UNIVERSIDAD DE CONCEPCIÓN

INGENIERIA EN AGROINDUSTRIAS

GUIA DE LABORATORIO
MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

MgcS. Lorena Briones Uribe

LOS ANGELES - CHILE

 EXAMEN BACTERIOLOGICO DE ALIMENTOS

I.- INTRODUCCIÓN

Los riesgos microbiológicos de los productos alimenticios constituyen una de las principales fuentes
de enfermedades de origen alimentario para las personas. Por esta razón, los alimentos no deben
contener microorganismos patógenos, ni sus toxinas o metabolitos, en cantidades que supongan un
riesgo inaceptable para la salud humana.

Los microorganismos de interés para la aceptabilidad o rechazo de los alimentos se pueden agrupar
en:

Microorganismos infectivos:

Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli enteropatógena (por ej: E. coli O157 o
enterohemorrágica y E. coli enterotixigénica), Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Vibrio
parahaemolyticus, entre otros.

Microorganismos toxigénicos:

Staphylococcus aureus, Clostridium perfringes, Clostridium botulinum y Bacillus cereus.

Microorganismos indicadores:

Enterobacterias (Fam. Enterobactericeae), coliformes totales, coliformes termotolerantes

(coliformes fecales), Escherichia coli, Enterococcus spp., microorganismos aerobios mesófilos,
microorganismos aerobios psicrótrofos, mohos y levaduras, etc.

Microorganismos alterantes:

Pseudomonas spp., microorganismos pectinolíticos, microorganismos proteolíticos,

microorganismos lipolíticos, microorganismos sacarolíticos, etc.

El Reglamento Sanitario de los Alimentos (Nº977/96) establece los requisitos generales de

seguridad alimentaria, en virtud de los cuales se comercializarán solo alimentos que sean inocuos
(libres de microorganismos patógenos o sus toxinas) y salubres (microorganismos indicadores
dentro de los rangos especificados para el alimento). Con este fin establece “Los Criterios
Microbiológicos”, donde se especifican los parámetros microbiológicos que se controlarán en los
distintos grupos de alimentos: microorganismos indicadores, microorganismos patógenos y/o

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toxinas. También se establecen los planes de muestreo, que pueden ser de 2 tipos: (i) Plan de 2
clases o (ii) Plan de 3 clases. Así mismo, se establecen los límites microbiológicos de acuerdo a las
recomendaciones internacionales.

Así por ejemplo, los criterios microbiológicos establecidos para el Queso Fresco (quesillo) y los
Moluscos Bivalvos Frescos son los siguientes:

Queso Fresco

Plan de muestreo Límite por Gramo

Parámetro Categoría Clases n c m M
2
Enterobacteriáceas 6 3 5 1 2·10 103
E. coli 6 3 5 1 < 3.0 10
S. aureus 6 3 5 1 10 102
Salmonella en 25 g 10 2 5 0 0 -

Moluscos Bivalvos Frescos

Plan de muestreo Límite por Gramo

Parámetro Categoría Clases n c m M
5
Rcto. Aerobios Mesófilos 1 3 5 3 5·10 106
Coliformes fecales en 100 g 4 3 5 3 2.3·102 4·102
Salmonella en 25 g 10 2 5 0 0 -

n= Número de muestras examinadas de un lote.

c= Número máximo permitido de unidades de muestras defectuosas.
m= Límite del valor del parámetro microbiológico que, en un plan de dos clases, separa la
calidad aceptable de la rechazable. Mientras que, en un plan de tres clases, separa la calidad
aceptable de la marginalmente aceptable.
M=Valor del parámetro microbiológico por encima del cual el alimento representa un riesgo para la
salud (rechazable).

II. -PRINCIPIOS GENERALES DEL MUESTREO

La necesidad de realizar el muestro se basa en la imposibilidad de poder someter a un lote completo

a un análisis microbiológico, ya que analizar cada subunidad del lote sería destructivo y demasiado
caro (un lote es una cantidad de alimentos producida y manipulada bajo condiciones uniformes).

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Un muestreo correcto requiere una atención cuidadosa, ya que su objetivo es obtener una muestra
representativa del alimento. Para que una muestra sea representativa debe contener un número
suficiente de unidades de muestra, las que se obtienen por el método de números aleatorios.

Las muestras seleccionadas deben trasladarse al laboratorio para su análisis en condiciones idénticas
a las que tenían en el momento del muestreo. Para ello deben ser enviadas en los recipientes
originales, si no es posible, los recipientes destinados a contener la muestra y utensilios utilizados
para su recolección deben ser previamente esterilizados.

Las muestras deben llegar al laboratorio en el mínimo de tiempo posible, y deben ser transportadas a
una temperatura que no estimule el crecimiento microbiano (entre 4 y 5ºC). Este requisito es de
valor fundamental para la mayoría de las muestras; sin embargo, es secundario para muestras como
conservas, preservas o productos deshidratados. Cada muestra debe estar acompañada de la
información que la individualice (lugar, hora y persona que la recolectó). Una vez en el laboratorio,
los análisis se deben realizar lo más pronto posible.

