Autoanticuerpos a componentes nucleares de células (anticuerpos antinucleares, ANA), incluido

ADN (a-ADN), son ampliamente utilizados en el diagnóstico y la subtipificación de ciertas

enfermedades autoinmunes, incluido el Lupus Eritematoso Sistémico (LES). A pesar del uso clínico,
la medición precisa y reproducible de títulos de ADN-α sigue siendo difícil, probablemente debido a
la secuencia sustancial y la heterogeneidad de longitud de ADN purificado de fuentes naturales
Diseñamos y probamos un panel de moléculas de ácido nucleico sintético compuesto de unidades
de desoxirribonucleótidos nativos para medir a-ADN. Ensayos ELISA que usan estos antígenos
muestran especificidad y reproducibilidad. Aplicando las pruebas ELISA a estudios serológicos de
pediatría y LES adulto, identificamos nuevas correlaciones clínicas. También observamos el
reconocimiento preferencial de un antígeno sintético específico por anticuerpos en sueros LES.
Determinamos la base probable de este hallazgo utilizando análisis computacionales,
proporcionando información estructural valiosa para el desarrollo futuro del ADN antígenos. Las
moléculas de ácido nucleico sintético ofrecen la oportunidad de estandarizar los ensayos y
diseccionar interacciones anticuerpo-antígeno.
Los autoanticuerpos contra componentes nucleares de la célula (anticuerpos antinucleares, ANA)
se detectan en pacientes con variedad de enfermedades autoinmunes (revisado en1). Entre ANA,
anticuerpos al ADN bicatenario (a-dsDNA) son particularmente característicos de LES, una
enfermedad autoinmune inflamatoria multisistémica con diversos cuadros clínicos y
manifestaciones serológicas y etiología desconocida. Las personas mayores y sanas pueden tener
un aumento en los títulos de dsDNA sin ningún síntoma de enfermedad autoinmune. Sin embargo,
en el contexto de LES, complejos AgAB generalmente fijan el complemento y causan inflamación y
cxdaño agudo y crónico de vasos sanguíneos y tejidos.
Los anticuerpos anti-ADN pueden reaccionar de forma cruzada con los receptores NMDA (N-metil-
D-aspartato) del cerebro y causar patología del sistema nervioso central. Además, los complejos
anti-DNA / DNA estimulan la liberación de citocinas proinflamatorias (p. ej., IL-1β, IL-8 y TNFα) e IL-
10 de células mononucleares, que pueden polarizar la reacción inmune hacia la vía T helper 2 (Th2)
y apoyar la producción de más autoanticuerpos.
En la mayoría de los pacientes con LES, el curso de la enfermedad se caracteriza por brotes y
remisiones. Detección temprana y el tratamiento de las erupciones en el LES puede mejorar los
resultados a corto plazo y reducir la morbilidad a largo plazo.
Anticuerpos para dsDNA y para antígeno Smith, una proteína nuclear no histónica compuesta de
varios polipéptidos, han obtenido valor diagnóstico en LES, y el aumento de los títulos de ADN anti-
ds se asocia con brotes de la enfermedad en algunos pacientes, pero no universalmente. El objetivo
de muchos estudios actuales es encontrar biomarcadores adicionales de la actividad de LES. con
algunos candidatos recientes que son proteínas C4d y C3d activadas por complemento ligadas a
células, varias proteínas urinarias, tales como transferrina, ligandos CC-quimiocina y hepcidinas,
ARN, microARN y perfiles epigenéticos de células inmunes circulantes (como se revisó en Liu et al.,
ref.10). Sin embargo, datos convincentes sobre el valor de ANA, tales como a-dsDNA, detectado
por el enzimoinmunoanálisis ligado a enzimas (ELISA) como un biomarcador de la enfermedad que
falta.
Las fuentes comunes de antígenos de ADN para la detección de ANA incluyen el ADN del timo de
ternera (CTD), amplicones de PCR de diferente longitud, y ADN plásmido, que son altamente
heterogéneos y se usan en la detección de ANA sin conocimiento de la secuencia de ADN. Usando
CTD, la detección precisa de ADN monocatenario (ss) versus a-dsDNA es un desafío, porque CTD
es una mezcla de ss- y ds-DNA con una alta proporción (~ 90%) de dsDNA.
