UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CEDERJ – Polo São Gonçalo

QUÍMICA VI

Dosagem de Proteínas Pelo Método do Biureto

31/08/2013

WALACE DE SOUZA CARVALHO

Mat: 102.140.700-12
CURSO: LICENCIATURA EM QUÍMICA
TUTOR: LUCIANA FACCHINETTI DE CASTRO
I) INTRODUÇÃO:
Proteínas são compostos poliméricos complexos com alto peso molecular(PM). Podem ser formadas
apenas por cadeias de aminoácidos ou constituídas por aminoácidos (parte proteica) conjugados com
outras classes de compostos como lipídios, ácidos nucleicos, carboidratos, grupo inorgânico, entre
outros (SANTANA, 2012).

Por serem formadas por aminoácidos e considerando-se que os aminoácidos aromáticos absorvem luz
na região ultravioleta, as proteínas, em geral, podem ser detectadas através da absorção de luz a 270
nm. No entanto, a detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas com
determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível,
permitindo a sua quantificação. Dentre os métodos utilizados, situa-se o método do biureto, que é
baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com proteínas e
peptídeos (no mínimo tripeptídeos) (IB/UFF, 2013). As ligações peptídicas das proteínas (-CONH-)
reagem com os íons cúpricos, em meio alcalino, formando um complexo de coloração violeta que é
proporcional ao teor das Proteínas no meio (BIOCLIN, 2013).

O nome do método provém do fato de que a uréia aquecida a 180°C dará reação positiva com
desprendimento de amônia (SOUSA, et al 2013):

O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de proteínas totais em
diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguíneo, líquido cérebro-espinhal, urina, alimentos,
saliva, fibrinogênio e tecido animal. O método de biureto tem sido, também, utilizado em análise por
injeção em fluxo, assim como em alguns métodos cinéticos. Apesar de ser rápido, utilizar reagentes
de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas,
este método não é muito sensível, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em grande
desvantagem, em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído
por métodos mais sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto continua sendo recomendado para a
determinação da concentração de proteínas totais em plasma sanguíneo pela Associação Americana
de Análises Clínicas e por diversos autores, bem como para a determinação de proteínas totais em
saliva e leite, quando comparado com outros métodos

II ) RESULTADOS E DISCUSSÃO

A pratica de fundamenta no fato de que a reação do biureto pode ser utilizada para demonstrar
a presença de proteínas em materiais biológicos, como também para quantificá-las, uma vez que
o complexo Cu-proteínas apresenta um absorção máxima a 550nm, a intensidade da cor
depende exclusivamente da concentração de proteína, já que as ligações peptídicas aparecem
com frequência por grama do material analisado.

Apesar de não ser um teste muito sensível (1 a 10mg de proteína), a reação do Biureto é
largamente utilizada em dosagens rotineiras, pois está menos sujeita a interferência de
contaminantes normalmente presentes nas amostras biológicas.

Cu2+
OH-

Cadeia Polipeptídica Complexo Azul-arroxeado

O experimento tem por objetivo, a dosagem de proteínas por espectrofotometria na faixa do

visível, determinar a concentração de uma solução problema.

Para isso foram utilizados: Uma solução padrão de caseína (10 mg/mL), a solução problema
de caseína (10 a 50mg/mL), reagente de Biureto e espectrofotômetro.

Utilizando 6 tubos de ensaio, foram preparadas soluções conforme a tabela abaixo, e as mesmas
foram postas para reagir no escuro por 30 minutos; passado esse tempo foram lidas as
absorbâncias, tal qual consta na tabela abaixo:
 Solução de H2O Reagente do Abs [Concentração]
TUBO Caseína (mL) (mL) Biureto (mL) (550nm) (mg/mL)
Branco 0 1,0 4,0 0 0
1 0,2 0,8 4,0 0,149 2,0
2 0,4 0,6 4,0 0,152 4,0
3 0,6 ,4 4,0 0,230 6,0
4 0,8 0,2 4,0 0,313 8,0
5 1,0 0 4,0 0,374 10,0
A concentração de Caseina em cada tudo é feita a partir da seguinte relação:

C1V1=C2V2

Para o tubo 1 tem-se que 0,2x10 = 1,0xC 2 -> C2=2,0 mg/mL

Para os demais tubos os cálculos são feitos da mesma forma, utilizando-se dos seus valores
respectivos valores.

