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CURSO 2017 -
Esteban Hopp
sobre la base de una teórica de:
RUTH HEINZ
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Factores
relevantes en
ingeniería • Conocimiento de las rutas metabólicas involucradas
metabólica • Regulación de las enzimas implicadas
• Efectos fisiológicos
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Aplicaciones de la celulosa, el almidón y otros azúcares
PRODUCTO APLICACIÓN
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica A B C
Tomado de: Visser and Jacobs, Trends in Biotechnology, 1993.
ATP ADP
AGPasa: ADP-glucosa
glucosa glucosa-6-P pirofosforilasa
2,3 Pi GBSS: almidón sintetasa
unida al gránulo
sacarosa 1 2, SSS: almidón sintetasa
ATP ADP soluble
3, 4
5 BE: enzima ramificante
6 fructosa
Pi
7 AGPasa
UDP-glucosa glucosa-1-P ADP-glucosa
8: fosforilasa del almidón Adaptado de: Visser and Jacobs, Trends in Biotechnology, 1993.
• Problema:
Sobreexpresión − La fructosa 1,6-bifosfato y el Pi actúan como efectores
de un gen positivo y negativo respectivamente sobre las ADP-glucosa
mutado pirofosforilasas vegetales regulando la síntesis de almidón.
de ADP- • Objetivo:
glucosa − Superproducción de almidón. Las papas convencionales
absorben hasta un 36% del aceite al freírlas, frente al 30%
pirofosforilasa observado en las modificadas para aumentar su concentración de
almidón). Requieren menos energía para cocinarse, ya que la
de Escherichia energía que se utiliza al freír, se consume en la eliminación del
coli en plantas agua.
de Solanum • Estrategia:
tuberosum − gen glgC16 (ADP-glucosa pirofosforilasa) de E. coli
mutada (insensible a regulación por Pi).
• Resultados:
Ingeniería
metabólica
− La enzima de origen transgénico se procesa
correctamente y es activa en las células vegetales.
Incrementa hasta un 30% el contenido total de almidón
presente en los tubérculos. Se transformó tomate, tabaco
y papa vía Agrobacterium tumefaciens.
Sobreexpresión Contenido de almidón en extractos de callos de tabaco transformados
de un gen con un gen glgC16 de Escherichia coli. Las líneas 1 a 6 expresan el
transgen; la línea 13 corresponde a una planta control no transformada.
mutado
de ADP-
glucosa
pirofosforilasa
de Escherichia
coli en plantas
de Solanum
tuberosum Tomado de: Stark et al. Science, 1992.
Planta control 36,38 ± 1,07 10,05 ± 0,03 27,75 ± 1,9 25,59 498
201 0,32 ± 0,18 0,07 ± 0,07 59,37 ± 5,3 77,45 2600
202 0,05 ± 0,02 0,00 ± 0,03 62,01 ± 1,4 80,84 3000
208 0,13 ± 0,04 0,01 ± 0,02 64,58 ± 1,4 77,04 2600
a La media y el desvío estándar fueron calculados a partir de cuatro muestras. Tomado de: Schwall et al. Nature Biotechnology, 2000.
La papa Amflora
Fue la primer papa transgénica que la Unión Europea autorizó para comercialización
desde la moratoria en 1998. Basf dejó de comercializar esta variedad en 2012 debido
a la poca aceptación pública.
- Se observó, que en los granos de maíz, existía una enzima GBSS mutante generada
por la expresión del gen amf. Al estar bloqueada su actividad con amilosa
ausente en el almidón presente en los amiloplastos. En la papa, no se ha
encontrado mutaciones del gen amf, pero en mutantes artificiales obtenidas
mediante radiación X de papas “diploides” (tetraploides haploidizadas, n=12), el
almidón aislado de los tubérculos de estas plantas, no contiene amilosa en su
composición.
- Basf diseñó la papa transgénica “Amflora” (evento EH92-527-1) bloqueando por
ARN antisentido/interferente la GBSS (almidón-sintasa o alfa-1,4-D-glucano- 4-
alfa-glucosil transferasa y principal responsable de la síntesis de amilosa)
prácticamente 100%) de amilopectina presente (y ausencia de amilosa), en los
gránulos de almidón pero tenía varios problemas fisiológicos.
- Construcción: promotor de patatina (específico de tubérculo) + cDNA del gen de
la GBSS en antisentido.