Además, incluso CTD altamente puro contiene fosfopéptidos unidos covalentemente que pueden
influir en la unión del anticuerpo. Alternativamente, Crithidia luciliae, un protista flagelado con un
cinetoplasto rico en ADNds, puede usarse como antígeno.
Aunque el ADN de Crithidia tiene una pureza más alta que la CTD, la detección de a-ADN con este
sustrato no es específica.
La información estructural sobre la interacción del ADN-a con los antígenos correspondientes,
aunque limitada, sugiere interacción específica de secuencia con nucleótidos definidos. Las pruebas
clínicas actuales no toman esto en cuenta. El uso de antígenos naturales probablemente contribuye
a la inconsistencia en los resultados entre diferentes laboratorios y puede obstaculizar las
correlaciones con parámetros clínicos. El uso de ADN puro controlado por secuencia permitiría una
mayor coherencia, detección, discriminación y posible subtipificación de ADN-a. Información de a-
DNA con conocidos la especificidad de secuencia ayudaría a proporcionar una base teórica sólida
para el reconocimiento anticuerpo-ADN. Además, los datos estructurales sobre complejos
anticuerpo-ADN podrían usarse en el diseño de antígenos con especificidad mejorada, que es de
importancia crucial para el diagnóstico clínico. Un ejemplo exitoso incluye ADN G-quadruplex, lo
que permitió la subtipificación de los pacientes con LES y mostró una correlación de los títulos de
ADN a con la actividad de la enfermedad. Antígenos específicos podrían permitir el establecimiento
de una estandarización previamente inalcanzable de los ensayos de ADN a y el poder abre la
emocionante posibilidad de tratamiento mediante la unión específica y el aclaramiento de a-DNAs
reactivas.
Hemos demostrado la especificidad y sensibilidad de un único oligonucleótido sintético de ADN que
contienen ácidos nucleicos bloqueados (LNA) para reconocimiento por a-dsDNAs monoclonales.
Recientemente, otros investigadores exploraron racionalmente antígenos peptoides diseñados para
diagnóstico de LES. Aquí, informamos una serie de nuevos antígenos de ADN sintéticos y
demostramos su aplicabilidad para la detección de anticuerpos correspondientes por ELISA en
pacientes con LES de inicio en pediatría (pSLE) o LES de inicio en adultos. Nuestros estudios
confirman una alta afinidad de unión de los nuevos antígenos en comparación con ADN natural.
Encontramos perfiles mixtos de a-ssDNA / a-dsDNA que varían entre pacientes. Aumento de los
títulos de anticuerpos a sintéticos dsDNA se correlacionan con la actividad de la enfermedad alta,
medida por SLEDAI. Mostramos que los niveles de autoanticuerpos para antígenos sintéticos de
ácidos nucleicos particulares en LES difieren entre adultos y niños. Los perfiles a-dsNA en LES
también difieren de aquellos en pacientes con otra enfermedad autoinmune, juvenil poliarticular
ANA-positivo artritis idiopática, indicando especificidad. Además, utilizando métodos
computacionales, identificamos interacciones específicas entre dsDNA y anticuerpos
correspondientes.
Resultados
El objetivo principal de este estudio fue desarrollar una prueba sensible, específica y reproducible
para a-ADN en muestras humanas. Para medir la cantidad de IgG e IgM a-DNA, seleccionamos el
a-DNA ELISA. ELISA es sencillo
y un ensayo bien establecido que nos permitió estudiar el efecto de la secuencia de ADN en la unión
de anticuerpos policlonales de una manera rápida y rentable. Las placas de microtitulación para
ELISA se recubrieron con el antígeno de ácido nucleico de elección (ver abajo). Después del lavado,
anticuerpos secundarios, específicos para IgG o IgM humana y conjugados con peroxidasa se
agregaron. Después de lavar nuevamente para eliminar los anticuerpos de detección no unidos, se
añadió sustrato de TMB y el alcance de la reacción colorométrica se midió y comparó entre
diferentes antígenos como un poder de la cantidad de anticuerpos anti-ácido nucleico unidos; ver
Fig. 1A. Los detalles sobre el ensayo se dan en la información suplementario, capítulo S1.
