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Máster en Biotecnología

Biotecnología Vegetal

Resistencia de Pisum sativum var. tiraberque al hongo


briotrofo Erysiphe pisi a través de su transformación
mediada por Agrobacterium tumefaciens

Salvador Osuna Caballero


b12oscas@uco.es
ÍNDICE

Introducción ...................................................................................3

Objetivos ........................................................................................7

Material y métodos ........................................................................7

Resultados esperables y discusión ...............................................13

ANEXO .......................................................................................14

Bibliografía ..................................................................................15

2
Introducción
El guisante (Pisum spp. L.) (Fig.1) pertenece a la familia Fabaceae, la tercera familia más amplia
entre las angiospermas con 650 géneros y unas 18.000 especies [1]. La especie cultivada de
guisante (P. sativum spp. Sativum) es una especie herbácea y sus hojas compuestas tienen un
número de foliolos variable (1-7) con zarcillos terminales y dos estípulas en la base (Fig. 1 y 2a),
aunque existen variaciones (Fig. 2b).

Figura 1. Guisante coultivado (Pisum sativum L.) Fuente: Atlas des plantes de France (1981).

Figura 2. Biotipos de guisante. A) P. sativum spp. Sativum cv. Messire con hojas compuestas con 2
foliolos; B) variedad áfila P sativum spp sativum cv. Radley.
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El origen de su domesticación del guisante (P. sativum) se sitúa en el Mediterráneo, concretamente
en Oriente Medio, siendo uno de los primeros cultivos domesticados hace unos 10.00 años [2].
Este se cultiva principalmente en las regiones templadas, siendo la cuarta leguminosa más
cultivada del mundo [3]. Su consumo se realiza myoritariamente en seco, cultivándose en 6-6,5
millones de hectáreas a lo largo de 97 países y produciendo un rendimiento medio de 1.500 kg/Ha
durante el año 2012 [4]. Aunque Europa y Asia son los continentes que dedican una mayor
superficie al cultivo, son Norte América y Europa los mayores productores de guisante debido a
los bajos rendimientos que se obtienen en Asia (Fig. 3) [5].

Figura 3. Producción global media de guisante para consumo en seco por continentes desde 1992 – 2012.

El guisante se desarrolla de forma óptima en climas templados y relativamente húmedos, aunque


su distribución puede alcanzar grandes altitudes en los trópicos soportando temperaturas que van
desde los 7 a los 30 ºC [6]. La temperatura óptima de crecimiento ronda los 16 – 21 ºC durante el
día y 10 - 16 ºC durante la noche [7].

Los fertilizantes con nitrógeno no suelen ser necesaria debido a la simbiosis del guisante con la
bacteria Rhizobium leguminosarum, que se encuentra comúnmente en los suelos españoles.

Las leguminosas constituyen una tercera parte del aporte proteico de la dieta humana y llegan a
constituir la fuente única de proteínas en la dieta de algunas regiones de Asia y África [8]. El
guisante juega un papel importante en los sistemas agrícolas mundiales dado su elevado valor
energético (50% de alimdón y 5% de azúcares simples), contenido proteico (23-25%) y los escasos
insumos necesarios para su cultivo.

Dentro de la familia de las leguminosas, el guisante se clasifica dentro de una rama que es conocida
como proteaginosas. Según las estimaciones de la Secretaría General Técnica del MAPAMA, la

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superficie de proteaginosas en la campaña de 2016/2017 se redujo un 4% frente a la campaña
anterior, hasta cerca de las 210 mil hectáreas.

Debido al incremento de los rendimientos, la producción de proteaginosas prevé un aumento de


cerca del 37% sobre la campaña anterior hasta alcanzar las 354 mil toneladas. Siendo por ello, el
guisante, la proteaginosa más cultivada en España con casi el 75% de superficie (Fig. 4 y 5).

Los principales productores de guisante en España son principalmente Castilla la Mancha,


Andalucía y Castilla y León.