Modificaciones en las rutas de síntesis de hidratos de
carbono para obtener moléculas de utilidad económica
CITOSOL
trehalosa
VACUOLA
sacarosa
sacarosa
4 ciclodextrinas
1
UDP-glucosa
6
almidón
fructanos
amilopectina amilosa
glucosa-1-fosfato
2 5
glucosa-6-fosfato ADP-glucosa
almidón
libre de
manitol mio-inositol amilosa
hexosa-fosfato
fructosa-6-fosfato
3
CO2
pinitol
triosa-fosfato triosa-fosfato
• Fructanos
- La expresión de levano sacarasa de Bacillus subtilis permitió acumular fructano
en tabaco y papa.
- El nivel de expresión alcanzado en tubérculos de papa es de 1-7% del peso seco
de los microtubérculos y de 1-30% en hojas.
• Alcoholes azúcares
- La expresión del gen de manitol-1-fosfato deshidrogenasa de Escherichia coli en tabaco
permitió la síntesis de manitol en hojas y raíces.
- La expresión del gen de myo-inositol O-metil transferasa de Mesembryanthemun crystallinum
permitió la síntesis de pinitol en tabaco.
Transformación de plantas de Solanum tuberosum
con genes de fructosiltransferasas y levanosacarasas
• Problema:
• Objetivo:
• Estrategia:
35Sl35S: Promotor doble del transcripto de 35S del CaMV; AIMV: enhancer traduccional del virus AlMV;
cpy: señal de transporte a vacuola de carboxipeptidasa Y de levadura; sacB: levano sacarasa de Bacillus subtilis;
ftf: fructosiltrasferasa de Streptococcus mutans; nos: terminador de nopalina sintetasa de A. tumefaciens
Tomado de: van der Meer et al. The plant cell, 1994.
Transformación de plantas de Solanum tuberosum
con genes de fructosiltransferasas y levanosacarasas
Comparación
de los niveles
de almidón y
fructano en
microtubérculos
de plantas
transgénicas
y controles
Tomado de: van der Meer et al., The Plant Cell, 1994.
• Los fructanos (los de bacterias se llaman inulinas, no son iguales), son polisacáridos de almacenamiento en
la vacuola presentes en el 15% de las angiospermas cuyo componente básico es la fructosa, unida entre sí
mediante enlaces glucosídicos beta 1,2. Constituyen una fibra soluble de pocas calorías. A diferencia del
almidón, su digestión se ve dificultada (presenta unos enlaces químicos de difícil ruptura por parte de las
enzimas de la saliva y jugo pancreático); es por eso que, los fructanos pasan por el estómago y el intestino
delgado sin sufrir modificaciones, siendo en el intestino grueso, dónde llevan a cabo su efecto prebiótico,
responsable, mayoritariamente, de sus beneficios saludables: carácter anti dislipémico, mejora en la
absorción de minerales o descenso del riesgo de cáncer de intestino grueso, entre otros.
• El Max Planck de Golm desarrolló papas transgénicas para dos genes, 1-SST (síntesis de la 1-Kestotriosa a
partir de sacarosa) y 1-FFT (fructano 1-fructosiltransferasa que transfiere residuos fructosilo). Estos genes
se tomaron del genoma del alcaucil (Cynara scolymus) provocando que la papa resultante contenga hasta
un 5% de fructano. El fructano así sintetizado, muestra un mayor peso molecular, una mayor
concentración, pero menor longitud de la cadena monómeros de fructosa (que el sintetizado en la raíz de
alacuacil).
• Se observó una leve reducción en el contenido de almidón, lo que indica que la síntesis de fructanos, se
lleva a cabo a expensas de la producción de almidón.
Transformación • El gen de la fructosiltransferasa
de Beta vulgaris 1-sst de Helianthus tuberosus
(Topinambo o Papa de Jerusalem) fue
con el gen 1-sst introducido en plantas de Beta
vulgaris.
de la fructosil-
• Esta enzima convierte la sacarosa en
transferasa de una mezcla de fructanos de bajo peso
molecular (GF2, GF3 y GF4).
Helianthus
tuberosus Tomado de: Sevenier et al., Nature Biotechnology, 1998.
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Agrobiotecnología
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Tiempo (min)
Ingeniería a) Remolacha no transformada; b) Línea transformada
Metabólica con el gen 1-sst; c) Mezcla de 20 mg/mL de glucosa
(G), fructosa (F), sacarosa (S), rafinosa (R), 1-kestosa
(GF2), nistosa (GF3) y fructofuranosil nistosa (GF4)
Transformación - Se caracterizó el perfil de expresion del gen en B.
de tabaco con píctus, se asiló y clonó el mismo
el gen fructan 6- - Se expreso en el sistema heterólodo Pichia pastoris
fructosyltransfera -Se transformaron plantas de tabaco con una
(6-SFT) de la construcción genética que contenía el gen 6-SFT
bajo el promotor de 35S de CaMV.
gramínea
-Se evaluó la actividad enzimática así como el
patagónica
contenido de fructanos en hojas de tabaco.
