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MICROBIOLOGIA CLÍNICA

FASES DO DIAGNÓSTICO
Fase pré-analítica: Fase que se inicia com a solicitação da análise, passando pela obtenção da amostra e finda ao se iniciar a análise
propriamente dita.
Fase analítica: Conjunto de operações, com descrição especifica utilizada na realização das análises de acordo com determinado método.
Fase pós-analítica: Fase que se inicia após a obtenção de resultados válidos das análises e finda com a emissão do laudo, para a interpretação
pelo solicitante.

NÍVEIS DE BIOSSEGURANÇA E RISCOS BIOLÓGICOS


NB1: Representa um nível básico de contenção que se baseia nas práticas padrões, sem uma indicação de barreias primárias ou secundarias,
com exceção de uma pia para a higienização das mãos.
Classe I (Risco 1): Dificilmente são patogênicos para o homem, animais ou plantas (escasso risco individual e comunitário). Ex:
Lactobacillus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis...
NB2: É adequado para qualquer trabalho que envolva sangue humano, líquidos corporais, tecidos ou linhas de células humanas primárias onde
a presença de um agente infecioso pode ser desconhecia.
Classe II (Risco 2): São patogênicos para o homem mas, medidas terapêuticas e profiláticas são eficazes (moderado risco individual e
limitado para a comunidade). Ex: E. coli, Pseudomonas spp, Acinetobacter spp, Vírus da dengue, adenovirus, HbC, HIV...
NB3: Enfatizam-se mais as barreiras primarias e secundarias, todas manipulações deveram ser feita em cabine de segurança biológica (CSB) ou
em outro equipamento de contenção. (Sistemas de ventilação)
Possível risco de transmissão respiratória.
Classe III (Risco 3): Muito patogênicos para o homem, potencialmente letais (risco para comunidade e meio ambiente). Ex: Flavivírus,
Influenza Aviária, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis,
Burkholderia mallei, Clostridium botulinum...
NB4: Prédio separado, zona completamente isolada, ventilação e gerenciamento do lixo, CBSIII, macacão com O 2.
Classe IV (Risco 4): São extremamente patogênicos para o homem e/ou para animas (elevado risco individual e comunitário). Ex: Vírus Ebola,
Febres hemorrágicas, Vírus da Aftosa...

COLETA E TRANSPORTE
A coleta e transporte deve ser realizada conforme o material clínico, e de acordo com o exame solicitado.
 Frascos de boca larga: escarro; fezes; urina.
 Swabs com meio Stuart ou Amies: isolamento de bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas.
 Meio Cary-Blair: contém conservantes para amostra de fezes e isolamento de enteropatógenos.

MEIOS DE CULTURA
Ágar Sangue: meio não seletivo e não diferencial que permite o crescimento de Gram-negativas e Gram-positivas, leveduras, além de
permitir a visualização da hemólise.
Ágar Chocolate: meio nutritivo que permite o crescimento da maioria das bactérias, especialmente H. influenzae e N. gonorrhoeae.
Thayer-Martin: meio seletivo utilizado para isolamento de N. gonorrheae e N. meningitidis. Inibe a maioria das outras bactérias.
Eosin Methilene Blue- EMB: meio seletivo e diferencial que permite o crescimento de bacilos Gram negativos, diferenciando as bactérias em
lactose positiva e lactose negativa. Inibe bactérias Gram positivas.
Mac Conkey: meio seletivo e diferencial que permite o crescimento de bacilos Gram negativos, diferenciando as bactérias em lactose positiva
e lactose negativa. Inibe bactérias Gram positivas.
Salmonella-Shiguella – SS: meio seletivo e diferencial para isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. detecta a produção de H2S.
CLED (cystine lactose eletrolyte deficiente agar): meio que permite crescimento de vários BGN e CGP, como sua composição é deficiente
em eletrólitos, inibe a formação de véu do Proteus spp.
Ágar Karmali Campy: meio seletivo para isolamento de Campylobacter spp.
Caldo Tioglicolato: meio de enriquecimento, desenvolve a maioria das bactérias.
Caldo Tetrationato: meio de enriquecimento, para Salmonella spp.
Caldo TODD: meio de enriquecimento, com ácido nalidíxico e gentamicina ou colistina, para isolamento de Streptococcus.
Cromo Ágar: meio cromogênico, para várias culturas, ocorre alteração nas cores das colônias.

