https://www.ncbi.nlm.nih.

gov/pmc/articles/PMC5877040/

Parásitos protozoarios en el agua potable: un enfoque sistémico para mejorar

el agua, el saneamiento y la higiene en los países en desarrollo
Alua Omarova , 1 Kamshat Tussupova , 2, 3, * Ronny Berndtsson , 3 Marat Kalishev , 1 y Kulyash Sharapatova 4

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Abstracto

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1. Introducción

La mejora del agua, el saneamiento y la higiene (WASH) podría evitar la muerte de más de dos millones de niños menores de
cinco años anualmente [ 1 ]. La causa principal de la mortalidad es la diarrea [ 2 ]. Las regiones de África y Asia sudoriental
representan el 78% (1,46 millones) de todas las muertes debidas a esta enfermedad en los países en desarrollo [ 3 ]. Los
parásitos protozoarios se identifican como la segunda causa etiológica más frecuente de mortalidad entre los niños menores
de cinco años. A nivel mundial, son responsables de 1,7 mil millones de casos de diarrea, lo que lleva a 842,000 muertes por
año [ 4 , 5 ]. Las enfermedades parasitarias transmitidas a través del agua por protozoos causan enfermedades epidémicas y
endémicas en los países desarrollados y en desarrollo [6 ]. Sin embargo, los primeros tienen mejores condiciones de higiene
por lo que los protozoos parasitarios no suelen considerarse como una razón de estas enfermedades [ 7 ]. El último, donde
la población consume tanto agua tratada como no tratada, tiene altas tasas de enfermedades por protozoos a pesar de haber
alcanzado sus estándares de tratamiento del agua. Por lo tanto, es necesario tomar muchas medidas para mejorar WASH en
entornos de escasos recursos para la identificación de estos organismos en los países en desarrollo [ 8 ].

Durante los últimos años, parece haber un número creciente de casos con brotes de enfermedades parasitarias transmitidas
por el agua o por agua en todo el mundo [ 9 , 10 ]. La razón de esto parece ser el desmoronamiento o el mal mantenimiento
de los sistemas comunitarios de abastecimiento de agua y de agua [ 10 , 11] Además, las pruebas para detectar protozoos no
se realizan con frecuencia y están ausentes en instalaciones de tratamiento pequeñas. En la práctica, los desafíos en la
investigación del agua potable para quistes y ooquistes de protozoos entéricos patógenos son la extracción y el suministro
de cantidades significativas de agua (50 l) a un laboratorio, la duración de la filtración, baja probabilidad de identificación de
quistes y oocistos y costosidad de el método. Es por eso que los índices microbiológicos de la calidad del agua en las Reglas
Sanitarias generalmente incluyen únicamente bacterias indicadoras, especialmente en las regiones en desarrollo.

A menudo es difícil distinguir la causa directa de la infección diarreica debido a las complejas interrelaciones entre WASH. Esta
puede ser una de las razones por las que los aumentos en la cobertura del servicio de agua y saneamiento a veces no reducen
la diarrea [ 1 ]. Debido a las relaciones íntimas y complejas entre los diferentes componentes de WASH, a menudo es
necesario mejorar no solo uno sino todos estos componentes para obtener resultados sostenibles.

El objetivo de este artículo es revisar el estado actual de los problemas de salud relacionados con WASH causados por
protozoos parásitos. Revisamos las técnicas de tratamiento actuales para el suministro de agua potable, así como los
enfoques de saneamiento y gestión institucional para disminuir el riesgo de brotes de enfermedades. La atención se centra
principalmente en los países en desarrollo. Para lograr el objetivo, primero damos una visión general y clasificación de los
protozoos y su efecto sobre la salud de las personas. Luego discutiremos diferentes maneras de mejorar el acceso a agua
potable, servicios de saneamiento y comportamiento de higiene personal. Finalmente, sugerimos un enfoque institucional y
de sistemas para garantizar WASH mejorado.

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2. Clasificación y aparición de los protozoos

Hay alrededor de 15,000 especies de protozoos [ 12 ] en la Tierra. Sin embargo, principalmente las siguientes clases tienen
un significado para la salud: Sarcodina, Flagellata, Sporozoa e Infusoria ( Figura 1). Los protozoos parásitos que se transmiten
a través del agua y los que causan infecciones humanas son Toxoplasma gondii , Entamoeba histolytica , Cyclospora
cayetanensis , Isospora belli , Blastocystis hominis , Balantidium coli,
Acanthamoeba spp., Sarcocystis spp. y Naegleria spp. Sin embargo, las infecciones parasitarias relacionadas con el agua más
comunes son la criptosporidiosis y la giardiasis [ 13]., 14 ]. Giardia y Cryptosporidium son agentes zoonóticos que se
identifican con mayor frecuencia durante los brotes causados por agua contaminada. La mayoría de los brotes de giardiasis
(71%) se produce en sistemas con agua superficial, mientras que la mayoría de los brotes de criptosporidiosis (53%) se
produce en el sistema de agua subterránea [ 6 ]. Estos parásitos protozoarios entéricos son importantes causas de
enfermedades diarreicas [ 5 , 9 , 11 , 15 ], especialmente entre los niños en los países en desarrollo [ 16 ].

Figura 1

Clasificación de protozoos parásitos.

Se encuentran quistes y oocistos de protozoos en las fuentes de aguas residuales, superficiales y subterráneas, así como
muestras de agua potable incluso después del tratamiento con métodos convencionales [ 6 ]. Dado que su objetivo principal
es la eliminación de bacterias patógenas como Vibrio cholerae , Salmonella typhi , Salmonella paratyphi y Escherichia
coli [ 17 , 18 ], los protozoos parásitos resistentes al cloro, como Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia, son motivo de
especial preocupación [ 19 , 20]. , 21 ]. Quistes de Giardia y oocistos deEl criptosporidio puede penetrar a través del sistema
de tratamiento de agua debido a su pequeño tamaño (1-17 μm) y puede causar brotes y epidemias después del consumo de
agua potable purificada [ 22 ].

La Figura 2 describe el ciclo de vida de los protozoos parásitos en términos de Giardia [ 23 , 24] Los quistes son responsables
de la transmisión de giardiasis y ooquistes para la criptosporidiosis. Tanto los quistes como los oocistos son formas resistentes
y pueden sobrevivir en agua fría durante varios meses. La infección comienza con la ingestión de quistes u ooquistes en agua
contaminada, alimentos, por las manos o fómites en el tracto digestivo del huésped. Cada quiste produce dos trofozoítos en
el intestino delgado. Los trofozoítos se multiplican por la fisión binaria longitudinal, permaneciendo en el lumen del intestino
delgado proximal donde pueden estar libres o unidos a la mucosa mediante un disco de succión ventral. Encystation ocurre
cuando los parásitos pasan al colon. Tanto los quistes como los trofozoítos se pueden encontrar en las heces [ 23 ]. Debido a
la defecación, los quistes y los oocistos se excretan en el entorno externo e infectan a otros huéspedes [ 23]., 25 , 26 ].
Figura 2

Ciclo de vida de Giardia [ 24 ].

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3. Mecanismos de contaminación del agua

La fuente de infección para la criptosporidiosis y la giardiasis es un ser humano o animal infectado, que secreta quistes y
oocistos invasivos en sus heces. La transmisión de Cryptosporidium y Giardia es fecal-oral. La infección ocurre a través del
agua potable o al tragar agua mientras se nada en piscinas abiertas [ 27 ]. El pequeño tamaño de los protozoos les permite
pasar filtros en las instalaciones de tratamiento de agua potable. Un estudio llevado a cabo en Japón mostró que los oocistos
de Cryptosporidium se detectaron en el 35% (9/26) de las muestras de agua filtrada (la concentración media geométrica fue
de 1.2 oocistos / 1000 L) y los quistes de Giardia en el 12% (3/26; la concentración media geométrica fue 0.8 quistes / 1000
L) [ 28] Además, tienen una gran estabilidad en el agua y pueden mantener una viabilidad de hasta 6-12 meses o más en el
entorno acuático. Esto se debe al hecho de que los oocistos de Cryptosporidium y los quistes de Giardia tienen una pared
gruesa a su alrededor. La formación de dicha pared protectora contribuye a la "congelación" del metabolismo de los
protozoos, y permanecen en la llamada "animación suspendida" [ 29 , 30 ].