III.- PREPARACION DE LAS DILUCIONES DE MUESTRAS DE ALIMENTOS

III.1.- ALIMENTOS NO LIQUIDOS

El método utilizado para el recuento y aislamiento de microorganismos en los alimentos no líquidos

requiere el tratamiento previo de la muestra, para liberar en el medio fluido (diluyente) los
microorganismos que pueden estar aprisionados en el interior o adheridos en las superficies secas o
gelatinosas del alimento.

El procedimiento más empleado es el uso del Stomacher 400®. Los laboratorios que no cuentan con
dicho aparato deberán usar una licuadora. Las muestras blandas como queso, quesillos y pastas
pueden molerse en morteros estériles.

Como diluyente se utilizará principalmente:

- Solución Salina Peptonada (SSP),

- Agua Peptonada al 0.1% (AP), o
- Citrato de Sodio al 2% (para quesos).

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PROCEDIMIENTO

a) Una vez recibida la muestra, realice el análisis lo más pronto posible.

b) Si debe postergar el procedimiento, mantener:

- A -18°C las muestras de productos congelados.

- Entre 0 y 4°C los alimentos perecibles no congelados, por un período no superior a 36
horas.
- A temperatura ambiente las muestras no perecibles como conservas o alimentos de baja
humedad.
- Si la muestra está congelada, descongelada en su envase original (o bien en el
recipiente en el que llegó al laboratorio) durante un período máximo de 18 horas en
refrigerador (a 5°C).
- Si la muestra congelada puede ser fácilmente triturada, como sucede con los
helados, no es necesario descongelarla.

c) Pese 10g, 25g. ó 50g de la muestra en el interior de una bolsa de Stomacher estéril. Si la
muestra no es homogénea, por ej. platos preparados, se deben tomar 50 g de una mezcla
de todos los componentes.
d) Añada a la bolsa de Stomacher 90, 225 o 450 mL de diluyente (siempre en una proporción
1:9). Homogenice la muestra en el Stomacher (230 rpm/1-2 minutos). De este modo
obtendrá la dilución 1:10 (10-1).
e) Prepare diluciones decimales seriada de la muestra. Para ello, traspasar 1 mL de la dilución
10-1 a un tubo que contenga 9 mL del diluyente; así obtendrá la segunda dilución (10-2).
Agitar y repetir esta operación para preparar las diluciones decimales consecutivas
necesarias (10-3, 10-4, etc.).

Importante:

- La preparación de cada dilución requiere el uso de una pipeta estéril.

- El período transcurrido entre la preparación del homogeneizado de la muestra y la siembra,
NO debe superar los 20 minutos.

III.2. - ALIMENTOS LIQUIDOS

a) Agite manual o mecánicamente la muestra para asegurar la distribución uniforme de los

microorganismos.
b) Medir 10 mL de la muestra y transferir a un frasco de boca ancha que contenga 90 mL del
diluyente apropiado. Así obtendrá la dilución 10-1.

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 c) Proseguir según técnica descrita para los alimentos no líquidos.

III.3.- ALIMENTOS QUE NECESITAN TRATAMIENTO ESPECIAL

Alimentos ácidos (pH inferior a 4,5): Jugos, néctares, yogurt, etc.

a) Mezclar 10g o mL de la muestra con 90 mL de Agua Peptonada Tampona (APT) para

tamponarla.
b) Preparar las diluciones decimales seriadas cono se ha indicado anteriormente.

Alimentos deshidratados

a) Alimentos tales como leche en polvo, gelatina, sopas, caldos, flanes, budines, huevo en
polvo, etc. requieren diluyente temperado a 45°C para facilitar su disolución o dispersión.
b) Alimentos con gran capacidad de absorción, tales como gomas, especias molidas y vegetales
deshidratados. Pesar 2 g y añadir 200 mL de diluyente (dilución 10-2). En el caso de los
vegetales deshidratados, dejar rehidratar por 30 minutos a temperatura de refrigeración y
luego agitar por 3 minutos.
c) Proseguir con las diluciones.

Alimentos grasos

a) Para homogeneizar alimentos cuyo contenido en grasa sea superior al 20%, se recomienda
agregar al diluyente 1% de Tween 80 u otro agente tensoactivo no tóxico, con el fin de
aumentar la dispersión de los glóbulos de grasa.
b) En el caso de la mantequilla o margarina, fundir la muestra bajo agitación en baño
termorregulado a 40°C por no más de 15 minutos.
c) En quesos, preparar la dilución 10-1 utilizando como diluyente una solución de citrato de
sodio al 2%. Para las siguientes diluciones usar el diluyente habitual.

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 Sesión Nº1
RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS
(RAM)

INTRODUCCIÓN

El número de microorganismos aerobios mesófilos encontrados en alimentos es uno de los

indicadores microbiológicos de calidad más utilizado. Es aplicable a todos los alimentos con ex-
cepción de los productos fermentados o madurados tales como yogurt, ciertos tipos de embutidos y
quesos.

Los resultados de este análisis permiten:

− Verificar la efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección.

− Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.
− Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de los
alimentos.
− Verificar condiciones de almacenamiento y transporte.
− Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos.
− Indicar alteración incipiente en ciertos alimentos.

