Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología

Microbiología I
Cátedra 1. Microbiología y Parasitología
Área de Virología

Seminario 14
MODELOS DE INFECCIONES PERSISTENTES
Virus hepatitis B
Virus herpes simplex
 OBJETIVOS

1. Conocer las relaciones entre estructura y

función de algunos virus que promueven
infecciones persistentes: HBV y HSV.

2. Conocer sus vías de transmisión y estrategias

de replicación viral.

3. Analizar los mecanismos inmunopatogénicos de

lesión.
4. Conocer los mecanismos de latencia y
cronicidad de las infecciones persistentes.
VIRUS HEPATITIS B
VIRUS HEPATITIS B

Horizontal
Sexual
Parenteral

Vertical
Perinatal
Congénita
ESTRUCTURA DE LA PARTÍCULA VIRAL

Nucleocápside (HBcAg)
Envoltura
ADN pdc
ADN polimerasa
X
S-HBsAg (Domino S)
M- HBsAg (Pre-S2+S) Partículas de Dane
L- HBsAg (Pre-S1+Pre-S2+S)

Partículas esféricas

Pre-S1
Pre-S2
S

Partículas filamentosas
 ESTRUCTURA DEL GENOMA DE HBV
Proteína L

Proteína M

Proteína S

ADNpdc

ATG ATG

traducción core

traducción precore

clivaje
REPLICACIÓN DEL GENOMA DE HBV
REPLICACIÓN DEL HBV
Taurocolato
de sodio

Carballal-Oubiña., Virología Médica. 2015

GENOTIPOS E IMPLICANCIAS MÉDICAS
GENOTIPO IMPORTANCIA MÉDICA
Frecuentemente asociado a cronicidad (mas que D y F), pero con mejor
A pronóstico, por remisión bioquímica sostenida
Edad de seroconversión HBeAg/anti-HBe es intermedia
Remisión bioquímica sostenida más probable después de la
B seroconversión HBeAg-antiHBe que el genotipo C.
Edad de seroconversión HBeAg/anti-HBe es muy tardía
Curso más agresivo. Alta tasa de CHC y cirrosis
C Seroconversión HBeAg/anti-HBe (a muy tardía edad) es predictiva de reactivación
Frecuentemente asociada con mutante en PreCore (codón STOP)
D Edad de seroconversión HBeAg/anti-HBe es muy tardía
Niños inmunizados desarrollan infecciones con cepas mutantes y
E salvajes: Gambia (1999 y 2008) y Argentina (2007)
Edad de seroconversión HBeAg/anti-HBe es muy temprana
Mediana de edad de Dx de CHC menor que con A-D. (22,5 vs 60 años)
F en nativos de Alaska sin asociación con mutaciones en el BCP
G Incapaz de sintetizar HBeAg.
H (I-J) ?
 TIPO DE INFECCIÓN POR HBV

INFECCIÓN CRÓNICA

< 0,1 % Estado de portador

Hepatitis B
RECIÉN inactivo / Fase de baja
ADULTOS crónica replicación viral
NACIDOS
2-6 % HBeAg (+)
8-10 % HBeAg (-)
Aguda Aguda
< 0,2 %
(2%) (90-99%) Cirrosis 2-3 %
compensada

Crónica Crónica 3-5 %

(~98%) (1-10%) Cirrosis 7-8 % Hepatocarcinoma celular
descompensada
20-50 %
20-50 Muerte
%
 INFECCIÓN AGUDA POR HBV (I)

Síntomas

T
I
T
U
L
O

Semanas post-exposición
 INFECCIÓN AGUDA POR HBV (II)
anti-HBc

HBe Ag anti-HBe

HBs Ag anti-Bs
Incremento en suero (% del valor máximo)

100

50 ALT
DNA de
HBV

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo post-infección (meses)

Fase de Enfermedad aguda Recuperación

Incubación De “Virología Médica”
Carballal & Oubiña, 2015
 INFECCIÓN CRÓNICA POR HBV (I)
Hepatitis B que evoluciona a la cronicidad
Curso serológico habitual

