Obsah

NMR spektroskopie a NMR

spektrometr
Aplikace v kapalné fázi
Využití v tuhé fázi
Další techniky

1
 NMR spectroscopy
Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is
a widespread tool in chemistry for the study of chemical
structure.
NMR

Solution state NMR Solid state NMR

•structure and dynamic •structure of molecules and
of molecules intermolecular packing
•polymorphs
2
 NMR spectroscopy

Nondestructive analytical method, for which many

possibilities are typical:

• to measure in liquid and solid state

• to measure spectra of different isotopes (1H, 13C, 15N,
19F, 31P ….)

• to perform different experimental techniques

• to apply in 1D, 2D, 3D experiments

3
 Frequency of NMR spectroscopy

• Energy is related to the frequency of electromagnetic radiation by…

Magnetic active isotopes: DE = h n

Odd number of protons or n = g Bo / 2p
neutrons DE = g h Bo / 2p
(1H, 13C, 15N, 19F, 31P…)

• For isotop 1H is this frequency by using commercial magnets (2,35 – 21,14

T) in the range 200-950 MHz.

g-rays x-rays UV VIS IR m-wave NMR

10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 100 102

wavelength (cm)
4
 Chemical shift differences

• Gyromagnetic ratio of different nuclei

– different types of nuclei resonate at different areas of the spectrum:  = g
B0

resonance
frequency 400 300 200 100 0

MHz 1H 19F 31P 13C 15N

400.000 161.923 100.577 40.531
376.308

5
 If b state contains 106 spins, state a contains 106+ surplus

21,14 T The higher magnetic

900 MHz field
b allows to excite
11,74 T
more
500 MHz spins – increasing
5,87 T sensitivity of
250 MHz
Bo = 0 NMR experiments
Bo
Population of the energy
levels –Bolztmann
40 spins equation

DE / kT
80 spins Na / N b = e
a
DE = g h Bo / 2p

144 spins 6
Influence of magnetic field on NMR spectrum

The higher magnetic

field –
1. The higher
resolution of NMR
spectra
2. The higher
sensitivity

7
 500 MHz –
Suitable compromise of resolution, sensitivity and price

8
800 MHz
900 MHz
9
ss NMR

500 MHz
NMR probes for liquid phase
•1 mm TXI
•5 mm TXO

11
 NMR tubes for liquid state
•5 mm
•1 mm
The size of NMR tube •10 mm
is corresponding to
the amount of sample and
to the sensitivity of
observed nucleus

12
 Basic parameters of NMR spectra

• Chemical shift

•Integral intensity

•Multiplicity

13
 Chemical shift
• Influence of different chemical environment created
magnetic field, which effected every isotope of the same
type

HO-CH2-CH3

downfield upfield

frequency o shielding s
14
 Intensity and multiplicity
O
• The ratio of intensity of signals H3C
corresponds to the ratio number
of protons in the molecule O 3
CH3
2 3
• Simple rule n+ 1 for spins with
I=1/2

• 2 protons of CH2 group split CH3 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
group to 2 + 1 = 3 lines (triplet)
• 3 protons of CH3 group split CH2
group to 3 + 1= 4 lines (quartet)

• CH3CO group has no protons

beside, therefore no spliting
(singlet)

4.10 4.00 1.30 1.20

15
 13C solid-state NMR of alanine
O

CH3
OH
without decoupling 1H decoupling
NH2

static

COOH CH3

CH

spinning speed 5 kHz

16
 ss NMR
Řez supravodivým magnetem
 ss NMR

CP/MAS Diagonála krychle

Z
54.7°

a Y

MAS = Magic Angle Spinning  význam pro zúžení linií

CP = Cross Polarisation  zesílení signálu: γI/γS
1H  13C : 4 x
1H  15N : 10 x gyromagnetický poměr
 ss NMR

