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Las enzimas o las proteínas producidas por los microorganismos pueden ser
intracelulares, periplásmicas o secretadas al medio de cultivo. Para enzimas
extracelulares, el grado de purificación requerido es mínimo y los procesos a gran
escala pueden rendir toneladas de producto proteico.
Muchas otras enzimas sin embargo, son producidos en mezclas intracelulares mas
complejas y representan un mayor desafío implicado en la purificación proteica. Los
productos para un uso terapéutico deben presentar unas características de purezas
muy exigentes y exactas. De nuevo, la ingeniería genética ha sido capaz de ayudar
en esta tarea. En el caso de las proteínas terapéuticas, hay grandes ventajas si la
proteína de interés puede ser secretada, bien al periplasma, bien al medio. Esto
provoca una enorme reducción del nivel de proteínas contaminantes y otras
macromoléculas de forma que se puede obtener el producto puro tras solo dos o
tres pasos de purificación.
Álcali.
Este método ha sido utilizado con considerable éxito para la extracción de proteínas
bacterianas a pequeña y gran escala.
Detergentes.
Los detergentes, tanto iónicos, como es el caso del lauril sulfato sódico, colato sódico
(aniónico) y el bromuro de cetiltrimetilamonio (catiónico), o no-iónicos.
Choque osmótico.
El método implica el lavado del cultivo de bacterias en una solución tampón para tratar
de eliminar los restos del medio de cultivo. El empleo del choque osmótico se está
viendo favorecido con el incremento en el número de proteínas recombinantes que se
secretan al periplasma.
Homogeneización con abrasivos.
Consiste en una cámara que contiene bolsa de vidrio y varios discos fijos y rotatorios.
La suspensión celular se bombea en la cámara, y la rápida agitación es suficiente para
romper incluso las bacterias más resistentes. La cámara de desintegración está
refrigerada para eliminar el calor que se genera.
Tamización sólida
El método implica la extrusión del material celular congelado a través de un orificio de
pequeño diámetro y a una presión elevada, manteniendo la temperatura próxima a
-20°C.
Tamización líquida
Este es ahora el método de ruptura celular de elección utilizado en la lisis a gran
escala de microorganismos, estando muy extendida su aplicación tanto en procesos
industriales como de investigación. Es particularmente útil en la ruptura de células
bacterianas aunque también puede ser efectivo en la rotura de hongos o levaduras.
Las células en una suspensión líquida son forzadas a pasar a través de un orificio de
pequeño diámetro bajo una presión muy elevada.
Para trabajos a gran escala se emplea generalmente un homogeneizador que se
pensó para la producción de emulsiones en la industria lechera.
PURIFICACIÓN INICIAL
Centrífugas
Existen diferentes centrífugas con rangos de capacidad desde las de menos de 1 ml
hasta aquellas que superan varios litros, capaces de aplicar una fuerza centrífuga
superior a 100.000 g.
Centrifugas de cestillo
En el contexto de la purificación de enzimas esto se refiere generalmente a materiales
intercambiadores iónicos, lo cuales han sido empleados apara la adsorción de la
proteína deseada.
PRECIPITACIÓN
Sulfato amónico
La sal más comúnmente empleada es el sulfato de amonio debido a su alta
solubilidad, a la ausencia de toxicidad para la mayor parte de las enzimas y a su bajo
costo. La precipitación de una proteína mediante el tratamiento con una sal depende
de diversos factores: como el pH, temperatura, la concentración de proteínas y la sal
empleada.
Solventes orgánicos
La adición de solventes orgánicos a soluciones acuosas reduce la solubilidad de las
proteínas al disminuir la constante dieléctrica del medio. Siendo los más utilizados el
etanol, la acetona y el 2-propanol, que es el más empleado. Debido a que las
proteínas se desnaturalizan en presencia de solventes orgánicos es aconsejable
trabajar a temperaturas inferiores a 0⁰C.
Selección de la metodología
Para obtención y separación de proteínas a gran escala se puede emplear cualquier
de las técnicas cromatrograficas disponibles: filtración a través de geles, intercambio
iónico, interacción hidrofóbica , afinidad, inmunoafinidad, y electroenfoque.