Bromus pictus
-Se realizaron ensayos sometiendo a plantas
previamente aclimatados o sin aclimatación a
condiciones de estrés por temperaturas de
congelamiento
- Se evaluó la perdidas de electrolitos asi como la
Agrobiotecnología altura de la parte aérea y el peso fresco de las plantas
en relación a controles no transgénicos.
Tolerancia
a estreses abióticos
Transformación de tabaco con el gen fructan 6-fructosyltransfera (6-SFT)
de la gramínea patagónica Bromus pictus
Las lineas trangénicas tanto aclimatadas como no aclimatadas presentaron menor daño de membrana plasmática comparada con
controles no trangénicos y mayores nivles de fructanos. Las lineas trangénicas reasumieron el desarrollo despues del tratamiento de
congelamiento.
Del Viso et al, 2011, J Plant Phys. 168 : 493–499
Modificaciones en las rutas de síntesis
de ácidos grasos
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Producción mundial de los principales aceites y grasas
(en miles de toneladas)
presentes 18
16
en aceites 14
12
vegetales cáprico
10
caprílico
linolénico
laurico 8
linoleico
mirístico COOH
palmítico
ricinoleico
esteárico oleico
Agrobiotecnología petroselínico
Ingeniería
metabólica Adaptado de: Töpfer and Martini W. Agricultural Biotechnology, 1998.
3 6: 12-oleoato desaturasa
C12:0 laurato
3
7: 12-oleoato hidrolasa
C14:0 miristato
8: 15-linolato desaturasa
3
9: 6-linolato desaturasa
C16:0 palmitato
1
4C16:1 4C18:1 petroselinato
2’ 2 3
3
C18:0 estearato
4 3
9C18:1 oleato
5 7
6
erucato linolato ricinoleato
CITOPLASMA 8 9
-linolenato -linolenato
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Transformación de Brassica con un gen
antisentido de la estearoil-ACP desaturasa
• Problema:
- Los aceites con alto contenido de ácidos grasos saturados como palmítico y
esteárico tienen gran demanda industrial. La mayoría de las plantas producen
aceites con bajo contenido de ácidos grasos saturados.
• Objetivo:
- Producción de semillas de Brassica napus y Brassica rapa con altos niveles de
ácidos grasos saturados.
• Estrategia:
- Introducción de genes antisentido de la estearoil-ACP desaturasa de Brassica
rapa.
Construcción con dos copias en antisentido del gen de la estearoil-ACP desaturasa. napin 5’ y napin 3’: promotor
y terminador de napina; ACP 5’ y ACP 3’: promotor y terminador de la proteína transportadora de ácidos grasos.
Transformación
de Brassica Composición de ácidos grasos de dos clases de semillas obtenidas
de plantas de la línea transgénica 3242-T-1 de Brassica rapa.
con un gen
antisentido
de estearoil-
ACP
desaturasa
Porcentaje
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Umbellularia • Estrategia:
- Se transformó Arabidopsis thaliana con un gen de la 12:0
californica acil-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica, que
interrumpe la elongación para producir ácido láurico .
21
21 324
324
4,4
4,4
10,6
10,6
Agrobiotecnología 16 16 260
260 4,6
4,6 12,1
12,1
19 19 903
903 6,7
6,7 16,4
16,4
Ingeniería 13 1080 6,4 23,5
metabólica 13 1080 6,4 23,5
Tomado de: Voelker et al., Science, 1992.
Acumulación de ácido láurico en líneas individuales de Arabidopsis
thaliana transformadas con el gen de la 12:0 acil-ACP-tioesterasa
Transformación
• Resultados:
de Arabidopsis - Se observó un alto contenido de ácido láurico con descenso
thaliana con concomitante de algunos ácidos grasos de cadena larga.
el gen de
12:0 acil-ACP-
tioesterasa de
Umbellularia
californica
Agrobiotecnología
8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C22:1
Colza [+ a. erúcico] 3 1 17 14 9 50
Colza [– a. erúcico] [Canola] 4 2 62 22 10 0
ClTEg100 1 3
ClTEg200 7 15
ChTE 11 27
UcTE 50
CtTE 25
Bc 9DES 0.7
Bc 9DESas 40
Bn 12DES(fad2)as 83
Bn 12DES(fad2)as X IMC 129 88
ScKAS elong X Canola 20
Adaptado de: Töpfer and Martini. Agricultural Biotechnology, 1998.