Figura 4. Producción de proteaginosas en España en miles de toneladas.

Figura 5. Superficie de proteaginosas en España en miles de hectáreas.

El cultivo del guisante se ha visto afectado desde su domesticación por diferentes estreses bióticos
y abióticos que provocan grandes pérdidas de rendimiento. Entre los diferentes estreses bióticos
que afectan al cultivo destacan el ataque de patógenos causantes de enfermedad, las plagas de
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insectos y el ataque de plantas parásitas. Aunque el guisante es objetivo de enfermedades como la
fusariosis vascular, ascoquitosis, etc… en este trabajo tratamos el Oídio provocado por Erysiphe
pisi D.C. Esta es una enfermedad de dispersión aérea que tiene distribución mundial [9] aunque es
especialmente importante en regiones donde los días son cálidos y secos y las noches frías y
húmedas [10]. E. pisi disminuye la biomasa total de la planta y su rendimiento [11] causando
pérdidas severas entre el 25 – 50 % [12]. Las mayores pérdidas de rendimiento se producen cuando
se realizan siembras tardías o se siembran cultivares de maduración tardía, ya que en estos casos
el ataque del patógeno coincide con el llenado de grano.

Con respecto al grano de la planta ya infectada, se produce una maduración acelerada haciendo
que los valores nutricionales, propiedades fisicoquímica y recolección del grano se vean en gran
medida afectados. Cuando la infección alcanza un estadío más grave es cuando se produce la
decoloración del grano (Fig. 6).

No solo el oídio afecta a la calidad de la semilla de guisante y a la planta, sino que la calidad en el
proceso del grano también se ve comprometida. Las semillas que se encuentren son capaces de
contaminar a semillas que se hallen en buen estado por lo que un control en el almacenamiento del
grano del guisante resulta primordial.

La enfermedad afecta a todas las partes verdes de la planta. Los primeros síntomas aparecen en
pequeñas manchas en los folíolos y las estípulas para más tarde seguir creciendo y volverse de
color blanco-gris superficie de la planta.

Hoy en día, los métodos más usados para el control de esta enfermedad son una siembra temprana,
el uso de agentes fúngicos y cultivos sólidos generados a partir de cruzamientos.

Figura 6. Cuando el ataque es muy intenso, las vainas se pueden ver tan afectadas que la enfermedad
acaba introduciéndose en el grano.

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Objetivos
Generar plantas de Pisum sativum variedad tirabeque (comercial) resistentes a Erysiphe pisi a
través de la introducción del gen MtREP1 de Medicago trunculata utilizando la bacteria
Agrobacterium tumefaciens como vector.

Material y métodos
Vegetal:

Se utilizará la variedad de guisante comercial denominado “tirabeque”, perteneciente al grupo de


madurez II, resultante de los cruzamientos entre Fayette X Hardin. Sobre la base de su capacidad
para la inducción de embriones somáticos primarios, cultivos embriogénicos proliferativos y la
recuperación de plantas enteras, esta variedad ha sido reconocida como un genotipo competente
para la transformación.

Bacteriano:

Se utilizará la cepa de Agrobacterium tumefasciens EHA105 (supervirulenta) portando el plásmido


pCambia 2300 (Cambia vectors) (fig. 7). Como selección bacteriana el gen que le otorga
resistencia al antibiótico Kanamicina (Kanamycin R) y como selección in planta el gen de
resistencia los antibióticos Neomicina y Kanamicina (NPTII). El gen de interés será MtREP1 y su
promotor VaEDS1 [12].

Figura 7. Mapa del plásmido pCAMBIA 2300. Tiene una longitud de 8742 pb. En la región MCS tiene
un sitio de corte para Hind III, donde incluiremos nuestra constricción promotor + gen de interés.

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El promotor VaEDS1 es capaz de regular el gen MtREP1 de manera que este sólo se exprese
cuando los niveles de ácido abscísico (ABA) en la planta. Se trata de un promotor con regulación
epigenética. Así pues, nuestro gen de interés se expresará cuando la planta de guisante se vea
infectada por el oídio y esta infección cause una elevación en los niveles de ABA.