I.- Procedimiento

a) Preparar diluciones de la muestra de alimento (10-1 hasta 10-3), según las indicaciones dadas
en "Preparación de las diluciones de muestras de alimentos”.
b) Depositar 1 mL (en duplicado) de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 (o mayores) en placas de
Petri previamente identificadas.
c) Vertir en cada placa de Petri aproximadamente 15 mL de Agar Plate Count, previamente
fundido y mantenido en baño de agua a 45-48°C.
d) Mezclar el inóculo con el medio fundido. La forma adecuada de llevar a cabo esta operación
sería la siguiente:

• Mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección,

• Hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj,
• Mover con movimientos de vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la
primera,
• Hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.

e) Dejar solidificar el agar a temperatura ambiente. Una vez solidificado, invierta las placas

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 rápidamente, para prevenir el crecimiento de colonias invasivas por acumulación de
humedad.
f) Incubar las placas en forma invertida a 30ºC durante 72 +2 horas o 35ºC durante 48 +2
horas.

I.2.- Recuento de colonias y registro

Luego de cumplir el período de incubación, realizar la lectura de las placas.

• Contar todas las colonias, incluyendo aquellas de tamaño muy pequeño, preferentemente en
aquellas placas que contengan entre 25 y 250 colonias.

• Registrar el número de colonias contadas en cada placa de cada una de las diluciones.

I.3.- Cálculo de resultados

El recuento total de microorganismos aerobios mesófilos se obtiene mediante la siguiente fórmula:

N=AxD

Donde N, es el recuento total de microorganismos aerobios mesófilos por gramo ó mL de producto;

A, número de colonias contadas en la placa seleccionada y; D, es el valor recíproco del factor de
dilución respectivo.

• Informe el recuento en unidades formadoras de colonias (ufc) por mililitro o gramo según
corresponda.

• Exprese los resultados con sólo un número entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la
potencia correspondiente.

Ejemplo:

240.000 ~ 2,4 x 105 ufc/g ó mL

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 Sesión Nº2
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS

INTRODUCCION

La familia Enterobacteriaceae se encuentra ampliamente distribuida en el medio ambiente (agua,

suelo y vegetación). Las especies que la integran son colonizadores normales del tracto intestinal del
hombre y animales de sangre caliente.

Son bacilos Gram negativos, aero-anaerobios facultativos, que fermentan la glucosa con o sin pro-
ducción de gas y dan negativa la prueba de oxidasa (oxidasa negativas).

Los principales géneros que conforman la familia Enterobacteriaceae son:

• Citrobacter • Klebsiella • Salmonella

• Edwarsiella • Morganella • Serratia
• Enterobacter • Proteus • Shigella
• Escherichia • Providencia • Yersinia
• Hafnia

El uso de esta familia como indicador resulta útil para detectar contaminación posterior, en aquellos
productos que han sido sometidos a algún tratamiento tecnológico, para evaluar la efectividad del
proceso, y también en aquellos alimentos en los cuales no se realiza el RAM.

La ventaja de determinar Enterobacterias es que detecta bacterias que pueden o no fermentar la

lactosa, a diferencia de la determinación de coliformes, que sólo incluye aquellas especies de esta
familia que son fermentadores de lactosa.

I.- Procedimiento

a) Preparar la muestra de alimento de acuerdo al procedimiento recomendado en "Preparación

de diluciones de muestras de alimentos”.
b) Tomar y depositar 1 mL (por duplicado) de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 (o mayores) en
placas de Petri, previamente rotuladas.
c) Verter en cada placa 15 mL de Agar VRBG previamente fundido y temperado a 44 -46°C.
d) Mezclar el inóculo con el agar siguiendo las instrucciones dadas en "RAM".
e) Una vez solidificado el agar con el inóculo añadir una segunda capa con 4 a 5 mL del mismo
agar.

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 f) Una vez solidificada la segunda capa de agar, incubar las placas invertidas a 35°C durante
24 ± 3 horas.
g) Elegir las placas que presenten entre 15 y 150 colonias. Si sólo se dispone de placas con
menos de 20 colonias, utilizar dichas placas.
− Cuente las colonias sospechosas de ser Enterobacterias (fermentadoras de glucosa).
h) Registrar como recuento presuntivo el número de colonias contadas en cada dilución y
multiplicar por el valor recíproco del factor de dilución correspondiente.

I.2.- Pruebas confirmativas

a) Sembrar por estría 5 colonias típicas en placas con Agar Nutritivo y por picadura en tubos de
medio Agar Glucosa Sal.
b) Cubrir con aceite mineral estéril el medio Agar Glucosa Sal.
c) Incubar ambos medios a 35-37ºC por 20-24 horas.
d) Realizar la Prueba de Oxidasa a las colonias desarrolladas en las placas con Agar Nutritivo.
e) Si la prueba de oxidasa resulta negativa y el Agar Glucosa Sal vira a color amarillo, con-
siderar las colonias examinadas como pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.

