María J. Contreras C.I 21.667.

099

Análisis:
Caracterización de una cepa SP1 de Pseudomonas putida resistente al
mercurio, aislada en el mar y su posible aplicación en la reducción del
mercurio marino
Weiwei Zhang y Lingxin Chen y Dongyan Liu

Los autores del presente estudio, hacen mención a la importancia sobre

el mercurio y su alto nivel de contaminación sobre el ambiente por medio de
actividades antropogénicas. Además, resaltan que en ambientes marinos la
contribución antropogénica ha aumentado los niveles de mercurio hasta un
92%. Es por ello, que existe la línea de investigación que estudia la
trasformación de mercurio en metales menos tóxicos a partir de bacterias
resistentes al mercurio, especialmente Pseudomonas putida , como potencial
en bioremediación de ambientes contaminados con dicho metal pesado,
aunque existan diversas bacterias resistentes a mercurio que han sido aisladas,
como especies de los géneros Pseudomonas, Staphylococcus, Bacillus ,
y Escherichia. De dichos géneros, se ha observado el contenido
de operones mer que generalmente se encuentran en transposones,
plásmidos, o los cromosomas bacterianos. La resistencia de estos operones
mer, se debe a la absorción de Hg 2+ en el citoplasma por MerT y MerP y
luego la reducción de Hg 2+ al Hg 0 relativamente inerte y menos tóxico, por
MerA, la enzima mercurico reductasa.
Adicionalmente, se mencionan los factores que afectan la trasformación
del mercurio por baterías, como lo son temperatura, pH, concentraciones de
iones y fuentes de carbono que pueden afectar los sistemas de transformación
mer. Estudios han indicado que el pH es un factor importante que afecta
significativamente la concentración de mercurio biodisponible, existiendo
mayores concentraciones de mercurio acumulado en las bacterias con la
disminución de pH. Por lo anteriormente dicho, el presente estudio se basó en
describir el aislamiento y la identificación de la cepa bacteriana resistente al
mercurio SP1 de ambiente marino, y la clonación y localización de su
mer operón: teniendo como objetivo, investigar la alta resistencia de SP1 al
mercurio y otros metales pesados, la alta eficacia en la eliminación de
HgCl 2 por SP1, y los efectos de pH en la expresión de merA y en la
transformación de Hg 2+ a Hg 0. .Además, también se exploró el potencial de
la cepa bacteriana resistente al mercurio SP1 para ser utilizado para la
eliminación de Hg 2+ del ambiente marino.

Con respecto a los materiales y métodos utilizados: las cepas

bacterianas
Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento y químicos

Agua de mar recogida de la zona costera de Yantai en Shandong La provincia

de China se concentró de 10 a 20 veces filtración a través de una membrana
de filtro de 0,45 μm de tamaño de poro y chapado en medios 2216E (5 g de
triptona, 1 g de extracto de levadura, 0.01 g FePO 4 , 1 L de agua de mar
envejecida) complementado con 1.2% agar La placa se incubó a 28 ° C
durante 2 a 3 días.
Pseudomonas fluorescens TSS (Hu et al. 2009) ; Wang et al.2009 ; Zhang et
al. 2009 ), un patógeno acuícola que puede infectar varias especies de peces, y
el mercurio aislado cepa resistente se cultivaron a 28 ° C en 2216E líquido
medios de comunicación. La cepa Topcher de Escherichia coli se cultivó a 37
° C en Luria-Bertani (LB) media. A menos que se indique lo contrario, todos
productos químicos utilizados en este estudio fueron comprados a Sangon
(Shanghai, China). El plásmido de clonación TA pMD18-T era comprado de
Takara.

Manipulación del ADN

La extracción de ADN del gel de agarosa se realizó de acuerdo a la
instrucción del kit Sangon. ADN genómico de SP1 se extrajo de acuerdo con
el método descrito previamente (Syn y Swarup 2000 ) El gen 16S rRNA se
amplificó por PCR usando los cebadores 8F y 1492R de acuerdo al método
descrito por Lane et al. ( 1985 ). Cuando el TA se empleó la estrategia de
clonación, los productos de PCR purificados se ligaron directamente en
pMD18-T. La secuenciación era llevada a cabo por Nuosai Sequencing
Company (Beijing, China)

Detección de volatilización bacteriana de HgCl 2

Un método simplificado de película de rayos X para detectar la producción
ción de Hg 0 por SP1 se llevó a cabo según lo descrito por Nakamura y
Nakahara ( 1988 ). En resumen, SP1 y TSS fueron suspendido en tampón de
fosfato 0,07 M (pH 7,0) que contiene EDTA 0,5 mM, acetato de magnesio 0,2
mM y 5 mM tioglicolato de sodio e incubado en poliestireno placa de
microtitulación con 18? M HgCl 2. El plato estaba cubierto con película de
rayos X (Kodak) en un cuarto oscuro a 28 ° C durante durante la noche. Las
áreas de niebla en la película fueron el resultado de la reducción de
la emulsión de Ag + por vapor de mercurio liberado por la bacteria.