Transformación bacteriana:

La digestión con Hind III del genoma de la colonia bacteriana mth2-76g24 incluye nuestro gen de
interés Medtr5g072340 (MtREP1) de unas 9,5 Kb [13]. Este fragmento es clonado en el vector
descrito anteriormente:

• Se corta el vector con Hind III para linealizarlo.

• Se desfosforilan los extremos 5’ del vector para evitar autoligación.

• Tras digerir nuestra muestra con Hind II se seleccionan los fragmentos según su tamaño por
electroforesis y se purifican, teniendo en cuenta que nuestro fragmento de interés es de 9,5 kb.

• Llevamos a cabo la reacción de ligación, primero uniendo nuestro promotor con el gen de
interés y más tarde esta construcción con el plásmido.

• Transferencia de los plásmidos a A. tumefaciens por electroporación.

• Selección de los clones en un medio con Kanamicina y X-gal. Son positivos los que
sobreviven en Kanamicina y carecen de actividad beta-galactosidasa.

Transformación vegetal:

La transformación en planta de guisante mediada por A. tumefaciens se realiza siguiendo el


protocolo específico para ello [14]. De manera resumida:

Desinfección de las semillas:

La desinfección se realiza en seco en presencia de gas cloro. Para esto se colocan


aproximadamente 100 semillas en una placa de Petri abierta dentro de un desecador con cierre
hermético y éste dentro de una campana de extracción.

Dentro del desecador se coloca un Beaker en el que se mezclan 100 ml de hipoclorito de sodio
comercial con 4 ml de HCl puro (12 N). Esta mezcla libera gas cloro de alto poder desinfectante.
Las semillas se esterilizan entre 24 y 48 horas.

Imbibición y germinación:

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Se colocan las 100 semillas en un Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 100 ml agua destilada
estéril. El Erlenmeyer se mantiene en un agitador rotatorio a 150 rpm durante 24h con la finalidad
de que las semillas se embeban y comience el proceso de germinación.

Extracción de explantos:

Una vez que las semillas se encuentran embebidas, tras las 24 horas, se procede al aislamiento
de los explantos. Para ello se ha de trabajar en una cámara de flujo laminar en completa asepsia
y evitando cualquier tipo de contaminación tanto dentro de la propia cámara como con el material
utilizado. El proceso puede resumirse en los siguientes pasos:

1. En primer lugar se retira el tegumento con las pinzas realizando previamente un corte
longitudinal bajo la radícula de la semilla.

2. Se separan ambos cotiledones, de tal manera que uno quede listo para proseguir con el
protocolo.

3. Del cotiledón restante, que aún tiene el embrión pegado, se separaran.

4. Por un lado, los cotiledones y por otro lado a los embriones a los cuales se le retiran los
primordios foliares que cubren el meristemo apical del tallo y se les corta la región radicular.

5. Ambos tipos de explantos se siembran en medio de pre-infección (ver composición de medios)


con una densidad de 10-15 explantos por placa de Petri.

Pre-infección:

Los cotiledones se disponen con la zona abaxial en contacto con el medio de pre-infección [15]
y los ápices embrionarios se colocaron verticalmente en placas de Petri a 1 mm de profundidad
sobre medio de pre-infección.

Después las placas se sellan con film y se incuban en cámara de cultivo en fotoperiodo de luz
16/8 con una intensidad de 100 µmol·m2·seg-1 y 24 ºC durante 24 h.