I.3.- Cálculos y expresión de resultados

El recuento total de Enterobacterias se obtiene mediante la siguiente fórmula:

N = A x B/C

Donde N, es el recuento total Enterobacterias por gramo ó mL de producto; A, es el recuento

presuntivo (colonias sospechosas x el valor recíproco del factor de dilución correspondiente); B, el
número de colonias confirmadas como Enterobacterias mediante la prueba de oxidasa y la
producción de ácido a partir de la glucosa y; C, el número (5) de colonias sometidas a las pruebas de
confirmación.

− Informe el recuento en unidades formadoras de colonias (ufc) por mililitro o gramo según
corresponda.

− Exprese los resultados con sólo un número entero y un decimal multiplicado por 10 elevado
a la potencia correspondiente.

Ejemplo:

2.700 ~ 2,7 x 103 ufc/g ó mL

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 Sesión Nº3
RECUENTO DE COLIFORMES, COLIFORMES FACALES (termotolerantes)
Y E. coli.

INTRODUCCIÓN

El grupo de microorganismos denominados coliformes forman parte de la familia

Enterobacteriaceae. Son bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, y que producen ácido a
partir de la glucosa y otros carbohidratos. Fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a
35°C en 48 horas. Este grupo incluye los géneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y
Enterobacter.

E. coli es una bacteria cuyo hábitat es el intestino del hombre y animales de sangre caliente y debido
a esto se ha utilizado como indicador de contaminación fecal. En la actualidad se utiliza el grupo
coliformes termotolerantes (coliformes fecales) como indicador de manipulación higiénica
inadecuada.

Los coliformes termotolerantes se define como bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos,
que fermentan la lactosa con formación de ácido y gas a 44,5°C en 24 horas. Estos microorganismos
están presentes en el intestino del hombre y animales de sangre caliente e incluye microorganismos
que pertenecen por lo menos a dos géneros: Escherichia y Klebsiella.

Tanto el grupo coliformes como coliformes termotolerantes no tienen validez taxonómica, su

definición está basada en la metodología de análisis establecida para su enumeración.

Dentro del grupo de los coliformes (o coliformes termotolerantes) Escherichia coli es el

microorganismo de mayor significado sanitario. Su recuperación se hace de acuerdo a la metodo-
logía establecida para la enumeración de coliformes. Tradicionalmente se identifica por los
resultados que da la prueba IMViC.

Para la determinación de coliformes totales y termotolerantes se utilizan 2 métodos: (i) Técnica del
Número Más Probable (NMP) y (ii) Método de Recuento en Placa.

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I.- RECUENTO DE COLIFORMES, COLIFORMES TERMOTOLERANTES Y E. coli EN
ALIMENTOS POR LA TECNICA DEL NMP.

I.1.- Prueba presuntiva

Procedimiento

a) Preparar la muestra y diluciones según procedimiento indicado en "Preparación de di-

luciones de muestras de alimentos".
b) Inocular 9 tubos de caldo LST (Caldo Lauril Sulfato Triptosa):
- 3 tubos con 1 mL de la dilución 10-1
- 3 tubos con 1 mL de la dilución 10-2
- 3 tubos con 1 mL de la dilución 10-3
c) Agitar suavemente la gradilla para mezclar.
d) Incubar a 35°C por 24 a 48 horas.
e) Observar la formación de gas en los tubos de fermentación a las 24 horas. En caso ne-
gativo incubar por 24 horas más.
− La presencia de gas significa una prueba presuntiva positiva para coliformes. Se
registra como positivo, cualquiera sea la cantidad de gas producido. Ausencia de
gas a las 48 horas significa prueba presuntiva negativa para coliformes.
f) Registrar el número de tubos positivos de cada dilución.

I.2.- Prueba confirmativa para coliformes totales y termotolerantes

Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas se transfieren a Caldo LBVB (Caldo
Lactosado Bilis Verde Brillante) para confirmar coliformes totales y a caldo EC (Caldo Escherichia
coli) para confirmar coliformes termotolerantes.

I.2.1.- Procedimiento para confirmar coliformes totales

a) Mezclar por agitación el tubo de la prueba presuntiva y transferir un inóculo con asa madera
a tubos de fermentación que contienen caldo LBVB. Se debe tener la precaución de enfriar el
asa para asegurar que se transfiere un inóculo de cultivo viable.
b) Incubar los tubos con Caldo LBVB a 35°C durante 24 a 48 horas.
c) Al término del período de incubación observar la formación de gas en los tubos de
fermentación del Caldo LBVB.
d) La presencia de gas en los tubos de fermentación de Caldo LBVB significa un test
confirmativo positivo para coliformes totales. Ausencia de gas constituye un test negativo.
e) Registrar los resultados de la prueba confirmativa.

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I.2.2.- Procedimiento para confirmar coliformes termotolerantes

a) Mezclar por agitación el tubo de la prueba presuntiva y transferir un inóculo con asa a tubos
de fermentación que contienen caldo EC temperados previamente a 44,5° C por 30 minutos
como mínimo. Se debe tener la precaución de enfriar el asa para asegurar que se transfiere
cultivo viable.
b) Los tubos de caldo EC se incuban en un baño de agua con cubierta a 44,5°C + 0,2°C por 24
horas. El nivel de agua del baño debe sobrepasar el nivel de caldo de los tubos.
c) La presencia de gas en los tubos de fermentación de caldo EC significa una prueba positiva,
la ausencia de gas constituye una prueba negativa. .
d) Registrar los resultados de la prueba confirmativa y de los cultivos control.