La principal causa de enfermedades transmitidas por el agua y el agua es la materia fecal en el suministro de agua y la falta
de higiene [ 11 ]. Las heces pueden ingresar al agua de varias maneras, como [ 31]: desbordamiento de aguas residuales,
sistemas de alcantarillado que no funcionan, desagües pluviales contaminados y efluentes agrícolas. Los agentes causantes
de la enfermedad de protozoos junto con las aguas residuales líquidas de inodoros, pozos negros y granjas de ganado mal
dispuestos penetran en el suelo y los acuíferos. Los desechos de ganado no tratado de las instalaciones ubicadas en las
proximidades de los asentamientos que utilizan los acuíferos superiores para el suministro de agua son especialmente
peligrosos. El derretimiento y el agua de lluvia en el suelo pueden penetrar los acuíferos subterráneos y contaminar la calidad
del agua utilizada para beber. El agua confinada constituye un depósito subterráneo entre los estratos de confinamiento con
un nivel de tiempo constante y una calidad de agua relativamente alta [ 32]] El agua confinada es la más confiable en términos
sanitarios y parasitológicos. Sin embargo, los quistes y los oocistos que siembran incluso en aguas confinadas pueden ocurrir
si se viola la integridad de los estratos confinados o no hay supervisión sobre los pozos viejos [ 31 ].

Como se mencionó anteriormente, las estadísticas sobre las causas directas de los brotes de diarrea son difíciles de evaluar
debido a la gran incertidumbre sobre los componentes interactivos de WASH. La mayoría de los casos confirmados por
laboratorio proviene de los países desarrollados. Por ejemplo, en los EE. UU., 411,041 casos de brotes causados
por Cryptosporidium y Giardia asociados con el agua potable se registraron para 1990-2012 [ 33 ]. De acuerdo con estos
datos, la deficiencia de tratamiento fue la causa más común durante los brotes. Obviamente, el número de brotes de
protozoos parásitos transmitidos por el agua o por agua en países de bajos y medianos ingresos es significativamente
mayor. Desafortunadamente, no tenemos hallazgos comparables para las regiones en desarrollo.

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4. Tratamiento de agua potable

Los métodos tradicionales de tratamiento de agua potable incluyen una serie de procesos. Cuando se aplican a fuentes de
agua cruda, contribuyen a reducir los microorganismos que causan preocupación por la salud pública [ 34 ]. La coagulación,
floculación y sedimentación actúan para separar los sólidos de la fase líquida cuando las partículas se sedimentan por
gravedad. Los agentes microbianos (protozoos, bacterias y virus) tienden a absorberse en la coagulación o floculación y, por
lo tanto, se eliminan. La eficacia de eliminación de oocistos de Cryptosporidium y quistes de Giardia es de alrededor del 90%
[ 6 , 35 ]. Lamentablemente, estos métodos se consideran económicamente no rentables para los países en
desarrollo. Plummer et al. [ 36] investigaron la eficacia de la clarificación (sedimentación versus flotación de aire disuelto)
para la eliminación de oocistos de Cryptosporidium en diversas condiciones. Los resultados de este estudio mostraron que la
absorción de oocistos fue máxima a pH 5,0 y cuando se usaron coagulantes a dosis más altas que las que se usan actualmente
para eliminar la turbidez [ 34 , 37 ].

Con el diseño y la operación adecuados, la filtración puede servir como una barrera consistente y efectiva para patógenos
microbianos [ 38 ]. La eficiencia de transferencia depende de parámetros tecnológicos tales como el tamaño y la densidad de
los microbios, el tamaño y la carga superficial de los organismos y las partículas de coagulante, así como la profundidad del
material del filtro y la tasa de filtración [ 39 ]. La filtración rápida, como un filtro de pantalla simple, no elimina eficazmente
los patógenos microbianos. Los filtros lentos de arena pueden ser muy efectivos para eliminar la contaminación microbiana
del agua [ 6 ]. Sin embargo, se ha demostrado que la filtración de diatomeas es más efectiva para reducir la concentración
de oocistos de Cryptosporidium y Giardia.quistes que otras filtraciones convencionales o medios granulados
[ 34 , 40 , 41 , 42 ].

Los procesos de membrana accionados por presión (microfiltración, ultrafiltración, nanofiltración y ósmosis inversa)
desempeñan un papel importante en la producción de agua potable en los Estados Unidos y Europa [ 43 , 44 ]. La
microfiltración, la ultrafiltración, la nanofiltración y la ósmosis inversa han recibido una gran atención como alternativa a la
purificación y eliminación tradicional de los quistes de protozoos [ 34 , 43].] Las membranas de microfiltración tienen los
poros más grandes en el rango de 0.1 a 10 μm y la permeabilidad más alta. La microfiltración es un proceso efectivo para
eliminar partículas que pueden causar problemas en el procesamiento posterior. El uso de membranas de microfiltración en
la purificación del agua incluye la clarificación, el pretratamiento y la eliminación de partículas y microbios [ 34 , 43 , 44].] Las
membranas de ultrafiltración tienen poros más pequeños (0.002-0.1 μm), por lo que su permeabilidad es mucho menor que
en la microfiltración, y se requiere alta presión. En la actualidad, el uso de membranas de ultrafiltración en el tratamiento del
agua implica la eliminación de partículas y microbios. El tamizado físico se considera el mecanismo principal para la
eliminación de quistes de protozoos. Los tamaños de poro para microfiltración y ultrafiltración utilizados en la purificación
de agua van desde 0.01 a 0.5 μm, que es al menos un orden de magnitud menor que el tamaño de los quistes de protozoos
(4-15 μm) [ 34 , 43] Las membranas de nanofiltración tienen poros de alrededor de 0.001 μm. La nanofiltración retira iones
divalentes del agua; por lo tanto, es ampliamente utilizado para el ablandamiento del agua. Las membranas de ósmosis
inversa tienen los poros más pequeños de aproximadamente 0.0001 μm. La ósmosis inversa es necesaria para la preparación
de agua potable a partir de agua de mar, agua salobre o agua subterránea debido a su capacidad de eliminación de iones
monovalentes [ 45 ].

LeChevallier et al. [ 46 ] realizó un estudio de 66 sistemas de agua convencionales en EE. UU. Y descubrió que el cumplimiento
de los criterios establecidos en la Regla de tratamiento de agua superficial (SWTR) no garantizaba que el agua filtrada
estuviera libre de protozoos relacionados con el agua. Por lo tanto, se necesitaban altos niveles de desinfección o
procedimientos de desinfección más efectivos para proteger a los humanos contra los protozoos transmitidos por el agua
como Cryptosporidium y Giardia.. La desinfección es un componente esencial para la mayoría de las instalaciones de
tratamiento, especialmente para aquellas que usan agua superficial, ya que el material de filtración granular por sí solo no
eliminará la mayoría de los agentes patógenos del agua. La razón principal para la ocurrencia generalizada de métodos
reactivos de desinfección del agua potable es la facilidad de la evaluación continua de su efectividad. Con un sistema
centralizado de suministro de agua, el monitoreo de la calidad del agua basado en indicadores epidemiológicos debe llevarse
a cabo al menos una vez por hora. En los métodos de desinfección con reactivos, la evaluación de la eficacia de la desinfección
del agua se lleva a cabo determinando las cantidades residuales de agente desinfectante en ella [ 34].] Los principales factores
que influyen en la efectividad de la desinfección son la concentración del desinfectante, el tiempo de contacto, la
temperatura y el pH (dependiendo del desinfectante) [ 6 ].

El cloro es el desinfectante más utilizado para el tratamiento del agua potable en muchos países desarrollados y en
desarrollo. El uso de cloro tiene una larga historia en el tratamiento del agua [ 47 ], y se ha utilizado con éxito tanto para agua
potable como para aguas residuales. Además, el cloro se recomienda como un método de tratamiento de agua en el hogar,
especialmente en los países en desarrollo, ya que es un desinfectante asequible y fácil de usar [ 48 , 49 ]. La desinfección
adicional con cloro en el punto de uso puede reducir el riesgo de diarrea causada por Escherichia coli entre los niños en un
29% [ 48] Sin embargo, tiene varias desventajas: ineficacia contra los protozoos, pérdida de efectividad, olor fuerte y sabor
desagradable debido a la materia orgánica en el agua tratada [ 48 , 50 ]. En términos de resistencia a la inactivación del cloro,
se considera que los virus y los bacteriófagos son más resistentes que las células bacterianas vegetativas [ 47 ]. Jarroll et
al. [ 51 ] determinaron que los quistes de Giardia habían sido relativamente resistentes a la inactivación del
cloro. Cryptosporidium es uno de los microorganismos más resistentes en el agua. De acuerdo con los datos publicados, la
inactivación de Cryptosporidiumno se ha observado incluso después de 18 horas de contacto con 1,05% y 3% de cloro
[ 34 , 52 , 53 , 54 ]. Considerando que la cloroaminación del agua potable ha ganado popularidad debido a las preocupaciones
sobre los riesgos hipotéticos del consumo a largo plazo de subproductos clorados de la desinfección. Se considera que la
monocloramina es un biocida débil en comparación con el cloro libre, ya que requiere de 25 a 100 veces más tiempo de
exposición que el cloro para lograr una inactivación comparable [ 6 ].

