Informe N°3 Reacciones de precipitación de proteínas

1.0.- INTRODUCCIÓN

La desnaturalización proteica puede definirse como cualquier modificación de

su conformación a nivel de la estructura secundaria, terciara y cuaternaria que
no vaya acompañada por la ruptura de los enlaces peptídicos implicados en la
estructura primaria, dando lugar a cambios en las propiedades químicas,
físicas y biológicas. Durante la desnaturalización las moléculas plegadas y
enrolladas de las proteínas, se desdoblan e interaccionan entre sí, con el agua o
iones pequeños, dependiendo que tipo de interacción predomine, la proteína se
solubilizará o se volverá insoluble, dando lugar a la formación de agregados o
geles. Esto puede ocurrir a diferentes velocidades, dependiendo de las
características de cada proteína y de los efectos de los agentes
desnaturalizantes sobre las mismas. Puede ocurrir por acción del calor,
congelación, fuerzas mecánicas, agentes químicos tales como sales, ácidos,
bases, metales, solventes orgánicos, etc.

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2.0.- PARTE TEORICA

2.1.- Los prótidos o proteínas:

Son biopolímeros, es decir, están constituidas por gran número de unidades

estructurales simples repetitivas (monómeros). Debido a su gran tamaño,
cuando estas moléculas se dispersan en un disolvente adecuado, forman
siempre dispersiones coloidales, con características que las diferencian de las
disoluciones de moléculas más pequeñas. Por hidrólisis, las moléculas de
proteína se escinden en numerosos compuestos relativamente simples, de masa
pequeña, que son las unidades fundamentales constituyentes de la
macromolécula. Estas unidades son los aminoácidos, de los cuales existen
veinte especies diferentes y que se unen entre sí mediante enlaces peptídicos.
Cientos y miles de estos aminoácidos pueden participar en la formación de la
gran molécula polimérica de una proteína. Todas las proteínas tienen carbono,
hidrógeno, oxígeno y nitrógeno y casi todas poseen también azufre.
Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la
actividad de este tipo de moléculas. Bastan algunos ejemplos para dar idea de
la variedad y trascendencia de las funciones que desempeñan. Son proteínas:

 Casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en organismos

vivientes;
 Muchas hormonas, reguladores de actividades celulares;
 La hemoglobina y otras moléculas con funciones de transporte en la sangre;
 Los anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra
infecciones o agentes extraños;
 Los receptores de las células, a los cuales se fijan moléculas capaces de
desencadenar una respuesta determinada;
 La actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del músculo
durante la contracción;
 El colágeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de sostén.

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2.2.- Desnaturalización de proteínas:

Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el

disolvente, se dice que presenta una estructura nativa (Figura inferior). Se
llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de
orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena
polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura
tridimensional fija.

Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente

disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la
desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las
cargas eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno
facilitará la agregación intermolecular y provocará la precipitación. La
precipitación suele ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización y
se dice entonces que la proteína se encuentra desnaturalizada (Figura
superior).

En una proteína cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan sólo

tienen en común la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la
componen. Los demás niveles de organización estructural desaparecen en la
estructura desnaturalizada.
La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:
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 Cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la

viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión
 Una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos
del interior aparecen en la superficie
 Pérdida de las propiedades biológicas

Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura primaria.

Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalización es reversible ya que es
la estructura primaria la que contiene la información necesaria y suficiente
para adoptar niveles superiores de estructuración. El proceso mediante el cual
la proteína desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama
renaturalización. Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de
aislamiento y purificación de proteínas, ya que no todas la proteínas reaccionan
de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. En
algunos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad,
con lo que la proteína precipita. La formación de agregados fuertemente
hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso sea irreversible.
Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman
agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos
(detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). Como en algunos casos
el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar
proteínas de manera selectiva mediante cambios en:

 la polaridad del disolvente

 la fuerza iónica
 el pH
 la temperatura

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2.3.- Desnaturalización por salación (salting-out):

A concentraciones salinas altas superiores a 1 M la solubilidad de las proteínas

decrece debido a que gran parte del agua presente en el medio se fija a los iones
salinos, lo que determina la deshidratación de las proteínas y puede haber
precipitación. Esto se debe a que las interacciones proteína–proteína resultan
más importantes que las interacciones proteína – agua y esto puede conducir a
una agregación seguida de precipitación. La acción precipitante de las sales
viene dada por la serie de Hofmeister donde los iones de la izquierda tienen
mayor efecto precipitante.

