschnitten werden.

3.3 Pflanzenschutzmaßnahmen 3.3 Plant protection measures


Ein Befall der Pflanzen mit Schädlingen wurde bis- No attack of the plants by pests has so far been ob-
her nicht beobachtet. Gelegentlich auftretende Rost- served. Occasional rust diseases on individual leaves
erkrankungen an einzelnen Blättern beeinträchtigen do not have a negative impact on the development of
die Entwicklung der Infloreszenzen nicht. Ein Ein- inflorescences. Use of plants protection agents is
satz von Pflanzenschutzmitteln ist daher in der Regel therefore generally unnecessary. Should their use be-
nicht notwendig; sollte er nötig sein, so muss die come necessary, the spontaneous mutation frequency
Spontanmutationsrate regelmäßig kontrolliert wer- must be monitored at regular intervals. If the rate of
den. Bei einer Erhöhung der Mutationsrate können mutation increases, no cuttings may be taken for ex-
dann in der Zeit nach der Applikation keine Schnitt- posure in the period following treatment.
linge zur Exposition geerntet werden.

3.4 Vorbereitung der Exposition 3.4 Preparation for exposure


Am Vortag einer Exposition werden junge Inflores- On the day prior to exposure, young inflorescences
zenzen, bei denen noch keine Knospe zur Blüte ge- on which no bud has yet flowered are taken as ca.
kommen ist, als ca. 20 cm lange Schnittlinge abge- 20 cm long cuttings and placed in 1/3-diluted Hoag-
schnitten und bis zur Exposition in 1/3 verdünnter land solution in an illuminator (16/8 h light/dark pe-
Hoagland-Nährlösung in einer Lichtbank (16/8 h riod) until exposure.
Hell/Dunkel-Periode) aufgestellt.
Der Standort der Übernacht-Akklimatisation (in der Overnight acclimatisation should be performed (gen-
Regel ein Innenraum) sollte keine Schadstoffbelas- erally indoors) in the absence of pollutants and other
tung und andere negative Einflüsse wie hohe Luft- negative influences such as high humidity, draught,
feuchtigkeit, Zugluft o. Ä. aufweisen. Im günstigsten or the like. In the most favourable case, the external
Fall entsprechen die äußeren Bedingungen bereits de- conditions already correspond to those of subsequent
nen der nachfolgenden Exposition. exposure.
Bereits im Gewächshaus werden 15 Infloreszenzen Before leaving the greenhouse, 15 inflorescences are
direkt abgeschnitten und fixiert (siehe Abschnitt 3.6). harvested and fixed (see Section 3.6). These plants
Mit Hilfe dieser Pflanzen wird die Spontanmutati- are used to determine the frequency of spontaneous
onsrate vor der Exposition bestimmt. Zu hohe Spon- mutation prior to exposure. Excessively high sponta-
tanmutationsraten oder anormale Entwicklungen der neous mutation rates or abnormalities in the develop-
Pollenzellen weisen auf eine ungewollte Belastung ment of the pollen cells are indicative of uninten-
oder Probleme bereits während der Kultivierung hin. tional impact of pollutants or problems that already
existed during cultivation.

3.5 Exposition 3.5 Exposure


Für die Exposition werden 250 m" der 1/3 verdünn- Exposure is carried out in 400-m" glass beakers filled
ten Hoagland-Nährlösung in 400-m"-Bechergläser with 250 m" of 1/3-diluted Hoagland solution and
gefüllt und mit doppelt gefalteter Alufolie abgedeckt, covered with doubly folded aluminium foil perfo-
in die kleine Löcher im Durchmesser der Pflanzen- rated to accommodate the plant stems (diameter of
stiele (ca. 4 mm) gestoßen werden. Pro Becherglas perforations ca. 4 mm). About 15 Tradescantia cut-
werden ca. 15 Tradescantia-Schnittlinge auf eine ein- tings per beaker are cut to a uniform length of 15 cm
heitliche Länge von 15 cm mit einem scharfen Skal- with a sharp scalpel or a razor blade, avoiding crush-
pell oder einer Rasierklinge abgeschnitten, sodass die ing of the cut ends.
Schnittenden nicht gequetscht werden.
Die Schnittlinge werden durch die Löcher der Alufo- The cuttings are inserted through the holes in the alu-
lie gesteckt und sollten dabei tief in die Lösung ein- minium foil and should be well immersed in the solu-
tauchen, ohne am Boden jedoch aufzusitzen. Es ist tion, yet without touching the bottom of the beaker. It
darauf zu achten, dass sich die Pflanzen gegenseitig should be assured that the plants do not shade one an-
– 10 – VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