ClTEg100 y ClTEg200: genes de acil-[ACP] tioesterasa de Cuphea lanceolata; ChTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Cuphea hookeriana;
UcTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Umbellularia californica; CtTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Carthamus tinctorius; Bc9DES: gen
de 9 desaturasa de Brassica rapa (campestris); Bc9DESas: gen antisentido de 9 desaturasa de Brassica rapa; Bn12DES(fad2)as: gen
antisentido de 12 desaturasa de Brassica napus; Bn12DES(fad2)as x IMC129: planta Bn12DES(fad2)as cruzada con el mutante IMC129
de colza; ScKAS elong x Canola: gen de la -cetoacil-[ACP] sintetasa de la elongasa de Somodnsia chinensis cruzada con Canola
Modificaciones en las rutas
de síntesis de aminoácidos
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Posibles
Muchas semillas, frutas o turbérculos que se
estrategias utilizan para alimentación animal o humana son
para modificar deficientes en aminoácidos esenciales. En
el contenido de particular, se busca incrementar el contenido
aminoácidos de lisina en los cereales y el de metionina en
esenciales las leguminosas.
aspartato
aspartato
kinasa
inhibición por
feedback inhibición por
feedback
DHDPS
múltiples pasos
enzimáticos
treonina
isoleucina metionina
lisina
• Resultados:
- La expresión del gen dapA produce un incremento de lisina libre unas 100 veces
mayor en canola y de hasta 25% más en soja. La expresión de ambos genes,
aumentó varios cientos de veces los niveles de lisina libre y hasta 5 veces el total
de lisina en semillas de soja.
Transformación de soja con los genes DHDPS de
Corynebacterium (dapA) y AK de Escherichia coli (lysC)
Contenido de lisina libre en semillas individuales de soja
Se extrajeron los aminoácidos libres de 10 semillas segregantes R1 para cada línea transgénica
y se determinó su composición. Se compara la línea A2396 (barras sólidas) con la línea A2396 (barras
vacías). Ambas líneas expresan los dos transgenes. Se indica la determinación de GUS, DHDPS y AK.
Contenido de metionina de distintas especies y modificación
de la composición proteica en cultivos de interés
Los niveles
Proteína tipo Proteína Contenido de Contenido de de aminoácidos
metionina metionina sulfurados en todas
( g 100 . g-1 proteína)a (% de residuos) las semillas
mencionadas varían
entre diferentes
Proteínas de Proteína de arveja 0,8 No determinada variedades;
semilla Proteína de lupino 0,6 No determinada sólo se mencionan
Proteína de soja 1,2 No determinada las más relevantes
en el contexto
Proteínas Zeína de maíz de 21 kDa 37 28 de modificar la
ricas en Albumina 2S B. excelsa 23 composición de
18 proteínas vegetales.
metionina Albúmina de girasol 20 16
Incremento Incremento
C ultivo Gen introducido de proteína de metionina
Maíz Zeína rica en medionina de 10 kDa 0,9 % 30 %
Tabaco Albúmina 2S de B. excelsa 8% 30 %
Canola Albúmina 2S de B. excelsa 4% 33 %
Soja Albumina 2S de B. excelsa 10 % 50 %
Haba Albumina 2S de B. excelsa 4,8 % 100 %
Lupino Albúmina 2S de H. annus 5% 100 %
Arveja Albúmina 2S de H. annus 2- 5 % -----
Garbanzo Albumina 2S de H. annus 2- 5 % -----
Tomado de: Tabe and Higgins, Trends in Plant Science, 1998.
Transformación de Brassica napus con el gen de la
albúmina 2S de Bertholletia excelsa (nuez del Brasil)
• La albúmina 2S de B. excelsa contiene 18,8 % de metionina
- El gen 2S se expresó bajo un promotor específico de semilla
(promotor de faseolina) y se introdujo en plantas de canola vía Agrobacterium.
- Se muestra la acumulación de albúmina 2S durante el desarrollo de las semillas.
- Se extrajeron las proteínas solubles totales a los 19, 22, 26, 29, 32, 36 y 40 días
luego de la antésis y se las analizó por PAGE y ELISA.
Niveles de albúmina 2S
acumulados en semillas de canola
determinados por ELISA a distintos
tiempos luego de la floración.