El enfoque principal de muchos investigadores se encuentra actualmente en desinfectantes alternativos que incluyen dióxido
de cloro, ozono y radiación UV [ 55 ]. El dióxido de cloro existe como un gas no disuelto disuelto en agua en el rango de pH
6.0-9.0. Es un desinfectante fuerte y, por regla general, se considera que su eficacia biocida es comparable o ligeramente
superior a la del cloro en determinadas condiciones [ 6 , 47]. El dióxido de cloro es un desinfectante eficaz
contra Giardia y Cryptosporidium (alrededor del 90% de inactivación de quistes y oocistos). Sin embargo, este desinfectante
forma subproductos como clorito y clorato. Además, el dióxido de cloro es entre cinco y diez veces más caro que el cloro [ 56]

En comparación, el ozono es un oxidante muy fuerte, que es tóxico para la mayoría de los patógenos en el agua, incluso para
algunos quistes de protozoos, como Cryptosporidium . Se utiliza para mejorar el sabor y el color, así como para eliminar
compuestos orgánicos e inorgánicos en el agua [ 57 ]. A pesar de las ventajas del ozono, tiene una serie de desventajas que
limitan su uso en el tratamiento del agua, como el alto costo, la necesidad de una infraestructura operativa y de servicios, y
ninguna protección residual en el sistema de distribución [ 58 ].

Una visión diferente es la desinfección con agua ultravioleta que ocurre a través de la capacidad de la radiación UV para
penetrar en la pared celular y alcanzar su centro de información, es decir, los ácidos nucleicos ADN y ARN. La desinfección
con agua ultravioleta daña irreparablemente el ADN, lo que conduce a un deterioro de la replicación celular y / o muerte
celular [ 59 ]. Las ventajas de la radiación UV son principalmente que no depende del uso de aditivos químicos, es efectiva en
la inactivación de parásitos protozoarios, requiere un tiempo de contacto relativamente corto y no hay subproductos de
desinfección identificados [ 34].] Sus desventajas, sin embargo, incluyen diferencias en la eficiencia entre varios tipos de
lámparas UV y diseños de reactores, incapacidad para medir la dosis de la lámpara en la práctica, interferencia de turbidez y
ninguna protección residual en el sistema de distribución de agua [ 34 ].

Desafortunadamente, ni la ozonización ni la radiación ultravioleta tienen un efecto secundario bactericida, por lo que no se
pueden usar como medios independientes de desinfección del agua cuando se trata agua para servicios públicos, suministro
de agua potable o piscinas. La ozonización y la desinfección ultravioleta se usan como métodos adicionales de
desinfección. Cuando se usan en combinación con la cloración, aumentan su eficacia y reducen la cantidad de reactivos que
contienen cloro [ 34 ].

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5. Gestión de saneamiento

En los países industrializados, el uso de aguas residuales tratadas para fines domésticos, industriales y agrícolas es
actualmente el método más importante de reutilización de aguas residuales al proporcionar garantías sanitarias y
ambientales [ 60 ]. Las plantas de tratamiento de aguas residuales pueden convertirse en una fuente de contaminación para
las áreas de drenaje si las aguas residuales no se tratan adecuadamente antes de ser descargadas a los ríos o estanques
cercanos [ 19 ]. Además, los quistes y los oocistos pueden resistir la desinfección de agua convencional (ver la sección
anterior), por lo que se pueden encontrar en cantidades significativas de aguas residuales tratadas [ 61 , 62 , 63 , 64 , 65 ].

Varios estudios de plantas de tratamiento, donde solo se llevó a cabo el tratamiento primario o cada tratamiento se consideró
individualmente, revelaron bajas tasas de eficiencia de eliminación en las etapas primarias [ 66 , 67 ]. El tratamiento primario
incluye la eliminación de contaminantes, como grasas, aceites, arena, grava y piedras, que se recolectan y eliminan
fácilmente. El objetivo principal de la etapa primaria es obtener un líquido homogéneo que pueda procesarse
biológicamente. Sin embargo, algunas plantas de tratamiento usan solo procesamiento primario, y dado que la eliminación
de parásitos no es el objetivo del tratamiento primario, la eficiencia de tales instalaciones es mínima [ 60 ]. Quistes
de Giardia y Cryptosporidiumlos ooquistes no se han eliminado completamente incluso después del tratamiento
secundario. El estudio realizado en España por Castro-Hermida et al. [ 60 ] con un análisis de muestras de aguas residuales
de 12 plantas de tratamiento mostraron que se presentaron quistes y oocistos en todas las muestras de aguas residuales
tratadas (100%) que fluyeron de las plantas de tratamiento durante todo el año, y el mayor número de quistes y ooquistes
encontrado en primavera y verano. La eficiencia de eliminación promedio para estos parásitos, que tenían procesos de
tratamiento primario y secundario, fue de 16% a 86% para Cryptosporidium spp. y del 2% al 90% para Giardia lamblia.

El manejo adecuado, el tratamiento y la dispersión de las heces de humanos y animales son importantes para la higiene y la
seguridad del agua potable y recreativa. Cuando se toma en cuenta la cantidad de heces que ingresan al ambiente, la
magnitud del problema puede parecer abrumadora [ 61 , 62 , 63 , 64 , 65 ]. En todo el mundo, hay una gran diferencia en la
cobertura de los inodoros. Aproximadamente 1.770 millones de personas en todo el mundo usan letrinas de pozo como el
principal medio de saneamiento.

Las letrinas de pozo son la forma más simple y barata de saneamiento mejorado. Por lo general, consisten en un agujero
redondo, rectangular o cuadrado en el suelo y están cubiertos con una losa de concreto o un piso con un agujero a través del
cual caen las heces [ 68 ]. Las letrinas de pozo usualmente carecen de una barrera física, como el concreto, entre los
excrementos almacenados y el suelo y / o las aguas subterráneas [ 69 ]. En algunos países donde las letrinas de pozo son
comunes, más de dos mil millones de personas usan el agua subterránea como fuente de agua potable [ 68].] Por lo tanto,
los contaminantes de las letrinas de pozo pueden ingresar al agua subterránea y crear una amenaza para la salud humana. El
grado de transferencia de microbios desde las letrinas de pozo al agua subterránea depende principalmente del contexto
ecológico de la zona, especialmente de las condiciones hidrológicas y del suelo. Las distancias y las velocidades de
movimiento de los contaminantes se determinan mediante la regulación por tipo de suelo, caudal y dirección del agua
subterránea para las condiciones naturales y antropogénicas, y las condiciones biogeoquímicas del agua subterránea [ 68 ]. El
potencial de contaminación a gran escala del agua subterránea por las letrinas de pozo también depende de factores sociales,
como el uso de inodoros, la densidad del inodoro, el mantenimiento y el bombeo del agua subterránea [ 68 ].

Existe la preocupación de que las letrinas de pozo puedan afectar la salud humana y el medio ambiente debido al uso más
común de las letrinas de pozo y los recursos de agua subterránea en los países de bajos ingresos. Un gramo de heces frescas
de una persona infectada puede contener alrededor de 10 6 patógenos virales, 10 6 -10 8 patógenos bacterianos, 10 4 quistes
y oocistos de protozoos y 10-10 4 huevos de helmintos [ 70 ]. El tipo de inodoro, el diseño, los materiales y la calidad de la
construcción también afectan la localización de la contaminación de las letrinas de pozo. Por lo tanto, es necesario tener en
cuenta los factores ecológicos y antropogénicos para evaluar la seguridad de la ubicación de las letrinas de pozo y las fuentes
de agua subterránea [ 68 ]. Dzwairo et al. [71 ] hizo hincapié en tres factores importantes. En primer lugar, el análisis de
algunos parámetros críticos, como la profundidad de la capa de infiltración y la dirección del flujo del agua subterránea. En
segundo lugar, desarrollar saneamiento alternativo, como letrinas de pozo elevadas o niveladas, para minimizar el impacto
en las aguas subterráneas. Finalmente, aplicación de un enfoque integral que incluye geotecnología e hidrogeología para
resolver problemas de saneamiento.