𝑆𝑂42− < 𝐹 − < 𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂− < 𝐶𝑙 − < 𝐵𝑟 − < 𝑁𝑂3− < 𝐼 − < 𝐶𝑙𝑂4− < 𝑆𝐶𝑁 −
𝑁𝐻4+ < 𝐾 + < 𝑁𝑎+ < 𝐿𝑖 + < 𝑀𝑔2+ < 𝐶𝑎2+

Las sales más empleadas para producir este efecto son las de sulfato de amonio
y sulfato de sodio.

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3.0.- DETALLES EXPERIMENTALES

3.1.- MATERIALES Y REACTIOS

MATERIALES:

 Tubos de ensayo.
 Vasos de Precipitado.
 Probetas.
 Algodón
 Bagueta.
 Cocinilla Eléctrica.

REACTIVOS:

 Sulfato de Amonio
 Ácido Acético (1%, 10% y concentrado)
 Cloruro de Sodio (saturado)
 Hidróxido de Sodio (10%)
 Ácido Nítrico (concentrado)
 Ácido Sulfúrico (concentrado)
 Ácido Tricloroacético (5%)
 Ácido Sulfosalicílico (20%)
 Sulfato de Cobre (5%)
 Acetato de Plomo (5%)
 Nitrato de plata (2%)
 Ácido Clorhídrico (5%)

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3.2.- PROCEDIMIENTO

A) Sedimentación de proteínas con sulfato de amonio

Curso de la determinación:

En un tubo de ensayo colocan 1,5ml de solución proteica de huevo

(ovoalbúmina), y agregar un volumen igual de solución saturada de sulfato de
amonio y suavemente agitar la mezcla. Observar el sedimento de la
precipitación de las globulinas. Luego filtrar el líquido a través de un papel
filtro.

Solución libre de
globulinas por
precipitación con
Partículas de Filtración (NH4)2SO4 saturado.
Globulinas dispersas.

A una parte del filtrado transparente (solución libre de globulinas) se calienta

hasta ebullición y observar la coagulación de la ovoalbúmina que se encuentra
en la solución (tubo N°1). A otro tubo con parte de la solución transparente se
agrega, con agitación, un exceso de sulfato de amonio en polvo hasta la
interrupción de su disolución (tubo N°2).

N°1 N°2

Turbidez o copos de
ovoalbúmina que
Coagulación de la
precipitan por el
ovoalbúmina por acción del
aumento de la fuerza
calor, un proceso de
iónica del agua.
desnaturalización
irreversible.

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Resultados:
En un inicio la proteína ovoalbúmina se encuentra hidratada y cargada
(estable), pero a altas concentraciones de sulfato de amonio, los iones que están
hidratados producen la destrucción de la capa acuosa de la proteína y se quita
la carga de la proteína que se adsorbió en ella. Como resultado de estos dos
procesos la solución proteica pierde estabilidad y precipitan por aglomeración
de proteínas.

B) Coagulación de proteínas por calentamiento

Curso de la determinación:
En cinco tubos de ensayo se colocan 2ml de la solución de ovoalbúmina
preparada; al tubo N°1 se procede a calentar. Al tubo N°2 se agrega una gota
de ácido acético al 1% y calentar. Al tubo N°3 se agrega 0,5ml de ácido acético
al 10% y calentar. Al tubo N°4 se agrega 0,5ml de ácido acético al 10% y unas
gotas de solución saturada de cloruro de sodio y calentar. Al tubo N°5 se añade
0,5ml de solución de hidróxido de sodio y lo calientan.

Tubo N°1 Tubo N°2 Tubo N°3

Tubo N°4 Tubo N°5

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Resultados:

En el primer tubo aparece el precipitado mucho mas antes que el líquido

hierva, debido al aumento de temperatura, las moléculas aumentan su
velocidad y dan origen a una desorganización de su estructura. El efecto del pH
es importante en la precipitación de la proteína, pues a un pH igual al PI
permite la precipitación de la proteína sin necesidad de calor.

C) Precipitación de proteínas con ácido concentrados

Curso de la determinación:

En tres tubos de ensayo se agregan 1ml de ácido nítrico, ácido sulfúrico y ácido
clorhídrico concentrados. Luego, después de inclinar cada tubo, con cuidado,
por la pared agregan 0,5ml de la solución proteica (ovoalbúmina), de tal
manera que no se mezcle con el ácido.