% de albumina 2S
de nuez del Brasil
Transformación de Brassica napus con el gen de la
albúmina 2S de Bertholletia excelsa (Nuez del Brasil)
• Las semillas de canola transgénica acumulan 1,7- 4,0 % de albumina 2S de
B. excelsa y pueden contener hasta 33 % más metionina que los controles
Tob pARC12 3 32 34 67
metionina 3,60 3,54 4,47 4,74 3,95 4,31
(0,23) (0,13) (0,31) (0,16) (0,14) (0,31)
Los números entre paréntesis corresponden a las desviaciones estándar. Tob y PARC12 representan
proteínas de plantas control (tabaco no transformado o transformado con el vector vacío).
Las columnas 3, 32, 34 y 67 corresponden a líneas transgénicas de tabaco que expresan la albúmina
2S de B. excelsa.
La Papa Protato
• La calidad nutricional de la papa tiene problemas desde el punto de vista de contenido de
aminoácidos esenciales, debido a los bajos niveles relativos de aminoácidos azufrados, lisina,
tirosina, etc.
• La proteína AmA1 (albúmina del amaranto 1) es una proteína bien equilibrada en términos
de la composición de aminoácidos e incorporaron el gen de la AmA1 en el genoma de papa,
provocando un incremento de hasta el 60% del contenido proteico total (sobre todo de
aminoácidos esenciales) de los tubérculos.
• Para mandioca, BioCassava Plus desarrolló una construcción codificante para una proteína
bautizada esporazeína, obtenida por la fusión de fragmentos de la subunidad beta de la
fracción zeína de maíz y la proteína esporamina de la batata.
Transformación de Solanum tuberosum con el gen de la
albúmina AmA1 de semillas de Amaranthus hypocondriacus
• Problema:
- El valor nutritivo de Solanum tuberosum está limitado por el contenido de
aminoácidos sulfurados, lisina y tirosina.
• Objetivo:
- Introducir una proteína con una composición balanceada en términos
de aminoácidos esenciales.
• Estrategia:
- Introducir el gen AmA1 de la albúmina de Amaranthus hypocondriacus en
Solanum tuberosum. Se expresó el gen en forma constitutiva o tubérculo
específica (pSB8 y pSB8G respectivamente).
• Resultados:
Tomado de: Chakraborty et al., PNAS, 2000.
• La papa Innate de Simplot expresa otros RNAi adicionales que tienen que ver con
el contenido de monosacáridos (que es el otro sustrato de la reacción de Maillard)
impidiendo la degradación de almidón durante el almacenamiento en frío
(fosforilasa L y R1) (hasta 58% de reducción) y la conversión de azúcar en glucosa y
fructosa (invertasa inducible por frío). Por otro lado, evitar el “endulzamiento por
conservación en frío” de la papa evita la pérdida del color amarillento típico de las
papas fritas, debido al uso de papas que no son “frescas”.
Inhibición de las Poli-Fenol-Oxidasas (PPOs)
Las PPOs, presentes en los cloroplastos son las encargadas, a través de reacciones de hidroxilación,
oxidación y polimeración, de transformar a los monofenoles incoloros en compuestos melanoides de
coloración pardusca y aroma extraño.
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Manzanas Arctic y champignones
CRISPR
• La empresa Okanagan Specialty Fruits, lanzó 2 nuevas variedades transgénicas de manzana
(Arctic Golden y Arctic Granny). La empresa responsable afirma que las manzanas Arctic
aguantan hasta 17 días después de trocearse sin amarronarse significativamente…
• El equipo del Dr. Yang de la Universidad de Pennsilvania, utilizó un plásmido no integrativo
(pUC19) conteniendo una construcción con los promotores U6 y gpd de A. bisporus que
controlan la expresión de secuencias guía de RNA (CRISPR) para direccionar el corte
enzimático de Cas9 (cuyo gen también estaba incluido en la construcción) y así producir la
mutación dirigida de genes que codifican para algunas de las PPOs. Después de transformar
protoplastos mediante la utilización de polietilenglicol (PEG), fueron capaces de regenerar
micelios, a partir de los cuales los champiñones resultantes, tuvieron reducida la expresión
de la PPO en un 30%, favoreciendo con ello una mejora de las cualidades organolépticas, vida
útil y los mecanismos automatizados de la cosecha de los champiñones blancos, así como
también los costes de producción y gestión de residuos.
La papa Innate I
• Además de inhibir la producción de monosacáridos en tubérculo, Simplot introdujo un gen
para RNAi de la enzima PPO POT32 que evita el amarronamiento producido por
golpes/magulladuras cuyo control (imperfecto) produce pérdidas por USD 298 millones por
año en EUA. Además, las papas no se amarronan (después de cortadas) por varios días.