Fase Aguda Fase Crónica

TÍTULO

Años
Semanas post-exposición
 INFECCIÓN CRÓNICA POR HBV (II)
anti-HBc

HBe Ag anti-HBe

HBs Ag

10
Incremento en suero (% del valor máximo)

ALT
DNA de
HBV
50

0
0 10 20 30 40 50
Tiempo post-infección (años)

Inmuno- Fase Fase de Fase de

tolerancia inmunorreactiva baja alta
replicación replicación
De “Virología Médica”
Carballal & Oubiña, 2015
 MARCADORES SÉRICOS
Estadío HBs Ag Anti-HBs HBe Ag Anti-HBe Anti-HBc DNA HBV

Temprana + - + - IgM +
Infección aguda

Período ventana - - - +/- IgM +/-

Recuperación - + - + IgG +/-

Estado activo + - + - IgG-IgM1 >105copias/mL

Estado inactivo + - - + IgG <105copias/mL

Infección crónica

Reactivación + - +/- - IgG-IgM >105copias/mL

Con variante + - - + IgG >105copias/mL

HBe Ag-minus
Oculta - +/- - +/- +/- +

Vacunado -2 + - - - -

Infección pasada - + - - IgG -

1Se pueden llegar a detectar bajos niveles de IgM.
2El HBs Ag podría llegarse a detectar en forma transitoria en suero en las primeras 24 horas de haber recibido la vacuna.
 MARCADORES SÉRICOS
Estadío HBs Ag Anti-HBs HBe Ag Anti-HBe Anti-HBc DNA HBV

Temprana + - + - IgM +
Infección aguda

Período ventana - - - +/- IgM +/-

Recuperación - + - + IgG +/-

Estado activo + - + - IgG-IgM1 >105copias/mL

Estado inactivo + - - + IgG <105copias/mL

Infección crónica

Reactivación + - +/- - IgG-IgM >105copias/mL

Con variante + - - + IgG >105copias/mL

HBe Ag-minus Infección oculta: Individuos HBs Ag (-) con o sin
Oculta marcadores
- serológicos
+/- de previa
- infección
+/- por
+/-HBV (anti- +
HBs y/o anti-HBc) con DNA HBV detectable en suero o
Vacunado -2 + tejido hepático.
- - - -

Infección pasada - + - - IgG -

1Se pueden llegar a detectar bajos niveles de IgM.
2El HBs Ag podría llegarse a detectar en forma transitoria en suero en las primeras 24 horas de haber recibido la vacuna.
INMUNOPATOGÉNESIS

De “Virología Médica”
Carballal & Oubiña, 2015
 RESPUESTA INMUNE ANTIVIRAL
DEBIL
OLIGOCLONAL
VIGOROSA
POLICLONAL AGUDA
MULTIESPECÍFICA

VIGOROSA
POLICLONAL
MULTIESPECÍFICA

PERSISTENCIA DEBIL
OLIGOCLONAL

De “Virología Médica”
Carballal & Oubiña, 2015
 DETERMINANTES VIRALES QUE FAVORECEN LA
PERSISTENCIA
ALTA TASA DE MUTACIONES

ESCAPE A LA
RESPUESTA INMUNE
HUMORAL
Mutaciones en el HBsAg que impiden
la unión de anticuerpos anti-HBs
previos

ESCAPE A LA
Mutaciones en los epítopes RESPUESTA INMUNE
para linfocitos T CELULAR
 DETERMINANTES VIRALES QUE FAVORECEN LA
PERSISTENCIA
HBV con síntesis de HBeAg
ATG ATG

traducción core
HBcAg en el virión
traducción precore

clivaje
HBeAg soluble

Mutantes de precore sin síntesis de HBeAg

ATG TAG ATG

traducción core
HBcAg en el virión
trad-

Sin producción de
HBeAg
 MUTANTES DE PRE-CORE
Mutantes HBeAg (-)
ATG TAG ATG

traducción core
Sin producción de HBeAg
trad-

HEPATITIS FULMINANTE

Depósito de anticuerpos anti-HBc sintetizados in situ

Mutantes en el promotor Aumento en la replicación
basal del gen del core viral
Farci et al, PNAS 2010
 DETERMINANTES VIRALES
HBV CON SINTESIS DE HBeAg
ATG ATG

traducción core
traducción precore
HBcAg y HBeAg comparten epítopes
clivaje para CD4 y CD8

