7
Fraksinasi Ekstrak dengan Kromatografi
Kolom
Ekstrak alkaloid buah mahkota dewa yang
memiliki aktivitas inhibisi tertinggi
dipisahkan dengan menggunakan kromato-
grafi kolom. Eluen yang digunakan dalam
kromatografi kolom yaitu eluen yang
diperoleh hasil pemilihan eluen terbaik dari
beberapa literatur. Eluen terbaik yang
didapatkan adalah metanol:kloroform (3:17).
Kolom disiapkan dengan memasukkan serat
kaca ke dalam dasar kolom, kemudian
dipadatkan. Silika gel yang telah dipanaskan
ditimbang sebanyak 40 gram, kemudian
dibuat suspensinya dalam kloroform. Bubur
yang terbentuk dimasukkan ke dalam kolom
dengan panjang 70 cm dan diameter 2 cm
secara perlahan-lahan sambil didorong
menggunakan pelarut terbaik, dan dipastikan
jangan sampai ada gelembung udara. Setelah
itu, kolom diisi pelarut hingga menggenangi
silika gel, dan dibiarkan selama 1 x 24 jam.
Ekstrak alkaloid ditimbang sebanyak
2.0195 gram, lalu dilarutkan dalam sedikit
pelarut terbaik. Larutan ini ditempatkan di
bagian atas kolom, kemudian dielusi
menggunakan pelarut terbaik. Elusi yang
dilakukan merupakan step gradient dengan
eluen kloroform dan metanol dengan berbagai
perbandingan. Eluat ditampung dalam tabung
reaksi berdasarkan volume pemisahan
sebanyak 5 ml, kemudian eluat diuji dengan
KLT. Eluat yang memiliki Rf dan pola KLT
yang sama digabungkan sebagai satu fraksi
dan diuji aktivitas α-glukosidase sehingga
diperoleh fraksi teraktif.
Penentuan Jumlah Fraksi dengan
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Eluat-eluat yang telah diperoleh dari
kromatografi kolom dipekatkan kemudian
ditotolkan di atas plat KLT aluminum, lalu
dimasukkan ke dalam wadah yang telah berisi
eluen terbaik yang telah dijenuhkan
sebelumnya. Setelah eluen bergerak mencapai
garis akhir, plat KLT segera diangkat dari
wadah lalu dikering-udarakan selama
beberapa menit dan segera dilihat jumlah
bercak yang terpisah dengan menggunakan
lampu sinar UV pada panjang gelombang 254
dan 366 nm. Eluat yang memiliki jumlah
bercak dan nilai Rf yang sama segera
digabungkan menjadi satu fraksi kemudian
dipekatkan. Fraksi diuji aktivitas inhibisi
terhadap α-glukosidase lalu ditentukan fraksi
yang memiliki aktivitas paling besar. Fraksi
ini diuji kandungan alkaloid dengan uji
fitokimia dan diidentifikasi dengan
menggunakan spektofotometer UV-tampak
dan inframerah.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Simplisia
Kadar air. Contoh yang digunakan dalam
penelitian ini adalah buah mahkota dewa
dengan berbagai usia yang dicirikan dengan
warna dari buah. Buah mahkota dewa yang
digunakan berwarna merah sekali, merah
hijau, dan hijau merah. Buah tersebut
diperoleh dari Departemen Konservasi
Sumberdaya Hutan dan Ekowisata (KSHE)
yang berupa buah segar sehingga buah harus
dikeringkan dan dihaluskan. Pengeringan
contoh dilakukan agar terhindar dari pengaruh
mikroba karena kandungan air dalam suatu
bahan akan mempengaruhi daya tahan bahan
terhadap serangan mikroba. Simplisia buah
mahkota dewa yang dihasilkan ditentukan
kadar airnya. Rerata kadar air buah mahkota
dewa merah sekali, merah hijau, dan hijau
merah berturut sebesar 5.49, 7.34, dan 7.50%
(Lampiran 5).
Penentuan kadar air ini berguna untuk
menyatakan kandungan zat dalam tumbuhan
sebagai persen bahan kering dan untuk
mengetahui ketahanan suatu bahan dalam
penyimpanan (Harjadi 1993). Hasil
pengeringan simplisia buah mahkota dewa
kurang dari 10% sehingga simplisia dapat
disimpan dalam jangka waktu yang cukup
lama karena kemungkinan rusak oleh mikroba
lebih kecil.
Uji Fitokimia. Uji fitokimia dilakukan
untuk mengetahui terdapatnya metabolit
sekunder yang diharapkan dapat berfungsi
sebagai antidiabetes dan mengkonfirmasi ada
atau tidaknya senyawa metabolit sekunder
alkaloid yang diharapkan dapat berpotensi
sebagai antidiabetes. Uji fitokimia dilakukan
pada simplisia buah mahkota dewa dan pada
ekstrak alkaloid. Hasil uji fitokimia pada
simplisia buah mahkota dewa semua umur
(Tabel 2) menunjukkan adanya alkaloid,
flavonoid, saponin, dan tanin. Hasil uji
fitokimia ini sama dengan yang dilaporkan
Rohimah (2008) dan Hartika (2009).