nicht zu sehr beschatten und vor allem die Knospen other excessively and above all that the buds are
möglichst frei exponiert sind (siehe auch Bild 3). freely exposed to the greatest possible extent (see
also Figure 3).
Die Bechergläser mit den Schnittlingen werden in ei- The beakers and the cuttings are transported to the
nem geschlossenen Behälter zum Einsatzort trans- point of exposure in a closed container. No additional
portiert. Eine zusätzliche Beleuchtung während des lighting is necessary during transportation.
Transports ist nicht erforderlich.
Es ist von Vorteil, die Schnittlinge, die Nährlösung The cuttings, the nutrient solution, and the beakers
und die Bechergläser getrennt zu transportieren und are preferably transported separately and the plants
erst am Expositionsort die Vorbereitung der Pflanzen prepared for exposure on arrival at the measuring
vorzunehmen. point.
Die bestückten, expositionsbereiten Bechergläser The beakers containing plants ready for exposure are
werden in einen Styroporbehälter gestellt, der einer- placed in a Styrofoam holder, which serves as a firm
seits dazu dient, die Standfestigkeit der Bechergläser support while also protecting the beakers from direct
zu gewährleisten, andererseits soll hierdurch direkte exposure to sunlight and a resulting excessive tem-
Sonneneinstrahlung und ein damit verbundener über- perature rise. The shading unit positioned above the
mäßiger Temperaturanstieg ausgeschlossen werden. exposure frame also affords protection from strong
Die über dem Expositionsgestell angebrachte Schat- incident solar radiation (Figure 4 and Figure 5).
tiereinheit dient ebenfalls dazu, starke Einstrahlung 
zu verhindern (Bild 4 und Bild 5).
Die Exposition der Pflanzen sollte im Zeitraum zwi- Exposure of the plants should begin between
schen 6.00 Uhr und 10.00 Uhr morgens beginnen und 6.00 a. m. and 10.00 a. m. and normally lasts for 30 h.
dauert im Normalfall 30 h. Diese Zeitdauer gliedert This time period is divided into the actual exposure
sich in die eigentliche Expositionsphase von 6 h und phase of 6 h and a subsequent recovery phase of 24 h,
eine anschließende Erholungsphase von 24 h, in der during which the pollen cells develop from the sensi-
sich die Pollenzellen aus dem empfindlichen Pro- tive prophase stage to the four-cell (= tetrad) stage in
phase-Stadium ins Vierzell(= Tetraden-)stadium wei- which the micronuclei can be microscopically
terentwickeln, in dem dann die Kleinkerne mikrosko- scored. In the case of unfavourable external condi-
pisch ausgewertet werden können. Sollten die äuße- tions, for example if the night-time temperature de-
ren Bedingungen ungünstig sein, beispielsweise creases below 15 °C or if heavy rainfall occurs after
durch Nachttemperaturwerte von weniger als 15 °C the first exposure phase, the plants can also be moved
oder starke Regenfälle nach der ersten Expositions- indoors for the recovery period (e. g. to the acclimati-
phase, können die Pflanzen für die Erholungszeit sation site). Transport distances should be as short as
auch in Innenräume (z. B. Akklimatisationsort) ge- possible and adequate lighting (see Section 3.4) and
bracht werden. Der Transportweg sollte dabei so kurz an essentially pollution-free environment assured.
wie möglich sein und eine ausreichende Lichtversor- The experimental and exposure conditions are re-
gung (siehe Abschnitt 3.4) sowie eine möglichst be- corded on a report form (see Annex B).
lastungsfreie Umgebung sichergestellt werden. Die 
Versuchs- und Expositionsbedingungen werden in 
einem Formblatt (siehe Anhang B) protokolliert.

Bild 4. Freilandexposition Figure 4. Field exposure


VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 – 11 –

Bild 5. Aufbau Expositionsgestell

Figure 5. Construction of the exposure frame

3.6 Fixierung und Lagerung 3.6 Fixation and storage


Nach der gesamten Expositionsphase von 30 h wer- After the entire exposure phase of 30 h has elapsed,
den die Infloreszenzen direkt unterhalb ihres Stiel- the inflorescences are cut off immediately below
ansatzes abgeschnitten, alle Blätter entfernt und in where they join the stem; after removal of all leaves
vorbereitete Gefäße mit Fixierlösung eingelegt, wo- they are placed in a vessel containing fixative, with
bei jede Variante bzw. an jeder Messstelle einzeln ge- each variant or at each measuring point being har-
erntet wird (siehe Bild 6). Hierfür eignen sich kleine vested separately (see Figure 6). Small closable
verschließbare Kunststoffbehälter oder Glasgefäße plastic or glass vessels (e. g. 50-m" snap-closure type
– 12 – VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