Tolerancia al metal y a los antibióticos y mínima inhibitoria concentraciones

(MIC)
Los metales y antibióticos utilizados en este estudio son los siguientes:
HgCl 2, AgCl, CdCl2, CoCl2, CrCl 3, CuCl 2, PBCL 2, ZnSO 4, ampicilina (Ap),
kanamicina (Kn), cloranfenicol (Cm), y tetraciclina (Tc). La capacidad de SP1
y SP1M para crecer en medios que contienen metales, excepto HgCl 2 o
antibióticos fue probado al agregar estos químicos a los siguientes
concentraciones: 0.01 mM, 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM y 10
mM. Para HgCl 2 , las siguientes concentraciones Se incluyeron las siguientes
técnicas: 50 μM, 100 μM, 200 μM y 300 μM. El crecimiento de las bacterias
se controló después de SP1 fue cultivado a 28 ° C por 48 h. El mínimo
inhibitorio las concentraciones de metales y antibióticos se definieron como
concentraciones más bajas que no causaron bacterias visibles crecimiento
(Murtaza et al., 2002 ).

Determinación de la eliminación de mercurio por SP1

El SP1 se inoculó en agua de mar o en medios 2216E que contenían 280? M
HgCl 2 y se cultivaron a 28 ° C durante 48 h, respectivamente. El sobrenadante
y el sedimento celular se recogieron por centrifugación gación. El sedimento
celular se resuspendió en tampón de lisis [PH 100 mM NaH 2 PO 4, Tris-Cl 10
mM, y 8 M urea (8.0)] durante 1 h y luego se centrifugó a 13,000 rpm durante
10 min para recolectar mercurio asociado a células. Los niveles de ambos
mercurio restante en el sobrenadante y la célula el mercurio asociado se
determinó utilizando un vapor frío espectrómetro de absorción atómica (AAS
de vapor frío) (AFS- 3000, Kchg, China). Para determinar el efecto del pH en
el eliminación de mercurio, SP1 se inoculó en medio de pH que van desde 5.0
a 9.0 y cultivadas a 28 ° C durante 48 h. los niveles de mercurio restante en el
sobrenadante y el el mercurio asociado a células se determinó como se
describe encima.

Clonación y localización del operón mer

Tres pares de cebadores (merF1 y merR2, merF2 y merR3, y merCF1 y
merR4) enumerados en la Tabla 1 fueron diseñado de acuerdo con
la secuencia mer de mercurio-cepas resistentes
de Pseudomonas / Xanthomonas aisladas de una mina de mercurio en
Kirgizia, Asia Central, presentada al Centro Nacional de Información
Biotecnológica (NCBI) con el número de acceso X98999 comunicado por
Kholodii et al. ( 1997 ) Los productos de PCR se separaron, purificaron y
luego se ligó a pMD18-T. E. coli transformantes fueron seleccionado y la
secuenciación del fragmento de ADN fue llevado fuera. Para determinar la
localización del operón mer , se llevó a cabo el curado del plásmido y el
análisis por PCR. Plásmido albergado en SP1 fue noqueado según el método
descrito por De et al. ( 2003 ) para generar la tensión SP1M.
Los plásmidos se aislaron de SP1 y SP1M usando el método de Kado y Liu
( 1981 ). SP1M fue verificado para ser un derivado de SP1 mediante análisis
16S rRNA. Reacciones de PCR utilizando el ADN genómico de SP1, SP1M y
plásmido extraído como plantilla se llevaron a cabo usando cebadores
merAF1 y merAR1, respectivamente (Tabla 1 ).
PCR en tiempo real (RT-PCR) para analizar la expresión de mera
Para determinar si el 16S rRNA era un apropiado control interno, se llevó a
cabo la transferencia del punto norte descrito por Zhang et al. ( 2008 ) con
modificaciones menores.
RT-PCR se llevó a cabo según lo descrito por Zhang ( 2008) )
El ARN se extrajo de las células utilizando el aislamiento total de ARN
sistema (Invitrogen). RT-PCR se llevó a cabo en un ABI 7500 sistema de
detección en tiempo real (Applied Biosystems) por utilizando
el kit SYBR Premix Ex Taq RT-PCR (Takara). Los cebadores utilizados para
RT-PCR del gen merA eran merRTF1 y merRTR1 (Tabla 1 ) 16S rRNA fue
amplificado con cebadores 933F y 16SRTR1 (Tabla 1 ). Análisis de
disociación de los productos de amplificación se realizó al final de cada PCR
se ejecuta para confirmar que solo un producto de PCR fue amplificado y
detectado. El ciclo de umbral comparativo método (2)
- △△ CT método) se utilizó para analizar el relativo expresión de ARNm
Determinación de LD 50 por infección experimental
Para determinar si la retención de SP1 en el medio ambiente fue patógeno, se
determinó LD 50 de SP1 usando platija y rodaballo como modelos
animales. LD 50 fue determinado como fue descrito por Wang et
al. ( 2009) ) En resumen, SP1 era Cebador Secuencia (5 '→ 3')
Referencia
merF1
TAAGACTGCTGCTGGTAGTGGGTG
Kholodii et al. ( 1997 )
merR2
GCGAGCCGCTTAGGGATTGTAT
Kholodii et al. ( 1997 )
merF2
TGCTGCCTCTGTTTGCTGGACT
Kholodii et al. ( 1997 )
merR3
GCCCGATACCGGACTCAAAGG
Kholodii et al. ( 1997 )
merCF1
CATATGGCAAATCCTCTCAATC
Este estudio
merR4
CCCGATGCACGCCCGGAATCTTCT
Este estudio
merRTF1
TACCGCCGTCTGGATCAGTTCTCCT
Este estudio merRTR1
CGAAACCGACAGCCGCACCTT
Este estudio merAF1
CATATGACCGAACTGAAAATCATTGGTAT
Este estudio
merAR1
CTCGAGCCCTGCGCAGCAGG
Este estudio
933F
GCACAAGCGGTGGAGCATGTGG
Zhang et al. ( 2008 )
16SRTR1
CGTGTGTAGCCCTGGTCGTA
Zhang et al. ( 2008 )
8F
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
Zhang y Sun ( 2007 )
1492R
GGTTACCTTGTTACGACTT
Zhang y Sun ( 2007 )
Tabla 1 Cebadores utilizados en este estudiar cultivado a un OD 600 de 1.0 y
suspendido en esterilizado solución salina tamponada con fosfato
(PBS). Lenguado saludable y rodaballo (aproximadamente 11 g) se criaron a
una temperatura de 20 a 22 ° C en agua de mar y se alimenta diariamente con
pellets secos comerciales. Treinta platija o 30 rodaballos fueron divididos
aleatoriamente en cinco grupos (seis peces por grupo) respectivamente e
inyectados intraperitonealmente (ip) con 100 μL de suspensión de SP1 de
concentraciones que van desde 5,0 × 10 8 a 5.0 × 10 10 CFU mL -1
. La mortalidad fue monitoreada durante un período de 14 días después del
desafío y el LD 50 se determinó utilizando la herramienta de análisis Probit del
software SPSS 15.0 (SPSS Inc., EE. UU.).