Tabel 2 Analisis fitokimia simplisia buah
mahkota dewa
Senyawa Merah Merah Hijau
sekali hijau merah
Alkaloid
Dragendroft + ++ + yang diinginkan, yaitu senyawa alkaloid.
Wagner ++ ++ +
Meyer + + + Tabel 3 Analisis fitokimia ekstrak
Flavonoid +++ ++ ++
Saponin + + + Senyawa
Tanin ++ ++ ++
Triterpenoid - - - Alkaloid
Steroid - - - Dragendroft +
Keterangan:
(+) : terbentuk warna yang diinginkan dan menyatakan
intensitas warna
(-) : tidak terbentuk warna yang diinginkan
Isolat Alkaloid
Ekstraksi. Buah mahkota dewa
diekstraksi dengan menggunakan metode
maserasi. Rendemen ekstrak alkaloid berda-
sarkan bobot kering buah mahkota dewa
merah sekali, merah hijau, dan hijau merah
berturut-turut sebesar 1.41, 13,32, dan 1.53%.
Rendemen ekstrak alkaloid berdasarkan bobot
basah buah mahkota dewa merah sekali,
merah hijau, dan hijau merah berturut-turut
sebesar 1.34, 12.4, dan 1.41% (Lampiran 6).
Jumlah rendemen yang dihasilkan bervariasi.
Hal ini disebabkan oleh tingkat kekeringan
ekstrak yang berbeda. Ekstrak buah mahkota
dewa merah sekali dan hijau merah memiliki
tingkat kekeringan yang tinggi, sedangkan
ekstrak mahkota dewa merah hijau memiliki
tingkat kekeringan di bawah dari kedua
ekstrak tersebut. Selain itu, kandungan
metabolit sekunder (alkaloid) dipengaruhi
oleh usia buah. Kandungan metabolit
sekunder (alkaloid) diduga banyak terkandung
pada buah mahkota dewa dengan usia sedang
(merah hijau). Kandungan metabolit sekunder
(alkaloid) pada buah mahkota dewa usia muda
(hijau merah) diduga sedikit karena awal dari
pembentukan senyawa-senyawa metabolit
sekunder dalam tumbuhan, sedangkan pada
usia tua kandungan metabolit mulai turun
dengan rusaknya sebagian sel-sel pada buah
mahkota dewa. Hal ini dapat diakibatkan
kandungan alkaloid lebih besar dan dalam
keadaan yang dibutuhkan oleh tubuh
tumbuhan.
Uji fitokimia. Hasil uji fitokimia pada
ekstrak alkaloid (Tabel 3) menunjukkan hanya
terdeteksi adanya senyawa golongan alkaloid.
Hasil positif uji alkaloid ditunjukkan dengan
terbentuknya endapan berwarna berturut-turut
8
putih, cokelat, dan merah jingga terhadap
pereaksi Meyer, Wagner, dan Dragendorf. Hal
ini mengidentifikasikan bahwa proses
ekstraksi alkaloid sudah berhasil dan senyawa
yang terambil atau terekstraksi sesuai dengan
alkaloid
buah mahkota dewa
Merah Merah Hijau
sekali hijau merah
++ +
Wagner ++ ++ +
Meyer + + +
Flavonoid - - -
Saponin - - -
Tanin - - -
Triterpenoid - - -
Steroid - - -
Keterangan:
(+) : terbentuk warna yang diinginkan dan menyatakan
intensitas warna
(-) : tidak terbentuk warna yang diinginkan
Uji Aktivitas α-Glukosidase. Ekstrak
alkaloid buah mahkota dewa (merah sekali,
merah hijau, dan hijau merah) diuji aktivitas
inhibisinya terhadap enzim α-glukosidase.
Reaksi yang terjadi pada daya hambat ialah
contoh akan menghambat hidrolisis p-
nitrofenil-α-D-glukopiranosida menjadi p-
nitrofenol yang berwarna kuning dan glukosa.
Intensitas warna kuning p-nitrofenol yang
dihasilkan diukur dengan spektofotometer
UV-tampak. Semakin besar aktivitas inhibisi
ekstrak maka jumlah p-nitrofenol yang
dihasilkan semakin sedikit sehingga intensitas
warna kuning akan berkurang.
Sistem reaksi yang diujikan dengan
menginkubasi substrat dan ekstrak dalam
bufer pada suhu 37 °C selama 5 menit. Hal ini
dilakukan untuk menyamakan suhu optimum
enzim α-glukosidase. Ketika enzim
ditambahkan, reaksi enzimatis akan terjadi.
Hasil penelitian (Gambar 4) menunjukkan
aktivitas inhibisi pada konsentrasi 1% (b/v)
ekstrak buah mahkota dewa merah sekali,
merah hijau, dan hijau merah berturut-turut
sebesar 35.16, 36.80, dan -9.69%. Kontrol
positif yang digunakan adalah acarbose yang
memiliki aktivitas inhibisi sebesar 97.73%.
Hasil ini menggambarkan bahwa ekstrak
alkaloid buah mahkota dewa merah sekali dan
merah hijau memiliki potensi sebagai
antidiabetes dengan menghambat enzim α-
glukosidase, sedangkan ekstrak alkaloid buah
mahkota dewa hijau merah tidak memiliki
 9