Modificaciones en las rutas
de síntesis de hormonas
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Modificaciones
genéticas
para controlar metionina
la síntesis
del etileno S-adenosil metionina
ACC sintasa
ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico
(ACC)
ACC deaminasa ACC oxidasa
(Pseudomonas spp)
etileno
Agrobiotecnología
-cetobutirato + NH3
Ingeniería Tomado de: Stearns and Glick, Biotechnology Advances, 2003.
metabólica
Transformación • Problema:
de especies - El tiempo requerido para la comercialización de flores y
frutos se reduce debido a la producción de etileno que
de interés acelera su maduración y/o senescencia.
para controlar • Objetivo:
la síntesis - Inhibir la producción de etileno para retardar
de etileno la maduración y la senescencia.
• Estrategia:
- Introducir el gen antisentido de la ACC-sintetasa o
de la ACC-oxidasa, o el gen de la ACC-deaminasa de
Pseudomonas para reducir la síntesis de etileno. Se
transformaron melón, tomate, clavel, brócoli y tabaco
con dichas construcciones.
Plantas de clavel
transformadas con
un gen antisentido
Agrobiotecnología de la ACC oxidasa
Ingeniería
metabólica
Planta transgénica (izquierda)
Planta control (derecha).
Transformación Distintas vías utilizadas para lograr la inhibición
de especies reversible de la maduración de tomate
de interés
A B C
para controlar Genes antisentido
la síntesis de ACC sintetasa
de etileno
D E F
Genes antisentido
ACC oxidasa
G H
Expresión de
un gen de ACC
deaminasa
Tomado de: Theologis, Current Opinion in Biotechnology, 1994.
Agrobiotecnología
A: fruto de planta control mantenida en aire por 60 días. B: fruto de planta transgénica
mantenida en aire por 78 días. C: fruto de planta transgénica mantenida en atmósfera
Ingeniería de 10 ppm de etileno por 78 días. D: frutos de planta no transformada mantenidos en
metabólica aire. E: frutos de planta transgénica mantenidos en aire. F: frutos de planta transgénica
mantenidos en atmósfera de 10 ppm de etileno. G y H: fruto de planta no transformada
y de planta transgénica respectivamente mantenidos a 20oC en aire por 138 días.
Aplicaciones de TILLING
Transformación de Petunia hybrida con el gen de isopentenil
transferasa bajo un promotor específico de senescencia
• Problema:
- Las flores comienzan su senescencia una vez polinizadas.
• Objetivo:
- Evitar la senescencia por la inducción de síntesis de citoquininas.
• Estrategia:
0 24 48 72 96 120
Flores psag12-ipt
0 24 48 72 96 120
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Los metabolitos La producción de metabolitos secundarios:
secundarios
no son - No es necesaria para el crecimiento y desarrollo
de la planta per se y no forma parte de las
esenciales principales estructuras celulares.
per se para
- Distribuidos en forma especie-específica.
las funciones
vitales - Depende de condiciones determinadas .
de control hormonal.
de las plantas
- Es paralela al desarrollo de tejidos especializados .
y órganos (raíces, tallos, hojas y glándulas).
supervivencia
Propiedades biológicas de importancia ecológica
en el
ecosistema - Protección contra herbívoros y microorganismos:
fitoalexinas y fitoanticipinas
- Atracción de polinizadores y animales que
dispersan semillas: pigmentos y esencias
volátiles
- Agentes alelopáticos: aleloquímicos que influyen
en la competencia entre diferentes especies
Agrobiotecnología
de plantas
- Estreses abióticos: pigmentos y osmolitos que
Ingeniería
metabólica
protegen de la radiación UV, presión osmótica,
toxicidad de metales pesados, etc.
Las plantas • Potencial:
como fuente - 75% de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las
de metabolitos . plantas.
Ecogenina Digitoxigenina
( aglicona de una saponina; ( aglicona de digitoxina; tratamiento
detergente) de congestiones cardíacas)
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica Taxol Forbol Costunólido
( droga anticancerígena) ( irritante y co-carcinogénico) ( repelente de insectos ;
antinutriente de mamíferos)
Ejemplos de Rizoma de ginger
fenólicos
derivados de Unos 8.000 fenólicos
fenilpropanoides se forman en las
Pimiento rojo y negro
gingeroles plantas por las rutas
del ácido shikímico o
del malonato/acetato
norhidrocapsaicina
capsaicina
Granos de café
piperina
ácido clorogénico
Corteza de canela
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
cinnamaldehido
Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales
Cinchona
officinalis
Cocaína
Quinina
Erythroxylon coca
Coffea arabica Cafeína
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Limitaciones
• Se ha estudiado bien el metabolismo secundario de
para la unas pocas plantas; los metabolitos secundarios son
manipulación especie-específicos.
genética del
• Existe un conocimiento limitado de las vías de
metabolismo biosíntesis, tanto a nivel de sus componentes como
secundario a nivel regulatorio.