Análisis de desarrollo de biofilm

La capacidad de TSS y SP1 para formar biofilms en un
Se determinó el plato de microtitulación de poliestireno (Costar, EE. UU.)
como fue descrito por Xu et al. ( 2006 ) En resumen, TSS y SP1 fueron
cultivado en una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos a 28 °
C durante 12 hy 24 h, respectivamente. Las celdas no conectadas eran lavado
cinco veces con PBS. Las celdas adjuntas fuerontratado con fijador de Bouin
durante 1 hora y teñido con 1%solución violeta cristal durante 30 min. Las
placas fueron luego enjuagadas con agua corriente y cristalina violeta se
disolvió en etanol durante 30 min. La absorbancia a 570 nm fue medido con
un espectrofotómetro ultravioleta y visible (Beckman, EE. UU.)
Búsqueda de bases de datos y acceso a la secuencia de nucleótidos
números para el ARNr 16S y el operón mer Busca similitudes de secuencia de
nucleótidos y aminoácidos se llevaron a cabo utilizando los programas
BLAST del NCBI

Las secuencias de nucleótidos de los genes 16S rRNA y mer operón de SP1 se
han depositado en la base de datos de GenBank con los números de acceso
HM217131 y HM217134. El aislado SP1 se depositó en la Microbiología
General de China. Colección de cultura ecológica (CGMCC, Beijing, China,
número de acceso CGMCC no. 3887).