Cultivo de Agrobacterium tumefaciens:

Agrobacterium tumefaciens EHA105 conteniendo el plásmido (pCambia 2300 + construcción)


se cultiva a 28 ºC a partir de un stock conservado a -80 ºC en medio LB sólido en presencia de
Kanamicina 10 mg/L y Rifampicina 60 mg/L. Una colonia individual se transfiere a 3 ml de
medio LB líquido con el agregado de los antibióticos mencionados anteriormente para el cultivo
sólido y se crece durante 24 h a 28 ºC con agitación orbital constante (150 rpm). Tras ese tiempo,
se inoculan 50 ml de medio LB líquido (también con los mismos antibióticos) con 100 µl de la
suspensión bacteriana cultivada, se crece otras 24 h a 28 ºC. Se cuantifica la densidad óptica del

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cultivo a 650 nm, tras centrifugar 20 min a 3645 g, se resuspende en el volumen apropiado de
medio de infección para conseguir las D.O.650nm de 1.

Infección de explantos:

Los ápices embrionarios y los cotiledones se tratan por separado, cada uno de ellos a
concentracion de A. tumefacien, a D.O.650nm de 1. Se incuban en medio de infección en tubos
tipo Falcon de 50 ml cubiertos con papel de aluminio, en oscuridad y agitación orbital suave
(Shaker) a 50 rpm durante 24 h a 21 ºC.

Se realiza una preinducción con acetosiringona (AS) en el medio de cultivo de 50 ml de LB con


las bacterias. Así pues, las bacterias crecieron durante 24 horas junto con una concentración 100
µM de AS.

Al medio de infección para los explantos se le añade L-cisteína a una concentración final de 600
mg/l. De tal manera que la mitad de los cotiledones y la mitad de los embriones fueron infectados
en estas condiciones, la otra mitad no.

Se añade también factores NOD al medio de infección junto con los explantos, buscando silenciar
la inmunidad innata de la planta. Se inoculan con una mezcla (dilución 1:5000) de los siguientes
5 factores NOD: Nod Bj-V(C16:0, MeFuc), Nod Bj-V(C18:1,MeFuc), Nod Bj-IV(C18:1), Nod
Bj-V(C18:1,Ac,MeFuc), Nod Bj-V(C16:1,MeFuc) (Muñoz et al., 2014).

Co-cultivo:

De igual manera que a la hora de la infección, durante el proceso del co-cultivo se han de tener
en cuenta las siguientes consideraciones:

Se retiran los explantos del medio de infección colocándolos sobre un colador de acero
inoxidable estéril sobre un recipiente estéril. Los embriones se colocan de lado en placas Petri
(10 – 15 por placa) con medio de co-cultivo sobre un papel de filtro estéril. Los cotiledones se
disponen con la cara abaxial pegada al papel.

Las placas se mantienen en oscuridad por 4 – 7 días en la cámara de cultivo a 21 º C.

El paso del co-cultivo pretendió avanzar igual al experimento anterior para obtener más réplicas
en el trabajo, pero no fue así. Debido a la escasez de medio de co-cultivo, los cotiledones se
dispusieron sobre varias capas de papel de filtro estéril previamente empapados con medio de
infección (unos 8 ml de medio por placa de Petri). Se usó el medio de infección como alternativa
al de co-cultivo por su similitud, de hecho, solo varían en que el medio de co-cultivo lleva agar
6 g/l y el medio de infección no. Los resultados, que se mostrarán más adelante, fueron más que
sorprendentes.
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Por otro lado, los embriones si fueron cultivados en medio de co-cultivo normal.

Al igual que en el paso de infección, en este caso al medio de co-cultivo para los explantos se le
añadió la L-cisteína a una concentración final de 600 mg/l, de tal manera que la mitad de los
cotiledones y la mitad de los embriones fueron infectados en estas condiciones, la otra mitad no.

Igual que en el paso de infección, se adicionó el medio de co-cultivo con los mismos factores
NOD ya mencionados a la misma dilución (1:5000) [16].

Descanso:

Se colocan los explantos en placas Petri en medio de descanso. Los ápices se disponen verticales
a 1 mm de profundidad, y se los cultiva en cámara en condiciones de luz a 100 µmol·m2·seg-1
con régimen 16/8 y 21 º C durante 5 – 7 días.