Para los antígenos ELISA, utilizamos un panel de moléculas de ADN sintéticas, que incluyen un
conjunto de ADN bicatenario (D1-D5) y un conjunto de ADN monocatenario (SD1, SD2). El diseño
de los antígenos de ADN sintéticos se basó en datos previos para la unión de ADN-anticuerpo y
modelado molecular adicional de 40 secuencias de ADN (Fig. 1B, C). Como antígeno de control,
utilizamos ADN de timo de ternera (CTD).
Para probar el a-DNA ELISA en muestras clínicamente relevantes, recolectamos sangre de niños
recién diagnosticados con pLES (n = 27), adultos con LES positivo (n = 244), controles sanos (n =
60) y pacientes poli ANA-positivo (n = 14) con enfermedad en curso. La información demográfica y
clínica sobre los pacientes se muestra en tablas suplementarias S1-S4 (Sección de Suplemento
S2).
Nos aseguramos de que la unión del anticuerpo a los antígenos alcanzara el equilibrio de unión bajo
la aplicación de condiciones de incubación (1.5 h, 37 ° C); (Fig. S3 suplementaria en la Sección
Supl. S1). Valores de corte para positivo débil y las señales positivas se determinaron por separado
para cada antígeno mediante un método estadístico arbitrario, es decir, como un aumento 2-3
veces, respectivamente, de A450 por encima del valor medio para los controles sanos.
Un hallazgo sorprendente y el resultado más importante de este trabajo fue la unión preferencial de
anticuerpos policlonales a-ADN de muestras de LES al antígeno D5 en comparación con D4 y CTD
(figura 2; secuencia de D5: (5 TCCTCTCTTTCTCTTTCTCTTTCCTCTCTT TCTCTT
TCTCTTTCCTCTCTTTCTCTTTCTCTT-3 '): (5 '- AAGAGAAAGAGAAAGAGAGGAAAGAGA
AAGAGAAAGAGAGGAAAGAGAAAGAGAAAGAGAGGA-3 ')). Se observaron altos títulos de
anticuerpos a-D5 en 19 muestras de pSLE (70%), incluidas 9 (33%) que fueron negativas para CTD.
Para el 89% de las muestras de pSLE positivo a-D5, la reactividad hacia D5 fue dos veces mayor
que para D4 y hasta a 10 veces más que la reactividad D5 de las muestras de JIA, indicando tanto
la especificidad antigénica como la especificidad de la reactividad de la enfermedad. La prueba t de
dos colas suponiendo varianzas desiguales confirmó diferencias estadísticamente significativas
entre los títulos de D5 para los grupos pSLE y polyJIA (p = 4.9 × 10-9, F 5.93> F critical 2.065).
Cuando es monocatenario
Se usaron antígenos de ADN, SD1 y SD2, las muestras de pLES mostraron títulos más altos de a-
ssDNA hacia antígeno SD2, en comparación con JIA o muestras de control sanas (p <0,001). Por
lo tanto, se observó una mayor unión de anticuerpos pLES para ambos objetivos ds y ss de ADN
sintéticos (Fig. 2). A diferencia de pLES, menos adultos tenían niveles elevados de a-D4 (7,3%
frente a 26% para pLES), y de a-D5 (19% (OUH) y 23% (SU) frente a 70% para pSLE). los niveles
de a-D5 en adultos no correlacionan con a-D4, a-dsDNA clínico o a-CTD (Tablas complementarias
S5, S6 en la sección Suplemento S3).
Curvas de dosis-respuesta para nuevos antígenos y controles indicaron valores de saturación para
anticuerpos en la mayoría de los pLES muestras que se unen a D5, CTD y, en algunos casos, D4;
tres muestras parecían tener títulos más bajos de a-D4 y no saturado (Figs. suplementarios S5 y
S6, supl. Sección S4). Además, la jerarquía de unión de muestra a los antígenos sintéticos variaban.
Por ejemplo, la muestra pSLE6 tiene los títulos más bajos contra D4 pero no contra D5 o CTD. La
muestra pSLE20 tiene los títulos más bajos de a-D5 con títulos altos de D4 y CTD en relación con
las otras muestras. Los antígenos de ADN D1-D3 nos permitieron investigar más a fondo la
especificidad de secuencia de los a-ADN. Como se muestra en Suplementario Fig. S6, los
anticuerpos en muestras de pSLE tenían mayores señales de unión a la secuencia D2 que a D3 y
D1. Esto sugiere la importancia de las interacciones entre ciertos dinucleótidos y anticuerpos y
podría indicar un papel inmunogénico primario de secuencias de nucleótidos particulares en el
desarrollo de respuesta del autoanticuerpo a-ADN / población.