Cada país tiene sus propios estándares para la construcción de sanitarios. Por ejemplo, en Haití, los inodoros deben ubicarse
a una distancia mínima de 30 m de cualquier fuente de agua superficial o potable, y el fondo de la excavación debe estar al
menos 1,5 m por encima de la altura máxima del nivel del agua subterránea [ 72 ]. De acuerdo con las recomendaciones para
las aguas subterráneas en Sudáfrica, las letrinas de pozo deben ubicarse al menos a 75 m de distancia de las fuentes de agua
[ 73 ]. La OMS sugiere un riesgo mínimo de contaminación del agua subterránea si la distancia entre la letrina de pozo y el
nivel del agua subterránea es superior a 2 m, siempre que la tasa de llenado sea inferior a 50 L / m 2 / día. Además, 15 m se
propone como una distancia lateral segura entre las letrinas de pozo y los pozos [ 74].] Sin embargo, en recomendaciones
posteriores y más conservadoras, WaterAid [ 75 ] sugiere que los inodoros y las fuentes de agua deben estar separados por
al menos 50 m. El proyecto Esfera [ 76 ] recomendó 30 m como el estándar mínimo para la distancia lateral entre los sistemas
de saneamiento locales y las fuentes de suministro de agua.

Las letrinas de pozo siguen siendo una estrategia importante para mejorar las condiciones de eliminación de excrementos
humanos a pesar del potencial de contaminación del agua subterránea. Este sistema es la opción más básica para que los
países de bajos ingresos reduzcan el nivel de defecación al aire libre y amplíen el acceso al saneamiento mejorado. Dado que
aproximadamente 1.11 billones de personas no tienen saneamiento [ 68 ], se espera que la cobertura de letrinas de pozo
aumente a medida que las personas traten de pasar de la defecación al aire libre al saneamiento básico [ 77 ]. Por lo tanto,
se requieren grandes esfuerzos para desarrollar enfoques más confiables pero viables para la colocación de letrinas de pozo
y fuentes de agua. Las directrices propuestas deben garantizar la protección del agua subterránea frente a la entrada de
cualquier patógeno [ 68 ].

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6. Higiene personal

Los principales factores que reducen la relevancia e impacto de las infecciones por protozoos en el campo de la salud pública
son la educación en saneamiento e higiene, abundante disponibilidad de agua de buena calidad, buenas condiciones
sanitarias y disposición adecuada de excrementos humanos y animales [ 58 ]. La educación y la motivación para cambiar el
comportamiento higiénico de las personas deben tener lugar en el contexto de la familia [ 78 ]. Las personas pueden
protegerse a sí mismas y a los demás de las enfermedades protozoarias relacionadas con el agua practicando una buena
higiene personal, que incluye lavarse las manos antes de preparar y comer, después de ir al baño, después de cambiar pañales
y antes y después de atender a alguien que está enfermo [ 79 ].

Incluso si hay un suministro ininterrumpido de agua microbiológicamente segura, puede contaminarse por los consumidores
en el hogar por el uso inadecuado [ 80 , 81] Por lo tanto, los tanques de agua deben estar limpios y cerrados, es necesario
limpiarlos y desinfectarlos regularmente. Cuando recolecte o almacene agua, no está permitido que nadie ponga las manos
en el agua y beba directamente del tanque de agua. Si es posible, los tanques de agua deben tener un cuello estrecho y un
tapón para evitar el contacto del agua con las manos, de lo contrario se debe tomar agua del tanque con un cucharón o una
taza. Además, es necesario utilizar el agua disponible hasta el final, y luego enjuagar bien el tanque con agua limpia antes del
siguiente llenado. Además, el agua para uso doméstico debe mantenerse en tanques durante el menor tiempo posible
[ 82]] Con el suministro de agua no centralizada, las personas deben ser conscientes de la importancia de proteger la fuente
de suministro de agua de la contaminación por protozoos patógenos y cómo hacerlo, así como de responsabilizarse por la
seguridad del agua que consumen. Las personas deben mantener los pozos cerrados cuando instalen una bomba de mano y
un drenaje adecuado, también deben mantener jarras, jarras y otros utensilios, que se usan para recolectar y almacenar
agua, limpiar y en lugares limpios. Es fundamental eliminar las heces y las aguas residuales de cualquier fuente de suministro
de agua y construir inodoros de acuerdo con los requisitos. Finalmente, la población debería realizar una inspección sanitaria
periódica de las fuentes de agua y la calidad del agua [ 82 , 83 ].

La purificación del agua a nivel doméstico es otro aspecto significativo de la higiene en los países en desarrollo. Algunos
pequeños dispositivos de purificación de agua se han desarrollado para ser utilizados directamente en el sitio. Por ejemplo,
los filtros pueden purificar pequeños volúmenes de agua a nivel de hogar. En este caso, todos los filtros tienen una propiedad
común, deben ser operados de la manera correcta (es decir, deben ser limpiados y mantenidos regularmente) [ 79 ]. Sin
embargo, no todos los filtros de agua domésticos pueden eliminar los protozoos parásitos. Por lo tanto, se cree que la
ebullición es el mejor método para obtener agua libre de contaminación biológica. En muchos países en desarrollo, las
personas hierven el agua de forma habitual, ya que no existe confianza en la seguridad del suministro de agua o está bajo
amenaza [ 84 ]. Para matar o inactivarCryptosporidium y Giardia , el agua debe mantenerse en ebullición durante un minuto
(a elevaciones superiores a 6500 pies, hervir durante tres minutos). El agua debe enfriarse, almacenarse en un recipiente
limpio y desinfectado con una tapa hermética y refrigerarse [ 31 , 85 ]. Sin embargo, es económicamente no rentable y
ambientalmente insostenible recomendar la ebullición diaria de agua potable a la población de los países en desarrollo con
bajos ingresos. Por lo tanto, la ebullición como método de desinfección del agua potable puede recomendarse solo en
situaciones de emergencia y solo la utilizan regularmente aquellos que pueden pagarla [ 84 ].
La eliminación segura de las heces humanas, de modo que esté aislada del contacto con humanos, animales o moscas, es la
principal barrera para evitar la propagación de parásitos protozoarios contenidos en las heces en el hogar y el entorno
cercano al hogar [ 86 ]. De acuerdo con Fewtrell et al. [ 87], las condiciones mejoradas para la eliminación de las heces
humanas pueden reducir el riesgo de enfermedades intestinales en un 32%. El inodoro debe enjuagarse después de cada
uso, cepillarse regularmente con limpiadores especiales y enjuagarse después de eso. También es necesario usar una solución
antióxido en el inodoro. La superficie de la taza del inodoro, así como otras superficies que entran en contacto con las manos,
como el borde, el asiento del inodoro, la tapa y el mango al ras se deben lavar regularmente con detergentes especiales, y es
importante usar un trapo separado para lavar la taza del inodoro Luego, el cepillo y el trapo deben lavarse con jabón o
detergente, enjuagarse y secarse bien. Además, el inodoro debe mantenerse cerrado para evitar la propagación de la
infección por las moscas [ 82 ].

En las áreas sin alcantarillado centralizado, la eliminación y el tratamiento de las heces humanas se realiza a nivel "local"
(fosas sépticas, letrinas de pozo, etc.). Es importante que el suelo donde se filtran los excrementos esté correctamente
seleccionado y que el inodoro esté correctamente instalado, teniendo en cuenta la distancia desde las fuentes de suministro
de agua y la profundidad del agua subterránea, y mantenido bien (ver recomendaciones en la sección anterior). Las personas
que no tienen acceso a saneamiento básico deben enterrar inmediatamente sus excrementos y no defecar cerca de la casa
[ 86].] Además, es importante utilizar métodos adecuados y seguros para el cuidado del ano. Incluso una pequeña cantidad
de heces restantes puede contener una gran cantidad de protozoos patógenos. La mejor manera de cuidar el ano después
de la defecación es usar papel higiénico u otro material, después de lo cual debe desecharse en la taza del inodoro o clavarse
en el suelo. En muchos países en desarrollo, después de la defecación las personas usan hojas, palos, piedras, etc. En tales
casos, es importante que estos artículos se desechen de manera segura, por ejemplo, enterrados en el suelo. Si se usa agua
corriente, es necesario enjuagar bien el ano, enjuagar y luego asegurarse de que no quede agua en la taza del inodoro o en
el piso. También se recomienda estrictamente lavarse las manos después de la defecación [ 82 ].