INTERPRETAÇÃO DO CRESCIMENTO NA CULTURA PRIMÁRIA


Amostras clínicas estéreis: Sangue/LCR/Biópsias/Líquido pleural/Pericárdio/ Líquido sinovial/ Medula óssea.
Amostras que geralmente apresentam microbiota normal ou colonização: Trato respiratório/ “Swabs” de sítios anatômicos infectados/Fezes
/Secreções genitais.
UROCULTURA
Agentes mais frequentes (comunitárias):
BGN: Escherichia coli (principal – até 70%), Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Enterobacter spp.
CGP: Staphylococcus saprophyticcus, Enterococcus spp.
Coleta:
Frasco estéril.
Paciente deve reter a urina de 2 a 3 hs.
Em algumas situações, como confirmar uma contagem baixa da cultura, pode ser necessário a retenção urinária de 4 hs.
O paciente não deve ingerir líquido em excesso.
Tipos de amostras:
Urina jato médio.
Amostra de urina de qualquer jato.
Urina coletada por sonda de alívio.
Urina de porção suprapúbica.
Urina de primeiro jato.
Como reportar o resultado:
Exemplos:
• 1- Não houve crescimento de microrganismos.
• 2- < 1.000 UFC/mL
• 3- > 100.000 UFC/mL de Escherichia coli.
• 4- Houve crescimento de 3 microrganismos diferentes, sugestivos de contaminação. Sugere-se nova coleta, a critério clínico.
HEMOCULTURA
Diagnóstico de ICS.
Entrada direta de microrganismos na corrente sanguínea através de agulhas, infusões contaminadas, cateter (bacteremia primária).
Drenagem dos microrganismos a partir de foco infeccioso primário (bacteremia secundária).
Microrganismos mais frequentes: SCN, S. aureus, Enterococcus spp, Streptococcus spp, K. pneumoniae, E. coli., P. aeruginosa, Acinetobacter
spp, Candida spp.
O volume de sangue coletado é uma das variáveis mais importantes para a positividade da cultura, quanto maior o volume coletado, maior a
probabilidade da sua positividade.
CULTURA DO TRATO RESPIRATÓRIO
Infecções de vias aéreas inferiores (IVAI) que podem ser por bactérias, fungos, parasitas, micobactérias e vírus;
Bronquites até quadros graves de pneumonias;
Hospitalar e comunitária;
Trato Respiratório Inferior
Amostras Clínicas: Escarro/Escarro induzido/ Aspirado traqueal/Lavado broncoalveolar/ Escovado broncoalveolar/Biópsia/ Líquido pleural.
Principais microrganismos na pneumonia comunitária: S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus, M. catarrhalis, Enterobactérias, BGN NF,
Legionella spp, M. pneumoniae.
Principais microrganismos na pneumonia hospitalar: K. pneumoniae, E. coli, Enterobacter spp, P. aeruginosa,
A. baumannii, S. aureus, L. pneumophila, Vírus sincicial respiratório (VSR), Aspergillus spp, P. jiroveci (P. carinnii).
Trato Respiratório Superior
Orofaringe, tonsila e faringe são os mais solicitados.
Outros materiais: amostras de seios maxilares (sinusite), mucosa oral (candidíase), secreção nasofaríngea.
Microrganismos mais frequentemente isolados: Streptococcus pyogenes, Streptococcus β-hemolítico dos grupos C, F e G, Streptococcus
pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Enterobactérias, BGN NF.
Faringite, tonsilite: S. pyogenes, beta-hemolíticos dos grupos C e G.
Sinusite aguda: M. catarrhalis, S. pneumoniae, H. influenzae, S. pyogenes.
Sinusite crônica: Os mesmo da aguda, BGN, P. aeruginosa, anaeróbios e fungos.
CULTURA DE AMOSTRAS DO TRATO GENITAL
As doenças infecciosas que acometem o trato genital masculino e feminino podem ser de origem bacteriana, viral, parasitária ou fúngica.
Em desiquilíbrio hormonal e pH vaginal, alguns microrganismos da microbiota normal podem tornar-se patógenos, como G. vaginalis e
Candida spp.
Microbiota feminina: Enterobactérias (E. coli), Lactobacilos, Streptococcus spp, Enterococcus spp, Neisseria spp. (não patogênica), SCN,
Anaeróbios.
Microbiota masculina: SCN, Streptococcus do grupo viridans, Corynebacterium spp, Micrococcus spp.
Principais infecções e sintomas:
Vaginite:
• inflamação da mucosa vaginal
• C. albicans e Trichomonas vaginalis
Vaginose bacteriana:
• Inflamação e irritação perivaginal com corrimento
• Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis
• Outros microrganismos facultativos e anaeróbios: Mobiluncus spp.; Prevotella spp.; Peptostreptococcus spp.
Cervicite:
• Corrimento
• N. gonorrheae e C. trachomatis.
Uretrite:
• Corrimento uretral
• Disúria
• N. gonorrheae, C. trachomatis, T. vaginalis, M. hominis, U. Urealyticum.
Quando deve ser feita pesquisa de Streptocuccus do grupo B (S. agalactiae) em gestantes?
O CDC (Centers for Disease Control and Prevention) recomenda que seja realizada entre a 35 e 37 semana de
gestação.
CULTURA DE LÍQUIDOS ORGÂNICOS
Líquido pleural: S. pneumoniae, BGN, Legionella spp.
Líquido peritoneal:

Peritonire primária:
• Crianças: S.pneumoniae, S. pyogenes, enterobactérias, SCN.
• Adultos; E. coli, S.pneumoniae, S. pyogenes.
Peritonire secundária:
• Anaeróbios (B. fragilis), E.coli, Enterococcus spp., Streptococcus spp.,
N. gonorrheae.
Líquido ascítico.
Líquido de diálise:
• SCN; S. aureus; Enterococcus spp.; Streptococcus spp.; P.
aeruginosa; Acinetobacter spp.; Enterobactérias.
Líquido sinovial:
• S. aureus; N. gonorrheae; H. influenzae; S. pyogenes
• Em próteses: SCN; Propionibacterium spp.; Corynebacterium spp.
LCR:
• Devido à vacinação contra H. influenzae tipo B, vacinas polivalentes contra S. pneumoniae e o aumento destes resistentes a penicilina,
observamos alteração da epidemiologia das meningites.
• As meningites agudas podem ser de origem bacteriana ou viral.
• Normalmente a concentração de microrganismos é baixa (10 ³ UFC/mL), por isso a importância da centrifugação da amostra.
CGP
Staphylococcus
As espécies clinicamente mais importantes são:
• S. aureus (possui a enzima coagulase)
• S. epidermidis (microbiota, menos virulenta do que o S. aureus, (biofilme)).
• S. saprophyticus (infecção do TGU, cistite, uretrite e pielonefrite).
• S. warneri, S. hominis, S. haemolyticus, S. capitis, S. caprae, S. lugdunensis.
A partir da caracterização da amostra como CGP através da coloração de Gram, a determinação da família é feita pela prova da catalase.
Streptococcus
β-Hemolíticos GRUPO A: S. pyogenes (Faringite frequente).
β-Hemolíticos GRUPO B: S. agalactiae (Microbiota do TGI) E mulheres coloniza a vagina e o reto, por isso é a principal causa de doença nos
períodos neonatal e perinatal.
β-Hemolíticos GRUPO D: S. bovis: associado a infecções humanas e animais; S. equinus: predominantemente em cavalos, raro agente
causador de bacteremia e endocardite no homem; S. pneumoniae: Principal agente causador de pneumonia bacteriana comunitária, causa
meningite bacteriana em adultos; principal fator de virulência: cápsula de polissacarídeos.
Streptococcus do grupo viridans: Inclui várias espécies de estreptococos α-hemolíticos e não hemolíticos: S. sanguis, S. oralis, S. gordonii, S.
mitis, S. mutans e S. salivarius.
Enterococcus spp: possui resistência às penicilinas, cefalosporinas e vancomicina; as espécies mais importantes são: E. faecalis, E. faecium.
COCOS GRAM POSITIVOS (CGP)
Dentre os cocos Gram positivos serão enfatizados alguns gêneros: estafilococos, estreptococos e enterococos.
Após avaliação preliminar da característica macroscópica e crescimento da colônia microbiológica, bem como
realização do esfregaço e coloração de Gram confirmando a presença de CGP em microscópio óptico (objetiva 1000X
– imersão). A identificação e diferenciação dos gêneros dos cocos Gram positivos se inicia com a prova da catalase.

PROVA DA CATALASE

Finalidade
Verificar a presença da enzima catalase que decompõe H2O2 em H2O + O2 e dessa forma, distinguir
os grupos estafilococos dos estreptococos e enterococos.
Procedimento
Com alça bacteriológica, retirar duas ou três colônias do meio de cultura.
Colocar a colônia sobre a lâmina de vidro ou de fundo escuro e adicionar uma gota de H2O2.
Leitura
Observar a formação de bolhas
Interpretação
Formação de bolhas indica ser o gênero Staphylococcus spp.
Sem formação de bolhas indica serem os gêneros Streptococcus spp. e Enterococcus spp.

COCOS GRAM POSITIVOS / CATALASE POSITIVA

PROVA DA COAGULASE EM TUBO

Finalidade
Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada que, reagindo com um fator
plasmático, forma um complexo que atua no fibrinogênio do plasma formando a fibrina.
Procedimento
Colocar 0,5 mL de plasma comercial em tubo de ensaio.
Adicionar um alçada de colônia diretamente no plasma comercial (plasma de coelho liofilizado).
Identificar e incubar por 4 h a 35±2°C em estufa ou banho-maria; caso não haja formação de
coágulo, incubar por 24h.
Leitura
Formação de coágulo observada pela inclinação suave do tubo.
Interpretação
Formação de coágulo inteira ou parcial identifica o Staphylococcus aureus.
Não formação de coágulo identifica os stafilococos coagulase negativa (SCN).
TESTE DA DNase (Azul de toluidina O)

Finalidade
Verificar se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada o ácido nucléico (DNA).
Procedimento
Fazer um inóculo denso de forma circular em uma pequena parte do meio DNase;
Identificar a placa e incubar a 35±2°C por 18 – 24h. Na placa pode ser inoculada com várias cepas.
Leitura
Formação de um halo cor-de-rosa ao redor do crescimento bacteriano.
Interpretação
Formação de halo cor-de-rosa identifica Staphylococcus aureus.
Crescimento bacteriano sem formação de halo cor-de-rosa identifica os estafilococos coagulase negativa.
OBS: este teste pode também ser usado para identificação dos bacilos Gram negativos não
fermentadores de glicose.

TESTE FERMENTAÇÃO DO MANITOL

Finalidade
Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o manitol contendo 7,5% de cloreto de sódio.
Procedimento
Semear com auxílio de alça bacteriológica as colônias (3-4 colônias) na superfície do ágar manitol.
Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.
Leitura
Formação de superfície amarela produzida pelas colônias no ágar manitol.
Interpretação
Formação de superfície amarela pelas colônias identifica Staphylococcus aureus.
Meio permanece inalterado na superfície, identifica estafilococos coagulase negativa (SCN).
OBS: outras espécies de estafilococos, com pouca frequência, também podem produzir ácido a
partir do manitol, portanto também devem ser testados quanto à produção de coagulase.
TESTE DE RESISTÊNCIA- NOVOBIOCINA
Finalidade
Verificar se o microrganismo é resistente à novobiocina.
Procedimento
Semear a colônia em ágar Mueller-Hinton, através da técnica de execução do antibiograma.
Com auxílio de pinça estéril, colocar um disco de novobiocina 5µg/mL.
Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.
Leitura
Formação de halo de inibição, que deve ser medido.
Interpretação
Formação de halo ≤ 16 mm identifica Staphylococcus saprophyticus.

