METODOLOGÍA

DÍA 1

Es necesario disponer de placas MacConkey, tubos con 5mL de agua

peptonada, por grupo.

 Se realiza un hisopado cloacal, introduciendo un hisopo estéril dentro de la cloaca.

Posteriormente se resuspende el hisopo en caldo nutritivo.

 Sacrificar el ave utilizando métodos humanitarios y realizar la necropsia de

acuerdo con los criterios establecidos en manuales de necropsia.

 Se seleccionan órganos que presentan lesiones compatibles con colibacilosis. Se

toma 1 g de muestra y se la resuspende en caldo nutritivo

 Sembrar por estría escocesa, por duplicado, en agar MacConkey. Incubar a 37°C

O/N.

DÍA 2

 A las colonias presuntivas de ser E coli, en los agares MacConkey y Levine, se

las resiembras en agar Sangre por estría escocesa.

 Incubar a 37°C O/N.

DÍA 3

 Es necesario contar con agua peptonada estéril. Se necesitan 4 tubos de ensayo de

5 mL por grupo. (2 para colonias de hisopado cloacal 2 para órganos).

1. Observar las morfologías macroscópicas coloniales. Verificar la presencia

de un solo tipo de colonia.

2. Realizar una tinción Gram de una colonia representativa de cada placa.

3. Realizar pruebas de catalasa y oxidasa.

 4. Inocular cuatro colonias presuntivas de E. coli (2 de cloaca y 2 de órganos)

en 5 mL de agua peptonada.

DÍA 4

Es necesario tener preparados 4 tubos de agar citrato, agar TSI en pico de flauta. Reactivo

de Voges Proskauer, Indol. Es necesario contar con glicerol estéril y tubos Eppendor

estériles,

1. De cada cultivo bacteriano, se procedente a realizar las siembras de acuerdo a lo

establecido en la práctica N° 4, en las pruebas de tubo.

2. Para las pruebas directas (Indol y PV). Tomar 1 mL de cada cultivo y añadir los

reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

3. Criopreservación de cepas: en tubos Eppendorf de 1.5 mL. Estériles, se añade 200

uL de glicerol estéril, y 800 uL del cultivo O/N. homogenizar bien y congelar a -

20°C en tubo rotulado (aislamiento, origen, fecha).

DÍA 5

1. Lectura de las pruebas bioquímicas. Confirmación de E. coli por medio del

Manual de Bergey´s
 RESULTADOS
Necropsia

AVE ENFERMA AVE SANA

En este caso observamos que el ave presenta
infección como es el caso de pericarditis,
sacos aéreos purulentos, hígado de color
verdoso, esplenomegalia e intestinos
hemorrágicos.
En esta ave se identificó que no tiene
ninguna afectación por infecciones a nivel
interno, es decir en los órganos ya que estos
presentan una coloración normal.

Toma de muestras

AVE ENFERMA
Hisopado cloacal Corazón

En este caso encontramos la presencia de En la siembra en agar Macconkey y Levine en el

microorganismos patógenos cual se pudo observar la la presencia de bacterias
presuntamente E. Coli. Se sabe que en la fermentadoras de lactosa. En este caso el corazón
cloaca del animal es el lugar que tiene fue uno de los órganos mas afectados con la
presencia de dicha bacteria. bacteria presuntamente Escherichia Coli.

Aislamiento de bacterias
Aislamiento de bacterias
Mediante la realización de siembras a partir de
disolución se observó la presencia de colonias
pequeñas, convexas y planas en el hisopado cloacal.
Estas colonias presentan una tonalidad roja lo cual da
positivo a bacterias fermentadoras de lactosa.

Colonia pura

En el caso de la siembra en agar MacConkey, como

en el agar Levine a partir de disoluciones en órganos
de necropsia (corazón) se obtuvo crecimiento de la
bacteria aislar. Posiblemente esto es debido a que la
infección avanzó a colonizar los órganos o porque se
trata de infección vírica.

En la siembra en agar MacConkey aplicando la

técnica de estría escocesa se logró obtener colonias
separadas, logrando así la presencia de colonias puras
de la bacteria estimada. Esto nos permitió observar
colonias circulares, pequeñas con una elevación
convexa y fermentadora de lactosa.
A su vez la observación de un color verde metálico
en el agar Levine ante la presencia de la bacteria E.
Coli que se adapta a este agar selectivo.
Pruebas en placa
Prueba Resultado
Gram Esta prueba es realizada para ver si el cultivo es
realmente puro. Para la realización de esta prueba
se utilizó diferentes reactivos como cristal violeta
(1 min), Yodo (30 seg), etanol (5s) y safranina (2
min). una vez realizado todo el proceso de manera
adecuada y ya seca la placa se procede a observar
al microscopio donde se identificó que los dos tubos
poseían bacterias Gram negativas que poseen forma
de bacilos con morfología microscópica
homogénea.

Pruebas bioquímicas
Prueba Gráfico Interpretación
Citrato En esta prueba no se observó una
(Cloaca y variación en la coloración (verde a
Corazón) azul), por lo cual se asume que es una
reacción con resultado negativo ya
que no hay presencia de bacterias.

TSI -
A/A; H2S ; gas +
(Cloaca y
Corazón)
Ácido

Producción de gas

Ácido
Indol Se presenta un anillo purpura o
(Cloaca y rosado en la superficie de la muestra
Corazón) colocado en el tubo, lo cual significa
que es positivo.