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Terpenoides
• Monoterpenos
- Esencias volátiles de flores y frutos
- Aceites esenciales de hierbas y especias
- Compuestos defensivos
• Sesquiterpenos
- Aceites esenciales de hierbas y especias
- Compuestos defensivos
- Repelentes de herbívoros
• Diterpenos
- Acidos de resinas coníferas y legumbres
- Drogas farmacológicas
• Triterpenos
- Compuestos defensivos
Agrobiotecnología - Repelentes de herbívoros
- Drogas farmacológicas
Ingeniería
metabólica • Tetraterpenos
- Carotenoides
Aumento • Problema:
de los niveles Los tomates sin aroma son percibidos por el público como
de s-linalol productos de baja calidad. El aroma está determinado por la
relación azúcares/ácido cítrico y por unos 400 compuestos
por volátiles.
modificación
• Solución:
de la vía Aumento del nivel de s-linalol, un alcohol monoterpeno
de los preponderante en el aroma y sabor del tomate.
monoterpenos • Estrategia:
Transformación con el gen heterólogo de la s-linalol sintetasa
(LIS) de Clarkia breweri bajo la dirección del promotor E8,
específico del estadío tardío de maduración del tomate.
Ingeniería
Se transformaron 2 variedades de tomate con poco aroma:
metabólica
UC82B: variedad de tomate para procesado
CB3: variedad de tomate fresco
Aumento
Linalol: alcohol monoterpeno acíclico presente en los
de los niveles tomates frescos que le otorga un aroma dulce y floral.
de s-linalol
por
modificación
de la vía
de los
monoterpenos
Agrobiotecnología
Ingeniería
Se desvió la vía de los terpenoides que lleva a la formación
metabólica
de carotenoides por sobrexpresión de la linalol sintetasa en
plástidos, lo que lleva a la producción de s-linalol.
La modificación de la vía de los monoterpenos en tomate produce un
aumento de los niveles de s-linalol pero no de su enantiómero r-linalol
CB3 Transgénica LIS 10,45 (0,31) 8,49 (0,82) 5,53 (0,56) 0,31 (0,01)
CB3 Control 11,07 (0,09) 7,02 (0,09) 3,00 (0,48) 0,00 (0,00)
UC82B Transgénica LIS 11,83 (0,34) 7,45 (0,75) 3,35 (0,60) 0,25 (0,05)
UC82B Control 10,40 (0,98) 6,40 (1,82) 4,80 (0,14) 0,00 (0,00)
Tomado de: Lewinsohn et al., Plant Physiol., 2001.
esencial de • Solución:
Disminuir la acumulación de metabolitos indeseables como
Mentha piperita mentofurano, y maximizar la producción de mentol.
• Estrategia:
- Sobrexpresión de la enzima 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato
reductoisomerasa (DXR).
- Supresión de la expresión de la enzima mentofurano
sintetasa (MFS) por expresión transcriptos antisentido del
del gen de MFS.
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Modificado de: Mahmoud et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001.
De las plantas transgénicas, la mayoría presentó un fenotipo normal, y algunas presentaron una pigmentación
anormal (sugiriendo inhibición de la síntesis de clorofila) y en mosaico. La utilización de un promotor constitutivo
permitió la expresión del gen dxr en hojas jóvenes y maduras de plantas transgénicas. Por el contrario, en las
hojas maduras de plantas no transformadas la expresión de este gen se encuentra normalmente reprimida.
Composición de aceites esenciales en plantas
transgénicas y control de Menta piperita
Porcentaje
Planta Mentona Mentofurano Pulegona Mentol
Modificado de: Mahmoud et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 98: 8915-8920, 2001.
• En las plantas DXR, la producción total del aceite esencial se incrementó en un 50% y se
observó un aumento en los niveles de mentol.
• En las plantas MFS, la producción total del aceite esencial fue similar a la de las plantas
control. Los niveles de mentofurano y pulegona disminuyeron y los de mentol aumentaron.
Expresión y
sobreproducción
de provitamina A
en plantas de Problema:
Oryza sativa
• Las deficiencias en distintas vitaminas afectan a
muchos millones de personas que se alimentan
con dietas restringidas.
Ingeniería
metabólica
Expresión y
sobreproducción
Solución:
de provitamina A
• En términos generales, muchos cultivos alimentarios
en plantas de podrían ser suplementados con vitaminas, lo que
Oryza sativa permitiría cubrir fácilmente los requerimientos
alimentarios mínimos.