TESTE DE RESISTÊNCIA- POLIMIXINA B


Finalidade
Verificar se o microrganismo é sensível ou resistente a polimixina B.
Procedimento
Semear a colônia em ágar Mueller-Hinton, através da técnica de execução do antibiograma.
Com auxílio de pinça estéril, colocar um disco de polimixina B.
Identificar a placa e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.
Leitura
Formação ou ausência de halo de inibição.
Interpretação
Formação de halo, Staphylococcus haemolyticus, S. saprophyticus, S. intermedius e S.
hominis.
Ausência de halo, Staphylococcus aureus e S. epidermidis.
OBS: Para espécie Staphylococcus lugdunensis a sensibilidade ou resistência a polimixina B é
variável.

TESTE DO PYR (pyrrolidonil arilamidase)

Finalidade
O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida também por alguns stafilococos
coagulase negativa (SCN).
Procedimento
Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre uma lâmina ou
placa de Petri vazia.
Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação mais lenta e menos intensa).
Realizar um esfregaço (de preferência com palito de madeira) com bactéria a ser testada, recém-isolada, sobre o
disco de PYR umedecido.
Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorre em até um minuto.
Interpretação
Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha.
Os Staphylococcus lugdunensis, S. haemoliticus e S. intermedius são PYR (+).
O aparecimento de coloração amarela ou laranjada indica resultado negativo.
PROVA COMPLEMENTAR (ORNITINA) para Staphylococcus lugdunensis e S. haemoliticus.
Finalidade
Avalia a habilidade enzimática dos S. lugdunensis e S. haemoliticus em degradar o aminoácido
ornitina, resultando em uma alcalinização do meio.
Procedimento
Com auxílio da alça ou agulha de repique microbiológica, introduzir com uma picada central no
ágar ornitina 03 a 04 colônias do ECN a ser testado.
Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.
Leitura
Formação de cor amarela ou roxa no tubo contendo ornitina.
Interpretação
Teste (+): Meio com coloração roxa
Teste (-): Meio com coloração amarela

Principais Síndromes Infecciosas causadas pelos Staphylococcus spp.


Pneumonias, Bacteremias, Infecções de pele e tecidos moles, Meningites.
Infecções relacionadas ao uso de próteses e cateteres venosos.
*Staphylococcus aureus: É o CGP mais importante entre os estafilococos. Coloniza 20 a 40% dos adultos, sendo
encontrados principalmente em narinas anteriores.
*S. epidermidis: Relacionado com infecções associadas ao uso de cateteres endovenoso,
endocardites, entre outras.
*S. saprophyticus: Causa infecções urinárias agudas, sobretudo em mulheres jovens, saudáveis e sexualmente ativas.
*S. haemolyticus: Presente na microbiota humana normal da pele. Sendo relatada resistência aos glicopeptídeos.
*S. hominis: É encontrado na pele humana e relacionado à bacteremia em pacientes
imunodeprimidos.
*S. lugdunensis: Associado a casos de endocardite.
COCOS GRAM POSITIVO / CATALASE NEGATIVA
A classificação do tipo de hemólise é fator primordial para indicar quais as provas de identificação devem ser
realizadas a fim de chegar a espécies de cocos Gram positivo, catalase negativa.

TESTE DE SENSIBILIDADE À BACITRACINA

Finalidade
Diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A) de outras espécies de CGP catalase negativa.
Procedimento
Com auxílio do swab umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras beta-hemolíticas da placa primária
ou reisolamento.
Semear as colônias presentes no swab, em ágar sangue com movimentos retilíneos e uniformes em todos os
sentidos da placa.
Colocar na superfície do AS um disco de bacitracina 10mcg.
I identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h.
Leitura
Formação de halo de inibição.
Interpretação
A presença de qualquer halo de inibição ao redor do disco é interpretada como sensível a bacitracina e indicando a
espécie S. pyogenes.

TESTE DE CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen)

Finalidade
O teste visa identificação de cepas de Streptococcus agalactiae (grupo B). Estas cepas produzem o fator CAMP que
atua sinergicamente com a β-hemolisina produzida pelo Staphylococcus aureus em ágar sangue.
Procedimento
Semear um inóculo na horizontal de S. aureus ATCC 25923 (ou cepa de S. aureus com duplo halo de hemólise) de um
ponto a outro da placa de AS (ágar sangue).
Semear perpendicularmente (90°) a colônia de estreptococo beta-hemolítico a ser testada, sem que haja contato
com a estria de S. aureus.
Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h.
Leitura
Visualizar a imagem de uma seta ou meia-lua no AS.
Interpretação
A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para o S. aureus na intersecção do crescimento das duas
bactérias indica que o teste é positivo e indica a espécie de Streptococcus agalactiae.
Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é negativo e a cepa não pertence ao grupo B de Lancefield.
TESTE DE PYR (pyrrolidonil arilamidase)

Finalidade
O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida pelo Streptococcus pyogenes,
mas não pelos demais estreptococos β-hemolíticos. Colônias β-hemolíticas de enterococos podem ser confundidas
com S. pyogenes, pois ambas apresentam positividade neste teste.
Procedimento
Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre uma lâmina ou placa de Petri vazia.
Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação mais lenta e menos intensa).
Realizar um esfregaço (de preferência com palito de madeira) com bactéria a ser testada, recém-isolada, sobre o
disco de PYR umedecido.
Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorre em até um minuto.
Interpretação
Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha.
Os Streptococcus pyogenes e os Enterococcus spp. são PYR positivo.
O aparecimento de coloração amarela ou laranjada indica resultado negativo.