Bild 6. Schematische Darstellung des Umgangs mit den Trades- Figure 6. Handling Tradescantia cuttings (schematic): (1) Prepa-
cantia-Schnittlingen: (1) Vorbereitung der Bechergläser mit ration of the beakers with nutrient solution and aluminium foil; (2)
Nährlösung und Alufolie, (2) Aufsicht Alufolie mit Löchern, (3) top view of perforated aluminium foil; (3) trimming of the cuttings
Schneiden der Schnittlinge auf 15 cm Länge, (4) Exposition der to 15 cm length; (4) exposure of the cuttings in a beaker; (5) har-
Schnittlinge im Becherglas, (5) Ernte der Infloreszenzen durch vesting the inflorescences; and (6) fixation
Abschneiden und (6) Fixieren

(z. B. 50-m"-Rollrandgläser). Es empfiehlt sich die glass vials) are suitable for this purpose. It is recom-
Beschreibung der einzelnen Versuchsvarianten zu co- mended that the description of the individual experi-
dieren. mental variants be coded.
Der Zeitpunkt der Ernte und der des Expositionsbe- The time of harvesting and the start of exposure are
ginns wird im Formblatt zur Exposition (siehe An- recorded on the exposure report form (see Annex B).
hang B) protokolliert. Nach einer 24-stündigen Fixie- After fixation for 24 h the inflorescences are trans-
rung werden die Infloreszenzen in die Konservie- ferred to the preservation solution and stored in a re-
rungslösung überführt und im Kühlschrank bei 4 °C frigerator at 4 °C until evaluation.
bis zu ihrer Auswertung gelagert.

3.7 Mikroskopische Auswertung 3.7 Microscopic evaluation


Für die Bestimmung der Kleinkernraten werden aus The micronucleus frequencies are determined by se-
den 10 bis 16 Einzelknospen einer Infloreszenz dieje- lecting those of the 10 to 16 individual buds of an in-
nigen herausselektiert, die sich in dem entsprechen- florescence which are at the appropriate tetrad stage.
den Tetradenstadium befinden. Hierzu werden auf This is done by mounting the anthers of a medium-
einem Objektträger die Antheren (= Staubbeutel) aus small bud on a slide, gently pressing them onto the
einer mittelkleinen Knospe herauspräpariert, mit slide with a lancet-shaped dissecting needle, and
einer lanzettförmigen Präpariernadel leicht ange- staining them with a drop of staining solution (see
drückt und mit einem Tropfen Färbelösung (siehe Section 3.1.8). The anthers are then squashed in the
Abschnitt 3.1.8) angefärbt. Danach werden die An- staining solution with the flat side of the dissecting
theren in der Färbelösung mit der flachen Seite der needle, the remaining plant material removed, and a
Präpariernadel zerrieben, das restliche Pflanzenmate- cover slip placed on the squash preparation. If the bud
rial entfernt und das Quetschpräparat mit einem contains tetrad stage material, counting is started im-
Deckglas abgedeckt. Handelt es sich um diejenige mediately to avoid drying of the squash preparation.
VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 – 13 –

Bild 7. Mikroskopische Aufnahmen von Tetraden, zum Teil mit Figure 7. Microscopic images of tetrads, some with micronuclei
Kleinkernen (Pfeile) (arrows)

