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¡SABER ES PODER!

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE


BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECURIAS

Escuela profesional de Industrias Alimentarias

TITULO DEL INFORME: DETERMINACION DE PROTEINAS – METODO


DE LOWRY

CURSO: análisis instrumental

GRADO: 3ro

PROFESOR: ING. Linley Vega

ALUMNO: José Cesar Mamani Nina

CODIGO: 2011-111085

Año 2017
DETERMINACION DE PROTEINAS – METODO DE LOWRY
I. OBJETIVOS
 Determinar las proteínas aplicando el método de lorwy con uso de matariles y reactivos
aplicados con este método

II. FUNDAMENTO DEL METODO DE LOWRY

Para aumentar la sensibilidad de la reacción de Biuret, el complejo proteína-Cu2+ se hace


reaccionar con el reactivo de Folin – Ciocalteus, dando una coloración azul, con un máximo de
absorción a 650 nm. La coloración se atribuye a la reducción del ácido
fosfomolibdico/Fosfotungstico a azul de heteropolimolibdeno de composición no definida, por
medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en mejor grado, m cisteinilos e histidilos de las
proteínas que forman el complejo con el Cu2+

CARACTERISTICAS DEL METODO

La intensidad de la coloracion varía con la composición de aminoácidos. Es más sensible que el


ensayo de Biuret. El rango es de 0.1 a -1mg/ mL. Presenta muchas interferencias.

El reactivo de Folin (ácido fosfomolibdico-fosfotungstico) es reducido por las proteínas para


formar un complejo azul de molibdeno. Es más sensible que el Biuret, pero más tedioso de
realizar. Puede detectar cantidades del orden de0.1 mg de proteína; el método se basa en la
reacción de proteínas con el Cu(II) en medio alcalino y también de la reacción de grupos fenólicos
(mayoritariamente tirosina en proteínas) con un reactivo denominado de Folin – Ciocalteau que
contiene fosfomolibdato y fosfowolframato. Las proteínas reaccionas con el reactivo de Folin –
Ciocalteau para dar un complejo coloreado.

El color que se forma se debe a la reacción del cobre con la proteína, La intensidad de color
depende del número de aminoácidos aromáticos presentes en especial la tirosina y el triptófano.
La técnica se basa en la reducción de una mezcla de ácidos que forman el reactivo cromógeno
de Folin – Ciocalteau por la oxidación de los aminoácidos aromáticos de las proteínas.
Se utiliza cobre como catalizador de la reacción ya que el ultimo forma un quetalo con la
estructura peptídica que facilita la transferencia de electrones a la mezcla cromogenica de
ácidos, produciendo una o más especies reducidas las cuales tienen un característico color azul
con una λ Max 745-750 nm. y una λ min a 405 nm.

Al producirse dicha reacción hay un cambio en el color de la muestra que puede ser cuantificado
determinando la absorbancia a 660 nm. Dentro de determinados rangos de concentración de
proteínas existe una relación lineal entre C y Abs660nm. A concentraciones altas de proteínas la
linealidad se pierde y por lo tanto este método no será adecuado para determinar la C real. El
rango adecuado es de entre 5 a 100 microgramos de proteína. Existe una amplia lista de
sustancias (como buffers, detergentes, lípidos, etc.) que interfieren con este ensayo y por lo
tanto afectan la determinación de la C real.

La solución a este problema se consigue diluyendo la muestra, y asi la cantidad de interferente


o por precipitación de las proteínas y resuspension en un buffer sin interferentes. El método de
folin Lowry es capaz de medir cantidades de proteínas en forma mas precisa, en microgramos.
Por ejemplo en un virus detecta las proteínas con muche más exactitud.