Formación de
anillo (positivo)

LIA En este tubo observamos en la parte

(Cloaca y del pico la alcalinidad que se muestra
Corazón) con la coloración purpura (K), y otra
parte alcalina en la parte final del
tubo de color Purpura (K). También
se muestra la ausencia de la
coloración negra (H2S-)

K/K H2S -

Motilidad Observamos en dichos tubos la

(Cloaca y presencia de movilidad de las
Corazón) bacterias

Positivo (+)

Urea Debido a la observación de la

(Cloaca y coloración natural de la urea
Corazón) (amarrillo) llegamos a la conclusión
que es:
Negativo (-)
 Tabla de los datos finales

BACTERIA MCK GRAM O/F INDOL CITRATO TSI LIA UREA MOTILIDAD

E. Coli Lactosa + Bacilos Anaerobio Positivo (+) Negativo (-) A/A K/K Negativo (-) Positivo
(Cloaca y Corazón) gram - Facultativo H2S- H2S - (+)
GAS +
 DISCUSIÓN
Obtener un aislamiento selectivo de Escherichia Coli a partir de hisopado cloacal y

órganos de necropsia en muestras aviares requiere de un proceso establecido para llegar

a la adquisición de un cultivo puro de mencionada bacteria, para lo cual se inicia con el

hisopado cloacal de una ave enferma con sintomatología de colibacilosis para

posteriormente ejecutar la necropsia, la cual nos permitió confirmar la patología ya que

en nuestra ave enferma se encontraron órganos que fueron altamente afectados como fue

el caso de pulmón , intestino, bazo, corazón, hígado y que según lo mencionado por

(Carranza, León, Falcón, Neumann, & Kromm, 2012) afirman que colibacilosis en estado

avanzado es caracterizado por lesiones multiorgánicas, tales como aerosaculitis asociada

a pericarditis, perihepatitis y peritonitis, que resulta en alta morbilidad y mortalidad. El

hisopado cloacal y necropsia de un ave sana dieron como resultado negativo para

Escherichia Coli ya que en base a lo mencionado por los autores anteriormente citados,

colibacilosis se presenta con lesiones en varios órganos, situación que no sucedió en los

órganos del ave presuntamente sana ya que se mostraron con su morfología y coloración

normal además no presentar ningún tipo de crecimiento bacteriano tanto en agar

MacConkey como Levine.

El crecimiento bacteriano en Escherichia Coli fue ejecutado en dos medios de cultivo

como son el agar MacConkey y el agar Levine a partir de muestras como corazón, y

cloaca, de los cuales ambos medios nos permiten el aislamiento selectivo para E. Coli

debido a que el primero es un medio selectivo para bacilos Gram negativos de tipo

entérico y en donde dicho aislamiento dio colonias pequeñas, circulares y con una

elevación convexa, que a su vez eran fermentadoras de lactosa. Todo lo cual guarda

relación con el metabolismo de E. coli de acuerdo a Borie et al., (2007) . El agar Levine

según Condori, Pérez, Catalán, & Campo, (2015) mencionan que es un medio adecuado
para el crecimiento de enterobacterias, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram

positivas y permite la diferenciación de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de

lactosa, dando lugar a colonias incoloras, las no fermentadoras, y colonias de color verde

metálico, las fermentadoras, datos que nos permiten confirman que en nuestras placas

Levine existe la presencia de E. Coli al mostrarse la coloración verde con brillos

metálicos al ser dicha bacteria una lac +. Todo esto complementado con Tinción Gram

nos permitió confirmar a las bacterias en base a su coloración roja-rosada como Gram

negativas y por su morfología como bacilos, características que se asemejan con

Escherichia Coli.

Según lo mencionado por Mollinedo & Gonzáles, (2014) las pruebas bioquímicas

permiten la identificación y reconocimiento de una bacteria determinada debido a que

muestran parte del metabolismo de cada diferente tipo bacteria, otorgando de esta forma

la seguridad de un aislamiento selectivo de E. Coli en la práctica realizada ya que según

los resultados definitivos en las pruebas bioquímicas , se obtuvieron negativo para citrato,

positivo para indol y motilidad en tanto que para TSI se obtuvo A/A H2S - GAS + y por

su parte LIA dio K/K H2S – tanto para corazón como para cloaca y que con los datos

establecidos en el manual de Bergey se asocia en su totalidad a Escherichia Coli

BIBLIOGRAFÍA

Borie, C., Monreal, Z., Guerrero, P., Sanchez, M. L., Martinez, J., Arellano, C., & Prado,
V. (2007). Prevalencia y caracterización de Escherichia coli. Archivos de Medicina
Veterinaria. https://doi.org/10.4067/S0301-732X1997000200005

Carranza, C., León, R., Falcón, N., Neumann, A., & Kromm, C. (2012). Caracterización
y distribución de cepas de Escherichia coli. Scielo, 23(2), 209–219.

Condori, M., Pérez, G., Catalán, M., & Campo, A. (2015). Aislamiento y caracterización
de Escherichia coli O157 en productos cárnicos. Sciencedirect, 13(2), 56–65.
 Retrieved from
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0325754115000486

Mollinedo, M., & Gonzáles, M. (2014). Revista de Actualización Clínica Volumen 49

2014 BACTERIAS GRAM NEGATIVAS. Revista de Actualización Clínica, 49,
2609–2613.