Resultados
Detección, aislamiento e identificación genética de bacteria resistente al
mercurio El agua de mar recolectada se sembró en un medio sólido 2216E
suplementado con 18? M HgCl 2. Después de la incubación a 28 ° C
durante 2 a 3 días, apareció una colonia resistente a HgCl 2 y
fue nombrado SP1. Para verificar genéticamente la identidad de SP1
y posicionar aún más el aislado dentro del género o especie, el
16S rRNA genes de SP1 fueron amplificados por PCR y la
Los productos de PCR se purificaron y se enviaron directamente para
secuenciación Comparación con el gen 16S rRNA conocido
los datos de secuencia indicaron que el 100% coincide con el 16S
secuencia del gen rRNA de SP1 fueron los de P. putida DSM
1819, tipo cepa de P. putida , P. putida KT-ql-116 y
WXZ-19 y Pseudomonas sp. cepas JW60.1a y
VS05_36, cuyo número de acceso era Z76667,
FJ611926, EF440613, FN556575 y FJ662897, respectivamente
tively Estos resultados indicaron que SP1 es miembro de P.
putida
Clonación y localización del operón mer de P. putida SP1
Un fragmento de 2.817 pb amplificado utilizando merF1 / merR2 como
cebadores, un fragmento de 2.601 pb amplificado con merF2 / merR3
como cebadores, y un fragmento de 561 pb amplificado usando merCF1 /
merR4 como cebadores se muestran en la Fig. 1a . El ADN amplificado
fragmento fue secuenciado y ensamblado. Análisis de la
el nucleótido secuenciado demostró que compartía el 99%
identidad con el operón mer ubicado en Tn5041. los
fragmento de ADN clonado de P. putida SP1 contenía merR
y el operón mer incluyendo el merT , merP y
genes merA , el gen accesorio merC y la función
gen orfY desconocido . La localización del operón mer era
demostrado estar en el cromosoma de P. putida SP1, como PCR
amplificación del gen merA con cebadores merAF1 y
merAR1, utilizando el ADN cromosómico del plásmido
falta la cepa SP1M como plantilla, mostró un resultado positivo
señal y amplificación por PCR del gen merA , utilizando
plásmido extraído de P. putida SP1 como plantilla, mostró
una señal negativa (Fig. 1b) ) No hubo reducción en el metal
y resistencia a antibióticos en la cepa P. putida SP1M comparada
con P. putida SP1, lo que sugiere que la resistencia múltiple
determinantes también se localizaron en el cromosoma bacteriano
algunos (Tabla 2 )
Fig. 1 Clonación del operón mer de P. putida SP1 ( a ) y detección de
plásmidos y el gen merA de P. putida SP1 y SP1M ( b ). un ADN
marcador ( carril 1 ), marcador de ADN ( carril 2 ), fragmento de ADN
amplificado con
cebadores merCF1 y merR4 ( carril 3 ), fragmento de ADN amplificado con
cebadores merF2 y merR3 ( carril 4 ), fragmento de ADN amplificado con
cebadores merF1 y merR2 ( carril 5 ). b Los plásmidos se extrajeron de P.
putida SP1M ( carril 1 ) y SP1 ( carril 2 ), marcador de ADN ( carril 3 ), el
El gen merA se amplificó con los cebadores merAF1 y merAR1 usando
ADN genómico de P. putida SP1M ( carril 4 ), ADN genómico de SP1
( carril 5 ) y plásmidos ( carril 6 ) como plantilla, respectivamente
1308
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Características de crecimiento de P. putida SP1 y SP1M
Caracterizar el crecimiento de bacterias en medios que contienen
HgCl 2, las cepas se cultivaron a 28 ° C con agitación
(120 rpm), ya sea con 18? M HgCl 2 añadido a los medios de comunicación
a una DO 600 de 0,2 o sin HgCl 2 añade como un control.
Los patrones de crecimiento de P. putida SP1 y SP1M en el
medios que contienen HgCl 2 se muestran en la Fig. 2 . Cuando HgCl 2
se agregó a los medios en un OD 600 de 0.2, hubo un
fase de retraso prolongada en el crecimiento de P. putida SP1. los
crecimiento de P. putida SP1 luego entró en una fase exponencial
y alcanzó la misma densidad celular máxima que P. putida
SP1 crecido en medios sin HgCl 2 . Sin embargo, el crecimiento de
otra cepa Pseudomonas TSS, que se conoce como
cepa bacteriana sensible al mercurio, se inhibió por completo
por la adición de 18? M HgCl 2. El crecimiento de P. putida
SP1 y SP1M era lo mismo en los medios que no lo hicieron
contener HgCl 2 . En presencia de HgCl 2 , crecimiento de P.
putida SP1M mostró la misma tendencia que P. putida SP1. Eso
también poseía una fase de latencia larga y luego ingresó un
fase de crecimiento exponencial. Inesperadamente, en el retraso tardío
fase y a lo largo de la fase de crecimiento exponencial,
el crecimiento de P. putida SP1M fue ligeramente mejor que el de P.
putida SP1.
Tolerancia a metales y antibióticos de P. putida SP1 y SP1M
El crecimiento de P. putida SP1 en los medios modificados con
diferentes concentraciones de HgCl 2 se muestran en la Fig. 3 . PAG.
putida SP1 creció más lentamente con el aumento
concentración de HgCl 2 modificada en los medios. Después
siendo cultivado por 48 h, P. putida SP1 obviamente mostró
crecimiento en los medios modificados con 200 μM de HgCl 2 , pero
mostró un ligero crecimiento en los medios modificados con 300 μM
HgCl 2 . Por lo tanto, la CIM de HgCl 2 para P. putida SP1 fue
encontrado que es 300 μM, lo que sugiere que P. putida SP1 era
altamente resistente al mercurio. Ambos P. putida SP1 y SP1M
fueron probados para metal y tolerancia a antibióticos. Los MIC
de AgCl, CdCl 2 , CoCl 2 , CrCl 3 , CuCl 2 , PbCl 2 , ZnSO 4 , y
antibióticos Ap, Kn, Cm y Tc para P. putida SP1 y
SP1M se enumeran en la Tabla 2 . Estos resultados indicaron que
ambos P. putida SP1 y SP1M son capaces de crecer en 2216E
medios que contienen altas concentraciones de CdCl2, CoCl2,
CrCl 3 , CuCl 2 , PbCl 2 y ZnSO 4 , respectivamente, y esa P.
putida SP1M no demostró resistencia reducida a
cualquiera de estos metales o antibióticos en comparación con P. putida
SP1.
Tabla 2 Tolerancia de SP1 y SP1M a metales y antibióticos a