aktivitas inhibisi karena nilai inhibisinya Fraksinasi

negatif dan diduga dipengaruhi oleh
ketidakcocokan senyawa yang terdapat di Penentuan keberadaan senyawa dalam
dalam dengan tapak aktif enzim. Kim et al. ekstrak alkaloid buah mahkota dewa dapat
(2000) melaporkan bahwa baikalin, dianalisis secara kualitatif dengan pemisahan
isorhamnetin-3-O-rutinosida, dan hiperin yang ekstrak menjadi beberapa fraksi. Pelarut atau
memiliki aktivitas inhibisi dengan nilai fase gerak yang digunakan adalah pelarut
negatif menyatakan bahwa beberapa terbaik hasil pemilihan dengan menggunakan
komponen yang terdapat dalam senyawa KLT. Noda hasil elusi berbagai pelarut dilihat
tersebut dapat menyebabkan kenaikan dengan menggunakan sinar ultraviolet pada
aktivitas α-glukosidase. Kemung-kinan panjang gelombang 254 dan 366 nm. Pelarut
disebabkan oleh adanya perubahan bentuk yang akan dijadikan fase gerak adalah pelarut
yang berasal dari ikatan senyawa tersebut yang menghasilkan jumlah noda terbanyak
dengan tapak aktif enzim. dan memiliki pemisahan yang baik.
Aktivitas α-glukosidase dipengaruhi oleh Fraksinasi dilakukan terhadap ekstrak
beberapa faktor, antara lain konsentrasi enzim, alkaloid buah mahkota dewa merah hijau
pH, suhu, konsentrasi substrat, senyawa karena memiliki aktivitas inhibisi terhadap α-
inhibitor, dan aktivator, serta waktu inkubasi glukosidase tertinggi, yaitu 36.80%. Pelarut
(Lehninger 1982). Enzim memiliki tapak aktif yang digunakan adalah kloroform: metanol
yang dapat mengenali substratnya yang (17:3), sedangkan fase diam yang digunakan
sesuai, sehingga memungkinkan untuk adalah silika gel (Gambar 5). Pemisahan
merancang inhibitor enzim yang dapat dilakukan dengan metode step gradient
menghalangi pengikatan substrat pada enzim. (peningkatan kepolaran) yang bertujuan agar
Dengan terikatnya inhibitor pada enzim, maka dengan peningkatan polaritas sistem eluen,
dapat menghambat terbentuknya produk dari semua komponen akan terbawa lebih cepat
suatu metabolit yang tidak diinginkan (King (Harvey 2000). Senyawa yang kurang polar
1994). akan keluar terlebih dahulu dari kolom dengan
100 97,97 eluen kloroform dan dilanjutkan dengan
90 senyawa semi polar dengan campuran kedua
80
eluen, dan terakhir senyawa polar dengan
Aktivitas inhibisi (%)