Knospe, die das Tetradenstadium enthält, wird unmit- If the mounted pollen cells are at too early a stage
telbar mit dem Auszählen begonnen, um ein Aus- (e. g. two-cell stage) or at too late a stage (e. g. in a tet-
trocknen des Quetschpräparates zu vermeiden. Soll- rad that has disintegrated into individual cells), then
ten die präparierten Pollenzellen in einem zu frühen younger or older buds, as appropriate, have to be ex-
(z. B. Zweizellstadium) oder in einem zu späten Sta- amined until the desired stage is found.
dium (z. B. in Einzelzellen zerfallenes Tetradensta- 
dium) vorliegen, sind entsprechend jüngere oder 
ältere Knospen zu präparieren, bis das gewünschte 
Stadium gefunden wurde.
Bei 400-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop At 400 times magnification, five individual buds are
werden pro Variante (Exponat, Standort) fünf Einzel- counted per variant (exposed plant, location) and 300
knospen und pro Knospe 300 Tetraden gezählt und tetrads per bud and the number of micronuclei occur-
die Anzahl aufgetretener Kleinkerne in einem Aus- ring recorded in a scoring report (see report form in
werteprotokoll (siehe Formblatt in Anhang B) notiert Annex B) (Figure 7). Since not every inflorescence
(Bild 7). Da nicht jede Infloreszenz eine Knospe im possesses a bud in the evaluable tetrad stage, seven to
auswertbaren Tetradenstadium besitzt, werden von ten of the 15 exposed inflorescences are usually re-
den 15 exponierten Infloreszenzen zumeist sieben bis quired for scoring.
zehn zur Auswertung benötigt.
Für die mikroskopische Auswertung muss pro Vari- Depending upon the level of skill, a time of ca. 2 h
ante je nach Einarbeitungsgrad mit einem zeitlichen must be expected for microscopic scoring of each
Aufwand von ca. 2 h gerechnet werden. variant.
Die Kleinkernrate einer Variante oder Messstelle be- The frequency of micronucleus formation of a variant
steht aus dem Mittelwert der Anzahl an Kleinkernen or a measuring point is given by the mean number of
je 100 Tetraden, gemittelt über alle fünf ausgewerte- micronuclei per 100 tetrads, taken over all five indi-
ten Einzelknospen. Zur abschließenden statistischen vidual buds evaluated. Final calculations can be per-
Verrechnung können verschiedene Testverfahren ein- formed using various tests. For example, a compari-
gesetzt werden. So kann beispielsweise ein Mittel- son of means based on a simple analysis of variance
wertvergleich basierend auf einer einfachen Varianz- and the Dunnett t-test or a rank-sum test according to
analyse und dem Dunnett-t-Test oder ein Rangsum- Mann-Whitney can be undertaken. The interdepend-
mentest nach Mann-Whitney durchgeführt werden. ence of the samples must be considered when choos-
Bei der Wahl des statistischen Verfahrens muss die ing the statistical procedure (a priori or posteriori
Abhängigkeit der Proben zueinander berücksichtigt tests), meaning that the samples to be compared
werden (A-priori- oder Posteriori-Tests), das heißt, should be selected in advance. This applies in partic-
die zu vergleichenden Proben müssen zuvor festge- ular to the field and laboratory controls or to the use
legt werden. Dies gilt im Besonderen bei Freiland- of positive controls. A significance level of D = 5 % is
und Laborkontrollen oder dem Einsatz von Positiv- usually adopted for statistical evaluation (see
kontrollen. Bei der statistischen Auswertung wird zu- Annex C for an example of evaluation).
meist eine Irrtumswahrscheinlichkeit von D = 5 % 
zugrunde gelegt (Auswertebeispiel siehe Anhang C).
– 14 – VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