Dado que la criptosporidiosis y la giardiasis están muy extendidas entre los niños, la eliminación segura de los excrementos
de los niños es importante para prevenir la transmisión de estas enfermedades protozoarias [ 9 , 88].] A los niños pequeños
se les debe enseñar a usar una olla. Se requiere usar papel higiénico para limpiar los fondos de los niños, y si no está
disponible, por ejemplo, en áreas rurales, enjuagar el fondo con agua corriente o con agua de una cubeta, para que el agua
de enjuague se acumule en la olla. Esto es importante, ya que el agua de enjuague puede contener protozoos patógenos. El
contenido de la olla, papel higiénico, etc. se debe verter en la taza del inodoro. La olla debe lavarse, secarse y cubrirse para
no atraer a las moscas. Si los niños defecan sin una olla, las heces deben desecharse inmediatamente vertiéndolas en la taza
del inodoro o cavando en el suelo. Si la defecación ocurre en la casa, el lugar debe lavarse y, si es posible,
desinfectarse. También es necesario lavarse las manos después de tales procedimientos higiénicos con un niño [89 ]. En
consecuencia, un mejor comportamiento de higiene personal es un factor crucial en la prevención de la criptosporidiosis y la
giardiasis.

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7. Enfoque institucional para garantizar WASH mejorado

La provisión de agua limpia y saneamiento para todos es uno de los Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS), también
conocidos como los Objetivos Globales [ 90 ]. El ODS 6 comprende seis objetivos técnicos para el período hasta 2030
relacionados con el agua potable, el saneamiento y la higiene, la gestión de aguas residuales, la eficiencia del agua, la gestión
integrada de los recursos hídricos y la protección de los ecosistemas acuáticos [ 91]] Deberíamos mencionar los primeros tres
de ellos. La meta 6.1 de los ODS es lograr el acceso universal y equitativo a agua potable segura y asequible para todos, que
se encuentra en las instalaciones, disponible cuando sea necesario y libre de contaminación química fecal y nociva. La meta
6.2 es lograr el acceso a servicios de saneamiento e higiene adecuados y equitativos para todos y poner fin a la defecación al
aire libre, prestando especial atención a las necesidades de las mujeres y las niñas y las que se encuentran en situaciones de
vulnerabilidad. El acceso a servicios de saneamiento seguros es crucial e implica una instalación de saneamiento básico, que
no se comparte con otros hogares y donde las excretas se desechan de manera segura in situ o se tratan fuera del sitio. La
meta 6.3 es mejorar la calidad del agua al reducir la contaminación, eliminar el vertido y minimizar la liberación de productos
químicos y materiales peligrosos,91 ]. Los objetivos universales de los ODS solo pueden considerarse alcanzados cuando se
reúnen para todos los subgrupos dentro de la población, lo que implica una desagregación progresiva de los datos por
ingresos, sexo, edad, raza, etnia, estado migratorio, discapacidad, ubicación geográfica y otras características relevantes en
contextos nacionales .
 Para alcanzar estos objetivos con respecto a las fuentes de agua potable libres de parásitos protozoarios, se debe utilizar el
enfoque institucional y de sistemas, tal como se describe en la siguiente figura ( Figura 3 ):

1. Acceso a fuentes de agua potable gestionadas de forma segura;

2. Mejor comportamiento de higiene personal;

3. Acceso a servicios de saneamiento administrados de manera segura; y

4. Enfoque institucional para garantizar la implementación eficiente de medidas para cumplir con las medidas de objetivos
anteriores.

figura 3

Esquema del enfoque de sistemas para garantizar agua, saneamiento e higiene mejorados (WASH).

Algunas partes del esquema pueden superponerse con los planes de seguridad del agua (WSP) recomendados por la
Organización Mundial de la Salud. Los PSA abarcan el suministro de agua desde la captación hasta el consumidor y tienen
tres componentes, que son responsabilidad de los proveedores: una evaluación del sistema, un monitoreo operativo efectivo
y una gestión y comunicación [ 92 ]. Sin embargo, la penetración de protozoos parásitos en el cuerpo humano depende en
gran medida del comportamiento de las personas, que debe estar dirigido a la prevención de la ingestión de protozoos con
agua y la transferencia de quistes y ooquistes en las fuentes de agua. Por lo tanto, la división de responsabilidades entre las
instituciones de monitoreo y los consumidores es esencial para la implementación de estos planes.

Estados Unidos ha establecido algunas organizaciones como el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC)
y la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA), que han monitoreado los brotes de enfermedades
relacionadas con el agua desde 1971. Suecia y Japón (en 1980 y 1981, respectivamente) estableció el sistema de Vigilancia
Epidemiológica Nacional de Enfermedades Infecciosas (NESID) [ 93 ]. El Sistema Nacional de Vigilancia de Enfermedades de
Declaración obligatoria (NNDSS) se creó en Australia en 1990. La Agencia de Protección de la Salud (HPA) se fundó en el Reino
Unido en 2003. La Agencia de Salud Pública de Canadá (PHAC) se estableció en 2004. Siguiendo a EE. UU. en 2005, algunos
países europeos organizaron el Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades (ECDC) [ 5] Estas
organizaciones monitorean y evalúan la calidad del medio ambiente, incluidas las fuentes de agua, debido a su impacto en la
salud pública y desarrollan prácticas recomendadas para reducir cualquier impacto adverso. El monitoreo de las condiciones
ambientales y la salud pública se lleva a cabo a nivel gubernamental. Uno de los aspectos más significativos de esta actividad
es el estudio y análisis de la morbilidad parasitaria. Numerosos departamentos y laboratorios de investigación se utilizan para
recopilar y analizar información [ 93 ]. La información relevante y la documentación sobre brotes causados por protozoos
parásitos están disponibles en la mayoría de estos centros [ 5 ].

En 1994, la USEPA publicó el documento Cryptosporidium Criteria [ 94 ] y, por lo tanto, declaró a Cryptosporidium como el
principal contaminante del agua potable. La atención a este género de protozoos se ha incrementado y, posteriormente, ha
llevado a una mayor investigación. La detección de Cryptosporidium y Giardia en el agua requiere equipos especializados,
habilidades para proporcionar datos confiables que puedan ser utilizados para monitorear el cumplimiento y para determinar
los riesgos microbiológicos de enfermedades asociadas con el agua potable [ 34 , 95 ]. USEPA ha aprobado el Método 1623
para la detección simultánea de Cryptosporidium y Giardia. Este método se considera el estándar de oro y requiere filtración,
separación inmuno magnética de quistes y oocistos, análisis de inmunofluorescencia para determinar las concentraciones de
protozoos con confirmación mediante tinción con tintes vivos (4,6-diamidinofenilindol) y microscopía de contraste de
interferencia diferencial [ 96 ]. Se permiten todos los procedimientos alternativos siempre que se lleven a cabo las pruebas
de calidad requeridas y se cumplan todos los criterios de control de calidad en estos métodos. Aunque, el Método 1623 ahora
está disponible para el control de Cryptosporidium y Giardiaen el agua, otros métodos potentes incluyen análisis moleculares,
como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) sola o en combinación con un análisis del cultivo de células infecciosas
(cultivo celular-PCR). Estos métodos se usan para la tipificación genética y para determinar la viabilidad / infectividad y los
genotipos de los quistes de Giardiay los oocistos de Cryptosporidium [ 97 , 98 , 99 , 100 , 101 , 102 , 103 ]. Tales
herramientas deberían usarse en estudios para obtener una mayor comprensión de la transmisión de estos patógenos. El
problema es que estos métodos no son asequibles para los países de bajos y medianos ingresos [ 96 ].

La mayoría de los países en desarrollo no cuenta con ningún sistema gubernamental para registrar la incidencia y prevalencia
de infecciones o brotes de protozoos relacionados con el agua. Por lo tanto, hay una falta de documentación sobre los puntos
focales parásitos de las enfermedades relacionadas con el agua [ 5 ], lo que puede haber llevado a tasas subestimadas de
infecciones por protozoos en los países en desarrollo. Alrededor de 600 millones de personas en América Latina, Asia y África
viven en condiciones insalubres [ 6 ], 1.100 millones de personas carecen de acceso a fuentes mejoradas de agua potable y
2.600 millones de personas carecen de saneamiento adecuado [ 104].] Por lo tanto, se puede esperar una alta prevalencia
de enfermedades parasitarias relacionadas con el agua en los países en desarrollo. La mayoría de los brotes de giardiasis
ocurren en América Latina, África y Asia, alrededor de 5100 nuevos casos cada año [ 105 ]. La prevalencia
de Cryptosporidium en muestras fecales de pacientes con gastroenteritis es de 1-4% en Europa y América del Norte, mientras
que la cifra en África, Asia, Australia y América del Sur oscila entre 3% y 20% [ 106 ]. Además, hay altas tasas de portación
asintomática de Cryptosporidium(10-30%) en los países en desarrollo, en comparación con los desarrollados (<1%). También
se pueden estimar tasas de prevalencia más altas en los países en desarrollo para otras infecciones protozoarias relacionadas
con el agua. Sin embargo, la mayoría de los estudios sobre la prevalencia de infecciones parasitarias se llevan a cabo en países
desarrollados, donde la infraestructura de salud y las pruebas de laboratorio son más asequibles que en los países en
desarrollo [ 5 , 107 ].