TESTE ÁGAR BILE-ESCULINA

Finalidade
Diferencia os Enterococcus spp de outros Streptococcus spp., tendo como princípio a hidrólise da esculetina
presente no meio de cultura bile-esculina pela bactéria; formando esculetina e dextrose.
A esculetina reage com sais de ferro presente no meio bile-esculina tornando-o enegrecido.
Procedimento
Semear com auxílio de alça bacteriológica as colônias (3-4 colônias) do ágar sangue na superfície do ágar Bile-
esculina. Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.
Interpretação
Presença de cor enegrecida na superfície do meio bile-esculina, identifica Enterococcus spp.
Meio permanece inalterado na superfície do meio bile-esculina, identifica outros Streptococcus spp.

TESTE DE CRESCIMENTO EM NaCl 6,5%


Finalidade
Determinar a capacidade do microrganismo de crescer em altas concentrações de sal.
Procedimento Com auxílio de alça inocular 03 a 04 colônias a serem testadas em um caldo BHI suplementado com
6,0% de NaCl (com ou sem indicador). Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 24h.
Interpretação
A turvação ou mudança de cor (no caso adição indicador) indica crescimento de Enterococcus spp.

PROVA DA OPTOQUINA

Finalidade
Fármaco utilizado para indicar se o streptococos alfa-hemolítico é um pneumococo. A optoquina é uma droga
solúvel em água que se difunde rapidamente em meio de cultura sólido.
Procedimento
Com auxílio do swab umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras alfa-hemolíticas da placa primária
ou reisolamento.
Semear as colônias presentes no swab, em ágar sangue com movimentos retilíneos e uniformes em todos os
sentidos da placa. Colocar na superfície do AS um disco de optoquina 5µg.
Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h.
Interpretação
Presença de halo de inibição ≥ 14 mm = Sensível a optoquina → Streptococcus pneumoniae.
O pneumococo pode apresentar halos < 14 mm, como os estreptococos grupo viridans.
Deve-se então ser realizado o teste de bile solubilidade.

TESTE DE BILE-SOLUBILIDADE (desoxicolato de sódio 2%)


Finalidade
Capacidade do desoxicolato de sódio (sal biliar) de lisar seletivamente o Streptococcus pneumoniae em fase
logarítmica do crescimento. Este sal ativa as enzimas autolíticas (autolisinas) produzidas pelo pneumococo,
acelerando a reação lítica natural da bactéria.
Procedimento
Preparar uma suspensão bacteriana densa a partir da cultura recente.
Utilizar 02 tubos de ensaio transparentes, para o teste: Tubo controle “C” e Tubo teste “T”.
Adicionar solução de desoxicolato de sódio 2% ao tubo ”T” e solução salina a 0,85% ao tubo “C”.
Os volumes em cada tubo devem ser iguais 0,5ml (500µL). Adicionar a cada tubo o mesmo volume da suspensão
bacteriana.
Homogeneizar e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica.
Fazer a leitura imediatamente, após 1h e até 2h de incubação.
Interpretação
Reação Positiva = Tubo“T” límpido ou turvação visivelmente menor que o Tubo “C”, confirma a espécie
Streptococcus pneumoniae.
Reação Negativa = Tubo “T” com turvação igual ao tubo “C”.

TESTE SULFAMETOXAZOL+TRIMETOPRIM (STX)


Finalidade
Verificar se os estreptococos não pertencem ao grupo A, B ou D de Lancefield.
Procedimento
Com auxílio do swab umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras beta-hemolíticas da placa primária
ou reisolamento. Semear as colônias presentes no swab, em ágar sangue com movimentos retilíneos e uniformes em
todos os sentidos da placa.
Colocar na superfície do AS um disco de STX. Identificar e incubar em jarra de vela, a 35±2°C por 18-24h.
Interpretação
Ausência de halo (Resistente), Streptococcus pyogenes; S. agalactiae e Enterococcus spp.
Presença de halo (Sensível), estreptococos não A, B ou D.
TESTE DA ARGININA
Finalidade
Determinar se o Enterococcus spp em estudo é capaz de hidrolisar o aminoácido arginina.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias, depositando o inóculo na parede do tubo,
abaixo do óleo mineral. Incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h.
Leitura
Hidrólise da arginina
Cor púrpura do meio mais acentuado que tubo controle: utilização do aminoácido.
Cor do meio igual ou mais amarelada que tubo controle: não utilização do aminoácido.

TESTE DE MANITOL, SORBITOL E ARABINOSE.