70
60 eluen metanol.
50
40 35,16 36,8
30
20
10 -9,69
0
-10 Akarbosa merah sekali merah hijau hijau merah
Sampel

Gambar 4 Aktivitas inhibisi ekstrak alkaloid

buah mahkota dewa).

Ekstrak alkaloid buah mahkota dewa

merah hijau memiliki aktivitas inhibisi
terhadap α-glukosidase tertinggi dibandingkan
dengan ekstrak alkaloid lainnya. Hal ini dapat
disebabkan karena alkaloid yang terdapat pada
buah mahkota dewa merah hijau memiliki
Gambar 5 Profil fase gerak terbaik kloroform:
kecocokan dengan tapak aktif enzim sehingga
metanol (17:3) ekstrak alkaloid
dapat menghambat α-glukosidase lebih besar.
buah mahkota dewa merah hijau.
Aktivitas inhibisi ekstrak bergantung pada
(Kondisi KLT: plat KLT SiO2 60
senyawa metabolit sekunder yang diisolasi.
F254, visualisasi bercak: UV 254
Hal ini dibuktikan dengan temuan Hartika
nm dan 366 nm).
(2009) menyatakan bahwa ekstrak flavonoid
Elusi dilakukan dengan menampung
buah mahkota dewa merah sekali memiliki
sebanyak 5 mL hasil pemisahan ekstrak
aktivitas inhibisi tertinggi dibandingkan
alkaloid ditampung dalam tabung reaksi.
dengan merah hijau dan hijau merah.
Pemisahan ekstrak alkaloid buah mahkota
dewa merah hijau diperoleh eluat sebanyak
189 tabung reaksi. Hasil pemisahan dengan
kromatografi kolom dimonitor dengan
 10

