LP 5. Microscopia optică a preparatelor native, a frotiurilor colorate.

Identificarea principalelor categorii microscopice microbiene

Obiective:
La sfârşitul acestei lucrări practice studenţii trebuie:
1. Să identifice corect părţile unui microscop şi să manipuleze corect microscopul în
copul efectuării unui examen microscopic.
2. Să poată efectua corect un preparat microscopic în laboratorul de microbiologie
(preparat umed, frotiu).
3.Să precizeze etapele coloraţiei Gram şi să execute corect această tehnică. Să
efectueze corect controlul de calitate al coloraţiei Gram. Să cunoască avantajele şi
dezavantajele examenului microscopic.
4. Să cunoască importanţa medicală a coloraţiei Gram.
5. Să examineze şi să descrie un frotiu.

1.Microscopul este format din:

-o parte mecanică ( piciorul, corpul ansamblului mişcărilor, braţul, masa port obiect);
- o parte optică ( sistem de lentile: obiective, oculare);
- sistem de iluminare.
Puterea de mărire a unui microscop =produsul dintre puterea de mărire a
obiectivului, a ocularului şi a capului binocular.

2. Preparate microscopice
2.a Preparate microscopice umede
Indicaţii:
- evidenţierea motilităţii microorganismelor;
- observarea fungilor, protozoarelor, spirochetelor
 microscopia cu fond întunecat este metoda de elecţie pentru evidenţierea
spirochetelor
- depistarea şi identificarea rapidă a unor elemente celulare şi necelulare în produse
patologice.
Se va descrie tehnica efectuării şi examinării unui preparat microscopic umed.
2.b Preparate microscopice colorate

Indicaţii: evidenţierea caracterelor morfologie ale bacteriilor ( mărime, formă, aşezarea,

unele structuri speciale) şi afinitatea tinctorială ( în coloraţii diferenţiale).

Frotiul:

Definiţie: Frotiul este materialul microbian (produs patologic, cultură microbiană) etalat
în strat cât mai subţire şi uniform pe suprafaţa unei lame de microscop.

Etapele efectuării frotiului.

1. Etalarea.
2. Uscarea.
3. Fixarea prin caldură.
Coloraţii:
- simple: albastru de metilen- evidenţiază morfologia bacteriilor
- diferenţiale: Gram
Ziehl Neelsen
-coloraţii speciale (flageli, spori)
1
 3. Coloraţia Gram
Principiu: Peretele bacterian nu este colorabil, dar prin structura sa chimică condiţionează
colorabilitatea protoplastului în coloraţiile diferenţiale.
Pentru a explica comportarea diferită a bacteriilor în coloraţia Gram există două ipoteze (
ambele bazate pe diferenţa de structură a peretelui bacterian)
1. Peretele bacteriilor gram - negative conţine până la 20% lipide şi este mai subţire
decât cel al bacteriilor gram - pozitive. Alcoolul solubilizează lipidele şi face, astfel,
peretele permeabil pentru complexul violet iod care se îndepărtează .
2. Peretele bacteriilor gram pozitive nu conţine lipide. Alcoolul deshidratează peretele
şi, astfel, reduce diametrul porilor prin care ar putea difuza la exterior complexul
colorant violet-iod.

Etapele coloraţiei diferenţiale Gram:

Nr. Etapa Descrierea etapei Bacterii gram Bacterii gram

crt pozitive negative
1 Colorarea violet de metil, un minut, se spală Violet Violet
2 Mordanţarea Lugol, două minute, se varsă . Violet Violet
Nu se spală!
3 Diferenţierea amestec alcool acetonă, 5-10 Violet Incolor
secunde, spală.
4 Recolorarea soluţie de fucsină fenicată Ziehl Violet Roşu
diluată 1/10, 30 secunde, se spală.