– NOTA
una fresa blanca, no transgénica, resultante del cruce por
de la familia de las fresas de cultivo, la fresa chilena (Frag
• Sí existe
una frutilla blanca, no transgénica, resultante del cruce de dos especies
común(Fragaria de la familia
virginiana) procedentes de Suramérica y N
conoce comercialmente como “Pineberry“, tiene toques d
Fragariachiloensis x Fragaria virginiana procedentes de Sudamérica y Norteamérica,
comercializó en 2010, sobre todo en Holanda y Bélgica (UE
respectivamente. Se conoce comercialmente como “Pineberry“, tiene toques de sabor
similares a los del ananá y se comercializó en 2010, sobre todo en Holanda y Bélgica (UE).
Tomates púrpuras
• En 2008, un equipo de investigación del John Innes Centre de Norwich (Inglaterra) ponían de manifiesto la
creación de tomates transgénicos púrpuras gracias al aumento de concentración de antocianas por medio
de la introducción de los genes Delila (DEL) y Rosea1 (ROS1) que codifican para factores de transcripción
implicados en la síntesis de antocianinas en plantas de la Boca de Dragón (Antirrhinum majus) y el gen
MYB12 que codifica para un activador especifíco de la biosíntesis de flavonoides en Arabidopsis thaliana.
• Los tomates púrpuras, ingeridos por ratones deficientes en uno de los principales antígenos de células
tumorales, el p53, en su supervivencia.
• El tomate morado NPS será comercializado por NorfolkPlant Science (spin off del equipo de
investigación del John Innes Center) luego de cruzarlos con otros tomates comerciales.
Flavonoides
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Flavonoides
• Los flavonoides son un grupo diverso formado
por compuestos polifenólicos de bajo peso molecular.
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Biosíntesis de flavonoles y antocianinas
L1
L1
Agrobiotecnología L1
100 35SC1 -
200 E8LC -
2500 35SC1/E8LC +
3000 E8C1/E8LC +
500
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Modificación
• Existe un gran interés comercial en incrementar
de la síntesis el contenido de ciertos metabolitos secundarios
de alcaloides de uso medicinal en las plantas que los producen.
en Atropa • El alcaloide del tropano escopolamina es un importante
anticolinérgico presente en varias plantas Solanáceas.
belladona
• Atropa belladona produce altos niveles hiosciamina
y muy poca escopolamina.
• La enzima que realiza la conversión entre estos dos
compuestos (hiosciamina 6 -hidroxilasa) fue aislada
de Hioscyamus niger.
Hiosciamina Hiosciamina
6 -hidroxilasa 6 -hidroxilasa
H6H H6H
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica Hiosciamina 6 -Hidroxihiosciamina Escopolamina
Modificación
de la síntesis • Objetivo:
de alcaloides Aumentar la expresión de
escopolamina, importante
en Atropa droga anticolinérgica, en
belladona Atropa belladona.
• Estrategia:
Transformación de Atropa belladona con el gen
que codifica la enzima hiosciamina hidroxilasa (H6H)
de Hyosciamus niger bajo la regulación del promotor
constituvo 35S de CaMV.
Agrobiotecnología
35S CaMV H6H Hyosciamus niger t-nos
Ingeniería
metabólica
Modificación de la síntesis de alcaloides en Atropa belladona
Tomado de: Yun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992.
• Más del 92% del total de los alcaloides presentes en hojas, tallos y raíces principales
de las plantas control es hiosciamina.
• Las plantas transgénicas T0 y T1 expresaron casi exclusivamente escopolamina
en las partes aéreas. En las raíces la conversión a escopolamina no fue tan eficiente.
Desarrollo
de plantas • Problema:
de café con - Existe una creciente demanda de
bajo nivel café descafeinado debido a los
efectos adversos que la cafeína
de cafeína produce en personas sensibles.
- La obtención de café descafeinado
por métodos industriales es cara
y el café pierde sabor.
• Objetivo:
- Obtención de plantas de café (Coffea canephora)
que produzcan menos cafeína
• Estrategia:
Agrobiotecnología
- Disminución de la expresión de la enzima teobromina
Ingeniería sintetasa por ARN de interferencia. La secuencia 3´ no
metabólica codificante del gen CaMXMT1 se utilizó para diseñar
fragmentos cortos y largos de ARNi.
Desarrollo de plantas de café con bajo nivel de cafeína
reducción de
cafeína del
50-70%
Salvaje ARN-S
Ingeniería
metabólica