Construção da curva padrão de proteínas

Com os dados da tabela acima, foi traçada uma curva de Absorbância x concentração, sendo que foi
removido o ponto referente ao tubo 1, devido ao fato de ter havido um erro na medida do volume de
caseína adicionado a este tubo, o que ocasionou um valor de absorbância muito elevado, e que
poderia comprometer o resultado final da análise.

A curva padrão acima possui relação definida pela equação y = 0,038x + 0,0008 e um R² = 0,9991

onde “y” representa absorbância e “x” a concentração da substancia.

  Cálculo do coeficiente angular.

K =abs = 0,152 + 0,230 + 0,313 + 0,374 = 0,0437

caseína 4,0 + 6,0 + 8,0

 Calculo do fator linear (f)

K=[caseína] = 4,0 + 6,0 + 8,0 = 22,86

abs 0,152 + 0,230 + 0,313 + 0,374

O limite se sensibilidade do método para a aparelhagem utilizada, são extremos dos

valores de absorbância medidos a 550nm (0,152 e 0,374), a concentração de Caseína está
associada a um valor de absorbância nessa faixa, o que é definido pela equação da reta
apresentada anteriormente y = 0,038x + 0,0006

Determinação da concentração de uma solução problema

Utilizando a curva padrão obtida, os mesmos reagentes e o espectrofotômetro, dever-se-ia

determinar a concentração de uma amostra de caseína com concentração desconhecida, porém era
sabido que sua concentração estava na faixa de 10 a 50 mg/mL.

Para isso, foram propostas 3 diluições na referida amostra (1:2, 1:6 e 1:10)

Diluição 1:2

C1V1=C2V2 Diluição 1:6 Diluição 1:10

10 x 1 = 2 x C2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2
C2 ~5,0mg/mL 10 x 1 = 6 x C2 10 x 1 = 9 x C2
C2 ~1,66 mg/mL C2 ~ 1mg/mL
E a cada uma das diluições acima, foi adicionada 4mL de biureto e este tubo foi posto para reagir
no escuro por 30 minutos, e passado esse período, foram medidas as absorbâncias dos mesmos,
resultando na tabela abaixo:

Protocolo de dosagem da solução problema diluída.

 Solução de H2O Reagente do Abs [Concentração] Fator de
TUBO Caseína (mL) (mL) Biureto (mL) (550nm) (mg/mL) Diluição
Branco 0 1,0 4,0 0 0 0
1 1,0 2,0 4,0 0,530 5,0 1:2
2 1,0 5,0 4,0 0,244 1,66 1:6
3 1,0 9,0 4,0 0,125 1,0 1:10

Calculo da concentração da solução problema

O calcula para concentração da solução problema, se faz através da curva padrão (y =

0,038x + 0,0006) obtida anteriormente, substituindo os valores de absorbância pelos medidos na
tabela acima, sendo assim:

Concentração no tubo 01

No tubo 01 a absorbância possui um valou de 0,530nm, esse valor se encontra acima do

limite de sensibilidade do método utilizado (0,152 a 0,374), a concentração nesse caso não é confiável
pois está fora da escala de reprodutibilidade da curva padrão.

Concentração no tubo 02

y = 0,038x + 0,0006

0,244=0,038x + 0,0006

X ~ 6,40 mg/mL

Como esta solução se encontra diluída em 6x, sua real concentração é 6,40 x 6 = 38,4 mg/mL

Concentração no tubo 03

y = 0,038x + 0,0006

0,125 = 0,038x + 0,0006

X ~ 3,27 mg/mL

Como esta solução se encontra diluída em 10x, sua real concentração é 3,27 x 10 = 32,7 mg/mL

III ) CONCLUSÃO
 A análise dos dados mostra que o método do Biureto é muito eficaz para de determinar a
presença de aminoácidos nos alimentos e consequentemente proteínas, este método também
possui a vantagem de ser rápido e se utilizar de reagentes de baixo custo, além do fato de não
apresentar grande variação de absortividade especifica para diferentes proteínas, sendo sua
grande desvantagem para com os outros métodos de análise, estar no fato de ele não ser muito
sensível, mesmo assim, o método do biureto é muito indicado para determinação de proteínas em
meios biológicos.

IV )REFERÊNCIAS:

 LEHNINGHER, Arthur. et al. Princípios de Bioquímica. 2 ed. São Paulo: Sarvier Editora,
1995.

 http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914.pdf - Determinação De Proteínas Totais Via

Espectrometria: Vantagens E Desvantagens Dos Métodos Existentes . Acessado dia 05/09/2013