Rezultat: bacterii gram pozitive=violet

bacterii gram negative=roşii
Controlul de calitate
- frotiu martor - suspensie care conţine un amestec de bacterii gram pozitive şi bacterii
gram negative ( ex: coci gram pozitivi şi bacili gram negativi)
-pe frotiurile efectuate din produs patologic, leucocitele sunt întotdeauna roşii.
 Leucocite roşii şi bacterii gram pozitive = coloraţie Gram bine efectuată
 Leucocite roşii şi bacterii gram negative= trebuie să examinăm frotiul martor.

Surse de eroare: -subdecolorarea

-supradecolorarea

4. Importanţa medicală a coloraţiei Gram

 Prima etapă în identificarea bacteriilor

 Orientează antibioterapia de primă intenţie

5. Microscopia cu imersie şi descrierea unui frotiu

Examinarea :
-se calculează puterea de mărire a microscopului
- se descrie tehnica examinării corecte

Descrierea:
-forma – coci
-bacili
-variaţia formei- coci rotunzi (stafilococi, streptococi), ovali (streptococi), lanceolaţi
(pneumococi), reniformi (neisserii).
2
 - bacili cu capetele rotunde, cu capetele tăiate drept (Genul Bacillus), cu
capetele măciucate (bacilii difterici)
-aşezarea: în grămezi (stafilococii), în lanţuri (streptococii), în diplo (pneumococii,
neisserii), în litere chinezeşti (bacilii difterici)
-mărime relativă: mic, mare
-afinitatea tinctorială : gram pozitiv, gram negativ
-prezenţa capsulei: pneumococii
- prezenţa sporului: -forma: oval (clostridii), sferic (C. tetani; Genul Bacillus)
-aşezare: central (Genul Bacillus), terminal (C.tetani), subterminal
(clostridii)
-dimensiune: mare, mic

Avantajele microscopiei:
- rapidă;
- cost redus;
-uşor de efectuat;
-orientează următoarele etape de diagnostic microbiologic;
-putem evidenţia bacterii necultivabile sau pe cele cu creştere lentă;
-informaţii cantitative ( 1 bacterie/câmp~ 105 UFC/ ml)

Dezavantajele microscopiei:
-sensibilitatea redusă.

Cultivarea microorganismelor: scopuri, medii de cultură, metode de

cultivare şi urmărire a culturilor
OBIECTIVE:
1. De a discuta scopurile cultivării bacteriilor.
2. De a prezenta mediile de cultură utilizate pentru cultivarea bacteriilor: definiţie, condiţiile de bază
ale unui mediu de cultură, criterii de clasificare, exemple.
De a discuta indicaţiile utilizării mediilor de cultură solide vs. lichide
îmbogăţite vs. simple
diferenţiale/selective vs. simple
3. Tehnica însămânţării în 4 cadrane. Obţinerea culturii pure. Descrierea caracterelor de cultură ale
bacteriilor pe diferite medii.

1. Scopurile cultivării:
 Medical - diagnosticul etiologic al infecţiilor bacteriene
- testarea sensibilităţii la antibiotice
Se discută cu studenţii necesitatea obţinerii “culturii pure”
Cultură pură = constituită din bacterii de acelaşi fel
= etapa indispensabilă identificării şi testării sensibilităţii la antibiotice
 Industrial - obţinerea de antigene, vaccinuri, produse de biosinteză, bioconversie sau fermentare

2. Definiţie
Mediul de cultură = soluţie apoasă a unor substanţe nutritive (nutrienţi, factori de creştere).
Nutrienţi = substanţe ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică.

Alimente = material crud din care derivă nutrienţii, prin digestie.
Factori de creştere = metaboliţi esenţiali pentru creştere: aminoacizi, baze azotate, vitamine.
Bacterii fastidioase = dependente de numeroşi factori de creştere

3
 Condiţii pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură:
- să fie nutritiv.
- să asigure presiunea osmotică (în general, medii izotone) şi pH (în general, 7-7,5) (similare celor
din mediul intern).
- să fie steril, pentru a cultiva exclusiv microorganismele din produsul investigat.
- să fie transparent – facilitează urmărirea culturii.
- să permită separarea, unele de altele, a microorganismelor dintr-un produs microbian.