Finalidade
Determinar se o Enterococcus spp. em estudo é capaz de consumir os açucares manitol, sorbitol e arabinose, sendo
detectado pela produção de ácido.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central nos tubos de meio de
cultura manitol, sorbitol e arabinose. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h.
Leitura
Consumo do manitol/sorbitol/arabinose
Cor rosa intenso dos tubos: Reação Positiva.
Cor rosa claro dos tubos: Reação Negativa.

MOTILIDADE DO MICRORGANISMO
Finalidade
Determinar a capacidade de movimentação do enterococos em estudo, distinguindo deste modo, a espécie do
microrganismo em questão.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central nos tubo de meio de
cultura do teste de motilidade.
Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24 horas.
Leitura
Crescimento além da picada, motilidade POSITIVA.
Crescimento somente na picada, motilidade NEGATIVA.

PIGMENTO DA COLÔNIA BACTERIANA


Finalidade
A identificação da coloração da colônia tem como finalidade auxiliar na diferenciação das espécies de enterococos.
Procedimento
Com auxílio de swab estéril branco passar o mesmo nas colônias e verificar as cores.
Leitura
As colônias dos enterococos podem apresentar coloração branca ou amarela.
Interpretação dos Resultados (identificação espécies dos enterococos)
Os resultados são realizados por um sistema número, criado pelo kit comercial (Kit-Enterococos-PROBAC®); onde
após leitura das provas se coloca valores estabelecidos para as provas positivas e para as provas negativas assume-se
o valor zero. Em seguida os valores obtidos em cada série de provas são somados. E aplicado a uma tabela com os
valores encontrados e suas respectivas espécies de enterococos em ANEXOS.
Principais Síndromes Infecciosas causadas pelos Streptococcus e Enterococcus spp.
Os enterococos são causadores de endocardite, infecções no trato urinário (ITU), infecções da corrente sanguínea, e
de sítio cirúrgico e intra-abdominal. Mas também infrequentemente podem causar pneumonias e meningites em
pacientes debilitados; bem como empiema em portadores de doença hepática.
* Streptococcus pyogenes: podem causar faringites, impetigo, erisipela, endocardites, meningites, artrites, infecções
respiratórias. Cepas produtoras de toxinas podem causar a febre escarlatina e choque tóxico.
* Streptococcus agalactiae: podem causar infecções graves em neonatologia, como meningite e sepse. Em adultos
com neoplasias, imunodeficiências e diabetes mellitus podem predispor infecções como endocardite, bacteremia,
infecções de pele e tecidos moles, pneumonia e osteomielites.
* Streptococcus pneumoniae: pneumonia, meningite, otite média aguda, artrite séptica, peritonite e derrame
pleural.
* Streptococcus do grupo viridans: fazem parte da microbiota normal da cavidade oral, trato gastrointestinal e trato
genital. Entretanto sua presença pode estar associada à endocardite subaguda, especialmente em portadores de
próteses valvulares.
BGN
Enterobactérias: BGN/Não esporulados/Oxidase negativos/Fermentam glicose (com ou sem produção de gás).
Principais espécies: E. coli, Salmonella spp, Shigella spp, Yersinia spp, Enterobacter spp, Citrobacter spp, Proteus spp,
Klebsiella spp, Serratia spp, Providencia spp, Hafnia spp, Edwardsiella spp.
Classificação da E. coli quanto ao sorotipo:
EPEC- E.coli enteropatogênica.
 Não excreta toxina/ acomete animais e homens, sendo comum (diarreia infantil).
 Aderência a membrana plasmática, através das fimbriasDestruição das microvilosidades intestinais,
diarreia, febre, náuseas e vômitos.
 Contaminação alimentar.
ETEC- E. coli enterotoxigênica.
 Produz 2 tipos de enterotoxinas: termolábil e a termoestável.
 Coloniza o intestino delgado, onde se multiplica e produz as toxinas, que induzem a secreção de fluidos (
diarreia intensa e aquosa).
 Água contaminada, alimentos.
 Diarreia em todas as idades, (Diarreia dos viajantes).
EIEC- E. coli enteroinvasora
 Causa disenteria bacilar, semelhante a causada pela Shigella.
 A bactéria é ingerida e invade as células epiteliais do intestino, causa febre, vômitos ou cólicas. As fezes
apresentam sangue e leucócitos.
 São fermentadores tardio de lactose ou não-fermentadores, imóveis, lisina negativa.
EHEC- E. coli enterohemorragica
 Responsável pela colite hemorrágica, causando dores abdominais e diarreia sanguinolenta com pouco ou
nenhuma febre.
 Produz uma toxina (Shiga Like) semelhante á produzida pela S. dysenteriae e uma sequela comum é a
síndrome hemolítica urêmica (crianças).
 Alimentos (carnes cruas) tem grande potencial de contaminação.

Salmonella spp.
 Podem ser diferenciados em 4 tipos clínicos:
Salmonella typhi, Salmonella choleraesuis, Salmonella paratyphi, Salmonella typhimurium
 Gastroenterites, que varia de diarreia leve à fulminante, com febre baixa e variados graus de náuseas e
vômitos.
 Bacteremia sem sintomas gastrointestinais, com picos de febre alta e hemocultivos positivos.
 Febre entérica causada por qualquer cepa de Salmonella, que se manifesta em geral como febre baixa e
diarreia.
 A Salmonella typhi causa febre tifoide no qual a doença progride através da febre e constipação,
hemocultivos positivos e de fezes negativo, com uma segunda fase diarreica apresentando um hemocultivo
negativo e fezes positivas.
 Para identificação rotineira utilizam-se basicamente três antissoros:
a) Anti-Salmonella polivalente somático (Grupo A, B, C, D, E).
b) Anti-Salmonella somático, Grupo D (S. typhi).
c) Anti-Salmonella anti V.