HBeAg atraviesa placenta

HBeAg induce respuesta TH2 y y llega al timo
produce depleción de TH1
específicas contra el HBcAg

TOLERANCIA
PERSISTENCIA Infección crónica en recién nacidos ~98 %
PATOGÉNESIS DEL CHC

Proteína X

Altera el
potencial de Aumento del
membrana Ca++ citosólico
mitocondrial

Liberación de
especies Cascada de
reactivas de señales
oxígeno

Activación de
factores de
transcripción

-Inhibición de la muerte celular

-Proliferación
-Transformación celular

De “Virología Médica”
Carballal & Oubiña, 2015
 FACTORES DE RIESGO
Factores asociados a un aumento del riesgo de progresión a la cirrosis
Del hospedador Virales Ambientales
 Edad avanzada  Alta tasa de replicación  Co-infección con HDV, HIV o HCV
 Sexo masculino viral  Consumo de alcohol
 Estado inmune  Genotipo (C > B; F)  Diabetes mellitus
 Variantes del HBV  Obesidad
(mutaciones en el
promotor basal del core)
 F progresión frecuente a
fibrosis
Factores asociados con riesgo aumentado de progresión al HCC
Del hospedador Virales Ambientales
 Edad avanzada  Alta tasa de replicación  Co-infección con HDV, HIV o HCV
 Sexo masculino viral  Consumo de alcohol
 Cirrosis  Genotipo (C > B; F)  Diabetes mellitus
 Historia familiar de  F progresión más rápida  Obesidad
HCC  Variantes de HBV  Tabaquismo
 Etnia (asiáticos, (mutaciones en el
africanos) promotor basal del core)
 Efecto transactivador de
X sobre genes celulares
 PATOGÉNESIS DE LAS MANIFESTACIONES EXTRA-
HEPÁTICAS

Inmunocomplejos Circulantes

Deposición de inmunocomplejos
en vasos sanguíneos, glomérulos HBsAg
y sinovia
HBsAg

Vasculitis y poliarteritis
nodosa
Reclutamiento mediado por
complemento y receptor Fc;
activación de células inflamatorias
Glomerulonefritis

Gránulos neutrofílicos, enzimas,

intermediarios reactivos de
Artritis
oxígeno
VIRUS HERPES SIMPLEX

Sanjuan, N. et al. Arch. Virol 91:329; 1986

 FAMILIA HERPESVIRIDAE
Sub- Virus Células blanco de la Células blanco de la
familia replicación productiva latencia
α HSV-1 Epitelial, queratinocito Neurona
HSV-2 Epitelial, queratinocito Neurona
VZV Epitelial, queratinocito, linfocito Neurona
T, monocito, endotelial,
Langerhans
β HCMV Macrófago, dendrítica, Célula pluripotencial
endotelial, músculo liso, hematopoyética (Stem cell)
epitelial, fibroblasto CD34+, macrófago

HHV-6 Linfocito T CD4 Célula pluripotencial

hematopoyética (Stem cell)
CD34+, macrófago
HHV-7 Linfocito T CD4 Linfocito T CD4
ɣ EBV Linfocitos B, epitelial Linfocito B
HHV-8 Linfocitos Linfocitos B
Penkert and Kalejta Herpesviridae 2011, 2:3
 FAMILIA HERPESVIRIDAE
SIMILITUDES
Morfología: ME (cápside, tegumento,
envoltura)
Estructura: grandes, envueltos, genoma DNA
de doble cadena y extenso.
Propiedades biológicas:
DNA polimerasa viral, Síntesis DNA y ensamblado en
núcleo
Latencia
Alteración de la respuesta inmune
Infecciones líticas, persistentes latentes
y –eventualmente, los γ- transformantes
Infecciones productivas con expresión
génica en cascada (IE, E, L)
En GENERAL las primo-infecciones ocurren en
edades tempranas (ej: HSV, CMV, EBV, VZV)
 infecciones de alta prevalencia en la
población general.
DIFERENCIAS
Enfermedades producidas
Células blanco de infección productiva vs
las de infección latente
Infección productiva  lisis celular (α) vs
efectos no líticos (en otros)
Estado genómico en la latencia
(episomal vs proviral)
Estrategias para el establecimiento y
mantenimiento de la latencia
Disponibilidad de vacunas y tratamiento
antiviral específico
 ESTRUCTURA DE LA PARTÍCULA VIRAL
150nm
Envoltura
Nucleocápside Tegumento