Para explorar la posible aplicación clínica de los anticuerpos a-D5, evaluamos las correlaciones con
los parámetros clínicos, incluyendo placebos y medicamentos, como descrito en Información
Complementaria, Supl. Sección S3. Según la prueba OLS, los títulos a-D5 correlacionaron con
índice de actividad de la enfermedad de LES (SLEDAI) en muestras pediátricas y de adultos (p =
0.022, 0.0008 (SU) y 1.6 × 10-11 (OUH)). En contraste, para los mismos pacientes, no hubo una
correlación estadísticamente significativa entre anti-CTD, a-D4 anticuerpos y SLEDAI puntuaciones
(p = 0,432, Fig. 3]. Curiosamente, 7 de 27 (26%) pacientes con LES tenían elevación títulos a-D4.
Para 6 pacientes con LESP, la reactividad a-D4 se correlacionó con SLEDAI y anticuerpos
antifosfolípidos, pero no se midieron otros parámetros clínicos (por ejemplo, anticuerpos anti-Smith
o anti-ribonucleoproteína (anti-U1RNP); véase Tabla Suplementaria S5). Ni los niveles a-D4 ni a-
D5 se correlacionaron con el uso de medicamentos. Ninguno de los sujetos SLE fue tratado con
medicamentos asociados con LES inducido por fármacos, que también argumenta que el ADN-a
era específico de enfermedad y no para el tratamiento.
A continuación, probamos las correlaciones entre títulos de autoanticuerpos y parámetros clínicos
para pacientes seleccionados durante el período desde el inicio de la enfermedad hasta los 64
meses de tratamiento; ver Información complementaria, Sección S5).
Los cambios en los títulos de a-dsDNA se correlacionaron positivamente con SLEDAI aumentado,
mientras que el valor predictivo de los cambios en a-CTD, los títulos y el complemento C3 fueron
bajos (Fig. 4 y Tabla Suplementaria S8, Suppl. Sección S5).
Por último, utilizamos métodos computacionales para analizar la unión de IgG a los antígenos de
ácido nucleico sintéticos para desarrollar un modelo de interacción ADN-ADN. Hasta la fecha, solo
unas pocas estructuras cristalinas de complejos anticuerpo / ADN han sido publicados. Entre estos,
la estructura de ED-10, un anticuerpo monoclonal de unión a ssDNA, complejado con el dinucleótido
ha sido resuelto. Teniendo en cuenta la reactividad cruzada previamente reportada de a-ssDNA y
a-dsDNAanticuerpo, razonamos que ambos tipos de complejos podrían compartir mecanismos de
unión. por lo tanto, nosotros utilizamos la estructura ED-10 para modelar complejos anti-dsDNA-
anticuerpo. Recientemente, se informó que las interacciones aromáticas median en la especificidad
de base 5 'del anticuerpo de unión a ssDNA ED-10. En nuestro modelo, ED-10 se une a pares de
bases dentro de la doble hélice, lo que conduce a un ADNds parcialmente desenrollado (figura 5A).
Para estudiar la especificidad de unión del anticuerpo por ADN, mutamos el par de bases inicial en
el antígeno a una variante alternativa (en total, se probaron 40 variantes). Basado en modelado
molecular, los nucleótidos unidos adoptaron una conformación en la que la nucleobase se retiró del
resto de azúcar. Las afinidades vinculantes relativas de las tres moléculas de ADN de doble cadena
al anticuerpo se estudiaron luego a través de simulaciones de dinámica molecular (MD) de 100 ns;
los detalles sobre las herramientas de simulación y el protocolo de simulación se proporcionan en
Métodos. La Figura 5B muestra un modo de unión típico de dsDNA al anticuerpo ED-10. La unión
predominante surge del apilamiento interacciones entre la timidina y los residuos de aminoácidos
W50 y W95, la citidina y el Y32 (flecha en el figura). Los enlaces de hidrógeno entre timidina y N95,
y citidina y K50 (líneas discontinuas en la Fig. 5B) también estabilizar el complejo dsDNA-anticuerpo.