Si bien los países desarrollados han establecido sistemas de vigilancia epidemiológica, todavía no existe un acuerdo
internacional sobre la estructura de presentación de informes. Hormann et al. [ 108 ] criticó el hecho de que los sistemas de
vigilancia y presentación de informes varían ampliamente entre diferentes países y la comparación de datos no siempre es
posible. Aunque el CDC registra cada brote transmitido por el agua por agente, ubicación y número de casos, los sistemas
europeos de vigilancia epidemiológica se utilizan para determinar las tasas de infección nacional y los incidentes, descuidando
así los detalles de los brotes relacionados con el agua. Además, Craun et al. [ 109] descubrieron que estos sistemas de
vigilancia epidemiológica a menudo no identificaban la causa y la fuente de la infección. Por lo tanto, incluso aquellos países
que ya apoyan el sistema de vigilancia de brotes parasitarios transmitidos por el agua deberían mejorar sus métodos de
detección y diagnóstico de enfermedades.

La introducción de sistemas de vigilancia epidemiológica en los países en desarrollo será útil para detectar y combatir los
protozoos parásitos, lo que puede ayudar a mejorar la salud pública. Por lo tanto, es necesario desarrollar instrumentos de
diagnóstico confiables y asequibles para identificar los protozoos patógenos, especialmente en los países en desarrollo. Se
requiere un estudio adicional de nuevos métodos para obtener más resultados sobre las enfermedades de
protozoos. Además, todos los países deberían establecer un sistema de notificación estándar internacional que conduzca a
bases de datos estandarizadas y una cooperación exitosa en el control de los protozoos patógenos transmitidos por el agua
[ 5 ].

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8. Discusión

El objetivo de esta revisión de la literatura fue presentar una visión general del estado actual de los problemas de salud
relacionados con WASH causados por protozoos parásitos. El agua limpia, la eliminación adecuada de biorresiduos y un mejor
comportamiento de higiene son factores importantes para prevenir la transmisión de la criptosporidiosis y la giardiasis
[ 110 ]. La protección del agua potable contra estos protozoos es un problema grave para las organizaciones de
abastecimiento de agua de todo el mundo. A pesar de que se ha logrado un gran éxito en el campo de la purificación de
agua, Cryptosporidium y Giardiasiguen siendo los dos patógenos de agua más importantes. Se requiere una buena
comprensión de los mecanismos para un control adecuado de estos parásitos y existe la necesidad de métodos de purificación
nuevos e innovadores que puedan utilizarse tanto en países en desarrollo como en países desarrollados. Esto solo se puede
lograr mediante estudios integrados que examinen las fuentes, concentraciones, supervivencia y transmisión de parásitos
relacionados con el agua, la exposición ambiental y, finalmente, la capacidad de los sistemas de purificación para reducir de
manera confiable el riesgo de transmisión de la enfermedad por protozoos a través del agua [ 34 ].

El principio rector para proporcionar agua segura es el concepto de barrera múltiple, que incluye la protección de la fuente
de agua (superficial y subterránea), la optimización de los procesos de purificación del agua y el mantenimiento adecuado de
los sistemas de distribución. Además, se debe aplicar un enfoque de barrera múltiple en el proceso de purificación de agua. El
tratamiento del agua potable, que incluye una combinación de diferentes desinfectantes y tecnologías de filtración para
eliminar e inactivar diversos patógenos microbianos, garantizará un menor riesgo de contaminación microbiana [ 34 ].

Dado que se sabe que los parásitos protozoarios viven en el medio ambiente durante muchos meses [ 111 , 112 ], existe la
necesidad de estudiar mejores métodos de purificación que puedan eliminar más eficazmente estos organismos para
prevenir más brotes transmitidos por el agua o por agua causados por Giardia y Cryptosporidium [ 113 ]. Hoy en día no
existen requisitos para analizar aguas recreacionales para parásitos protozoarios, aunque se ha demostrado que estos
patógenos pueden ser vertidos en aguas recreativas durante los brotes [ 114 , 115] A diferencia de las piscinas, las playas
recreativas tienen sedimentos del fondo que pueden contener índices de contaminación bacteriana y parasitaria 1000 veces
más que el agua superpuesta [ 116 ]. Por lo tanto, es importante realizar un control parasitológico en plantas de tratamiento
y establecer regulaciones para concentraciones aceptables de quistes y ooquistes basadas en el uso posterior de aguas
residuales [ 60 ].

Además, además de mejorar los sistemas de abastecimiento de agua y alcantarillado para prevenir o minimizar el riesgo de
propagación de parásitos protozoarios, las medidas deben enfocarse en el comportamiento higiénico de las personas
[ 110 ]. Las personas deben sentir que comparten la responsabilidad de la salud y llevar a cabo actividades tales como lavarse
las manos, hervir el agua del grifo o instalar filtros adicionales para la purificación del agua, la eliminación segura de desechos
humanos y la educación sanitaria.

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9. Conclusiones

En conclusión, el enfoque institucional y de sistemas para WASH es necesario para resolver problemas de salud causados por
protozoos parásitos. En primer lugar, es necesaria una purificación adecuada del agua potable para garantizar el acceso al
agua potable. En segundo lugar, se requiere la higiene personal a nivel doméstico y personal para evitar la penetración de
protozoos parásitos en el cuerpo humano. En tercer lugar, un buen comportamiento de saneamiento puede proteger nuestro
cuerpo de reinfestaciones. Finalmente, el tratamiento apropiado de las aguas residuales o la eliminación de excretas en el
hogar es significativo para que los parásitos protozoarios en las heces no ingresen a las fuentes de suministro de agua. Un
cuerpo apropiado debería monitorear este complejo sistema. En consecuencia, los sistemas de monitoreo de agua para
protozoos parásitos son esenciales en los países en desarrollo.
https://www.nature.com/articles/ismej201320

Artículo original | Publicado:28 de febrero de 2013

Población microbiana y ecología comunitaria

Enriquecimiento de poblaciones específicas de protozoos durante

la biorremediación in situ de aguas subterráneas contaminadas con uranio
The ISME Journal volumen7 , páginas1286 - 1298 (2013) | Descargar Citation

Abstracto

La importancia de las bacterias en la biorremediación anaeróbica de aguas subterráneas contaminadas con

contaminantes orgánicos y / o metálicos es bien reconocida y en algunos casos se comprende tan bien que es
factible el modelado de la actividad metabólica in situ de los microorganismos subsuperficiales relevantes en
respuesta a cambios en la geoquímica subsuperficial. . Sin embargo, un factor potencialmente significativo
que influye en el crecimiento bacteriano y la actividad en el subsuelo que no se ha abordado adecuadamente
es la depredación de protozoos de los microorganismos responsables de la biorremediación. En
experimentos de campo en un acuífero contaminado con uranio ubicado en Rifle, CO, EE. UU., Las enmiendas
de acetato promovieron inicialmente el crecimiento de Geobacter reductor de metalesespecie, seguido por
el crecimiento de reductores de sulfato, como se observó anteriormente. El análisis de las secuencias del gen
18S rRNA reveló una amplia diversidad de secuencias estrechamente relacionadas con los protozoos
bacteriovorous conocidos en el agua subterránea antes de la adición de acetato. El florecimiento de
las especies de Geobacter fue acompañado por un enriquecimiento específico de las secuencias más
estrechamente relacionadas con el flagelado ameboide, Breviata anatema , que en su apogeo representó
más del 80% de las secuencias recuperadas. La abundancia de especies de Geobacter disminuyó luego de la
rápida aparición de B. anatema . El crecimiento posterior de Peptococcaceae reductoras de sulfatofue
acompañado por otro enriquecimiento específico de protozoos, pero con secuencias más similares a
flagelados diplomonadídicos de la familia Hexamitidae , que representaron hasta el 100% de las secuencias
recuperadas durante esta fase de la biorremediación. Estos resultados sugieren una respuesta presa-
depredador con protozoos específicos que responden a una mayor disponibilidad de bacterias predadas
preferidas. Por lo tanto, la cuantificación de la influencia de la depredación de protozoos sobre el
crecimiento, la actividad y la composición de la comunidad bacteriana subsuperficial es esencial para el
modelado predictivo de las estrategias de biorremediación de uranio in situ .