Tubo N°1 Tubo N°2 Tubo N°3

Resultados:

Los ácidos minerales utilizados provocan la neutralización de las cargas y la

destrucción de la estructura espacial de la proteína, lo que conlleva a su
desnaturalización. La concentración del ácido es muy importante, pues a
elevadas concentraciones de estos ácidos minerales provocan la deshidratación
de la proteína y su desnaturalización irreversible.

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D) Precipitación de proteínas con ácidos orgánicos

Curso de la determinación:

A dos tubos de ensayo se agregan 2ml de solución de proteína (ovoalbúmina) y

a un primer tubo se añade algunas gotas de solución al 5% de ácido
tricloroacético, y al segundo tubo varias gotas de ácido sulfosalicilico al 20%.

Tubo N°1 Tubo N°2

Resultados:

Estos ácidos orgánicos presentan el mismo efecto de los ácidos minerales,

provocan la neutralización de cargas y la desnaturalización de la proteína, pero
también se debe agregar que estos ácidos pueden reaccionar con los grupos
laterales de los aminoácidos de la proteína.

E) Precipitación de proteínas con metales pesados

Curso de la determinación: Preparar cuatro tubos de ensayo y agregar 1ml de

solución de proteína (ovoalbúmina). A un tubo de le añade una solución de
FeCl3 (cloruro férrico) y luego se añade un exceso. A un segundo tubo se agrega
AgNO3 (nitrato de plata). A un tercer tubo se agrega CuSO4 (sulfato de cobre).
Y a un cuarto tubo de agrega Pb(CH3COO)2 (acetato de plomo).

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4.0.- CONCLUSIONES

 Las globulinas son proteínas que precipitan o coagulan por el aumento de la

fuerza iónica del agua, por efecto de la saturación del sulfato de amonio,
pero a diferencia de las albúminas que precipitan en un medio iónico más
alto.

 En general la desnaturalización de las proteínas puedes ser de dos tipos una

desnaturalización reversible o una desnaturalización irreversible. Donde la
desnaturalización reversible presenta muchas aplicaciones y diversas
técnicas para la separación o extracción de una proteína en particular; a
diferencia de la desnaturalización irreversible la cual modifica las
propiedades fisicoquímicas de la proteína sin poder retornar a su forma
nativa.

 En una solución proteica de albúmina está presente otras proteínas

denominadas globulinas, las cuales precipitan en un medio iónico no muy
alto, es decir, un grado de saturación del sulfato de amonio; en cambio la
ovoalbúmina precipita o coagula en un grado sobresaturado del sulfato de
amonio en solución. Este método se denomina “Salting Out”.

 El aumento de temperatura provoca la desorganización de la estructura

terciaria de la ovoalbúmina, debido a rupturas de enlaces puente hidrógeno
que luego permiten la coagulación de la proteína; pero se considera también
la fuerza iónica del solvente (Agua), pues cuando se encuentra en un medio
muy ácido, es decir, pH menor que el punto isoeléctrico (PI) no se forma
precipitado alguno; y cuando se encuentra a un pH cercano al PI la
coagulación por acción del calor es más rápida. Lo mismo se observa en un
medio muy básico pH mayor que el PI no hay coagulación ni por acción del
calor.

 La acción de los ácidos minerales provoca la desorganización de la

ovoalbúmina debido a la deshidratación y también a la neutralización de las
cargas, evidenciándose la coagulación de la proteína. El efecto de los ácidos
es que deshidratan a las proteínas de manera que la desnaturalizan
irreversiblemente.

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 Las sales de metales pesados precipitan las proteínas porque el ion del
metal pesado muy probablemente se combina con la forma aniónica de la
proteína. La proteína en el lado alcalino de su punto isoeléctrico existe como
ión negativo y así al combinarse con el ión del metal o catión, formará
proteínatos tales como proteinato de mercurio, de plomo, de plata, etc. Es
decir, para estos casos favorece el medio alcalino.

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5.0.- RECOMENDACIONES

 La solución de ovoalbúmina debe de ser muy diluida, pues a una elevada

concentración no se observaría adecuadamente los productos deseados al
momento de reaccionar con los diferentes reactivos.

 Al momento de agregar el sulfato de amonio para la sobresaturación se debe

de agregar pequeñas cantidades de cristales para observar la precipitación
de la ovoalbúmina. De la misma manera para observar la influencia del pH
en la coagulación se debe de hacer con los ácidos minerales diluidos para
poder observar y comprobar la desnaturalización reversible.