4 Kenngrößen des Verfahrens 4 Parameters of the procedure


Die Spontanmutationsrate unterliegt natürlichen Since the rate of spontaneous mutation is subject to
Schwankungen, sodass die Kontrollpflanzen im Test natural variations, control plants are needed as refer-
die Bezugsbasis für die Bewertung der ermittelten ence basis to ascertain the frequency of micronucleus
Kleinkernraten in den Belastungsexpositionen bil- formation in the exposed plants. In addition, green-
den. Zur Beobachtung der Spontanmutationsrate der house controls, i. e. direct fixation of inflorescences
angezogenen Pflanzen können zusätzlich Gewächs- of the greenhouse-grown plants without exposure,
hauskontrollen, das heißt die direkte Fixierung von can also serve for monitoring of the rate of spontane-
Infloreszenzen der Gewächshauskultur ohne Exposi- ous mutation of the cultivated plants. At least one ref-
tion, dienen. Zur späteren Auswertung der Kleinkern- erence location provides a control value for subse-
raten an den Messorten dient mindestens ein Refe- quent evaluation of the micronucleus formation rate
renzstandort als Kontrollwert. Die 15 Einzelschnitt- at the measuring points. The 15 individual cuttings in
linge in einem Expositionsgefäß stellen die Parallelen an exposure vessel represent parallel determinations
pro Messort dar. at each measuring site.
Eine Expositionskampagne setzt sich somit in der An exposure campaign thus generally comprises the
Regel zusammen aus: following components:
• Gewächshauskontrolle zur Bestimmung der Spon- • greenhouse control to determine the frequency of
tanmutationsrate der Gewächshauskultur spontaneous mutation of the greenhouse plants
• 1 bis n potenziell belastete Messorte mit einem • 1 to n potentially polluted measuring sites, each
Expositionsgefäß mit je 15 Schnittlingen with an exposure vessel containing 15 cuttings
• mindestens einem unbelasteten Referenzstandort • at least one non-polluted reference site
• einer eventuellen Positiv- und Negativkontrolle • a possible positive- and negative control in the
im Labor (siehe Abschnitt 5) laboratory (see Section 5)
Bei der Bewertung der Daten ist es wichtig, die Er- It is important to include the results from the control
gebnisse der jeweiligen zu einer Exposition gehören- measuring points belonging to an exposure and any
den Kontrollmesspunkte sowie der eventuell durch- appropriate laboratory controls in evaluation of the
geführten Laborkontrolle mit einzubeziehen. data. Variations of the rate of spontaneous mutation
Schwankungen der Spontanmutationsraten zwischen between individual exposure campaigns can thus also
einzelnen Expositionskampagnen lassen sich da- be determined and compensated where appropriate.
durch miterfassen und gegebenenfalls nivellieren.
Die Streuung der Kleinkernraten wird als Standard- The scatter of the micronucleus formation rates is
abweichung des Mittelwertes einer Variante angege- given as the standard deviation of the mean value of a
ben. Sie kann als Variabilität der Einzelknospen an variant. It can be described as the variability of the in-
einem Expositionsort beschrieben werden. Bei einer dividual buds at an exposure site. If the variability is
hohen Variabilität kann es notwendig sein, mehr Ein- high, it may be necessary to evaluate more individual
zelknospen je Variante auszuwerten, um mögliche buds for each variant in order to improve the statisti-
Effekte statistisch besser erfassen zu können. cal assessment of possible effects.
Nach vorliegenden Erfahrungswerten und den Anga- According to present experience and data reported in
ben in der Literatur schwanken die Spontanmutati- the literature the frequencies of spontaneous muta-
onsraten in der Regel zwischen einem und drei Klein- tion generally vary between one and three micro-
kernen pro 100 Tetraden mit einer Standardabwei- nuclei per 100 tetrads with a standard deviation of
chung von etwa 0,5. about 0,5.
Die Höhe der Kleinkernrate, mit der eine signifikante The magnitude of the micronucleus formation fre-
Wirkung angegeben wird, ist abhängig von der Spon- quency that is indicative of a significant effect de-
tanmutationsrate der Kontrollen und den Standard- pends upon the rate of spontaneous mutation of the
abweichungen der mittleren Kleinkernraten je Expo- controls and the standard deviation of the mean mi-
sitionsort und damit von der statistischen Berechnung. cronucleus frequency for each exposure site and thus
Ein signifikanter Unterschied zwischen den unter- upon statistical calculations. A micronucleus forma-
suchten Gruppen setzt zumindest eine doppelt so hohe tion rate at least twice as high as that of the control is
Kleinkernrate gegenüber der Kontrolle voraus. a prerequisite for a significant difference between the
groups investigated.
Zur Auswertung sollten die mikroskopischen Präpa- The microscopic preparations of all exposures to be
rate aller zu vergleichenden Expositionen von dersel- compared should be scored by the same person in or-
VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 – 15 –

ben Person ausgezählt werden, um subjektive Ein- der to minimise subjective effects. Use of suitable im-
flussgrößen zu minimieren. Der Einsatz geeigneter age processing systems would be welcome yet they
digitaler Bildverarbeitungssysteme ist begrüßens- must permit spatial imaging of the tetrads so that each
wert, jedoch muss der räumlichen Erfassung der Te- tetrad can be examined for micronuclei in different
traden Rechnung getragen werden, sodass jede Te- image planes. No such digital image processing sys-
trade in verschiedenen Bildebenen auf Kleinkerne tems are readily available at present.
abgeprüft werden kann. Derzeit sind keine derartigen 
digitalen Bildverarbeitungssysteme frei verfügbar.