Regeneración:

Tras el descanso, se transfirieren los explantos a un medio de regeneración. Este medio además
del agregado de los antibióticos necesarios para controlar el crecimiento bacteriano contiene
también el antibiótico de selección in planta del plásmido (Kanamicina / Neomicina). Cuando
transferimos los explantos a este medio es necesario retirar el callo que se vaya formando, por lo
que es necesario realizar repiques cada 10 / 15 días.

Confirmación de la transformación:

Vamos a llevar a cabo un protocolo de extracción de ADN de las plantas de guisante de la variedad
comercial tirabeque que hemos conseguido transformar. Nos centraremos en realizar PCR para
comprobar que son transformantes, pero podemos llevar a cabo otras pruebas como un Southern
blot, Elisa, Western blot, etc…

Extracción ADN

1. Obtención del ADN a partir de las hojas de las plantas. Recogeremos el tercer par de hojas y
las mezclaremos con nitrógeno líquido para así poder machacarlas y obtener de este modo el
polvo de la hoja.

2. Dispensar 20µl de tampón TPS en tubos de 0.6 ml,o bien, en placas de PCR.

3. Agregar 20 mg del polvo de la hoja a cada tubo marcados previamente y mezclar


completamente el tampón con el polvo.

4. Calentar a 96º C aproximadamente durante 10 minutos en la máquina de PCR.

5. Centrifugar durante 1 minuto a 16.000 g. Retirar el sobrenadante a un tubo nuevo y usar como
molde para la PCR.
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6. Si su uso no es inmediato podemos almacenar de 2-3 semanas a 4º/8º C.

Reacción PCR
Como nuestra construcción llevaba incluido el gen marcador de la neomicina fosfotransferasa
(nptII) usaremos cebadores específicos para comprobar si existe amplificación o no mostrando
si se ha llevado a cabo la transformación o por el lado contrario es una planta normal que no ha
incorporado el gen de resistencia.

1. Preparar una mezcla de reacción de PCR de 25 µl que lleva:


• 1.5 µl tampón PCR 10X • 0.3 µl de MgCl2
• 4 µl de dNTPs
• 0.125 µl de cebadores: y: 5'-GAGGCTATTCGGCTATGACT-3', and f: 5'-CCCCTGATGCTT
TCGTCCA-3
• 0.3 µl de Taq polimerasa
• 14.45 µl de H2O
• 1.5 µl de ADN molde previamente extraído.
2. Las condiciones para la PCR de nptII son:
• 94º C durante 30 s
• 60º C durante 30 s
• 72º C durante 45 s

Repetir el proceso hasta 30 ciclos y dejar, por último, a 72º C durante 7 minutos. Finalmente,
preparamos un gel de agarosa al 1% y añadimos en cada pocillo 12 µl del producto de PCR y
comprobamos los resultados.

También podemos utilizar los primers específicos para nuestro gen de interés MtREP1. En este
caso serían:

• 0.125 µl de cebadores: F1, 5’-GGAACTCAACTTAAAATCCCTACC-3’, and R1, 5’-


CTAAAAGACTTCGTCTTCGTCATTGGGTAT-3’. Estos primers amplifican un producto de
743 bp.

Ensayo en cámara de cultivo

1. Las condiciones de invernadero que usamos para las plantas son de 22 ° C por un mínimo de 16
horas por día y de 14 ° C por una noche de 8 horas.

2. Para transferir las plántulas desde el agar hasta el sustrato en el invernadero, lave suavemente
el agar de las raíces, plante una plántula por maceta y cubra.

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3. Para cubrir las plántulas en la transferencia al suelo, utilizamos tubos de plástico de 95 mm de
diámetro y 60 mm de alto.

4. Después de aproximadamente una semana, cuando las plantas han comenzado a crecer, se
levanta un lado de la bañera para permitir la circulación del aire y la reducción gradual de la
humedad. Dos días después, la tina se elimina por completo. Una vez que las plantas están
establecidas, no movemos las macetas para no perturbar ninguna raíz que pueda haber surgido del
fondo de la maceta.