I.3.- Cálculo y expresión de resultados

El número de tubos positivos por dilución (10-1, 10-2 y 10-3) permite obtener una cifra compuesta de
3 dígitos Ej. 3 -2 -O, esta combinación se consulta en la tabla NMP (Anexo Nº1) y se expresa como:
− NMP = 93 coliformes totales / g o mL de muestra, o bien como
− NMP = 93 coliformes fecales / g o mL de muestra.

1.4.- Prueba confirmativa para Escherichia coli

a) De cada tubo de caldo EC que presente formación de gas en el test confirmativo de

coliformes termotolerantes, transferir un inóculo a una placa de agar EMB-Levine y sembrar
por agotamiento en superficie para obtener colonias aisladas.
b) Incubar las placas invertidas a 35°C por 18 a 24 horas. Al término del período de incubación
observar las colonias que presentan un centro oscuro con o sin brillo metálico.
c) De cada placa de agar EMB-Levine transferir 2 colonias aisladas a tubos de Agar Nutritivo o
Agar Tripticasa. Tras incubar a 35ºC durante 24 horas, realizar la prueba IMViC (Indol, Rojo
de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato).

Prueba IMViC

Producción de indol
o Inocular un tubo de caldo triptona e incubar a 35°C por 24 ± 2 horas. Al término del período
de incubación, agregar al cultivo 0,2-0,3 mL de reactivo de Kovacs.
- Prueba positiva: color rojo intenso en la superficie del medio
- Prueba negativa: color amarillo

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 Reacción Voges Proskauer
o Inocular un tubo de caldo RM-VP e incubar 48 ± 2 h. a 35°C. Transferir 1 mL de este
cultivo a otro tubo y agregar 0,6 mL de solución a naftol y 0,2 mL de solución KOH al 40%.
Agitar el tubo. Observar después de 2 horas.
- Prueba positiva: color rosado
- Prueba negativa: color café pardo

Reacción rojo de metilo

o Inocular un segundo tubo de caldo RM- VP e incubar a 35°C por 72 horas.Tras el periodo
de la incubación agregar 5 gotas de solución rojo de metilo
- Prueba positiva: color rojo
- Prueba negativa: color amarillo

Utilización de citrato
o Inocular suavemente en línea recta, un tubo de Agar Citrato Sirnmon’s. Incubar a 35°C
hasta 96 horas. Observar el cambio de color producido en el medio.
- Prueba positiva: color azul
- Prueba negativa: color verde

I.5.- Interpretación de la prueba IMViC

Todos las colonias cuyas pruebas IMViC sean compatibles con E.coli (Ver Tabla) deben ser
considerados como E. coli.

Reacciones IMViC características para E.coli

Pruebas IMViC
Indol RM VP Citrato E.coli
+ + - - Tipo I
- + - - Tipo II

I.6.- Cálculo y expresión de resultados

Calcular el NMP de Escherichia coli, basándose en el número de tubos de caldo EC en que se

confirmó su presencia.

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II.- RECUENTO DE COLIFORMES, COLIFORMES TERMOTOLERANTES Y E. coli EN
AGUA NO CLORADA POR LA TECNICA DEL NMP.

II.1.- Prueba presuntiva

− En la prueba presuntiva se utiliza CLST en tubos de fermentación.

− Previo a la inoculación, la muestra y diluciones deben agitarse vigorosamente 25 veces en 7

segundos en un arco de 45°, con movimientos de arriba a abajo para asegurar la
homogeneidad de la muestra. Este procedimiento debe repetirse antes de inocular cada serie
de diluciones.

Procedimiento

a) Inocular:
5 tubos de caldo LST doble concentración con 10 mL de la muestra en cada tubo
5 tubos de caldo LST concentación simple con 1 mL de la muestra en cada tubo
5 tubos de caldo LST concentración simple con 0,1 mL de la muestra en cada tubo.
b) Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo e incubar los
tubos a 35°C por 24 a 48 horas.
c) Observar la formación de gas en cada tubo. La presencia de gas se registra como prueba
positiva, cualquiera que sea la cantidad de gas producido. Ausencia de gas a las 48 horas
significa una prueba presuntiva negativa para coliformes.
d) Registrar el N° de tubos positivos para cada dilución.

II.2.- Prueba confirmativa para coliformes totales y fecales

Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas se transfieren a caldo LBVB para confir-
mar coliformes totales y a caldo EC para confirmar coliformes termotolertantes.

II.2.1.- Procedimiento para confirmar coliformes totales

a) Mezclar por agitación el tubo de la prueba presuntiva y transferir un inóculo con asa a tubos
de fermentación que contienen caldo LBVB. Se debe tener la precaución de enfriar el asa
para asegurar que se transfiere un inóculo de cultivo viable.
b) Incubar los tubos con caldo LBVB a 35°C durante 24 a 48 horas.
c) Al término del período de incubación observar la formación de gas en los tubos de
fermentación de caldo LBVB.
d) La presencia de gas en los tubos de fermentación de caldo LBVB significa una prueba

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 confirmativa positiva para coliformes totales. Ausencia de gas constituye una prueba
negativa.
e) Registrar los resultados de la prueba confirmativa.