Condiţiile fizico-chimice necesare cultivării:

- presiunea osmotică - majoritatea bacteriilor patogene cresc în medii izotone cu mediul intern al
organismului gazdă
- bacterii halofile ( >2 % NaCl)
- pH - majoritatea bacteriilor necesită un pH optim în jur de neutralitate (7-7,5)
- bacterii acidofile (5-5,5) / bazofile (8,5-9)
- temperatura:
- bacterii psihrotrofe se multiplică rapid la 20-30ºC şi cultivă lent la temperatura
frigiderului
- bacterii psihrofile (0-20ºC)
- bacterii mezofile (25-45ºC)
- bacterii termofile (50-70ºC).
- atmosfera de incubare:
- bacterii strict aerobe = se dezvoltă doar în prezenţa oxigenului
- bacterii strict anaerobe = se dezvoltă doar în absenţa oxigenului
- bacterii facultativ anaerobe = cultivă atât aerob, cât şi anaerob
- bacterii microaerofile = cultivă numai în prezenţa unor concentraţii reduse de O2 (5%)
- bacterii carboxifile = necesită pentru creştere cantităţi de CO2 mai mari decât cele din
aer (5-10%)

Clasificarea mediilor de cultură (criterii, repartizarea mediilor, exemple)

a. după provenienţa nutrienţilor:

- empirice – ingrediente de origine animală sau vegetală
- sintetice – ingrediente chimic pure → studiul necesităţilor nutritive ale bacteriilor

b. în raport de valoarea nutritivă:

-simple - bacterii nepretenţioase nutritiv
- îmbogăţite - bacterii pretenţioase nutritiv
c. după consistenţă:
- lichide – produse patologice monobacteriene
- solide – produse patologice pluribacteriene
- semisolide – studiul mobilităţii şi conservarea tulpinilor bacteriene.
d. după scopul utilizării:
- de izolare
 uzuale - satisfac exigenţele nutritive pentru o gamă largă de specii bacteriene
 diferenţiale - conţin substratul pentru anumite enzime bacteriene şi un indicator care atestă atacarea
acestui substrat  un caracter metabolic diferenţiază între ele bacterii cu aspect al culturii identic
pe mediile simple.
 selective - medii solide
- inhibă dezvoltarea bacteriilor de contaminare a prelevatelor
- frecvent sunt şi diferenţiale
 de îmbogăţire - medii lichide
- favorizează multiplicarea bacteriilor a căror izolare o urmărim
- inhibă selectiv flora de asociaţie.

- de identificare – studiul activităţii biochimice a bacteriilor în scopul încadrării într-un

gen/specie.
- de conservare.
4
3. Cultivarea şi izolarea bacteriilor în cultură pură

Tehnicile uzuale de cultivare a bacteriilor: însămânţarea bacteriilor pentru obţinerea culturii pure
– se efectuează demonstrativ însămânţarea prin epuizare în 4 cadrane, pe geloză simplă .
Însămânţare = depunerea în mediul de cultură a materialului bacterian, inoculum.
Cultură = totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare
Colonie = masă de cultură, vizibilă cu ochiul liber pe suprafaţa unui mediu de cultură solid, rezultată
prin multiplicarea unei singure celule bacteriene sau a unui grup de celule, numit unitate formatoare
de colonii/UFC.Colonie = clonă bacteriană, DECI cultură pură

Descrierea caracterelor de cultură:

 condiţii optime de cultivare:
- bacterii cultivabile vs. necultivabile;
- exigenţe nutritive: bacterii pretenţioase vs. nepretenţioase nutritiv;
- temperatura optimă de cultivare: psihrotrofe / psihrofile / mezofile / termofile;
- atmosfera optimă de cultivare: strict aerobe / strict anaerobe / facultativ anaerobe / microaerofile /
carboxifile;
- pH: neutru / bacterii acidofile / bacterii bazofile;
- presiune osmotică: bacterii care cultivă pe medii izotone/ bacterii halofile.
 aspectul culturii pe medii lichide / solide (sublinierea diferenţelor):
- forma de cultură S şi forma de cultură R pe mediu lichid / solid:

Forma de cultură Mediu lichid Mediu solid

S - tulbură omogen mediile lichide
- suprafaţa netedă, lucioasă
- contur circular
R - cultivă sub formă de grunji, - suprafaţa uscată, rugoasă
lăsând mediul supernatant - margini neregulate
clar

- aspectul coloniilor: diametru, circumferinţa, relief, suprafaţă, culoare, transparenţa, consistenţă,

aderenţa la mediu;
 modificări ale mediilor de cultură induse de cultivare (se prezintă comparativ mediile sterile
cu cele însămânţate)
- hemoliza pe agar-sânge: alfa / beta / gamma
- reacţii pe medii diferenţiale zaharate
- producerea de pigment difuzibil în mediu
- producerea unui miros particular.

ANTIBIOGRAMA
Obiective:
1. Discutarea relaţiei bacterie – antibiotic in vitro şi in vivo;
2. Criterii în iniţierea şi conducerea antibioterapiei.
3. Discutarea metodelor de testare a sensibilităţii bacteriilor la antibiotice:
a. calitative: antibiograma difuzimetrică – principiu, indicaţii, necesar, procedură,
citirea şi interpretarea, control de calitate, avantaje şi dezavantaje.
b. cantitative (determinarea CMI):
a) metoda diluţiilor în mediu lichid– principiu, indicaţii, necesar, procedură, citirea
şi interpretarea, control de calitate, avantaje şi dezavantaje.
b) metoda diluţiilor în mediu solid.
c) testul E.
4. Aprecierea eficientei terapiei cu antibiotice.

5
 1. Discutarea relaţiei bacterie – antibiotic in vivo şi in vitro

In vitro:
- CMI (cantitatea minimă de antibiotic care inhibă cultivarea unei tulpini
bacteriene);
- CMB (cantitatea cea mai mică de antibiotic care omoară 99,9% din bacteriile
unei tulpini testate).

In vivo:
– bacterie sensibilă la un anumit antibiotic (folosit în doze uzuale asigură cu
mare probabilitate vindecarea infecţiei);
- bacterie rezistentă la un anumit antibiotic (există o probabilitate puternică de
eşec terapeutic);
- bacterie intermediară (efectul terapeutic se poate obţine prin supradoze de
antibiotic, administrare locală, doze uzuale în cazul antibioticelor care realizează concetraţii
urinare mai mari decât cele serice).

Relaţia CMI cu încadrarea tulpinilor bacteriene în una din cele 3 categorii (S,
R, I):
 tulpinile sensibile (S) sunt cele care au valoarea CMI < decât nivelul mediu al
antibioticului din focarul de infecţie;
 tulpinile rezistente (R) au CMI > decât nivelul mediu al antibioticului în
focarul de infecţie;
 tulpini intermediare (I) au CMI apropiată de nivelul mediu al antibioticului
din focarul de infecţie.

2. Criterii în iniţierea şi conducerea antibioterapiei.

- oportunitatea tratamentului antibacterian;
- criterii în alegerea antibioticului adecvat:
 sensibilitatea agentului etiologic:
o terapie empirică bazată pe evaluarea probabilă a agentului etiologic;
o tratament ţintit, adaptat la sensibilitatea tulpinii izolate, determinată
prin antibiogramă.
 sediul infecţiei;
 particularităţi ale pacientului;
 criterii ecologice;
 criteriul economic.

3.a. Antibiograma difuzimetrică

Principiu: pe suprafaţa mediului Mueller-Hinton însămânţat în pânză cu tulpina

de testat depunem microcomprimate cu diferite antibiotice; antibioticul difuzează circular în
mediu, realizînd concentraţii descrescătoare; cultura este inhibită în zona în care antibioticul
realizează concentraţii ≥ CMI;

Indicaţii: testarea uzuală a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor cu creştere

rapidă;

Necesar şi procedură:
- realizarea unei suspensii a tulpinii de testat (folosind cultura pură) cu densitatea
de 108 UFC/ml, apreciată cu standardul de 0,5 Mac Farland;
6
 - impregnarea cu această suspensie a unui tampon de vată steril cu ajutorul căruia
se însămânţează în pânză suprafaţa mediului Mueller-Hinton;
- depunerea microcomprimatelor cu antibiotice;
- incubare la 35ºC, timp de 18-24 ore;
- în cursul incubării, antibioticul difuzează circular în mediu, realizând concentraţii
descrescătoare în raport cu distanţa faţă de microcomprimat; cultura este inhibată în zona în
care antibioticul realizează concentraţii ≥ CMI.