Introducción

Los protozoos anaeróbicos son miembros importantes de las comunidades microbianas que habitan en la
zona anóxica de la mayoría de los ambientes acuáticos. Se han encontrado en una variedad de hábitats
subsuperficiales de agua dulce prístinos y contaminados ( Sinclair y otros, 1993 ; Novarino y otros, 1997 ; Ellis
y otros, 1998 ; Zarda y otros, 1998 ; Kinner et al., 2002 ; Luo et al., 2005 ; Brad et al., 2008 ; Yagi et al.,
2010 ; Lin et al., 2012 ) a profundidades de hasta 200 m por debajo de la superficie ( Sinclair et al.,
1993 ; Nagaosa et al., 2008).) Muchos de estos protozoos son bacteriófobos, pastorean activamente sobre
bacterias en el subsuelo ( Fenchel, 1982 ; Linley y otros, 1983 ; Fenchel, 1986 ; Fenchel y Ramsing,
1992 ; Kinner y otros, 1998 ; Decamp et al., 1999 ; Kinner et al., 2002 ) y tienen un papel principal en el
control biológico de arriba hacia abajo de las bacterias y la regeneración de nutrientes, como nitrógeno,
fósforo, oligometales y elementos orgánicos, en estos ecosistemas ( Caron et al., 1988 ; Caron,
1994 ; Eccleston-Parry y Leadbeater, 1995 ).

Aunque el pastoreo con protozoos elimina las células bacterianas, la liberación de nutrientes que limitan el
crecimiento secretados por los protozoos en pastoreo puede estimular el metabolismo bacteriano. Por
ejemplo, la nitrificación, la producción de metano y la reducción de sulfato aumentaron en el subsuelo en
presencia de pastoreo de protozoos, y la tasa de crecimiento específico de bacterias fue dos veces mayor en
presencia de protozoos ( Bloem et al., 1988 ; Verhagen et al. 1995 , Strauss y Dodds, 1997 , Biagini et al.,
1998 ). Este metabolismo mejorado puede mejorar la eficiencia de la biodegradación de compuestos
orgánicos, como el lodo anaeróbico de las plantas de tratamiento de aguas residuales de productos lácteos
( Priya et al., 2008); hidrocarburos ( Rogerson y Berger, 1983); Mattison y Harayama, 2001 ; Mattison y otros,
2005 ); y material vegetal ( Biagini et al., 1998 ; Ribblett et al., 2005 ). El pastoreo con protozoos también
puede ayudar a prevenir la reducción de la conductividad hidrológica que de otro modo podría resultar de la
biomasa microbiana que obstruye los espacios de poros del acuífero ( Sinclair et al., 1993 ; DeLeo y Baveye,
1997 ; Kinner et al., 2002 ; Mattison et al., 2002 ). .

Alternativamente, en algunos casos el pastoreo de protozoos puede tener un impacto negativo en la

biorremediación de aguas subterráneas al reducir críticamente la cantidad de microorganismos que
degradan los contaminantes ( Kota et al., 1999 ). Por ejemplo, los protozoos inhibieron la degradación
de tricloroetileno y BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y o , m y p -xilenos) en microcosmos de laboratorio
construidos con sedimentos acuíferos contaminados ( Kota et al., 1999 ; Cunningham et al., 2009 ). y cuando
la depredación de protozoos no se consideró en un modelo de computadora que simulaba la
biorremediación de tricloroetileno por una comunidad metanotrófica, las tasas de degradación de
tricloroetileno se sobreestimaron en un 25% (Travis y Rosenberg, 1997 ).

Los esfuerzos para modelar la in situ biorremediación de agua uranio-contaminada se han convertido en cada
vez más sofisticado con la introducción de modelos metabólicos genoma escala para predecir el crecimiento
y la actividad metabólica de los microorganismos que se cree que influir en el proceso de biorremediación
( Scheibe et al., 2009 ; colmillo et al., 2011 ; Lovley et al., 2011 ; Mahadevan et al., 2011 ; Zhuang et al.,
2011 ; Barlett et al., 2012) Sin embargo, estos esfuerzos de modelado no han considerado el papel potencial
de los protozoos para influir en la dinámica de la comunidad microbiana. Aquí informamos que estimular el
crecimiento de la comunidad bacteriana con acetato para promover la reducción de U (VI) da como resultado
un enriquecimiento específico de protozoos con diferentes géneros de protozoos que responden al
crecimiento de Geobacter o bacterias reductoras de sulfato.

Materiales y métodos

Sitio y descripción del sitio de campo

En 2010, se llevó a cabo un experimento de biorremediación in situ apequeña escala en los terrenos de una
antigua instalación de procesamiento de mineral de uranio en Rifle, CO, EE. UU., Durante los meses de
agosto a octubre, como se describió anteriormente ( Miletto et al., 2011 ; Giloteaux et al., 2012 ). Esta misma
parcela se bioestimuló mediante adiciones de acetato durante los meses de agosto a octubre de 2011. Esta
investigación fue parte del programa de acción reparadora de relaves de uranio (UMTRA) del Departamento
de Energía de EE. UU. La gráfica utilizada en ambos experimentos de campo fue adyacente a una parcela
experimental más grande previamente estudiada en el sitio ( Anderson et al., 2003 ; Vrionis et al., 2005).) La
matriz de monitoreo consistió en una galería de inyección con seis pozos de inyección, nueve pozos
descendentes y un monitoreo de fondo bien ubicado aguas arriba de la galería de inyección
(ver Material Suplementario y Figura Suplementaria S1 ). El agua subterránea para el experimento fue
recolectada del pozo CD-04 en 2010 y CD-01 en 2011.

El sitio Old Rifle se encuentra en una llanura de inundación del río Colorado. El agua subterránea se mueve
principalmente en la unidad hidrostratigráfica superior del acuífero no confinado, una grava arenosa, un
aluvión de arena con grava. La capa permeable superior (conductividad hidráulica de aproximadamente 37 m
d -1 ) está sustentada por una capa de esquistos limosos relativamente impermeable (conductividad de
aproximadamente 0.005 m d -1 ) de la erosionada formación Wasatch ( DOE, 1999 ; Anderson et al.,
2003 ; Yabusaki et al., 2007 ).

La porosidad de los sedimentos del rifle es aprox. 25%, y solo el 38% del material del acuífero está contenido
en la fracción de tamaño <2 mm y la mayoría es de grava ( Fox et al., 2012 ).

Durante el experimento de campo, se inyectó una solución concentrada de acetato / bromuro (50/20 m M )
mezclada con agua subterránea nativa en la subsuperficie para proporcionar aproximadamente 5 m M
DEacetato al agua subterránea en el transcurso de 30 días en 2010 y 68 días en 2011as descrito previamente
( Anderson et al., 2003 ; Williams et al., 2011 ). El bromuro se utilizó como un trazador no reactivo.

Técnicas analíticas.

Se recogieron muestras para análisis geoquímicos después de purgar 12 l de agua subterránea de los pozos
con una bomba peristáltica. El hierro ferroso se midió espectrofotométricamente inmediatamente después
del muestreo utilizando el método de fenantrolina (ampollas AccuVac, Hach Company, Loveland, CO, EE.
UU.) Para hierro ferroso. Después de la filtración a través de un filtro de politetrafluoroetileno (Teflon) de
tamaño de poro de 0,2 μm (Alltech Associates Inc., Deerfield, IL, EE. UU.), Las concentraciones de acetato se
midieron con un cromatógrafo iónico Dionex ICS-1000 equipado con una columna IonPac AS22, un supresor
ASRS 300 y Eluyente de carbonato 4,5 m M / bicarbonato 1,4 M M (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, EE.
UU.).

Extracción de ácidos nucleicos de muestras

El ADN y el ARN se extrajeron del agua subterránea recogida del acuífero contaminado con U (VI) durante los
experimentos de campo de biorremediación. Para obtener suficiente biomasa del agua subterránea, fue
necesario concentrar 50 l de agua subterránea mediante filtración por impacto en filtros de disco de
membrana Supor de 293 mm de diámetro (Pall Life Sciences, Port Washington, NY, EE. UU.), Lo que demoró
aproximadamente 3 min. Todos los filtros se colocaron en bolsas de hidromasaje, se congelaron
instantáneamente en un baño de hielo seco / etanol y se enviaron de vuelta al laboratorio donde se
almacenaron a -80 ° C. El ARN se extrajo de los filtros como se describió previamente ( Holmes et al., 2005 ) y
el ADN se extrajo con el kit FastDNA SPIN para suelo (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.).

Las lecturas de absorbancia con el espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.)
Y la electroforesis en gel de agarosa mostraron que se extrajeron ADN y ARN de alta calidad de las muestras
de agua subterránea. Para garantizar que las muestras de ARN no estuvieran contaminadas con ADN, la
amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores dirigidos al gen 16S rRNA se
realizó en muestras de ARN que no se habían sometido a transcripción inversa.