II.2.2.- Procedimiento para confirmar coliformes fecales

a) Mezclar por agitación el tubo de la prueba presuntiva y transferir un inóculo con asa a tubos
de fermentación que contienen caldo EC temperados previamente a 44,5°C por mínimo 30
minutos. Enfriar el asa para asegurar que se transfiere un inóculo de cultivo viable.
b) Incubar los tubos en un baño de agua con cubierta a 44,5°C por 24 horas El nivel de agua del
baño debe sobrepasar el nivel de caldo de los tubos.
c) Al término del período de incubación observar la formación de gas en los tubos.
d) La presencia de gas significa una prueba confirmativa para coliformes termotolerantes.
Ausencia de gas significa una prueba negativa para coliformes termotolerantes.
e) Registrar los resultados de las pruebas confirmativas y de los controles.

II.3.- Cálculo y expresión de resultados

La combinación de tubos positivos y/o negativos de las pruebas confirmativas es referida a la tabla
NMP para serie de 5 tubos (Anexo Nº3) y se expresa como:

− NMP de coliformes totales por 100 mL de muestra

− NMP de coliformes termotolerantes por 100 mL de muestra

III.- RECUENTO DE COLIFORMES, COLIFORMES TERMOTOLERANTES Y E. coli

EN ALIMENTOS POR MÉTODO EN PLACA.

III.1.- Prueba presuntiva

a) Preparar la muestra de alimento de acuerdo al procedimiento recomendado en "Preparación

de diluciones de muestras de alimentos".
a) Depositar 1 mL (en duplicado) de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 (o mayores) en placas de
Petri previamente identificadas.
b) Verter en cada placa 15 mL de Agar VRBL (Rojo Neutro Cristal Violeta Lactosa) temperado
a 48°C.
c) Mover la placa con movimientos rotatorios para mezclar la muestra y el medio, según
técnica descrita en RAM.
d) Una vez solidificado el agar, agregar aproximadamente 5 mL del mismo agar para formar

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 una capa superficial.
e) Dejar solidificar e incubar las placas invertidas a 35°C durante 48 horas.
f) Seleccionar la dilución cuyas placas contengan entre 25 y 250 colonias. Contar las colonias
sospechosas tanto típicas como atípicas.
− Colonias típicas: Color rojo intenso, con precipitado (lactosa positiva).
− Colonias atípicas: Color rosado, amarillentas o café claro con o sin precipitado.
g) Registrar el recuento presuntivo, multiplicando el número de colonias por el valor recíproco
de la dilución correspondiente.

III.2. Pruebas confirmativas para coliformes totales y fecales

Procedimiento

a) Seleccionar 5 colonias sospechosas e inocular cada colonia en un tubo de fermentación, que

contiene caldo EC e inocular la misma colonia en un tubo de fermentación que contiene
caldo LBVB. Tener la precaución de inocular primero el caldo EC y luego el LBVB.
b) Incubar los tubos de caldo EC en baño de agua a 44,5°C durante 24 horas y observar la
formación de gas. Registrar como prueba positiva la presencia de gas y como negativa, la
ausencia de gas.
c) Incubar los tubos de caldo LBVB a 35°C durante 48 horas. Al término del período de
incubación observar la formación de gas.
d) Registrar como prueba positiva aquellos tubos que presentan gas. La ausencia de gas se
considera prueba negativa.
e) Registrar los resultados del test confirmativo.

III.2.1.- Cálculo y expresión de resultados

Coliformes totales

Cuando todas las colonias sometidas a confirmación dan un resultado positivo, significa que el
recuento presuntivo fue confirmado. Si sólo algunas colonias resultan positivas, es necesario cal-
cular el recuento de coliformes totales utilizando la siguiente fórmula:

N = A x B/C

Donde N, es el recuento de coliformes totales por gramo ó mL de producto; A, es el recuento

presuntivo (colonias sospechosas x el valor recíproco de la respectiva dilución); B, el número de
colonias confirmadas como coliformes en CLBVB y; C, el número (5) de colonias sometidas a
confirmación.

17
• El resultado se expresa en ufc de coliformes totales por g ó mL de alimento.

• Exprese los resultados con sólo un número entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la
potencia correspondiente.

Ejemplo:

2.30 ~ 2,3 x 102 ufc/g ó mL

Coliformes termotolerantes

Cuando todas las colonias sometidas a confirmación dan un resultado positivo, significa que el
recuento presuntivo fue confirmado. Si sólo algunas colonias resultan positivas, es necesario cal-
cular el recuento de coliformes termotolerantes utilizando la siguiente fórmula:

N = A x B/C

Donde N, es el recuento de coliformes termotolerantes por gramo ó mL de producto; A, es el

recuento presuntivo (colonias sospechosas x el valor recíproco de la respectiva dilución); B, el
número de colonias confirmadas como coliformes termotolerantes en caldo E.C y; C, el número (5)
de colonias sometidas a confirmación.

El resultado se expresa de la misma forma que para coliformes totales.