ADN

Envoltura

Cápside

Glicoproteína de superficie Glicoproteína de superficie

(gD) (gC)
Tegumento
Glicoproteína de superficie Glicoproteína de superficie
(gB) (gH, gL) Glicoproteínas

• ADNdc lineal en el virión (con extremos palindrómicos) y circular en el núcleo de la célula

• Cápside icosaédrica
• Tamaño genómico: 150-230 kb
• Virus grandes: Codifican 80-200 productos génicos
COMPARACIÓN DE GENOMAS VIRALES

TODOS LINEALES Y CON SECUENCIAS PALINDRÓMICAS QUE

HACEN QUE SE CIRCULARICEN DURANTE LA LATENCIA
 VIRUS HERPES SIMPLEX

Entrada
Enfermedades: Salida
Encefalitis
Queratitis
Encefaliti Entrada
Diseminación
s
Lesiones muco-cutáneas Salida
Latencia
Enfermedad
diseminada en el Diseminación
paciente
Latencia
inmunocomprometido

Entrada
Entrada
Enfermedad
con aparición Salida
de lesiones
recurrentes Diseminación
Herpes Latencia
neonatal

Medical Microbiology. 4th edition.

Baron S. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996.
 HSV-1 y HSV-2
HSV-1 HSV-2
Adquirido habitualmente Adquirido habitualmente
antes de los 6 años de edad luego de un contacto sexual

1) ~ 50% de homología. Son similares y no presentan

diferencias funcionales conocidas.
2) Usualmente causan infecciones asintomáticas
3) Se diseminan por contacto directo (NO hay diseminación
epidémica)
4) Permanecen en forma latente en cuerpos neuronales.
5) La respuesta inmune humoral específica no confiere
protección cruzada
REPLICACIÓN DEL HSV

α = inmediato tempranas: Paralizan el

metabolismo celular y bloquean las defensas
de la célula hospedadora

β = tempranas. Timidino quinasa (TK), DNA

polimerasa

γ = tardías. Proteínas estructurales (cápside,

tegumento, envoltura)
PATOGENESIS DEL HSV
 PROGRESIÓN DE LA INFECCIÓN (I)
LATENCIA
Ubicación en el núcleo
neuronal, donde el DNA
viral se encuentra en
estado episomal

Progresión intra-axonal retrógrada Recurrencias periódicas

ante estímulos
inespecíficos

Entrada por una terminal

de un nervio periférico

Ingreso en la mucosa
por microtraumas y
replicación en el epitelio
 RESUMIENDO: ESTABLECIMIENTO,
MANTENIMIENTO y REACTIVACIÓN

Establecimiento

Mantenimiento

Reactivación

ICP0:
• Favorece la transcripción del
genoma
• Induce la degradación deproteínas
involucradas en la represión del
genoma.
 ACTIVACIÓN DE HSV-1
VP16=TIF: Recluta factores de transcripción celulares y se
une a promotores de genes IE  Síntesis de proteínas 
(ICP0, ICP4, ICP22, ICP47)
En células neuronales está en citoplasma
HCF (podría fallar el transporte de VP16 al núcleo)

VP16
HCF

Oct-1 VP16
ZHANGFEI
TAATGARAT Genes IE (ICP0)
Promotor
Citoplasma
Núcleo
Oct-1: Baja expresión en neuronas, pudiéndose expresar
otras proteínas de la familia Oct que compiten con ésta
(pero que no pueden interactuar con VP16)
 LATENCIA (LAT-ICP0)

LATs (transcriptos asociados a la latencia):

• no tienen polaridad de mensajero
• no están asociados a neurovirulencia, aunque sí inhiben la apoptosis
neuronal.
ICP0: transactivador promiscuo de toda clase de genes del HSV.

