ANALISIS INSTRUMENTAL

Cromatografía
HPLC

2017-2018
 Espectroscopia Ultravioleta visible (UV-Vis)

Electrones implicados
1. Electrones p, s y n en moléculas orgánicas
2. Electrones d y f en metales de transición
3. Electrones de transferencia de carga en complejos
metálicos
 Absorción: Ley de Lambert Beer
La ley de Lambert – Beer establece una relación entre la
transmisión de la luz y la concentración de la sustancia

A: Absorbancia (adimensional)
l : longitud de la celda (cm)
https://www.youtube.com/
C : concentración (M)
watch?v=ILeKva55dWY E: coeficiente de absorción molar (M-1cm-1)
Componentes de un espectrofotómetro
 Cromatografía
La cromatografía se define como la separación de una
mezcla de dos o mas compuestos por distribución entre
dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una
fase móvil.

Todos los sólidos finamente pulverizados tienen el

poder de adsorber en mayor o menor grado otras
sustancias sobre su superficie y similarmente, todas las
sustancias pueden ser adsorbidas, unas con más
facilidad que otras. Este fenómeno de adsorción
selectiva es el principio fundamental de la
cromatografía.
 Cromatografía
Eter Cromatografía

Colores
Clorofila

CaCO3

Tswett
 Fase Móvil – Fase Estacionaria

La afinidad con la fase

móvil y la fase estacionaria
Fase varía con el soluto.
Móvil
Fuerte Débil
La separación ocurre
debido a la diferencia en la
Fase velocidad de movimiento
Estacionaria y esto depende de la
naturaleza química de la
FM y FE
 Cromatografía en capa fina (TLC)
La fase estacionaria es una placa de vidrio o aluminio
recubierta con material adsorbente, el mas común la
silica gel.
La fase móvil puede ser: éter de petróleo, tolueno,
diclorometano, acetato de etilo, ciclohexano,etc

https://www.youtube.com/watch?v=4IyGp6tqFqA
Cromatografía en capa fina
 Cromatografía en columna

Columna
solvente solvente
(fase móvil) (fase móvil)
y muestra y muestra
separada

Empaque de silica gel

recubierto

https://www.youtube.com/watch?v=WO0OsxaPYs8
&list=UUAi08vpGsxeDRb20qu2EnRw&index=21
Cromatografía en columna – Cromatografía plana

Columna de separación

Superficie
recubierta

Material de
empaque

Tres dimensiones Dos dimensiones

 Polaridad de las sustancias
La polaridad es una propiedad de las moléculas de tener
polos positivos y negativos debido a la posición de los
electrones

La miscibilidad de los solventes, depende de la polaridad.

Lo polar disuelve a lo polar
 Polaridad de las sustancias

• Grupos funcionales • Grupos funcionales

no polares polares
– -(CH2)nCH3 – -COOH
• Grupos alquil • Grupos carboxil
– -NH2
– -C6H5
• Grupos amino
• Grupos fenil
– -OH
• Grupos hidroxil

Hidrofóbico Hidrofílicos
 Tipos de cromatografía
Según la naturaleza de la fase móvil y de la fase
estacionaria, la cromatografía puede ser normal o
inversa
 HPLC

H igh
Performance
L iquid
C hromatography
HPLC

Fase Móvil (FM)

Bomba

Inyector
Horno de la
columna (FE)
Detector
 Cromatografía líquida de fase reversa

• Fase estacionaría: Baja polaridad

– Silica gel recubierta con grupos octadecil silanos
(ODS – C18) u octil silanos (C8)

• Fase móvil: Alta polaridad

– Agua, metanol, acetonitrilo
– Buffers para mantener el pH
 Fase estacionaria
Silica Gel Silica Gel Derivatizada

R = C18H37

Superficie Polar Superficie no polar

Fase normal Fase Reversa
 Fase estacionaria
3 mm

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2

Si -O-Si
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

C18 (ODS)
 Fase móvil
• Agua • Solventes orgánicos
– Agua ultrapura – Solventes grado HPLC
– Agua destilada para HPLC

Filtro membrane
0.45 µm

Ultrasonic
cleaning unit
 HPLC
Injector
La separación esta
basada en la diferencia
de migración entre la
Pumps
fase móvil y la fase
estacionaria.
Columna

Detector

Residuo
Solventes
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

22
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents

33
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 HPLC
Injector Chromatogram

Mixer mAU

Pumps

Start Injection time

Column

Detector

Solvents
 Aplicaciones del HPLC
• Proteínas
• Péptidos
• Poliestirenos
• Barbituricos
• Corticoides
• Antidepresivos
• HC poliaromáticos
• Iones inorgánicos
• Herbicidas
• Lípidos
• Antioxidantes
• Azucares
• Aminoácidos
• Vitaminas
 Cromatograma
to – tiempo muerto
tR- tiempo de retención

tR

tR Area o altura
proporcional a la
mAU cantidad de
analito
to

Injección tiempo
Relación entre el tiempo de retención y
la polaridad

C18 (ODS) OH

Débil
Fuerte
CH3
 Parámetros Cromatográficos
Métodos para expresar el desempeño de la columna y
la separación de los analitos
 Factor de retención (k)

tR t R  t0
k
t0
mAu

t0
tR: tiempo de retención
t0: tiempo muerto

Tiempo
Número de platos teóricos (N)

2
tR
N  16
W
2
tR
 5.54
H W1/ 2
W1/2
tR • H
2
H1/2  2p
Area
W
Número de platos teóricos (N)

N: Grande
2
tR
N  16
N: Pequeño W
2
tR
 5.54
W1/ 2
N: Pequeño
N: Grande
tR • H
2
 2p
Area
 Resolución (Rs)

tR1 tR2

t R 2  t R1
RS 
1
(W1  W2 )
2
t R 2  t R1
 1.18 
W1/ 2 h ,1  W1/ 2 h , 2
W1/2h,1 W1/2h,2 h1/2

W1 W2