5 Maßnahmen zur Qualitätssicherung 5 Quality assurance measures


Die Entnahme von Schnittlingen darf nur von gesun- Cuttings may only be taken of healthy, well-formed
den und gut gewachsenen Pflanzen erfolgen. Eine plants. A quality check in the form of the rate of spon-
Überprüfung der Qualität in Form der Spontanmuta- taneous mutation is provided by greenhouse controls
tionsrate erfolgt mit Hilfe von Gewächshauskontrol- (see Section 3.4).
len (siehe Abschnitt 3.4).
Um die Variabilität der Pflanzenreaktion besser ein- In order to better estimate the variability of the plant
schätzen zu können, ist für den Vergleich mehrerer reaction, a reference location is recommended if sev-
Expositionsstandorte ein Referenzstandort empfeh- eral exposure sites are to be compared. At least one
lenswert. Ebenfalls empfohlen wird eine mindestens repetition of exposure at the same site is likewise rec-
einmalige Wiederholung der Exposition am gleichen ommended.
Messort.
Um die Sensitivität der in der jeweiligen Expositions- Laboratory reference testing (= positive control) is
serie eingesetzten Testpflanzen zu belegen, ist die recommended to establish the sensitivity of the plants
Durchführung einer Referenztestung im Labor (= Po- used in a given series of exposures (see Sec-
sitivkontrolle) empfehlenswert (siehe Abschnitt 3.1.9). tion 3.1.9).
Eine Aufzeichnung von Klimadaten ist hilfreich, um Recording of climatic data is helpful, for example to
beispielsweise die Temperatur während der Exposi- register the temperature during exposure and to rule
tion zu erfassen und Fehlinterpretationen erhöhter out misinterpretations of elevated micronucleus for-
Kleinkernraten aufgrund anderer Einflussgrößen als mation rates owing to influencing factors other than
luftgetragener Schadstoffe zu vermeiden. airborne pollutants.
Für eine objektive Auszählung müssen die einzelnen Objective scoring requires that the individual variants
Varianten codiert und damit für die Auswerteperson are coded and thus unknown to the scorer.
unbekannt sein.
Der sorgfältige Umgang mit Messdaten erfordert es, Care in the handling of measured data requires that
dass die mittleren Kleinkernraten immer mit Stan- the mean micronucleus formation rates are always
dardabweichung angegeben werden. Darüber hinaus given with the standard deviation. Moreover, the con-
sollen die Kontrollwerte und die Anzahl der Wieder- trol values and the number of repeat exposures should
holungsexpositionen angegeben werden. also be recorded.
Unregelmäßigkeiten in den Präparaten (z. B. Schädi- Irregularities in the preparations (e. g. damage such as
gungsmuster wie deformierte Pollenzellen) müssen deformed pollen cells) have to be recorded and con-
protokolliert und bei der Interpretation der Ergeb- sidered in the interpretation of the results, and ex-
nisse berücksichtigt und gegebenenfalls aus der Be- cluded from evaluation where appropriate. A possible
wertung herausgenommen werden. Protokolliert increased number of scored preparations undertaken
wird gegebenenfalls auch eine Erhöhung der Anzahl to improve statistical reliability should be also re-
der ausgewerteten Präparate zur statistischen Ab- corded.
sicherung.

6 Bewertung 6 Evaluation
Die Ergebnisse der wirkungsbezogenen Untersu- The results of effect-related studies with Trades-
chungen mit dem Reaktionsindikator Tradescantia cantia yield immediate information about the genoto-
liefern unmittelbare Erkenntnisse zum genotoxischen xic potential of the studied exposure sites for the
– 16 – VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

Potenzial der untersuchten Expositionsorte für den period of exposure (see example of evaluation in
Zeitraum der Exposition (siehe Auswertebeispiel in Annex C).
Anhang C).
Durch einen Vergleich der mittleren Kleinkernraten Comparison of the mean micronucleus frequencies
lassen sich Standorte mit erhöhtem genotoxischen permits identification of sites with an elevated geno-
Potenzial identifizieren. Bei zeitlich gestaffelten Ex- toxic potential. Temporally staggered series of expo-
positionsreihen können die Ergebnisse eines Exposi- sures permit the results for a given exposure site to be
tionsorts in einem größeren Zusammenhang betrach- viewed within a larger framework and/or a possible
tet und/oder ein mögliches Auftreten zeitlich punktu- variation of pollution levels with time to be detected.
eller Belastungen angezeigt werden.
Die Ergebnisse können mit den mittleren Ergebnissen The results can be compared with the mean results of
anderer genotoxischer Untersuchungen luftgetrage- other genotoxic studies of airborne pollutants and of
ner Immissionen und von Immissionsmessungen/-er- pollution measurements/assessments and evaluated
hebungen verglichen und bewertet werden [9; 11; 14]. [9; 11; 14].
VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 – 17 –

Anhang A Bezugsquellen Annex A Sources


Einheitserde ED 73: Einheitserde Werkverband e.V.; ED 73 Standard soil: Einheitserde Werkverband e.V.;
Waldsiedlung 4; 36391 Sinntal, Waldsiedlung 4; 36391 Sinntal, Germany,
www.einheitserde.de www.einheitserde.de
COMPO GmbH & Co. KG, Gildenstraße 38, COMPO GmbH & Co. KG, Gildenstraße 38, 
48157 Münster,  48157 Münster, Germany,
info@compo.de, www.compo.de info@compo.de, www.compo.de
Tradescantia-Klone: Tradescantia sp. # 4430, ein Tradescantia clone: Tradescantia sp. # 4430, a hybrid
Hybrid aus T. hirsutiflora und T. subacaulis aus of T. hirsutiflora and T. subacaulis from the
dem Brookhaven National Laboratory, United Sta- Brookhaven National Laboratory, United States
tes
– 18 – VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