III.3.- Prueba confirmativa para Escherichia coli

a) De cada tubo de caldo EC que presente formación de gas en el test confirmativo de

coliformes termotolerantes, transferir un inóculo a una placa de agar EMB-Levine y sembrar
por agotamiento en superficie para obtener colonias aisladas.
b) Incubar las placas invertidas a 35°C por 18 a 24 horas. Al término del período de incubación
observar las colonias que presentan un centro oscuro con o sin brillo metálico.
c) De cada placa de agar EMB-Levine transferir 2 colonias aisladas a tubos de Agar Nutritivo o
Agar Tripticasa. Tras incubar a 35ºC durante 24 horas, realizar la prueba IMViC (Indol, Rojo
de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato).

Cálculo y expresión de resultados

Cuando todas las colonias sometidas a confirmación dan un resultado positivo, significa que el

18
recuento presuntivo fue confirmado. Si sólo algunas colonias resultan positivas, es necesario cal-
cular el recuento de Escherichia coli utilizando la siguiente fórmula:

N = A x B/C

Donde N, es el recuento de Escherichia coli por gramo ó mL de producto; A, es el recuento

presuntivo (colonias sospechosas x el valor recíproco de la respectiva dilución); B, el número de
colonias confirmadas como Escherichia coli a través de la prueba IMViC y; C, el número (5) de
colonias sometidas a confirmación.

El resultado se expresa de la misma forma que para coliformes totales y termotolerantes.

19
 Sesión Nº4
RECUENTO DE Lactobacillus

INTRODUCCION

Las especies del género Lactobacillus son bacilos Gram positivos, inmóviles, salvo raras
excepciones. Aunque son anaerobios facultativos crecen mejor en microaerofilia (en atmósfera
enriquecida con 5% de CO2). Son exigentes en relación a sus necesidades nutricionales. No poseen
citocromos, por lo tanto son catalasa negativos.

Su metabolismo energético es exclusivamente fermentativo y su crecimiento se acompaña de una

fuerte acidificación que favorece su pH óptimo de desarrollo, alrededor de 5,5 para la mayoría de las
especies.

Son alterantes frecuentes de carnes almacenadas al vacío o en atmósferas modificadas y frutas

mínimamente procesadas.

I. - RECUENTO DE Lactobacillus

I.1.- Procedimiento

a) Preparar la muestra de alimento de acuerdo al procedimiento recomendado en "Preparación

de diluciones de muestras de alimentos".
b) Depositar 1 mL (en duplicado) de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 (o mayores) en placas de
Petri previamente identificadas.
c) Verter en cada placa 15 mL de agar MRS previamente fundido y temperado a 44- 46°
d) Mezclar el inóculo con el agar siguiendo las instrucciones dadas en " RAM".
e) Una vez solidificado el agar con el inóculo, añadir una segunda capa con 5 mL del mismo
agar. Dejar solidificar.
f) Colocar las placas en forma invertida dentro de una jara de anaerobiosis junto con un sobre
generador de CO2 (Anaerocult C, Merck). Cerrar herméticamente la jarra.
g) Incubar a 35°C durante 48 a 96 horas.
h) Registrar como recuento presuntivo la suma del número de colonias con forma lenticular
obtenidas en cada dilución y multiplicar por el valor recíproco de la dilución.

I.2.- Pruebas de confirmación

a) Confirmar 5 colonias por placa mediante tinción de Gram (bacilos Gram positivos) y prueba

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 de la catalasa (catalasa negativa).

I.3.- Cálculo y expresión de resultados

El recuento total de Lactobacillus se obtiene mediante la siguiente fórmula:

N = A x B/C

Donde N, es el recuento total Lactobacillus por gramo ó mL de producto; A, es el recuento

presuntivo (colonias sospechosas x el valor recíproco de la respectiva dilución); B, el número de
colonias confirmadas como Lactobacillus (Gram positivas y catalasa negativas) y; C, el número (5)
de colonias sometidas a la prueba confirmativa.

El resultado se expresa en ufc de Lactobacillus por g ó mL de alimento.

• Exprese los resultados con sólo un número entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la
potencia correspondiente.

Ejemplo:

2.30 ~ 2,3 x 102 ufc/g ó mL

21
 Sesión Nº5
RECUENTO DE Staphylococcus aureus

INTRODUCCION

Staphylococcus aureus pertenece a la familia Staphylococcaceae. Es una bacteria inmóvil, Gram

positiva, esférica y usualmente agrupada en racimos, aero-anaerobia facultativa, catalasa positiva.
Produce generalmente la enzima coagulasa, fermenta el manitol y otros azúcares formando ácido
pero no gas. El crecimiento ocurre en un amplio rango de temperatura (6,5 a 50°C), siendo el óptimo
30-40°C. Tolera concentraciones altas de cloruro de sodio y es capaz de desarrollarse aeróbicamente
en alimentos con bajo aw (0.86).

Staphylococcus aureus es un microorganismo que se destruye fácilmente con altas temperaturas y

por casi todos los agentes desinfectantes, por lo cual la presencia de esta bacteria en alimentos pro-
cesados o en equipos, generalmente indica higiene deficiente o contaminación post proceso de ori-
gen humano.