 Se recomienda tener cuidado al trabajar con ácidos minerales concentrados,

pues una elevada cantidad de estos ácidos necesitaría mayor cantidad de
solución básica para su neutralización, se debe tener en cuenta pues
nosotros solo evaluamos cualitativamente.

 Al momento de trabajar con las sales de metales pesados, se debe de agregar

gota en gota para evitar la sobresaturación y poder observar el fenómeno de
coagulación de la proteína. El medio básico puede aumentar la precipitación
de la proteína.

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6.0.- BIBLIOGRAFÍA

 http://www.aulavirtualexactas.dyndns.org/claroline/backends/download.php
?url=L1RyYWJham9zX1By4WN0aWNvcy9UUF9Oul80X0Rlc25hdHVyYWx
pemFjafNuX2VfSGlkcmF0YWNp824ucGRm&cidReset=true&cidReq=IA818

 David T. Plummer, “Bioquímica Práctica”, McGraw-Hill Latinoamericana,

Página 112-132.

 Facultad De Odontologia, “Practicas de Bioquimica”, UNAM.

 Silvia Quesada Mora, “Manual de experimentos del laboratorio para

Bioquímica”, editorial universidad a distancia.

 http://es.scribd.com/doc/57711271/Identificacion-de-Aminoacidos-yProteinas.

 http://es.scribd.com/doc/49000057/Bioquimica-Practica-Plummer-Chp05a.

 http://es.scribd.com/doc/27312502/INFORME-LABORATORIO
RECONOCIMIENTO - DE -AMINOACIDOS-EN-ALIMENTOS.

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7.0.- CUESTIONARIO

1.-¿Qué efecto tiene el pH en la precipitación de las proteínas con metales

pesados?

Como sabemos que el pH influye en cuanto a la carga neta de la proteína, es

decir, esta relacionada con el punto isoeléctrico (PI); si el pH es mayor que el PI
(pH>PI) la carga que predomina es la carga negativa, debido a la ionización de
los grupos carboxilo que presentan los aminoácidos en esta proteína. La carga
negativa total de la proteína interacciona con un catión como (Ag +, Cu2+, etc)
para forman un precipitado debido a la neutralización de las cargas, de manera
que pueda ocurrir la precipitación de la proteína.

2.-¿Todos los metales pesados tienen el mismo efecto precipitante?, ¿Por qué?

No todas tienen el mismo efecto precipitante, por que , en este caso la Ag +, al

agregar un exceso a la solución proteica, la proteína adsorbe a una cantidad de
iones Ag+ de manera que queda cargada positivamente (Efecto de la doble capa)
y se solubiliza en el mio acuoso.

3.-Explicar desde el punto de vista químico los fenómenos de desnaturalización

y renaturalización.

La desnaturalización, en primera instancia consiste en la desorganización de

las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria, por efecto de calor, fuerza
iónica y pH, para dar origen a una cadena desorganizada (estructura primaria)
que luego precipita por la baja de solubilidad, a consecuencia de los grupos
laterales hidrofóbicos de aminoácidos que conforman la proteína (se pierde la
interacciones puente de hidrógeno de la proteína con el medio acuoso). Y la
renaturalización es un proceso reversible que permite organizar la estructura
inicial, sin perdida de propiedades fisicoquímicas o alguna actividad.
(organización de la estructura, y solubilización de la proteína debido a la carga
neta).

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4.-¿Cómo influyen las sales diluidas y concentradas sobre la solubilidad de las

proteínas?

A concentraciones salinas altas superiores a 1 M la solubilidad de las proteínas

decrece debido a que gran parte del agua presente en el medio se fija a los iones
salinos, lo que determina la deshidratación de las proteínas y puede haber
precipitación. Esto se debe a que las interacciones proteína–proteína resultan
más importantes que las interacciones proteína – agua y esto puede conducir a
una agregación seguida de precipitación.

5.-¿Por qué precipitan las proteínas por acción de los metales pesados?

Los metales pesados presentan cargas positivas, la cuales se neutralizan con

las cargas negativas de la proteína (debido a la suma de todos los aminoácidos
ácidos presentes en la estructura primaria) originando así la neutralización de
cargas y la precipitación de la proteína debido a la formación de complejos
entre la proteína y los metales.

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