menggunakan KLT. Fase gerak yang Diabetes melitus dapat disebabkan oleh
digunakan dalam KLT adalah eluen terbaik, bermacam alasan. Tingginya kadar glukosa
yaitu kloroform: metanol (17:3). Eluat dalam dalam darah yang disebabkan defisiensi
tabung reaksi yang memiliki pola dan Rf sama insulin (Tipe I) atau juga karena sekresi
dijadikan satu fraksi. Oleh karena itu, hasil insulin yang progresif (Tipe II). Aktivitas
fraksinasi ekstrak alkaloid buah mahkota fraksi 5 dapat menghambat aktivitas
dewa merah hijau diperoleh 5 fraksi. Warna katabolisme polisakarida oleh enzim α-
fraksi yang dihasilkan berwarna kuning glukosidase sehingga berpotensi untuk
dengan intensitas yang semakin meningkat mengatasi diabetes tipe II, karena kontrol
dengan bertambahnya nomor fraksi. Namun, glikemik tidak sepenuhnya dapat terjaga
eluat-eluat yang menjadi fraksi dua tidak dalam waktu yang lama dengan diet dan
memiliki warna dan tidak menghasilkan olahraga sehingga tetap diperlukan obat
bercak saat disinari dengan sinar UV 254 dan antihiperglikemia untuk mengatasi kadar gula
366 nm dalam analisis KLT. Hasil fraksinasi darah yang terlalu tinggi (Lee et al. 2007).
ini dapat dilihat pada Lampiran 8. Hasil ini Dengan demikian, potensi ekstrak alkaloid
kemudian diuji aktivitas inhibisinya terhadap buah mahkota dewa merah hijau dapat
α-glukosidase. menjadi solusi sebagai antihiperglikemia yang
dapat membantu proses penyembuhan
Uji Aktivitas α-Glukosidase. Fraksi hasil diabetes tipe II.
pemisahan ekstrak alkaloid buah mahkota
dewa merah hijau diuji aktivitas inhibisinya Identifikasi Spektrofotometer UV-
terhadap α-glukosidase dengan konsentrasi Tampak dan FTIR. Identifikasi fraksi 5 yang
yang sama yaitu 1% (b/v). Hal ini bertujuan memiliki aktivitas inhibisi tertinggi dilakukan
mengetahui fraksi teraktif dan untuk pencirian dengan menggunakan spektrofotometer UV-
serta penentuan senyawa golongan alkaloid. Tampak pada panjang gelombang 230-560
Hasil pengujian (Gambar 6) menunjukkan nm. Analisis dengan menggunakan
bahwa fraksi teraktif adalah fraksi 5 dengan spektrofotometer UV-tampak selain
daya inhibisi 87.29% dan fraksi 4 tidak digunakan untuk melihat ada tidaknya ikatan
memiliki daya inhibisi terhadap α- rangkap terkonjugasi, dapat juga digunakan
glukosidase. Kemungkinan fraksi ke-4 untuk menentukan jenis inti yang terdapat
menjadi aktivator α-glukosidase sehingga dalam senyawa alkaloid. Hasil spekto-
membantu adanya hidrolisis polisakarida. fotometer UV-Tampak menunjukkan serapan
Aktivitas inhibisi fraksi 5 sebesar 87.29% maksimum pada panjang gelombang 244 nm
mendekati aktivitas inihibisi acarbose sebesar dan serapan tambahan pada panjang
97.73% yang merupakan inhibitor komersil. gelombang 316 nm dan 364 nm (Gambar 7).
Hal ini mengindikasikan bahwa fraksi 5 Adanya serapan tambahan pada panjang
memiliki potensi yang baik dalam mengatasi gelombang 316 nm dan 364 nm dicurigai
penyakit diabetes tipe II. Fraksi 5 kemudian mengandung beberapa senyawa, walaupun
diidentifikasi secara kualitatif dengan uji dalam profil KLT hanya terdiri dari satu noda.
fitokimia alkaloid. Hal ini dilakukan untuk Serapan 230-270 nm merupakan serapan
meyakinkan bahwa senyawaan yang untuk benzena. Adanya serapan pada panjang
terkandung dalam fraksi 5 adalah benar-benar gelombang maksimum 244 nm menunjukkan
alkaloid. Uji fitokimia alkaloid dinyatakan bahwa transisi yang mungkin terjadi, yaitu
positif untuk fraksi 5. transisi -* yang dihasilkan dari kromofor
97,97 C=O dan C=C (Sudjadi 1983).
87,29
90
Aktivitas inhibisi (%)