Anhang B Formblätter
Testprotokoll Tradescantia-Kleinkern-Test
I. Angaben zum Versuch (Testprotokoll Nr.): Bearbeiter/in:
Probenprotokoll-Nr.: Bemerkungen/ 
Besonderheiten:
Beschreibung Messorte bzw. 
Versuchsvarianten:

II. Testdurchführung Bearbeiter/in:


Datum Uhrzeit Expositionsbeginn
Expositionsgefäße
Nährlösung in "
pH-Wert mit (z. B. KOH/HCl):
Pflanzenherkunft
Expositionsort/-dauer
Erholungsort/-dauer
Negativkontrolle Labor?
Positivkontrolle Labor?
Gewächshauskontrolle?
Expositionsbedingungen

Sonstiges

Mikroskopische Auswertung
Kleinkerne (KK) innerhalb einer Tetrade
Versuchsvariante Knospe 1 KK 2 KK 3 KK 4 KK weitere gezählte Kleinkernrate
Tetraden
1
2
3
4
5
6
7
8
Mittelwert
ausgewertet am: Bearbeiter/in:
VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 – 19 –

Annex B Forms
Tradescantia micronucleus test
I. Details of experiment (Test report no.): Person performing test:
Sample report no.: Remarks/
special features:
Description of measuring sites or
experimental variants:

II. Execution of test Person performing test:


Date Time of start of exposure
Exposure vessels
Nutrient solution in "
pH value with (e. g. KOH/HCl):
Origin of plants
Exposure site/duration
Recovery site/duration
Negative control in lab?
Positive control in lab?
Greenhouse control?
Exposure conditions

Miscellaneous

Microscopic scoring
Micronuclei (MN) within one tetrad
Experimental variant Bud 1 MN 2 MN 3 MN 4 MN more Tetrads Micronucleus rate
counted
1
2
3
4
5
6
7
8
Mean
Scored on: Person performing test:
– 20 – VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

Anhang C Auswertebeispiel

Testprotokoll Nr. 12345 Datum  01.01.2008


Ansatz:
Probenprotokolle Nr. 121212
ROHDATEN

Variante Beschreibung
LAB-Ko Negativkontrolle im Labor
LAB-MH Positivkontrolle im Labor (Maleinsäurehydrazid)
Ref-Standort Referenzstandort Freiland
Standort A Expositionsstandort A
Standort B Expositionsstandort B
Standort C Expositionsstandort C
GWH Gewächshauskontrolle

KLEINKERNRATEN

LAB-Ko LAB-MH Ref-Standort Standort A Standort B Standort C GWH


Wiederholung
1 1,000 2,666 1,000 1,666 3,222 1,666 1,666
2 1,666 1,666 1,333 2,000 3,222 3,333 1,000
3 0,333 3,333 2,000 1,000 2,000 1,333 1,666
4 0,333 2,666 0,666 2,666 1,666 1,666 0,333
5 1,333 3,000 1,333 1,333 3,666 2,000 0,666
6
7
8
Mittelwert 0,933 2,666 1,266 1,733 2,755 2,000 1,066
Standabw. 0,596 0,624 0,495 0,641 0,869 0,782 0,596
Varianz 0,355 0,389 0,245 0,411 0,756 0,611 0,355
VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 – 21 –

Annex C Example of evaluation

Test report no. 12345 Date test: 2008-01-01

Sample report no. 121212


CRUDE DATA

Variant Description
LAB-Co Negative control in lab
LAB-MH Positive control in lab (maleic hydrazide)
Ref site Reference site in field
Site A Exposure site A
Site B Exposure site B
Site C Exposure site C
GHC Greenhouse control

MICRONUCLEUS RATES

LAB-Co LAB-MH Ref site Site A Site B Site C GHC


Repetition
1 1,000 2,666 1,000 1,666 3,222 1,666 1,666
2 1,666 1,666 1,333 2,000 3,222 3,333 1,000
3 0,333 3,333 2,000 1,000 2,000 1,333 1,666
4 0,333 2,666 0,666 2,666 1,666 1,666 0,333
5 1,333 3,000 1,333 1,333 3,666 2,000 0,666
6
7
8
Mean 0,933 2,666 1,266 1,733 2,755 2,000 1,066
Standard dev. 0,596 0,624 0,495 0,641 0,869 0,782 0,596
Variance 0,355 0,389 0,245 0,411 0,756 0,611 0,355
– 22 – VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