IRL

ARNm ICP0

LATs
ROL DE LA RESPUESTA CELULAR EN LA LATENCIA

VP16 → Genes IE (ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47) LATs

Schiffer et al., Nature Medicine 19, 280–288 (2013)

Control epigenético de la latencia y la reactivación
 REACTIVACIÓN DEL HSV-1(I)
Estímulos inespecíficos para la recurrencia: radiación solar, stress, menstruación,
neurectomías, etc.
La inmunodepresión NO es un estímulo imprescindible para la reactivación.
NO hay necrosis neuronal en la reactivación

ICP0 → Genes IE →Genes E → Replicación ADN

↓
Genes L
↓
Virus

La recurrencia ocurre a veces por los

nervios sensoriales y llega a los lóbulos
temporales produciendo una encefalitis
herpética (causa más frecuente de
encefalitis esporádica en adultos
inmunocompetentes)
 TUTORÍA
Problema 1
Con el objetivo de dilucidar aspectos centrales de los mecanismos de patogenia del HBV se
han llevado a cabo diversos estudios empleando animales como modelo experimental. En
uno de estos, se utilizaron chimpancés que fueron infectados con el HBV por vía intravenosa.
Al cabo de unas semanas post-inoculación, los primates desarrollaron un típico cuadro de
hepatitis. Para analizar la cinética de replicación / eliminación viral y la cinética del desarrollo
de la enfermedad, se obtuvieron muestras de sangre y biopsias hepáticas semanalmente a lo
largo del curso de la infección. En la figura I se documentan las determinaciones realizadas.

Figura I. Curso de la infección por HBV en

chimpancés inoculados experimentalmente
Determinación cuantitativa (carga viral por PCR) del
DNA del HBV en hígado y análisis de la actividad de
la alanina aminotransferasa (ALT) en suero.
Análisis cualitativo del genoma viral (DNAccc e
intermediarios replicativos) en hígado (Southern
blot) y determinación de los niveles de RNA
mensajero de IFNγ y CD3 en hígado.
Microbiología y Parasitología I
Tutoría Seminario 14 - Virología

Problema 1

Con el objetivo de dilucidar aspectos centrales de los mecanismos de patogenia del HBV se han llevado a cabo diversos
estudios empleando animales como modelo experimental. En uno de estos se utilizaron chimpancés los cuales fueron
infectados con el HBV por vía intravenosa. Al cabo de unas semanas post-inoculación los primates desarrollaron un típico
cuadro de hepatitis. Para analizar la cinética de replicación/eliminación viral y la cinética del desarrollo de la enfermedad,
se tomaron muestras de sangre y biopsias hepáticas semanalmente a lo largo del curso de la infección. En la figura I se
documentan las determinaciones realizadas.

DNA viral Figura I

en hígado Curso de la infección por HBV en chimpancés inoculados
experimentalmente
ALT sérica A) Determinación cuantitativa (carga viral por PCR) del DNA del HBV en
Carga viral en hígado

hígado y análisis de la actividad de la alaninaaminotransferasa (ALT) en

ALT sérica

suero.
CARGA VIRAL LINK 1en inglés:
https://www.youtube.com/watch?v=YhXj5Yy4ksQ
A) Análisis cualitativo del genoma viral (DNAccc e intermediarios
Semanas post-infección replicativos) en hígado (Southernblot) y determinación de los niveles
de RNA mensajero de IFNγ y CD3 en hígado.
circular laxo

Genoma circular covalentemente cerrado

del HBV simple cadena
Pregunta 1
En base a los resultados observados en la Figura I conteste VERDADERO o FALSO

a. Tras la inoculación del HBV los chimpancés desarrollaron una infección crónica persistente.
b. El HBV es un virus citopáticoper se ya que como consecuencia de la replicación viral se produce un daño directo en el
hepatocito.
c. La destrucción de los hepatocitos es responsable de la reducción temprana del genoma viral en hígado.
d. Existe un control temprano No citolítico de la replicación del HBV el cual está asociado a la acción del IFNγ.
e. La injuria hepática es consecuencia de la respuesta de células T.