En este sentido, etapas en las que se produce una concentración del producto, como
es la cromatografía de afinidad, hidrofobica o de intercambio iónico deben realizarse
antes que aquellas que causan una dilución, como es el caso de la filtración a través
de geles. La cromatografía de interacción hidrofobica puede realizarse posteriormente
a una de intercambio iónico con un cambio mínimo en el tampón, puesto que la
mayoría de las proteínas se unen mas fuertemente a un soporte hidrofobica a fuerzas
iónicas altas.
Elección de la matriz
Quizás la decisión mas importante que se debe tomar cuando se diseña un proceso de
purificación a gran escala sea la concerniente a la selección del tipo de matriz de
cromatografía. Una matriz de cromatografía a gran escala deberá ser hidrofilica,
macroporosa, rígida, con partículas esféricas, químicamente estable, ligandos
delicados y de fácil modificación.
Tabla 2. Propiedades de las matrices cromatográficas básicas.
Tipo de Matriz Porosidad Adsorció Rigide Estabilida Facilidad Coste
n z d de relativo
no- modificació
específic n
a
Dextrano con enlaces Baja Baja Baja Buena Buena Bajo/medio
entrecruzados
Poliacrilamida con Baja Baja Baja Buena Buena Medio
enlaces entrecruzados
Agarosa Alta Baja Baja Deficiente Buena Medio
Agarosa con enlaces Alta Baja Media Buena Buena Medio
entrecruzados
Compuesto Alta Media Media Buena Buena Medio
Poliacrilamida/Dextrano
Compuesto Media Baja Media Buena Buena Medio/alto
Poliacrilamida/Agarosa
Polímero acrílico Media Media Media Buena Buena Medio
hidroxilado
Copolímero etilenglicol- Baja/media Media Media Buena Buena Medio
metacrilato
Celulosa Media/alta Alta Baja Buena Buena Bajo
Sílice porosa Baja/media Alta Alta Deficiente Deficiente Alto
Polímero orgánico Media/alta Baja Alta Buena Buena Alto
rígido
Gel filtración
Éste tipo de separación se basa en el tamaño molecular. La fase estacionaria esta
formada por bolas porosas rodeadas de una fase solvente móvil. Cuando se añade la
muestra, las moléculas de la mezcla se reparten entre los poros del gel del solvente.
Los intercambiadores celulósicos iónicos son ideales para diversas operaciones como
primera etapa en varios procesos.
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
La cromatografía de afinidad es quizá el método de purificación más elegante para
obtener una proteína a partir de una mezcla compleja. Aunque se usa ampliamente en
el laboratorio, solo en los últimos años parece aceptable en purificaciones a escala
industrial.
Esta metodología se basa en la interacción de una proteína con un ligando
inmovilizado. El ligando puede ser bastante especifico para una proteína particular, por
ejemplo un sustrato, un análogo del substrato, un inhibidor, o un anticuerpo. Existen
alternativas en las que el ligando es capaz de interaccionar con una variedad de
proteínas, en este caso del NAD, AMP, ADP, colorantes, o cadenas de hidrocarburos.
ULTRAFILTRACION
La ultrafiltración ha sido una técnica de uso corriente en el laboratorio para la
concentración de soluciones proteicas en condiciones muy suaves. También es una
alternativa para la diálisis y filtración a través de geles para la eliminación de sales o
los cambios de tampones.
CONCLUSION
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos
nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras
similares, la electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas (de los cual se trato este
trabajo) al final del procedimiento.
El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro
tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de
acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la
matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes.
Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán
posteriormente analizadas e interpretadas.
En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis;
sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa
ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas,
mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros métodos electroforéticos
que presentan ciertas modificaciones, así tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente
usada para separar fragmentos
muy grandes de ADN (ADN genómico), la electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de
las proteínas etc.
Es importante señalar que la electroforesis en asociación con otras técnicas tales como PCR, e
hibridación, brinda una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta técnica es posible visualizar
las bandas de ARN o ADN de patógenos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar una
nueva proteína, entre otros.