Magic Angle Spinning: technická realizace

Dr
iv
e
B0 Be
ar
in Drive
g

Dr
iv
Be e
ar
in
g
Optics
•Řez (Princip) •Pohled shora
MAS Rotory

• Čím menší poloměr –

tím větší možná
úhlová rychlost,
ale menší citlivost
• Každé jádro vyžaduje
jinou rychlost
 Příklad - vývoj a výroba
Risedronát Na PO3H2
OH
PO3HNa xH2O
N

31P CP/MAS NMR

forma A + H

forma H

forma A

amorf
 Příklad - vývoj, výroba, péče o portfolio
Atorvastatin Ca - charakteristika
- Terapeutická kategorie: Antihyperlipoproteinemikum

- Biofarmaceutický klasifikační system: BCS II

O
OH OH O

(R) (R)
NH
N O- Ca2+
H H

FF
2
 Příklad – atorvastatin Ca
PXRD 13C CP/MAS NMR 19F MAS NMR
Counts
ATV_form I

1000

krystal I krystal I
500
krystal I
0
ATV_form VIII

1000

krystal VIII krystal VIII

500
krystal VIII
0 ATV_amorphous
6000

4000
amorf
2000
amorf amorf
0
10 20 30

Position [°2Theta] (Copper (Cu))

Counts
ATV_T_Atorvastatin_163+164 0020505 40 ref zaznam
ATV_T_validace_7+8 placebo ref zaznam

tablety
Atorvastatin - amorphous form

30000
tablety tablety
placebo
amorfní API
20000

placebo placebo
10000

amorfní API amorfní API

0
10 20 30

Position [°2Theta] (Copper (Cu))

 Příklad – atorvastatin Ca
2
O O 1/2 Ca
1
2
13
HO
3
4
12
HO
5
6
17
16 18 7
F

14
N 14
14 8
17
18 9
23 22
15
14 10 O

15
15 HN
11 14 19
20 15
15
19

15 21

amorfní forma

krystalická forma VIII

13C CP/MAS NMR spektra krystalických forem I, VIII a amorfu

(API)
 Příklad – atorvastatin Ca
2
O O 1/2 Ca
1
2
13
HO
3
4
12
HO
5

krystalická forma I
6
17
16 18 7
F

14
N 14
14 8
17
18 9
23 22
15
14 10 O

15
15 HN
11 14 19
20 15
15
19

15 21

amorfní forma

krystalická forma VIII

19F MAS NMR spektra krystalických forem I, VIII a amorfu (API)

 Příklad – atorvastatin Ca
2
O O 1/2 Ca
1
2
13
HO
3
4
12
HO
5

krystalická forma I 16
17
18 7
6

14
N 14
14 8
17
18 9
23 22
15
14 10 O

15
15 HN
11 14 19
20 15
15
19

15 21

amorf

léková forma

13C CP/MAS NMR spektra lékové formy, krystalické formy I a amorfu -

signály API jsou překryty signály pomocných látek
 Příklad – atorvastatin Ca
2
O O 1/2 Ca
1
2
13
HO
3

krystalická forma I 12
HO
5
4

6
17
16 18 7
F

14
N 14
14 8
17
18 9
23 22
15
14 10 O

15
15 HN
11 14 19
20 15
15
19

15 21

amorfní forma + 10% formy I

amorfní forma

15N CP/MAS NMR spektra krystalické formy I a směsi amorfní formy

s 10 % krystalické formy I, 7mm kyveta
 Příklad – atorvastatin Ca
2
O O 1/2 Ca
1
2
13
HO
3
4
12
HO
5

40mg API/540 mg F 16
17
18 7
6

14
N 14
14 8
17
18 9
23 22
15

krystalická forma I
14 10 O

15
15 HN
11 14 19
20 15
15
19

15 21

pomocné látky + amorfní forma + 5% formy I

s protonovým decouplingem

excipienty + amorfní forma + 5% formy I

bez protonového decouplingu

19F MAS NMR spektra krystalické formy I a modelové směsi pomocných

látek s 5 % krystalické formy I (jen 0,07 % celk. hmotnosti vzorku)
 Amorphous form and
NMR
• Changes in the molecular mobility of amorphous drugs
can lead to recrystalization of all or part of the material.
• Instability of amorphous form is possible to detect by
means of NMR.