Metal / antibióticos
MIC (mM)
HgCl 2

0.3
AgCl
0.01
CdCl 2

1
CoCl 2

1
CrCl 3

8
CuCl 2

2
PbCl 2

1
ZnSO 4

1
Ampicilina
0.6
Kanamycin
0.62
Cloranfenicol
0.6
Tetraciclina
0.1
a El MIC para SP1M es el mismo comparado con el de SP1 que se muestra en
la mesa
Fig. 2 Crecimiento de bacterias resistentes al mercurio ( P. putida SP1 y
SP1M)
cepa sensible al mercurio ( TS fluorescens TSS) en los medios 2216E.
HgCl se añadió a una DO de 0,2 a la concentración final de 18? M.
2 600

Los símbolos indican crecimiento de P. putida SP1 en ausencia de

HgCl ( relleno
2

cuadrados ), en presencia de HgCl ( cuadrados abiertos ), crecimiento de P.

2

putida
SP1M en ausencia de HgCl ( triángulos rellenos ), en presencia de
2

HgCl ( triángulos abiertos ) y crecimiento de P. fluorescens TSS en ausencia

2

de HgCl _ { ( círculos rellenos ), en presencia de HgCl _ { ( círculos

2} 2}

abiertos ).
Se tomaron alícuotas en diferentes momentos para mediciones de
absorbancia a 600 nm. Los datos son los medios para al menos tres
independientes
experimentos y se presentan como los medios ± SE
Fig. 3 Efecto de la concentración de HgCl en el crecimiento de P.
2

putida SP1.
P. putida SP1 se cultivó en medios 2216E modificados con diferentes
concentraciones de HgCl . Se tomaron alícuotas en diferentes puntos de
2

tiempo para
la medición de la absorbancia a 600 nm. Los datos son los medios para en
al menos tres experimentos independientes y se presentan como los medios ±
SE
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Eliminación de HgCl 2 por P. putida SP1
Para determinar la mayor concentración de HgCl 2 que P.
putida SP1 fue capaz de tolerar, varias concentraciones de HgCl2
traciones entre 200 μM y 300 μM se enmendaron en
los medios de comunicación. El resultado demostró que P. putida SP1 creció
bien en 2216E medios que contienen 280? M HgCl 2 (Fig. 3 ) PAG.
putida SP1 fue luego inoculado en agua de mar pura
que contiene 280? M HgCl 2 y se incubaron durante 48 h. los
la concentración remanente de HgCl 2 en el agua de mar era entonces
medido por AAS de vapor frío. Estos resultados mostraron que
89% del mercurio total fue eliminado por P. putida SP1. A
investigar la supervivencia de P. putida SP1 en agua de mar, 1.0 ×
10 8 CFU mL
-1
de P. putida SP1 se inoculó en
agua de mar que contiene 280? M HgCl 2, y alícuotas se
tomado en varios puntos de tiempo para mediciones OD 600 y
recuento de placas. Los resultados mostraron que el número de
la bacteria fue más alta en los primeros días debido a la restante
nutriente introducido en el agua de mar y disminuido con el tiempo
(Fig. 4 ) El método simplificado de la película de rayos X se utilizó para
determinar si Hg 0 se formó. P. putida SP1 claramente
indujo una reacción de volatilización en el tampón que contiene
HgCl 2; sin embargo, no se observó reacción en el control
pozos o en pozos que contienen P. fluorescens TSS, el
cepa sensible al mercurio (Fig. 5 )
Para mejorar la eficiencia de la eliminación de mercurio por P.
putida SP1, esta cepa fue inoculada en 2216E fresca
medios, incluyendo 280 M HgCl 2. Después de agitar a 28 ° C durante
48 h, tanto el mercurio restante en el sobrenadante y
el mercurio asociado a células se sometió a AAS de vapor frío
para determinar el nivel de mercurio. El mercurio restante
concentración en el sobrenadante fue 0,23 μM, y la
la concentración de mercurio en el sedimento celular fue de 0,383 μM.
Estos resultados indicaron que al agregar nutrientes al agua de mar,
se logró un aumento integral en la eficiencia, con
casi el 100% del mercurio total eliminado del acuático
ambiente. Se formuló la hipótesis de que el Hg 2+ eliminado por
P. putida SP1 se transformó en Hg 0 por el operón mer
de P. putida SP1 y luego Hg 0 difundido fuera del cultivo.
Efectos del pH sobre el crecimiento de P. putida SP1 y el
eliminación de HgCl 2 por P. putida SP1
Para determinar el efecto del pH sobre el crecimiento de P. putida
SP1, esta cepa fue inoculada en medios de pH que varían
de 4.0 a 10.0 y crecido a 28 ° C durante 48 h. Como se muestra en
Tabla 3 , el crecimiento de P. putida SP1 mostró un amplio rango
de pH permisivo entre 5.0 y 9.0. El pH óptimo para
el crecimiento de P. putida SP1 en medios sin HgCl 2 fue
6.0-7.0; sin embargo, P. putida SP1 creció mejor en álcali débilmente
medios de pH 8,0-8,5, en presencia de 18? M HgCl 2.
La Tabla 3 muestra el pH final del cultivo de P. putida SP1
crecido durante 48 h en medios de pH diferente con o sin
HgCl 2 . El crecimiento de P. putida SP1 afectó el pH del
medios de comunicación. Después de P. putida SP1 se cultivó durante 48 h, la
final
El pH del cultivo se movió a un ambiente alcalino y
aumentó 0.14-1.55 unidades, respectivamente. Los medios de ácido
El pH varió con el amplio rango y los medios de pH alcalino
variado con el rango pequeño.
Para determinar el efecto del pH en la eliminación de HgCl 2
por P. putida SP1, los medios de pH que van desde 5.0 hasta 9.0 fueron
usado. El mercurio eliminado en cada punto de pH se expresó
como el porcentaje del mercurio que se agregó inicialmente
en los medios. Como se muestra en la Tabla 3 , los resultados indicados
esa condición alcalina, pH que variaba de 8.0 a 9.22, era
más adecuado para P. putida SP1 para eliminar HgCl 2 . los
eficacia de eliminación de P. putida SP1 a pH inicial de 8,0 y
9.0, cuyo pH final correspondiente fue 8.40 y 9.22,
respectivamente, fue significativamente mayor que la eliminación
eficiencia a pH inicial de 7.0, cuyo pH final correspondiente
fue 7.68. La diferencia en la eficiencia de eliminación en ácido y
las condiciones neutrales fueron insignificantes. Por lo tanto, el resultado
indicó que la condición alcalina podría facilitar P. putida
SP1 para eliminar HgCl 2 , y condición ácida y neutra conducida
Fig. 4 Supervivencia de P. putida SP1 en agua de mar que contiene 280 μM
HgCl . Se tomaron alícuotas en diferentes momentos después de la
2