GRAFIK

LAB-Ko LAB-MH Ref-Standort Standort A Standort B Standort C GWH

Mittelwert 0,933 2,666 1,266 1,733 2,755 2,000 1,066

Standabw. 0,596 0,624 0,495 0,641 0,869 0,782 0,596

EINFACHE VARIANZANALYSE

LAB-Ko LAB-MH Ref-Standort Standort A Standort B Standort C GWH

Ausgezählte Knospen 5 5 5 5 5 5 5

Gesamt-MW 1,774

Stichproben-
gruppen k: 7
Gesamtumfang N: 35

Streuung FG SQ MQ

zwischen 6 16,3863 2,7311

innerhalb 28 12,4888 0,4460

total 34

Prüfgröße F 6,1230

Tabellenwert Ftab 2,44

F(k – 1);
(N – k)

und alpha = 0,05

Entscheidung: F > Ftab >>> es bestehen signifikante Unterschiede


VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 – 23 –

DIAGRAM

LAB-Co LAB-MH Ref site Site A Site B Site C GHC

Mean 0,933 2,666 1,266 1,733 2,755 2,000 1,066

Standard dev. 0,596 0,624 0,495 0,641 0,869 0,782 0,596

SIMPLE ANALYSIS OF VARIANCE

LAB-Co LAB-MH Ref site Site A Site B Site C GHC

Scored buds 5 5 5 5 5 5 5

Total-MN 1,774

Random sample
Groups in k: 7

Total number N: 35

Scatter FG SQ MQ

between 6 16,3863 2,7311

within 28 12,4888 0,4460

total 34

Test statistic F 6,1230

Tabular value Ftab 2,44

F(k – 1);
(N – k)

and alpha = 0,05

Decision: F > Ftab >>> significant differences exist


– 24 – VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

PAARWEISER DUNNETT-t-TEST

Variante 1 Variante 2 (zwei Varianten wählen, die verglichen werden sollen)

3,222 1,000

3,222 1,333
2,000 2,000

1,666 0,666

3,666 1,333

Mittelwerte 2,755 1,266

s= 0,70715 [=WURZEL((4*VARIANZ(Variante 1) + 4*VARIANZ(Variante 2))/8)]


angegebene Formel für fünf Wiederholungen

ti0 = 3,329 [=(MITTELWERT(Variante 1) – MITTELWERT(Variante2))/(s*WURZEL(0,4))]

Eintragung: ti0 ist aus den jeweiligen Paar-Vergleichen in die Zusammenfassung einzutragen.

t tab = 1,86 alpha = 0,05

Entscheidung: ti0 > t tab >>> signifikanter Unterschied

ZUSAMMENFASSUNG

Individuelle Eintragung der ti0-Werte aus den gewünschten paarweisen Vergleichen


(alle paarweisen Vergleiche möglich, jedoch nicht immer sinnvoll, z. B. GWH oder LAB-MH mit Standorten A, B und C)

LAB-Ko LAB-MH Ref-Standort Standort A Standort B Standort C


LAB-MH 4,49

Ref-Standort

Standort A 0,57
Standort B 3,33 0,76

Standort C 1,77 0,59 1,44

GWH 0,35 0,58

(Signifikante Unterschiede können z. B. farbig markiert werden.)


VDI 3957 Blatt 16 / Part 16 – 25 –

PAIRWISE DUNNETT t-TEST

Variant 1 Variant 2 (select two variants for comparison)

3,222 1,000

3,222 1,333

2,000 2,000

1,666 0,666

3,666 1,333

Mean 2,755 1,266

s= 0,70715 [=ROOT((4*VARIANCE(Variant 1) + 4*VARIANCE(Variant 2))/8)]

Formula given for five repetitions

ti0 = 3,329 [=(MEAN(Variant 1) – MEAN(Variant2))/(s*ROOT(0,4))]

Entry: ti0 is to be entered in the summary from the appropriate pairwise comparisons.

t tab = 1,86 alpha = 0,05

Decision: ti0 > t tab >>> significant difference

SUMMARY

Individual entry of the ti0 values from the selected pairwise comparisons

(all pairwise comparisons are possible, but not always meaningful, e. g. GHC or LAB-MH with sites A, B, and C)

LAB-Co LAB-MH Ref site Site A Site B Site C


LAB-MH 4,49

Ref site

Site A 0,57

Site B 3,33 0,76

Site C 1,77 0,59 1,44

GHC 0,35 0,58

(Significant differences can be marked in colour.)


– 26 – VDI 3957 Blatt 16 / Part 16

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