Wax and paraffin are amorphous.

29
 Příklad – atorvastatin Ca
XRPD metoda – verifikace složení – amorfní forma
Counts Counts
ATV_amorphous ATV_amorphous
6400
ATV_1% crystal I
ATV_3% crystal I
ATV_5% crystal I

6400

3600

1600
3600

400
amorfní forma směs 1 – 5%
1600
forma I v amorfní formě
0
10 20 30 10 20 30

Position [°2Theta] (Copper (Cu)) Position [°2Theta] (Copper (Cu))

Counts Counts
ATV_form I ATV_amorphous
ATV_1% crystal VIII
ATV_3% crystal VIII
ATV_5% crystal VIII
900

6400

400 forma I
100

0
ATV_form VIII
3600

900
forma VIII Mixtures 1 – 5%
400 form VIII in amorphous form
100
1600

0
10 20 30 10 20 30

Detegovatelný je přídavek 1% krystalické formy.

Position [°2Theta] (Copper (Cu)) Position [°2Theta] (Copper (Cu))
 Solvates

• Solvates are not truly polymorphic forms but they are

sometimes said to be in a pseudo-polymorphic
relationship.
• Some solvates are readily desolvated without destroying
the basic structure whereas in other cases desolvation leads
to complete breakdown of the structure.
• Solvation or desolvation can occur during the manufacture
of drugs (especially during processing and formulation)
and their storage.
31
 Salts

• Another interesting area for pharmaceutical industry is

salt formation.
• Anorganic and organic salts can be distinguished.
• Chemical structure can be easily determined by the NMR
spectroscopy.

32
13C ss NMR of different forms of
Esomeprazol
(base, Mg salt form A, B)

Mg salt - form
B

Mg salt - form A

Base

33
 NH4 salt

Na salt

Meloxicam

13C CP/MAS NMR spectra

34
 Crystallic NH4 salt

Amorphous NH4 salt

Meloxicam

13C CP/MAS NMR spectra

35
 * Spinnig sidebands

NH4

Crystallic NH4 salt

* *
*

Amorphous NH4 salt

Meloxicam- 3 nitrogen
* * * *

15N CP/MAS NMR spectra – the proof of presence of NH4 salt

36
 * Signals of acid

*
Adipate * *

* * *
Lactate

Oxalate *

Base

37
 Analysis of salts

H H
O N N
N
COOH
NH
COOH N
H COOH
COOH

base

1:1

2:1

38
 HO OH

O (S,S)
HOOC COOH
S
N

base

1:1

2:1

39
Comparison of original and
generic form

40
 13C ss NMR – Tahor – Sortis- ATV Eu
230510A

Avicel 101,
102
ATV

Lactose Mg stearate

41
• Spectroskopie NMR je účinná metoda ve farmaceutickém
výzkumu a vývoji pro:
• Kapalná fáze
– Identifikace API
– Identifikace API v lékové formě
– Identifikace nečistot
– Vytváření podkladů pro DMF
– Podpora klinických studií – struktura metabolitů
– Podpora syntézy – vývoj chemických procesů
– Identifikace excipientů
– Identifikace excipientů v lékové formě
– Charakterizace polymerů
– Charakterizace komplexů a jiných asociálů
• Tuhá fáze
– Identifikace API
– Identifikace API v lékové formě
– Identifikace excipientů
– Identifikace excipientů v lékové formě
– Podpora stabilitních studií
– Detekce polymorfů a polymorfní čistoty API jak v substanci, tak i v lékové
formě
– Monitorování hydratace
– Charakterizace solí a solvátů
42
MS X-ray

NMR NMR
Liquid solid

IR,
Raman

43