III. MATERIALES Y REACTIVOS


Material:

- Tamiz (60 mesh) - Agitadores - Tubos de ensayo


- Mortero - Baras magnéticas - Pipetas
- Espectrofotometro - Centrifuga

Reactivos:

- NaCi 0.15 M - Sulfato de cobre - Albumina de suero


- Carbonato de sodio - Tartrato de sodio y bovina
anhidro potasio
- NaOH - Reactivo de Folin
IV. Preparación de las Muestras:

 Tomar 50 gr. de frijol y moles hasta una granulometría < de 60 mesh. Reservar una porción
para determinación de Nitrógeno total.
 Preparar una suspensión de 10% en soluciones de NaCI 0.15 M y agitar por 1 hora
 Determinar el contenido de proteínas por el método de Lowry
 La muestra debe ser preparada a partir del extracto haciendo una dilución de 1/20 y
tomando alícuotas de 0.2 y 0.3 ml.

1. Solución alcalina:

Carbonato de sodio anhidro 20 g


NaOh 4g
Agua destilada 1000ml

2. Solución de sulfato de cobre:

CuSO4 2g
Agua destilada 100 mL

3. Solución de tartrato de sodio y potasio:

Tartrato de sodio y potasio 4g


Agua destilad 100 mL

4. Mixtura reactiva o Reactivo de Lowry:

Adicionar en ese orden (para no formar pp.). preparar diariamente

Solución numero 2 (CuSO4) 2 mL


Solución numero 3 (tartrato de sodio o potasio 2 mL
Solución alcalina (1) Completar para 100 mL
5. Solución estoque de Folin – Ciocalteau:

 En un balón de 2000 Ml, disolver 100 g de tungstato de sodio y 25 g de molibdato de


sodio (Na2MoO4. 2H2O) adicionar 700 mL de agua destilada
 Adicionar 100 mL de HCI concentrado y 50 mL de H3PO4 (85%)
 Adaptar a un condensador de reflujo y hervir levemente durante 10 horas
 Enfriar
 Adicionar 150 g de LiSO4, 50 mL de agua destilada y algunas gotas de bromo (en
campana extractora)
 Enfriar
 Completar a 1000 mL con agua destilada, el color de este reactivo debe ser amarillo-
dorado. La regeneración puede ser hecha por la adicion de gotas de bromo y hervor
por 15 minutos cuando se presenta verdosa

6. Reactivo de Folin – Ciocalteau diluido:

- Diluir un volumen de reactivo estoque (5) con (2) volúmenes de agua destilada. Es
recomendable titular con NaOH 1N, de tal forma que corresponda a un ácido 1N

7. Solucion de NaOh 1N:


- NaOH 4g
- Agua destilada 100 mL

8. Solución padrón de Albumina Bovina

- Pesar 50 mg de suero albumina bovina y 0.1 mL de NaOH 1N


- Disolver con agua destilada y completar para 100 mL (sin mucha agitación)
V. PROCEDIMIENTO

Esperar 10 minutos
Esperar 30 minutos y leer la absorbancia a 660 nm.

Grafico1. Curva de calibración Concentración (x) vs Absorbancia (y).

Mediante la ecuación lineal


VI. Resultados:
Ecuación de la recta para una muestra de ABS = 0.4550

𝑦̂ = 0.14365 + 0.08366 𝑥̂

0.4550 − 0,14365
𝑥̂ = = 𝟎. 𝟑𝟕𝟏𝟕 𝒎𝒈
0.08366

0.3716 mg ------- 0.2 ml


X -------- 86 ml (ml centrifugados)
X = 159.788 mg.

CONVIRTIENDO
159.788 mg a gr : 159.788 mg/1000mg = 0.159788 gr.
Si
0.159788 gr hubo en 10 gr de muestra (harina). ¿Cuánto habrá en total (100%)?

0.159788 gr ----------- 10 gr M
X ------------- 100 %
X = 1.5978 %
1.5979 % x 1000 = 15.978 g/Kg proteína.

VII. CONCLUSIONES

 Se hallo el porcentaje de proteínas dando un resultado de 1.5978%, aplicando el método


de Lowry, como resultado de 15.978 g/kg de proteína, se utilizó el reactivo de Folin