Control de calitate: în paralel procedăm asemănător cu o tulpină de referinţă

(ATCC – American Type Culture Collection) care si-a păstrat sensibilitatea naturală la
antibioticele testate, cu ajutorul căreia verificăm respectarea condiţiilor standardizate de
lucru.

Citire şi interpretare: diametrul zonei de inhibiţie a creşterii, în mm, se compară

cu cele două diametre critice stabilite de experţi
– când această valoare este ≥ diametrul critic superior (D), tulpina este
considerată sensibilă (S)
– când valoarea găsită este ≤ diametrul critic inferior (d), tulpina este
considerată rezistentă (R)
– când diametrul măsurat este situat între valorile celor două diametre critice
considerăm tulpina ca intermediară (I).

≥D ≤d

sensibil intermediar rezistent

Avantaje: posibilitatea testării simultane a sensibilităţii faţă de mai multe

antibiotice
Dezavantaje: lipsa de concordanţă a rezultatelor obşinute in vitro cu rezultatele
terapiei in vivo.

3. b. Metode cantitative

Principiu: un inocul standardizat al tulpinii testate este însămânţat într-un gradient

discontinuu de concentraţii de antibiotic; după incubare este urmărită CMI.

Indicaţii:
- precizarea categoriei de sensibilitate a unei tulpini clasificate intermediară prin
antibiograma difizimetrică;
- determinarea sensibilităţii bacteriilor fastidioase;
- testarea sensibilităţii la penicilină a tulpinilor de S. pneumoniae izolate din
sânge sau LCR;
- testarea rezistenţei S. aureus faţă de vancomicină;
- testarea sensibilităţii la penicilină a tulpinilor de streptococi viridans izolate
din endocardite.
7
 Metoda diluţiilor în mediu lichid

Necesar şi procedură:
- realizarea de diluţii duble succesive de antibiotic în bulion Mueller-Hinton;
- se adaugă câte 0,1ml din suspensia de 105UFC/ml a tulpinii de testat;
- realizarea unui martor cultivare şi a unui martor sterilitate mediu;
- incubarea mediilor la 35ºC timp de 18-24 ore.

Control de calitate: în paralel procedăm asemănător cu o tulpină de referinţă

(ATCC), cu ajutorul căreia verificăm respectarea condiţiilor standardizate de lucru

Citire şi interpretare:
 CMI corespunde celei mai mici concentraţii de antibiotic, în µg/mL, care
determină inhibarea vizibilă a creşterii, comparativ cu martorii pentru cultivarea tulpinii şi
sterilitatea madiului;
 raportăm această valoare la cele două concentraţii critice, maximă (C) şi
minimă (c) pentru definirea tulpinii ca S, R sau I.
Rezultatul este formulat după ce am verificat că CMI a tulpinii de referinţă se
încadrează între valorile recunoscute de standard.

≤c ≥C

sensibil rezistent
intermediar

Avantaje: determinarea cu exactitate a CMI

Dezavantaje: realizarea testării faţă de un singur antibiotic folosind o cantitate
mare de materiale şi medii.

4. Aprecierea eficientei terapiei cu antibiotice.

Criterii clinice:
- scăderea febrei;
- ameliorarea stării generale.
Criterii paraclinice:
- scădere / normalizarea valorilor:
o CRP (detalii);
o Procalcitoninei;
o VSH.
- normalizarea leucogramei.
Criterii bacteriologice: negativarea examenelor bacteriologice.