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Sensibilidades a la temperatura de enzima extracelular Vmax y Km a través de ambientes

térmicos. (Resumen)
Autores: Steven Allison, Adriana Romero, Ying Lu, John Taylor.
Conceptos claves: Relación de Arrhenius, teoría de la fisiología térmica.
Hipótesis: Para enzimas de ambientes cálidos se espera encontrar menores Vmax, Km, y
sensibilidad a la temperatura de Km, pero mayor sensibilidad a la temperatura de Vmax.
Importancia: Para parametrizar los modelos bioquímicos existentes.
Prueba: Se probó la hipótesis usando filamentos del hongo Neurospora, recolectada por el
mundo y de la descomposición de hojarasca en un experimento de calentamiento en el bosque
boreal de Alaska. Para la enzima extracelular de Neurospora, Vmax=1.48-2.25, y Km=0.71-
2.80. Siguiendo con la teoría, Vmax y Km fueron relacionados positivamente y Vmax se
redujo en consecuencia del experimento de calentamiento en la cepa de Alaska. Sin embargo,
la sensibilidad térmica de Vmax y Km no varió como se esperaba. También se encontró que
no hubo relación entre sensibilidad térmica de Vmax y Km. La disminución de Vmax en la
experiencia de Alaska implica una retroalimentación negativa a corto plazo para el cambio
climático, pero los resultados de la Neurospora sugieren que los cambios inducidos por el
clima en las entradas de las plantas y las propiedades del suelo son importantes los controles
sobre la cinética de la enzima a largo plazo.
Ecuaciones para tener en cuenta (cinética enzimática):
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉= (Michaelis-Menten)
(𝐾𝑚+[𝑆])

∆𝐺𝑒𝑠 = ∆𝐻𝑒𝑠 − 𝑇∆𝑆𝑒


Kcat=A*exp(-Es/RT)
1/km=exp(-∆𝐺𝑒𝑠/RT)
Km=exp(∆𝐺𝑒𝑠/RT−∆𝑆𝑒𝑠/R)
Materiales y métodos:
Neurospora → obtenida de Costa de Marfil, Tailandia, Suiza, España y Estados Unidos. Ésta
se encuentra en todo el mundo y tiene una estructura poblacional compleja, existen
poblaciones que habitan el suelo y se reproducen después de un incendio en bosques boreales
y templados.
Para su crecimiento, fueron introducidas a partir de cultivos madres en el centro de una placa
de Agar que contenía medio mínimo de Vogel (VMM). Se sellaron las placas con Parafilm e
incubadas por 5-7 días a 21°C hasta llenarse de Micelio. El Micelio fue transferido a un
matraz de 250 mL que contenía 100 mL VMM a 28°C con agitación a 150 rpm. Después de
3 días el medio se centrifugó para separar el Micelio que después se enjuagó y resuspendió
en VMM, se homogenizó en una mezcladora y transfirió a un matraz de 120 mL de VMM
fresco. Este procedimiento fue necesario para reducir la añadidura de Micelio que inhibe el
crecimiento de Neurospora. Después de 4 días más de crecimiento a 28°C y agitación de 150
rpm, el Micelio fue separado del medio por centrifugación y el sobrenadante se usó en
ensayos enzimáticos.
Experimento de calentamiento camada, Se analizó los parámetros enzimáticos en bolsas de
basura recogidas de un experimento de calentamiento de los suelos de los bosques boreales
de Alaska. Estos experimentos empezaron en Julio del 2005 con 2.5m x 2.5m de parcelas de
control, sin calentar y calentando. El calentamiento se hizo en invernaderos cerrados,
teniendo en cuenta las temporadas de invierno y lluvias para que no interfirieran. El
tratamiento de calentamiento incrementó la temperatura del aire en 1,6°C, la temperatura del
suelo en 0,5°C y redujo la humedad del suelo en 22%.
***
Bolsas que contenían 2g de senescentes agujas de abeto negro fueron puestas en control y se
calentaron parcelas en Mayo del 2013, cada parcela recibió 5 series de 2 bolsas colocadas en
el suelo del bosque y un conjunto de bolsas se cosechó en Julio del 2013, Agosto del 2013,
Mayo del 2014, Septiembre del 2014 y Julio del 2015, y el contenido de las dos bolsas se
combinaron. Las muestras fueron removidas para su determinación enzimática (alrededor de
0,6g en peso) y se almacenaron a -80°C hasta su análisis.
Ensayos enzimáticos
Análisis estadístico
Resultados y discusión

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