Universidad Nacional de Trujillo Bioquímica

E.A.P. Microbiología y Parasitología

“Práctica N°7: Componentes de la cadena respiratoria efecto

de inhibidores”

I. INTRODUCCIÓN

La Cadena Respiratoria en este punto la célula ha ganado solo 4 ATP, 2 en la glucólisis y dos en
el ciclo de Krebs, sin embargo ha capturado electrones energéticos en 10 NADH2 y 2 FADH2.
Estos transportadores depositan sus electrones en el sistema de transporte de electrones
localizado en la membrana interna de la mitocondria.
La cadena respiratoria está formada por una serie de transportadores de electrones situados en la
cara interna de las crestas mitocondriales y que son capaces de transferir los electrones
procedentes de la oxidación del sustrato hasta el oxígeno molecular, que se reducirá formándose
agua.
Como resultado de esta transferencia de electrones, los transportadores se oxidan y se reducen
alternativamente, liberándose una energía que en algunos casos es suficiente para fosforilar el
ADP y formar una molécula de ATP. Se trata de la fosforilación oxidativa que permite ir
almacenando en enlaces ricos en energía la energía contenida en las moléculas NADH2,
FADH2, NADPH2, que se liberan en la glucólisis y en el ciclo de Krebs y que será más tarde
fácilmente utilizada. Toda cadena respiratoria que comience por el NAD conduce a la formación
de 3 ATP mientras que si comienza por el FAD produce sólo 2 ATP. El rendimiento energético
del NADP es similar al del NAD, así como el del GTP lo es al del ATP.
Actúan a nivel del complejo I (NADH-ubiquinona reductasa): rotenona, producto vegetal,
poderoso veneno de peces, amital y otros barbitúricos, y anestésicos como halotano. Estas
sustancias impiden la llegada a la CoQ de hidrógenos procedentes de sustratos oxidados por
deshidrogenasas ligadas a NAD. No afectan, en cambio, la oxidación de succinato y otros
sustratos que ceden hidrógenos a flavoproteínas con FAD, probando así que éstos siguen otra
vía. El antibiótico antimicina A inhibe el transporte de electrones en el complejo III. Cianuros
(CN), monóxido de carbono (CO) y azidas (N3-) inhiben específicamente la citocromo-oxidasa o
complejo IV y bloquean la etapa final de activación del oxígeno. (Blanco 2001).
El uso de inhibidores no sólo ha ayudado a deducir la secuencia de la cadena respiratoria, sino que ha
permitido conocer mejor el mecanismo de acción de algunos fármacos y venenos.
Los objetivos a tomar son:
La presente experiencia práctica está dirigida a demostrar el efecto de algunos inhibidores
sobre la cadena respiratoria con el objetivo final de identificar sus componentes,
empleando para ello enzima de homogeneizado hepáticos.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

o Material biológico:
 Homogenizado
o Material y equipo de laboratorio:
 Juego de pipetas 1.2 y 5 mL
 Tubos de ensayo
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 Gradillas
o Reactivos:
 Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7.4
 2,6 Diclorofenolindofenol 0,02%
 Malonato 0,1 M
 Cianuro de sodio 0.1 M
 Barbiturato de sodio 0.1 M
o Sustratos:
 Succinato 0,1 M(sustrato natural)
 p-Fenilendiamina(sustrato artificial)

Metodología

A. Sistema de succinato:

COMPONENTES TUBOS
(mL)
1 2 3 4 5 6
Buffer fosfato de 1.5 1.2 1.0 0.5 0.5 0.5
sodio 0,1 M pH 7.4
2,6 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Diclorofenolindofe
nol 0,02%
Succinato 0,1 M 0.2 --- 0.2 0.2 0.2 0.2
Malonato 0,1 M --- --- --- 0.5 --- ---
Cianuro de sodio --- --- --- --- 0.5 ---
0.1 M
Barbiturato de --- --- --- --- --- 0.5
sodio 0.1 M
Homogenizado --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
hepático
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B. Sistema de la p-fenilendiamina

COMPONENTES(mL) TUBOS DE VIDRIO

1 2 3 4 5
Buffer fosfato de sodio 2.0 1.5 1.0 1.0 1.0
0,1 M pH 7.4
Malonato 0,1 M --- --- 0.5 --- ---
Cianuro de sodio 0.1 M --- --- --- 0.5 ---
Barbiturato de sodio 0.1 --- --- --- --- 0.5
M
p-Fenilendiamina 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Homogenizado hepático --- 0.5 0.5 0.5 0.5

III. RESULTADOS

A. Sistema con el sustrato oxidable Succinato.

Tubos
Características 1 2 3 4 5 6
Color Inicial
Color Final
Ocurrió Oxido-Reducción (Si/No) No No Si No No Si
Ocurrió Inhibición (Si/No) No No No Si Si Si

En el tubo 1A: se aprecia de color azul, la muestra solo contiene al sustrato e indicador.
En el tubo 2A: se aprecia el color azul, no se ha reducido.
En el tubo 3A: se tornó incoloro, debido a que la muestra se ha reducido.
En el tubo 4A: se aprecia el color azul, debido a que se ha inhibido.
En el tubo 5A: se aprecia el color azul, debido a que se ha inhibido.
En el tubo 6A: se torna incoloro; se ha inhibido el complejo I, pero hay paso de electrones por
el complejo II; la muestra se ha reducido.
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B. Sistema con el sustrato indicador p-Fenilendiamina.