5. Agua para mantener las plantas húmedas, pero no mojadas. Fertilice dos o tres veces durante el
período de crecimiento con Plantosan.

6. Cuando la floración haya terminado y las vainas estén llenas y se sequen, reduzca el riego para
que las vainas estén completamente secas para cosechar. Normalmente esperamos de 15 a 30
semillas por planta (el rango es de 0-100), y generalmente tarda 4 meses desde el trasplante al
invernadero hasta la cosecha de la semilla. Esto también depende del cultivar y la estación.

Resultados esperables y discusión


Con los resultados que obtengamos esperamos haber obtenido una variedad que originalmente era
susceptible a Erysiphe pisi y que a través del uso de la biotecnología y de la transformación con
Agrobacterium tumefaciens hemos introducido resistencia en una variedad de gran interés comercial
como es el guisante de la variedad tirabeque.

Esperamos también con este proyecto aumentar el rendimiento de dicho cultivo ya que hemos visto
que el rendimiento se ve reducido con la infección. El agricultor podrá obtener el máximo de calidad
de su cultivo y que su producción no se vea mermada por la infección.

Reducir los costes para los agricultores en cuanto al uso de fungicidas y demás productos que, en
ocasiones, llegan a afectar a la ecología subyacente del cultivo y a especies beneficiosas para el
cultivo, manteniendo de esta manera un compromiso con el medio ambiente.

Integrar las técnicas de biología molecular a un área donde prima el uso de técnicas convencionales
como los cruzamientos y demostrar que ambas doctrinas pueden coexistir y compenetrarse la una con
la otra.

Aumentar la capacidad de producción puesto que una forma de control biológico de esta enfermedad
es el uso de cultivos tempranos. Con esto permitimos el desarrollo en cualquier momento sin
problemas de que la enfermedad pueda infectar al cultivo.

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Mantener la biodiversidad y las variedades locales que resultan ser un recurso muy valioso con el fin
de mantener el fondo genético de las variedades.

Abrir las puertas a la creación de técnicas de análisis rápido que permitan detectar variedades
resistentes o susceptibles directamente en campo. Además de optimizar y poner a punto los protocolos
empleados en la creación de esta variedad transformante maximizando la eficacia de los mismos y
reduciendo los errores.

ANEXO
Composición de los medios de cultivo a emplear:

1- Medio LB: Triptona10 g/L, 5 g Extracto de levadura 5 g/L, NaCl 10 g/L pH (7.5) . Si
es sólido se adicionan 15 g/L de agar

2- Medio de preinfección: Sales MS (Murashige y Skoog, 1962), vitaminas B5


(Gamborg, 1976), Sacarosa 30 g/L, Bencilamino purina (BAP) 3.5 mg/L y agar-agar 6
g/L (pH 5.8)

3- Medio de infección: Sales MS al 50%, vitaminas B5 al 50%, Sacarosa 30 g/L, Glucosa


10 g/L, BAP 6 mg/L MES 0.5 g/L, Acetosiringona 200µM (pH 5.4).

4- Medio de co-cultivo: Igual composición que el medio de infección, solidificado con


agar-agar 6 g/L

5- Medio de descanso: Sales MS al 50%, vitaminas B5 al 50%, Sacarosa 30 g/L, Glucosa


10 g/L, BAP 0.2 mg/L, Acido Indol Butírico (IBA) 0.2 mg/L agar-agar 6 g/L pH 5.8.
A este medio una vez esterilizado se le adicionan los antibióticos agregados por
filtración) Cefotaxime 200 mg/L, Vancomicina 50 mg/L.

6- Medio de regeneración: Igual al medio de descanso con la adición de Hygromicina 1


mg/L.

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Bibliografía
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15
[16] Muñoz N, Soria-Díaz ME, Manyani H, Sánchez-Matamoros RC, Gil A, Megías M, Lascano R.
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