El crecimiento de S. aureus en alimentos presenta un riesgo en salud pública debido a que algunas
cepas producen enterotoxinas termoestables (A, B, C1, C2, C3, D Y E), las cuales causan intoxica-
ción alimentaria de alta incidencia.

Los síntomas más característicos de esta intoxicación son: vómito, náuseas, diarrea y el período de
incubación es de 1 a 6 horas.

Los alimentos comúnmente asociados a intoxicaciones son: lácteos, productos de pastelería

especialmente con crema, carnes y productos cárneos, etc.

I.- RECUENTO DE Staphylococcus aureus POR EL MÉTODO EN PLACAS

I.1.- Procedimiento

a) Preparar la muestra según procedimiento indicado en "Preparación de diluciones de muestras

de alimentos".
b) Depositar 0.1 mL (en duplicado) de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 (o mayores) sobre la
superficie de Baird-Parker.
c) Extender el inóculo mediante rastrillo estéril en toda la superficie del agar.
d) Incubar a 35°C durante 48 horas.
e) Realizar recuento de todas las colonias de color negro o gris oscuro, brillantes, convexas, de

22
 2-3 mm de diámetro, de consistencia cremosa y que presenten una o más de las siguientes
características:
− Discreta zona de precipitado debajo de la colonia.
− Una zona clara o halo alrededor de la colonia, con una zona de precipitado debajo de ella.
− Una zona clara o halo alrededor de la colonia, sin precipitado.
f) Registrar como recuento presuntivo la suma del número de colonias típicas de S aureus
obtenidas en cada dilución y multiplicar por el valor recíproco de la dilución respectiva.

I.2.- Pruebas de confirmación

Prueba de la coagulasa

a) Repicar 5 colonias típicas y sembrar en caldo cerebro corazón.

b) Incubar a 35°C durante 20 - 24 horas.
c) Traspasar 0,1 mL de cultivo a un tubo con 0,3 mL de plasma de conejo.
d) Incubar a 35°C y examinar periódicamente por un lapso de 6 horas para observar la for-
mación de coágulo. Solamente un coágulo firme y completo que permanece en su lugar al
agitar o invertir el tubo, es considerado positivo para S. aureus.

Prueba de aglutinación de partículas de látex

Esta prueba reemplaza puede reemplazar a la prueba de la coagulasa

a) Repicar 5 colonias típicas y sembrar mediante estrías en una placa con Agar Tripticasa
b) Incubar a 35°C durante 20 - 24 horas.
c) Confirmar mediante la prueba de aglutinación de partículas de látex: Staphytect Plus Latex
Agglutination Kit (Oxoid)
d) Las colonias que origen una reacción de precipitación serán consideradas como
Staphylococcus aureus.

I.3.- Cálculo y expresión de resultados

El recuento total de Staphylococus aureus se obtiene mediante la siguiente fórmula:

N = A x B/C

Donde N, es el recuento total S. aureus por gramo o mL de producto; A, es el recuento presuntivo

(colonias sospechosas x el valor recíproco de la respectiva dilución); B, el número de colonias
confirmadas como S. aureus mediante la prueba de coagulas o aglutinación y; C, el número (5) de
colonias sometidas a la prueba confirmativa.

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El resultado se expresa en ufc de S. aureus por g ó mL de alimento.

• Exprese los resultados con sólo un número entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la
potencia correspondiente.

Ejemplo:

27.000 ~ 2,7 x 104 ufc/g ó mL

II.- RECUENTO DE S. aureus MEDIANTE LA TÉCNICA DEL NMP

El método de NMP es recomendado para rutina en productos en los cuales se presume que:

− El número de S. aureus es bajo,

− Contengan una gran población de especies competitivas,
− Hayan sido sometidos a tratamientos drásticos que impliquen daño celular.

II.1.- Procedimiento

a) Preparar la muestra según procedimiento indicado en “Preparación de las diluciones de

muestras de alimentos”.
b) Inocular 9 tubos de Caldo Tripticasa suplementado con 10% de NaCl y 1 % de Piruvato
de Sodio:
− 3 tubos con 1 mL de la dilución 10-1
− 3 tubos con 1 mL de la dilución 10-2
− 3 tubos con 1 mL de la dilución 10-3

c) Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo.

d) Incubar a 35°C por 48 horas.
e) Registrar como positivos todos aquellos tubos que presentan turbidez.
f) De cada uno de los tubos positivos sembrar por agotamiento en estrías sobre la superficie
de placas de Agar Baird- Parker, previamente secas.
g) Incubar a 35°C por 48 horas.
h) Repicar a caldo cerebro corazón o agar Tripticasa una o más colonias características
provenientes de cada dilución.

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 i) Incubar a 35°C por 18 - 24 horas.
j) Realizar las pruebas de confirmación (Coagulasa o Staphytect Plus Latex Agglutination
Kit)
k) Registrar los resultados.
l) Considerar como positivo el tubo en que se confirma al menos una colonia.

II.2.- Cálculo y expresión de resultados

Consultar la tabla NMP (Anexo Nº1) y calcular como se indica en NMP de coliformes. El resultado
se expresa como NMP de S. aureus por g ó mL de muestra.

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