Las energías de interacción promedio del anticuerpo con los diversos pares de bases se muestran
en la figura 5C. Estas energías de enlace representan el valor promediado en el tiempo de más de
100 ns y son medidas representativas de la fuerza del dsDNA que se une al anticuerpo. La
dependencia del tiempo de las energías en las tres simulaciones se muestra en la Fig. S11, que
ilustra que la energía fluctúa constantemente alrededor de algún valor promedio.
Con base en los resultados de ELISA y modelado molecular, concluimos que el antígeno D5 fue el
más reactivo en ADN vinculante en LES pediátrico y adulto, y que la base estructural para el
reconocimiento involucró tanto el apilamiento interacciones y enlaces de hidrógeno entre
dinucleótidos TC repetición de D5 y aminoácidos en anticuerpos.
Discusión
Previamente, nosotros y otros observamos el reconocimiento del ADN sintético por anticuerpos
monoclonales a-dsDNA. En nuestro presente trabajo, dimos el siguiente paso hacia una mejor
comprensión de los autoanticuerpos frente a los ácidos nucleicos y hacia un ensayo mejorado
usando nuevas moléculas sintéticas de ADN. Como mostramos, estas moléculas fueron antígenos
eficientes para la cuantificación de a-dsDNA usando ELISA estándar. Comparado con los antígenos
de ADN actualmente aplicados, las pruebas de muestras de LES mostraron alta reproducibilidad y
especificidad cuando se utilizó ADN sintético. Los nuevos antígenos también fueron estables
después del almacenamiento como moléculas individuales y después de la inmovilización en placas
de microtitulación (datos no mostrados).
Las principales ventajas de aplicar antígenos sintéticos son alta homogeneidad, pureza controlada
y lo más importante, secuencia conocida. Estos factores nos permitieron por primera vez estudiar
perfiles de ADN a un panel de ss y ds antígenos en pacientes con diagnóstico de LESP y LES de
inicio en adultos. De acuerdo con nuestros estudios, los pacientes con LES tenían un título global
más alto de anticuerpos hacia antígenos específicos de secuencia, y solo unos pocos pacientes
tenían anticuerpos contra análogos de ds mezclados con ATCG sin un patrón distinguido. Esto
difiere de los resultados con sujetos ANA + poliJIA; menos pacientes con poli JIA tenían anticuerpos
a-DNA, y en todos los casos, estos anticuerpos se reconocen preferentemente antígenos ds
mezclados. Ninguno de los sujetos JIA tenía a- sDNA. Curvas de dosis-respuesta y estudios de
antígenos de 21mer confirmó adicionalmente que la unión al blanco por el ADN-a era sensible a la
secuencia de nucleótidos de los antígenos aplicados.
Con base en nuestros resultados, es posible que la reactividad de anticuerpos hacia D5 sea una
característica distintiva de SLE, con la mayor actividad en enfermedades pediátricas. Una posible
explicación para esto podría ser la sobreexpresión de D5 en SLE. Sin embargo, el papel biológico
de D5 y otros antígenos controlados por secuencia requiere más investigación. Una combinación
de los métodos descritos en este documento y de las modernas tecnologías genómicas podría ser
un emocionante paso siguiente hacia una mejor comprensión del ADN-a y su papel en el LES.
Múltiples sujetos sanos tenían títulos elevados de a-ssDNA, pero no de a-dsDNA. Esto podría ser
causado por enrollamiento del antígeno ss en formas tridimensionales que pueden interactuar de
forma no específica. Anteriormente se sugirió que elevados títulos de a-ssDNA son una
característica distintiva del LES inducido por fármacos (DISLE). Como no se utilizó ningún
medicamento causante de DISLE por los sujetos SLE, estudiamos, nuestros datos excluyen la
asociación entre a-ssDNA positiva con el uso de particular drogas. Sin embargo, nuestro estudio
implica que el valor clínico de a-ssDNA es bajo en SLE.