Tubos
Características 1 2 3 4 5 6
Color Inicial
Color Final
Ocurrió Oxido-Reducción (Si/No) No Si No No Si
Ocurrió Inhibición (Si/No) No No Si Si Si

En el Tubo 1B: se torna incolora, la muestra solo contiene el sustrato-indicador.

En el Tubo 2B: se torna marrón, la muestra se ha oxidado.
En el Tubo 3B: se torna incolora, la muestra ha sido inhibida.
En el Tubo 4B: se torna marrón, el complejo II ha quedado inhibido, pero queda el complejo I
por lo que si hubo oxidación.
En el Tubo 5B: se torna marrón, el complejo I es inhibido, pero queda el complejo II por lo que
si hay oxidación.

IV. DISCUSIÓN

En el sistema de incubación con el sustrato oxidable succinato se verificará como el 2,6-

diclorofenolindofenol de estar en un estado oxidado pasa a estar reducido, gracias a la
intervención de enzima. Se comprobará también si los inhibidores hicieron su trabajo si es que
impiden el proceso de la reacción.
 El tubo N° 1
Contiene 2,6 diclorofenolindofenol (indicador), Succinato (sustrato) pero no tiene el
homogenizado hepático (enzima) por lo que no se lleva a cabo ninguna reacción de
reducción. La muestra presenta un color azul.

 En el tubo N° 2
Contiene 2,6 diclorofenolindofenol (indicador) pero a diferencia del tubo Nº 1 no tiene
Succinato (sustrato), pero si tiene el homogenizado hepático (enzima) por lo que no se reduce
el indicador. La muestra presenta un color azul.

 En el tubo N° 3
Al contener el 2,6 diclorofenolindofenol (indicador), Succinato (sustrato) y homogenizado
hepático (enzima) se produce la reducción del indicador, porque este capta los e- liberados
por la Flavoproteína reducida (FADH). Muestra incolora.

 En el tubo N° 4
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El Malonato (Inhibidor) agregado actúa a nivel del complejo II inhibiendo a la succinato

deshidrogenasa evitando la reducción del 2,6 diclorofenolindofenol. La muestra presenta un
color azul.

 En el tubo N° 5:
El cianuro de sodio (inhibidor) ha actuado sobre el complejo IV, por esta razón no hay
reducción en 2,6 diclorofenolindofenol. La muestra presenta un color azul.

 En el tubo N° 6
El barbiturato inhibe en el complejo I e impide que NADH done sus electrones a la CoQ.
Pero queda el ingreso por el complejo II y hay transporte de electrones por medio de FADH y
este seguirá la secuencia. La muestra presenta un color azul..

En el Sistema de incubación con el sustrato indicador p-Fenilendiamina

 El tubo N° 1:
Contiene solo p-Fenilendiamina (sustrato-indicador) y Buffer fosfato de sodio (amortiguador)
por lo que no hay reacción. Muestra incolora.

 En el tubo N° 2
La cadena respiratoria contenida en el homogenizado hepático (enzima) oxida a la p-
Fenilendiamina (marrón oscuro) luego este sigue transfiriendo los electronos por el resto de
la cadena transportadora.

 En el tubo ºN 3
El Cianuro de sodio (inhibidor) actúa a nivel de complejo IV, impidiendo que reciba los
electrones del Cyt c, donados por la p-Fenilendiamina, impidiendo que esta siga oxidándose,
manteniendo su color claro. Muestra incolora

 En el tubo ºN 4
El Malonato actúa en el nivel de complejo II inhibiéndolo, pero la p-Fenilendiamina dona sus
e- al Cyt c por medio del complejo I y esta pasa a oxidarse. La muestra presenta un color
marrón.

 En el tubo ºN 5
El Barbiturato de sodio inhibe la transferencia de e- de la NADH por el complejoI, pero la p-
Fenilendiamina dona sus e- por el complejo II oxidándose. La muestra presenta un color
marrón.

V. CONCLUSIONES

El Barbiturato de sodio impide la transferencia de e- a nivel de complejo I y II el

Malonato inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo II y el cianuro de sodio
inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo IV.
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Referencias bibliográficas

Anonimo.(17 de marzo de 2015). Wikipedia. Obtenido de Wikipedia:

https://es.wikipedia.org/wiki/Inhibidores_de_la_respiraci%C3%B3n
Anonimo.(22 de mayo 2016).Ocw-uma Obtenido de ocw-uma:
https://ocw.uma.es/ciencias/diseno-y-sintesis-de-compuestos-organicos-
bioactivos/miasignaturaocw/docs/Tema5