Shigella spp
Shigella sonnei - soro grupo D – ornitina descarboxilase+ manitol+
Shigella dysenteriae – soro grupo A
Shigella boydii – soro grupo C manitol+
Shigella flexneri – soro grupo B manitol +

 Shigelose: doença bacteriana aguda que envolve o intestino delgado, conhecida como disenteria bacilar.
 Dor abdominal e cólica, diarreia com sangue, pus ou muco, febre e vômitos. (infecção autolimitada, dura 4 a
7 dias).
 As infecções graves estão associadas a uma ulceração da mucosa com sangramento retal e desidratação.
 Transmissão via fecal-oral.
Klebsiella spp.
 São BGN largos, possui cápsula espessa, colônias mucoides, lactose +, imóveis, produz enterotoxina
termoestável.
 K. rhinoscleromatis (agente do escleroma).
 K. ozaneae. (rinite atrofia com perda da arquitetura da mucosa nasal).
 K. oxytoca e K. pneumoniae. (Maior importância).
Serratia spp.
 Produz pigmento vermelho em meios sólidos e a de maior importância clinica é a S. marcescens.
 Causam infecções urinárias, feridas cirúrgicas e pneumonias, principalmente em hospital.
 Possuem alta resistência aos antibacterianos.
 Diferencia-se as demais enterobactérias pela presença de 3 enzimas: DNase, lipase e gelatinase.
Providencia spp.
P. rettgeri, P. stuartii (infecções do TGU, de ferida operatória e da escara de queimado).
P. alcalifaciens - Não hidrolisa uréia.
P. rustiagianii
P. heimbachae
(Alcalinizam a urina igual o Proteus).
Morganella morganii
 Possível patógeno entérico, mas causa predominantemente infecções extra intestinais, principalmente no
ambiente hospitalar, destacando-se infecções no TGU, bacteremia, ferida e queimaduras.
BGN-NF
 São aeróbios, não esporulados.
 Não utilizam carboidratos como fonte de energia ou os degradam através de vias que não à fermentação.
 Oxidase +/-
Pseudômonas aeruginosa
 Bacilos Gram -, moveis.
 Formam colônias redondas e lisas de coloração esverdeadas e fluorescentes (pioverdina).
 Piocianina: É um fator de virulência ativo, o que permite P. aeruginosa para matar as células hospedeiras,
para contrariar os movimentos dos cílios, inibir a proliferação de linfócitos e alterar a fagocitose.
Citrobacter spp.
C. freundii e C. koseri
 Faz parte da microbiota fecal, não sendo considerado um patógeno entérico.
 Pode causar pielonefrite, meningites do recém-nascido, abscesso cerebral, endocardite e bacteremia em
indivíduos com a imunidade comprometida.
Enterobacter spp.
 Incluem 11 espécies, os principais são E. aerogenes e E. cloacae, não causam diarreia.
 São similares a Klesiella, exceto na prova da ornitina (+) e motilidade (+) fazem parte da microbiota fecal,
mas pode causar infecções oportunistas urinarias e respiratórias.
Proteus spp.
P. mirabilis (ornitina +) e P. vulgaris (ornitina -)
 São móveis, com colônias irregulares em meio sólido com véu.
 P. mirabilis, agente de infecções urinárias e de feridas comuns em infecções comunitárias.
 Sensiveis a AMP e cefalosporina e resistentes a nitrofurantoína.
 Hidrolisa uréia, formam amônia, alcaliniza a urina, favorecendo a produção de cálculos renais.
Pseudomonas aeruginosa
 Cresce bem a 37-42°C ajuda a diferenciar de outras espécies de Pseudomonas.
 Oxidase positiva
 Não fermenta carboidratos
Burkholedeira cepacia
 Isolado em numerosas fontes de H2O, superfícies úmidas, incluindo soluções de detergentes e líquidos
endovenosos.
 Resistente aos aminoglicosídeos.
 Sensível à (STX).
Stenotrophomonas maltophilia
 Possui flagelos polares multitriquios
 DNase +
 Oxidase –
 Resistente aos aminoglicosídeos e β –lactâmicos
 Sensível à (STX)/(TRI).
 Resistente a imipenem
Acinetobacter spp
 Cocobacilos imóveis
 Oxidase –
 Das espécies mais importantes em Infecção Hospitalar (IH), atualmente chamada de Infecção Relacionada
à Assistência à Saúde (IRAS).

IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS
 IAL: rugai modificado
 EPM-MILI: Testes de produção de gás por fermentação de glicose, produção de H2S, hidrolise de uréia e
desaminação do triptofano.
Mili: motilidade, produção de indol e descarboxilação da lisina.
 TSI
Provas de identificação manual

CITRATO
Finalidade
Verificar se as bactérias são capazes de utilizar o citrato como única fonte de carbono.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril estriar 03 a 04 colônias na superfície do tubo de meio citrato.
Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h.
Interpretação
Crescimento bacteriano e/ou mudança de cor para azul intenso → Reação Positiva
Ausência de crescimento bacteriano, cor inalterada → Reação Negativa.