inoculación
y midió la absorbancia a 600 nm. Los datos son los medios para en
al menos tres ensayos independientes y se presentan como los medios ± SE
Fig. Captura película 5 de rayos X de volatilizado HgCl P. putida SP1 y P.
2.

Los fluorescentes TSS se inocularon en un microtitulador de poliestireno de

96 pocillos
placa que contiene medios modificados con HgCl . El plato era entonces
2

cubierto con una película de rayos X (Kodak) en el cuarto oscuro a 28 ° C

durante
durante la noche
1310
Appl Microbiol Biotechnol (2012) 93: 1305-1314

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a la reducción en la eficacia de eliminación de mercurio de P. putida
SP1.
Efecto del pH en la expresión de merA
Para investigar el efecto del pH sobre la expresión de merA , a
cultivo de P. putida SP1 (OD 600 de aproximadamente 0,5) fue
dividido en cinco partes y centrifugado a 10.000 rpm para
5 min para recolectar la bacteria. Luego se agregaron las bacterias
en medios de pH diferentes que van desde 5.0 a 9.0. Después
siendo cultivado por otros 15 minutos, el crecimiento de P. putida
SP1 en los medios de pH diferente no fue significativamente
diferente ( P > 0.05) y no se observó cambio de pH.
El ARN total se extrajo de las células cosechadas en diferentes
condiciones de crecimiento y se utilizan para el análisis de transferencia
northern
de la transcripción de rRNA 16S y análisis de RT-PCR de merA
expresión de ARNm El resultado del borrón de puntos del norte usando
cantidades iguales de ARN mostraron que las diferencias en el
los niveles de transcripción del rRNA 16S estaban entre 0.9- y
1.5 veces entre las cepas de P. putida SP1 cultivadas en diferentes
pH, lo que sugiere que el pH apenas afectó la transcripción de
16S rRNA de P. putida SP1. Por lo tanto, 16S rRNA se utilizó como
un control interno en el análisis RT-PCR de merA . Como
se muestra en la Fig. 6 , la expresión de merA fue significativamente
influenciado por las fluctuaciones de pH y el nivel de ARNm
aumentado con la disminución del pH. La expresión de merA
fue fuertemente estimulado particularmente cuando el pH del
los medios fueron inferiores a 7.0.
LD 50 y análisis de desarrollo de biofilm
Para estimar si P. putida SP1 era de baja virulencia o
cepa no patógena utilizada para la biorremediación, el LD 50
de P. putida SP1 se determinó y desarrollo de biofilm-
ensayos de desarrollo se llevaron a cabo. Tanto platija como rodaballo
fueron desafiados con 100 μL de diferentes concentraciones
de la suspensión de P. putida SP1 y se controlaron durante
mortalidad. Aunque diferentes dosis de inyección exhibidas variaron
número de muertos, platija y rodaballo comenzaron a morir en el
cuarto día y la muerte duró hasta el séptimo día cuando el
el pescado fue desafiado con 5.0 × 10 9 CFU P. putida SP1
(Fig. 7 ). No se observó muerte cuando los dos tipos de peces
fueron desafiados con 5,0 × 10 7 CFU P. putida SP1. los
gráfico de supervivencia indicó que tanto lenguado como rodaballo
mostró muerte pronta después de ser desafiado con P. putida
SP1. LD 50 de P. putida SP1 se calculó usando el Probit
herramienta de análisis del software SPSS 15.0. LD 50 de P. putida
SP1 a platija o rodaballo fue 1.5 × 10 9 CFU, que era un
dosis relativamente alta. También comparamos la capacidad de P.
Tabla 3 Efectos del pH en el crecimiento de P. putida SP1 y eliminación de
Hg por SP1
2+