Para develar el rol de la respuesta de células T en la infección aguda por HBV, subsiguientemente se efectuaron más
estudios utilizando el mismo modelo y procedimiento experimental. Para ello se monitoreó semanalmente el curso de la
infección por HBV en primates inoculados a los cuales se les indujo la depleción temporal de LT CD8+ o LT CD4+ mediante
la administración de Acs monoclonales específicos anti-CD8 o anti-CD4 respectivamente. En la figura II se observa una
parte de los resultados obtenidos.

Figura II
Mab anti-CD8
Curso de la infección por HBV en chimpancés luego de la inoculación
experimental y la depleción transitoria de LT CD8+.
A) Determinación cuantitativa (carga viral por PCR) del DNA del HBV en
Semanas
post-infección hígado, análisis de la actividad de ALT en suero y recuento de LT CD3+
CD8+ en sangre periférica.
B) Determinación de los niveles de RNA mensajero de IFNγ y CD3 en
Semanas
post-infección
hígado.
C) Respuesta intra-hepática de LT CD8+ específicos productores de IFNγ
Respuesta intrahepática
de LT CD8+ específicos
obtenidos de biopsias hepáticas.
Mab anti-CD8

NOTA: El curso de la infección por HBV en los chimpancés con depleción

Semanas
post-infección transitoria de LT CD4+ fue casi idéntico al de los chimpancés del problema
anterior (Figura I).
Pregunta 2
Según los resultados obtenidos conteste VERDADERO o FALSO

a. La respuesta de LT CD8+ es imprescindible para el control de la infección y la eliminación viral.

b. Los LT CD8+ contribuyen en forma importante al control no citolítico de la replicación del HBV.
c. Los LT CD8+específicos son los responsables de la injuria hepática y la completa eliminación del DNA viral del hígado.

d. La completa eliminación del genoma del HBV del hígado estuvo asociada a una respuesta de LT CD8+ monoespecíficos.

Pregunta 3
¿Por qué mecanismos cree Ud. que el IFNγ promueve la eliminación viral del hepatocito?

Problema 2

Una paciente de 25 años consulta en la guardia por fiebre, cefalea, mialgias y disuria. En el examen físico se observa una
erupción localizada cutánea en la zona genital, formada por vesículas con contenido líquido claro.
Diagnóstico clínico: posible infección por virus herpes simplex (HSV)

Seleccione la o las respuestas correctas:

1- Basados en el examen físico cree Ud. que se trataría de una infección por Herpesvirus humano 1 o 2?Discuta posibles vías
de transmisión
2- ¿Cuál es el blanco principal de la infección productiva?
a) neuronas
b) células epiteliales
c) células dendríticas
d) células musculares
e) Fibroblastos
f) Linfocitos B

Dos años después consulta por una nueva aparición de vesículas genitales, aunque esta vez afebril, sin cefalea, ni
mialgias; la paciente sólo refiere una leve disuria. Manifiesta haber tenido relaciones sexuales sin protección.

3- Conociendo la patogenia de la infección Ud. deduce que se produjo:

a) Una nueva infección viral por un serotipo distinto.
b) Una reactivación desde la latencia
c) Infección persistente latente en el epitelio

Al recibir la respuesta del médico infiere que ha estado muy nerviosa debido a que ha intentado por varios meses quedar
embarazada y no lo ha podido conseguir.
4- ¿Cuáles son los factores que puede causar este nuevo episodio?
a) Nuevo ingreso del genoma viral en la neurona ganglionar
b) Estímulos externos
c) Expresión de LATs
d) Edad
5- ¿Qué información piensa Ud. que podría ser importante brindar a la paciente sobre el comportamiento del HSV en
recién nacidos?

a) La infección adquirida en el período perinatal es la menos frecuente.

b) La infección congénita es la menos frecuente entre las de transmisión vertical.
c) La infección del neonato es severa y frecuentemente fatal aún con tratamiento.