FENILALANINA (FENIL)
Finalidade
Verificar se as bactérias são capazes de degradar o aminoácido fenilalanina através da enzima fenilalanina
desaminase, tendo como produto final da reação o ácido fenilpirúvico.
O ácido fenilpirúvico é detectado com adição do Cloreto férrico 10% (indicador da reação).
Somente os gêneros: Proteus, Morganella e Providencia possuem a enzima fenilalanina desaminase.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril estriar 03 a 04 colônias na superfície do tubo de
meio citrato. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h.
Após 24h de incubação adicionar o cloreto férrico 10%.
Interpretação
Coloração verde musgo na superfície do fenil, após adição do cloreto férrico → Reação Positiva.
Ausência de coloração verde musgo, após adição do cloreto férrico 10% → Reação Negativa.

LISINA
Finalidade
Verificar a capacidade das bactérias de descarboxilar o aminoácido lisina em amina, resultando em alcalinidade do
meio de cultura lisina; bem como verificar a motilidade bacteriana e a visualização do indol (produto final da
descarboxilação do aminoácido triptofano) detectado com a adição do reativo de Ehrlich ou Kovacs.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central notubo do meio lisina.
Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h.
Após 24h de incubação interpretar as reações metabólicas.
Interpretação
# Descarboxilação da lisina
Teste (+): Lisina com coloração roxa
Teste (−): Lisina com coloração amarela
# Motilidade bacteriana
Crescimento além da picada (turvação do meio lisina). Motilidade POSITIVA.
Crescimento somente na picada (meio lisina límpido). Motilidade NEGATIVA.
# Produção de indol
Adicionar o reativo de Ehrlich ou Kovacs e observar a reação.
Teste (+): formação de anel róseo na superfície do meio, após adição do reativo Ehrlich.
Teste (−): formação de anel amarelado na superfície do meio, após adição do reativo Ehrlich.
RUGAI
Finalidade
Verificam se as bactérias são capazes de: fermentar glicose e lactose, produzir gás e H2S (gás sulfídrico), degradar
uréia e o aminoácido triptofano. Todas estas informações são visualizadas nas bases inferior e superior do tubo
Rugai.
Procedimento
Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central até o final do tubo e ao
chegar à superfície do meio Rugai realizar estrias. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h. Após 24h
de incubação interpretar as reações metabólicas.

Interpretação
Na Base Inferior do Tubo Rugai
→ Fermentação da Glicose
Teste (+): base inferior do rugai amarela = bactéria fermentadora de glicose.
Teste (−): base inferior do rugai inalterada (verde) = bactéria não fermentadora de glicose.
→ Produção de Gás
Teste (+): bolhas na base inferior do tubo rugai.
Teste (-): ausência de bolhas na base inferior do rugai.
→ Produção de H2S (gás sulfídrico)
Teste (+): Base inferior do rugai com coloração negra.
Teste (−): Ausência de coloração negra na base inferior do rugai.
→ Degradação da Uréia
Teste (+): base inferior do rugai azul = bactéria degrada uréia pela ação enzima urease.
Teste (−): base inferior do rugai sem a coloração azul = bactéria não degrada uréia.

Na Base Superior do Tubo Rugai


→ Fermentação da sacarose
Teste (+): base superior do rugai amarela = bactéria fermentadora de sacarose.
Teste (−): base superior do rugai inalterada (verde) = bactéria não fermenta sacarose.
→ Degradação do aminoácido Triptofano
Através da enzima L-triptofano desaminase na base superior do meio de cultura Rugai.
Teste (+): coloração verde musgo ou acastanhada no ápice do Rugai.
Teste (−): ausência de coloração verde musgo ou acastanhada no ápice do Rugai.

Meio de OF (para oxidação e fermentação)


Princípio:
Meio utilizado para a diferenciação de bacilos
Gram-negativos quanto à capacidade do
microrganismo em utilizar os carboidratos pela
via oxidativa ou fermentativa.
O meio de OF contém uma alta concentração
de carboidratos (1%) e uma pequena
concentração de peptona (0,2%), que facilita a
utilização dos carboidratos de forma oxidativa
pelos bacilos Gram negativos não
fermentadores da glicose.
Após preparo o meio apresenta coloração
verde.
A reação positiva é indicada pela cor amarela.
Inoculação:
São necessários dois tubos para a prova de OF
de glicose. Com o fio bacteriológico inocula-se
uma colônia a ser pesquisada.
Em seguida colocar esterilmente em um dos
tubos 0,5 mL de óleo mineral estéril.
Incubar em estufa bacteriológica a 35° C por 18
a 24 horas.
Interpretação:
A produção de ácido é detectada no meio
através do aparecimento de uma cor amarela,
no caso de organismos oxidativos, pode-se
notar primeiro a produção de cor próxima à
superfície do meio.
TUBO TUBO
ABERTO (sem FECHADO (com RESULTADO
óleo) óleo)
Amarelo : Metabolismo
verde : alcalino
ácido oxidativo
Amarelo : Amarelo : Metabolismo
ácido ácido fermentativo
Verde : Não
Verde : alcalino
alcalino sacarolítico