70

50

27,17
30 23,41
20,28

10
-7,51

-10 Akarbosa fraksi 1 fraksi 2 fraksi 3 fraksi 4 fraksi 5

Sampel

Gambar 6 Aktivitas inhibisi hasil fraksinasi

ekstrak alkaloid buah mahkota
dewa merah hijau.
 11

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Ekstrak alkaloid buah mahkota dewa

merah kehijauan memiliki aktivitas inhibisi
terbesar terhadap α-glukosidase sebesar
36.80%. Hasil fraksinasi dengan kromatografi
kolom menghasilkan lima fraksi dengan fraksi
teraktif fraksi ke-5 yang memiliki aktivitas
inhibisi terhadap α-glukosidase sebesar
87.29%. Identifikasi menggunakan
spektrofotometer UV-tampak dan inframerah
menunjukkan bahwa fraksi lima mengandung
senyawa golongan alkaloid.
Gambar 7 Spektrum UV-Tampak fraksi 5 Saran
ekstrak alkaloid buah mahkota
dewa merah hijau dengan Perlu dilakukan identifikasi lanjut
panjang gelombang maksimum terhadap fraksi teraktif untuk mengetahui
244 nm. senyawa alkaloid yang dapat menghambat α-
glukosida dengan menggunakan spektro-
Fraksi 5 kemudian diidentifikasi dengan fotometer NMR dan LC-MS.
menggunakan spektrofotometer inframerah.
Hasil identifikasi dengan menggunakan
spektrofotometer inframerah (Lampiran 10)
menunjukkan bahwa terdapat lima gugus
DAFTAR PUSTAKA
fungsi. Gugus fungsi yang mungkin ada
dalam senyawa fraksi 5, yaitu pada bilangan [AOAC]. Assosiation of Official Analytical
gelombang 3408.87 cm-1 terdapat uluran –OH, Chemist. 1999. Official Methods of
1616.91 cm-1 merupakan gugus uluran C=C Analysis of AOAC International.
aromatik, dan 1279.88 cm-1 merupakan uluran Washington DC: AOAC International.
C-N amina aromatik, yang juga diperkuat
dengan pita overtone pada 617.21 cm-1 (Tabel Ashour MA et al.. 2007. Indole alkaloid from
4). Dari gugus-gugus fungsi yang ada, dapat the Red Sea sponge. Hyrtios erectus.
diduga bahwa senyawa golongan alkaloid ARKIVOC 25: 225-231.
merupakan golongan alkaloid dengan atom
nitrogen yang berada pada cincin aromatik. Berkov S. et al.. 2007. Revised NMR data for
Senyawa pada fraksi 5 dapat diduga Incartine: an Alkaloid from Galanthus
merupakan senyawa alkaloid golongan elwesii. Molecules 12:1430-1435.
kuinolin atau isokuinolin. Gugus –OH yang
terdeteksi pada fraksi 5 dapat ditimbulkan dari Bowman WC, Rand MJ. 1968. Textbook of
residu metanol atau gugus yang ada pada Pharmocology, Ed ke-2. New York:
senyawaan alkaloid. Blackwell.
Tabel 4 Analisis gugus fungsi menggunakan
inframerah fraksi 5 ekstrak alkaloid Christian GD. 1986. Analytical Chemistry. Ed
buah mahkota dewa merah hijau. ke-4. New York: J Willey.
Bilangan
Acuan*
gelombang
(cm-1)
Gugus Dugaan Darwis D. 2000. Teknik Dasar Laboratorium
(cm-1) Dalam Penelitian Seyawa Bahan Alam
3408.87 3100-3700 Uluran O-H
2924.84 3100-2990 Uluran C-H (sp3)
Hayati. Workshop Pengembangan Sumber
1616.91 ~ 1625 Uluran C=C aromatik Daya Manusia Dalam Bidang Kimia
1465 1439-1399 Tekukan C-H (sp2) Organik Bahan Alam Hayati. Padang:
1279.88 1342-1266 Ulur C-N amina aromatik Universitas Andalas.
1079.92 1250-1020 Uluran C-O eter
*) Sumber : Silverstein RM & Webster FX (2006)
Djumidi et al... 1999. Inventaris tanaman obat
Indonesia, Ed ke-5. Jakarta: Balai