PH inicial
PH final
Absorbancia relativa OD (%)
600 a

Porcentaje de Hg eliminado (%)

2+ b

- Hg 2+

+ Hg 2+
- Hg2+

+ Hg 2+

3.93 ± 0.01
-
-
-
-
-
4.93 ± 0.02
6.42 ± 0.04
5.45 ± 0.16
100.00
87.97 ± 4.82
79,78 ± 1,55
5,94 ± 0,06
7.06 ± 0.04
6.71 ± 0.02
109.01 ± 9.81
87.43 ± 1.55
83.33 ± 6.82
7.05 ± 0.04
7.80 ± 0.02
7.68 ± 0.02
99,72 ± 7,53
87.43 ± 6.21
81.33 ± 5.36
8.06 ± 0.03
8.47 ± 0.16
8.40 ± 0.09
95.41 ± 6.24
94.42 ± 5.67
99.57 ± 5.04
8.97 ± 0.05
9.25 ± 0.17
9.22 ± 0.06
85.67 ± 8.61
85.09 ± 3.82
96.86 ± 4.38
9.99 ± 0.04
-
-
-
-
-
a La absorbancia relativa OD 600 se expresa como porcentaje de la absorbancia del cultivo de P. putida SP1 cultivado a pH 5.0 en
ausencia de HgCl 2

b El porcentaje de Hg 2+ eliminado por P. putida SP1 se expresa como el porcentaje de la concentración inicial de Hg 2+ que se
añadió a los medios de
pH diferente
Fig. 6 Efecto del pH sobre la expresión de merA . P. putida SP1 era
propagado a 28 ° C a una OD de 0.5 y las células fueron recolectadas por
600

centrifugación Las células se resuspendieron en medios de pH que van desde

5,0 a 9,0 con 18 M HgCl y se cultivaron a 28 ° C para otro
2

15 minutos. El ARN total se extrajo de las células y se usó para RT-PCR. los
El nivel de ARNm de merA se normalizó con respecto al rARN 16S. Los
datos son
los medios para tres experimentos independientes y se presentan como el
medios ± SE
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1311

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putida SP1 para formar una biopelícula con la de P. fluorescens TSS.
El resultado demostró que aunque P. putida SP1 podría
desarrollar biofilm, la producción de biofilm de P. putida SP1 fue
De 1 a 3 veces menos en comparación con la biopelícula producida por P.
fluorescens TSS. El tiempo de incubación prolongado no dio como resultado
aumentos en las biopelículas desarrolladas por P. putida SP1, a diferencia
el creciente patrón de producción de biofilm de P. fluorescens
TSS.
Discusión
Muchas bacterias resistentes al mercurio han sido aisladas de
varios entornos y se ha demostrado que tienen
aplicaciones prometedoras en la eliminación de mercurio en ambos
laboratorios
escalas de planta piloto y experimental (Von Canstein et al., 1999 ;
Wagner-Döbler 2003 ; Barkay y Wagner-Döbler 2005 ;
Mortazavi et al. 2005 ; Pepi et al. 2010 ). Cepas bacterianas
con potencial para ser utilizado para la biorremediación fueron pensados
someterse a presiones de selección en presencia de antibióticos,
metales pesados y solventes orgánicos (Hideomi et al., 1977 ).
En este estudio, la cepa bacteriana P. putida SP1 pudo
sobrevivir en medio 2216E enmendado con 280 μM HgCl 2 . PAG.
putida SP1 también exhibió mayores niveles de resistencia a
antibióticos y una variedad de metales pesados tóxicos que hizo el
cepa Pseudomonas sp., Proteus sp., Aeromonas sp.,
Enterobacteriaceae sp., Y Xanthomonas sp. descrito
previamente (De et al., 2003 ; Bafana et al., 2010 ). Para nuestro
conocimiento, esta fue la mayor concentración de HgCl 2
que las Pseudomonas sp. las tensiones podrían tolerar. Comparado
con P. putida Spi3 aislado de sedimentos fluviales, P.
putida SP1 podría eliminar el mercurio en una mayor eficiencia en
mayor concentración de NaCl. NaCl a la concentración de
menos de 24 g L -1 fue adecuado para P. putida Spi3 para eliminar
mercurio; sin embargo, P. putida SP1 podría eliminar casi
100% de Hg 2+ del agua de mar, en la que la concentración de
El NaCl es de hasta aproximadamente 36 g L -1 (Von Canstein y
otros, 1999 ). PAG.
putida SP1 posee un operón mer como resistente al mercurio
determinante como la mayoría de las otras bacterias resistentes al mercurio,
y el operón mer de P. putida SP1 se encuentra en el
ADN cromosómico como se describe en otras cepas (De et al.
2003 ; Bafana et al. 2010 ). Debido a múltiples genes de resistencia
a menudo se encuentran en elementos genéticos móviles (Mindlin et al.
2001 ; Perdiz et al. 2001 ; Barkay et al. 2003 ) Y genes
codificación de resistencia a metales pesados menudo están vinculados a
genes de resistencia a antibióticos en el mismo elemento móvil
(Mindlin et al. 2002 ;. Barkay et al 2003 ), la similitud
entre el mer operón de P. putida SP1 y el mer operón
situado en Tn5041 sugirió que el medio ambiente
bacteria P. putida SP1 puede haber adquirido este cromo-
Somal mer operón y otro metal pesado o antibiótico
determinantes de resistencia a través de elementos transponibles que
conferir resistencia a HgCl 2 y una variedad de otros xenobióticos.
Como un factor ambiental importante, el pH ha sido
previamente estudiado por su efecto en la reducción bacteriana de
Hg 2+ (Mortazavi et al. 2005 ) En este estudio, se encontró que
condiciones alcalinas eran condición óptima para P. putida SP1
para volatilizar Hg 2+ , que era consistente con el hecho de que P.
putida SP1 era una cepa aislada de medio ambiente marino.
Expresión de merA fue facilitado en condiciones ácidas,
tal como pH 5,0. Este hallazgo es consistente con la
estudios previos que más Hg 2+ , el factor necesario
La Fig. 7 Curva de supervivencia de floun-
der ( un ) y el rodaballo ( b ) después de la
peces fueron desafiados con dife-
concentraciones rentes de P. putida
suspensión SP1. platija y
rodaballo se inyectaron ip con
100 l de P. putida SP1 sus-
pensión de 5,0 × 10 CFU ml
8