Actualmente, hay informes contradictorios sobre la correlación entre a-dsDNA y otros ANA con
fenotipos clínicos de enfermedades autoinmunes. Las asociaciones informadas más
consistentemente son la nefritis lúpica, índice de actividad total de enfermedad y brotes en LES y
uveítis crónica en AIJ oligoarticular. En este estudio, formulamos la hipótesis de que los anticuerpos
específicos de secuencia pueden correlacionarse con un subconjunto diferente de fenotipos clínicos
y ayudar a determinar subgrupos de pacientes según su estado de a-ADN. Nos enfocamos en varios
aspectos del aumento de los títulos de anticuerpos: correlación con otros biomarcadores o
tratamiento en un único punto de tiempo (inicio de la enfermedad), y correlación con brotes durante
el curso de tratamiento. En general, altos títulos de anticuerpos hacia el ADN sintético se
correlacionan con alta actividad de la enfermedad al inicio según lo determinado por SLEDAI. Sin
embargo, no encontramos ninguna correlación con otros biomarcadores incluyendo anticuerpos
ANA, complemento o anti-Smith. Reactividad de a-ADN hacia oligonucleótido de diferencia las
secuencias también variaron para sujetos SLE individuales con enfermedad activa.
Un informe reciente describe subgrupos moleculares en pSLE de acuerdo con el análisis
transcripcional. Notablemente, las correlaciones más fuertes en este estudio fueron entre firmas
moleculares y ADN anti-ds y entre firmas y actividad de la enfermedad por SLEDAI. Creemos que
un panel más grande de ácidos nucleicos sintéticos podría permitir una mayor resolución de
subconjuntos moleculares de una manera clínicamente práctica.
En la mayoría de los pacientes con LESP, las futuras exacerbaciones de la enfermedad no fueron
predichas claramente por los cambios en común pruebas serológicas, incluido ANA. Los niveles
clínicamente probados de a-dsDNA disminuyeron junto con el tratamiento, pero no se levantó antes
de las erupciones. Sin embargo, se detectaron títulos elevados de anticuerpos IgG contra antígenos
en todo el ADN-a. pacientes positivos utilizados en este estudio antes de las erupciones.
El análisis computacional de la unión entre los antígenos dsDNA cortos y el anticuerpo monoclonal
arrojan luz sobre la base molecular del reconocimiento. La unión de energías libres para el nuevo
antígeno dsDNA y ED-10 se computaron a partir de el MD clásico de todos los átomos, que emplea
el software computacional NAMD, y se analiza en el programa VMD.
Las energías de enlace obtenidas se correlacionaron con los resultados de ELISA de muestras de
plasma usando antígenos D1-D3, y el se observó la unión más estable para el dsDNA rico en TC.
En la estructura inicial de rayos X adoptada para las simulaciones, el anticuerpo ED-10 unido
selectivamente al ADN. De acuerdo con nuestros resultados, la unión de ED-10 a la parte interna
de complejos dsDNA estabilizados para un período de simulación de más de 100 ns. Esto implica
similitud estructural para la interacción original ssDNA-ED-10 e interacciones sintéticas dsDNA-
anticuerpo.
Conclusión
En general, los antígenos sintéticos descritos en este documento demuestran alta especificidad,
sensibilidad y reproducibilidad en la detección de a-DNAs en SLE, una enfermedad que se sabe
que está asociada con a-DNAs, y por primera vez permite un detallado estudio estructural de la
especificidad de secuencia de estos autoanticuerpos. Otras ventajas importantes del nuevo
antígeno sintético en comparación con las moléculas heterogéneas naturales son: (1) Especificidad
conocida, que incluye un control fácil unión específica de secuencia de anticuerpos a-ADN; (2)
Posibilidad de determinar perfiles de anticuerpos individuales que puede tener implicaciones
clínicas; y (3) Potencial para determinar el papel biológico de a-DNA en SLE. Por lo tanto,
racionalmente los ácidos nucleicos diseñados podrían convertirse en una base para el desarrollo
de ensayos clínicos y científicos estándar para LES y otras afecciones autoinmunes donde se han
detectado ANA, como enfermedad mixta del tejido conectivo y esclerodermia. La detección del ADN-
a específico de la secuencia no se puede aplicar solo; sin embargo, estos ensayos podrían
convertirse en un valioso complemento de las pruebas de laboratorio existentes y el análisis de las
manifestaciones clínicas, con el objetivo de mejorar el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades
autoinmunes.