-1
,
1,0 × 10 CFU ml
9
-1
, 5.0 ×
10 CFU ml
9

-1
, 1,0 ×
10 CFU ml
10

-1
y 5,0 ×
10 CFU ml
10

-1
. La mortalidad fue
monitoreado durante un período de
14 días después del desafío
1312
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inducir la expresión de merA , acumulado en la célula con
la disminución del pH (Kelly et al. 2003 ; Ahn et al. 2010 ).
Teniendo en cuenta todos estos resultados, se sugirió que,
además de la expresión de merA y la concentración de
Hg 2+ acumulado en las bacterias, la transformación de Hg 2+
por P. putida SP1 también puede requerir otro detoxifica- específica
reacciones ción para contribuir a su capacidad para volatilizar Hg 2+ ,
tales como la producción de DNDPH por bacterias.
bacterias resistentes al mercurio son una alternativa importante
herramienta para la biorremediación debido a su simplicidad, la falta de
contaminación secundaria, y de bajo costo en comparación con
otras tecnologías de tratamiento (Singh et al. 2008 ) A pesar de que
P. putida SP1 estaba presente a nivel apenas detectable en
nicho marina oligotrófica, todavía volatiliza 89% del total
mercurio. La mayor eficiencia que se logra por la
Además de los nutrientes en el agua de mar era debido en parte a la
aumentando gradualmente la población de P. putida SP1 en el
ambiente. Como varios aislados de P. putida fueron recientemente
notificado a ser de importancia patógena (Bouallèguea et
Alabama. 2004 ; Altinok et al. 2006 ), se estimó el pathoge-
nicity de P. putida SP1 para asegurar su uso para la biorremediación.
La DL 50 de P. putida SP1 a dos tipos de importancia marina
pescado era 1000 veces mayor que la LD 50 de P. fluorescens
TSS (10 6.1 ) (Wang et al. 2009 ), lo que demuestra que P. putida
SP1 se atenuó drásticamente en su bacteriana general
virulencia y potencialmente era una cepa bacteriana con baja
patogenicidad. Además, como biofilm es uno de los más
parámetros importantes asociados con la patogénesis, la
reducción del desarrollo de biopelículas por P. putida SP1 en comparación
con P. fluorescens TSS, cuya biopelícula se había demostrado
implicadas en la patogénesis, reforzado aún más la noción
que P. putida SP1 era una cepa de baja virulencia que podría ser
utilizado en la biorremediación en marina mercurio contaminado
ambientes (Parsek y Singh 2003 ; Hu et al. 2009 )
Agradecimientos sinceramente Agradecemos al Dr. L. Sun del Instituto de
Oceanología de la Academia China de Ciencias y su laboratorio para
amable ayuda en el suministro de la cepa bacteriana P. fluorescens TSS. Esta
trabajo fue apoyado financieramente por los Proyectos de Innovación de la
china
Academia de Ciencias conceder KZCX2-EW-206 y KZCX2-YW-Q07-
04, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF)
subvención
20975089, y el Programa de 100 talentos de la Academia China de
Ciencias.