Se usó un kit de síntesis de cadena única de avian RT mejorada DuraScript (Sigma, Sigma-Aldrich, St Louis,
MO, EE. UU.) Para generar cDNA como se describió previamente ( Giloteaux et al., 2012 ).

Parámetros de amplificación de PCR y construcción de la biblioteca de clonación

Se usaron varios pares de cebadores previamente descritos para la amplificación de 16S rRNA, 18S rRNA y β-
tubulin fragmentos de genes de ADN genómico y cDNA construido a partir de ARNm extraído de aguas
subterráneas. Los fragmentos de genes del rRNA 16S y los genes 18S rRNA se amplificaron con 8F ( Eden et
al., 1991 ) y 519R ( Lane et al., 1985), y 515F ( Giovannoni et al., 1988 ) y 1209R ( Reysenbach et al. ,
1992 ); respectivamente; BT107F y BT261R ( Baker et al., 2004 ) se usaron para amplificar el gen de la β-
tubulina . El rRNA 18S y β-tubulinalos conjuntos de cebadores fueron inespecíficos y amplificaron secuencias
de genes tanto protozoarios como no protozoarios. Algunas de las secuencias de genes no protozoarios
detectadas en este sitio provienen de especies vegetales, fúngicas y animales, que representaron ca. 5% y
25% de las bibliotecas de clones de rRNA y β-tubulina 18S (ver Material complementario , Figura
complementaria S2 y Tabla complementaria S1). Estos estudios se centraron exclusivamente en las
secuencias de protozoos detectadas en estas bibliotecas eucarióticas.

Los cebadores degenerados dirigidos al gen que codifica la subunidad α de la proteína reductoide sulfito
reductasa ( dsrA ) de especies de Peptococcaceae (dsrPept_380F y dsrPept_740R) ( Tabla S2
complementaria ) se diseñaron a partir de varias secuencias de nucleótidos
de Desulfitobacteria , Desulfosporosinus y Desulfotomaculum dsrA obtenidas del NCBI GenBank sitio web
( http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).

Una reacción de PCR de 50 μl consistió en las siguientes soluciones: 10 μl de tampón Q (Qiagen, Valencia, CA,
EE. UU.), 0,4 m M de cada dNTP, 1,5 m M MgCl 2 , 0,2 μ M de cada cebador, 5 μg de albúmina de suero
bovino , 2,5 U de ADN polimerasa Taq (Qiagen) y 10 ng de molde de PCR. La amplificación se realizó con un
minicicultor PTC 200 (MJ Research, Waltham, MA, EE. UU.) Comenzando con 5 min a 94 ° C, seguido de 35
ciclos que consisten en desnaturalización (45 s a 94 ° C), apareamiento (ver Tabla Suplementaria S1 ) ,
extensión (90 s a 72 ° C) y una extensión final a 72 ° C durante 10 min.

Después de la amplificación por PCR de estos fragmentos génicos, los productos de PCR se purificaron con el
kit de extracción de gel (Qiagen) y se clonaron en el vector de clonación TOPO TA, versión M (Invitrogen,
Carlsbad, CA, EE. UU.). En total, se secuenciaron 100 insertos de plásmido de cada una de estas bibliotecas de
clones con el cebador M13F en la Instalación de Secuenciación de la Universidad de Massachusetts.

Cálculo de índices de diversidad

Los índices de diversidad de Shannon-Wiener y Simpson se usaron para determinar la diversidad de taxones
presentes en las aguas subterráneas recolectadas del sitio. El índice de diversidad de Shannon-Wiener ( H ')
se calculó de la siguiente manera ( Margalef, 1958 ; Dunbar et al., 1999 ):

El índice de diversidad de Simpson ( D ) se calculó con la siguiente ecuación ( Simpson, 1949 ):

donde p i en ambas ecuaciones representaba la proporción del i- ésimo filotipo.

Uniformidad Especies estaba representada por el índice de uniformidad de Pielou ( J '), que se calcula a partir
de H ' / H ' max , donde H ' max es igual a ln ( s ) y s es el número total de filotipos ( Pielou, 1966 ).

Pruebas y diseño de cebadores qPCR

Los siguientes conjuntos de cebadores se utilizaron para cuantificar 16S rRNA y citrato sintasa ( gltA ) copias
de genes y el ARNm de transcripción que se encuentran en las aguas subterráneas recogidas durante los dos
experimentos de campo por cuantitativa (q) PCR: 16S rRNA se amplificó con 338F ( . Weisburg et al, 1991 ) y
518R ( Muyzer et al., 1993 ), y gltA se amplificó con CS375F y CS598R ( Holmes et al., 2005). Nuevos
conjuntos de cebadores de qPCR dirigidos DsrA y beta-tubulina genes fueron diseñados de acuerdo con las
especificaciones del fabricante (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.) y tenía tamaños de amplificación
que van from100 a 200 pb. cebadores qPCR dirigidos a todos los β-tubulinagenes de protozoos que se
encuentran en el agua subterránea (qbetGen_260F / qbetGen_340R) fueron diseñados a partir de secuencias
que se encuentran en nuestras bibliotecas de clones y de protozoos representante beta-tubulinasecuencias
obtenidas de la base de datos GenBank.

Los cebadores para qPCR también se diseñaron para dirigirse específicamente a genes de β-tubulina
de Breviata y Hexamita , y genes de dsrA de Desulfosporosinus en el agua subterránea ( Tabla S2
complementaria ). El breviata β-tubulina par de cebadores (qbetBrev_521F / qbetBrev_610R) fue diseñado a
partir de una β-tubulina clon (clon RB) que tenía una identidad de nucleótidos 86% a beta-tubulina
de breviata anatema y representó el 65% de la β-tubulinabiblioteca de clones ensamblados del agua
subterránea recolectada el día 14 durante el experimento de campo 2010. El par de
cebadores Geobacter gltA (CS375F / CS598R) se diseñó previamente a partir de un Geobactersecuencia más
similar a Geobacter sp. M18 ( Holmes et al., 2005 ) y representó el 79% de la biblioteca de clones
de Geobacter gltAensamblada con aguas subterráneas recolectadas en el pico de reducción de Fe (III)
durante el experimento de campo de 2010. El par de cebadores Hexamita (qbetHex_309F / qbetHex_542R)
se diseñó a partir de un clon de β-tubulina (clon RH) idéntico en 84% a la secuencia de nucleótidos de β-
tubulina de Hexamita inflata y representó el 86% de las secuencias de β-tubulina detectadas en día 46 en
2011. El par de cebadores dsrA de Desulfosporosinus (qdsrA_56F / qdsrA_217R) se diseñó a partir de
un dsrAclon (clonar RD) que era 98% idéntico a Desulfosporosinus youngiae y representaba el 95% de la
biblioteca de clonación en el agua subterránea recogida el día 39 en 2011.

Cuantificación de la abundancia de genes y transcritos por qPCR

La detección y la amplificación de qPCR se realizaron con el sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied
Biosystems) utilizando ADN genómico y ADNc fabricados mediante transcripción inversa a partir de ARNm
extraído del agua subterránea recogida durante el experimento de biorremediación.

Todos los ensayos de qPCR se realizaron por triplicado. Cada mezcla de reacción consistió en un volumen
total de 25 l y contenía 1,5 l de los cebadores apropiados (concentraciones de acciones, 1,5 μ M ), 5 ng de
ADNc y 12,5 l de energía SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Las curvas estándar que cubren
ocho órdenes de magnitud se construyeron con diluciones seriadas de cantidades conocidas de ADNc
purificado cuantificado con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific) a una absorbancia
de 260 nm. Las abundancias de transcripción y las eficiencias de qPCR (95-99%) se calcularon a partir de las
curvas estándar apropiadas.

Los parámetros óptimos de ciclado térmico consistieron en un paso de activación a 50 ° C durante 2 min, un
paso de desnaturalización inicial de 10 min a 95 ° C, seguido de 50 ciclos de 95 ° C durante 15 sy 60 ° C
durante 1 min. Después de 50 ciclos de amplificación por PCR, se realizaron curvas de disociación para todos
los productos de qPCR al aumentar la temperatura de 60-95 ° C a una tasa de incremento del 2%. Todas las
curvas arrojaron un solo pico predominante, lo que apoya adicionalmente la especificidad de los pares de
cebadores de PCR.

Estimaciones de número de celda de resultados de qPCR

Se estimaron los números de células protozoarias y bacterianas a partir de las copias del gen 16S rRNA y β-
tubulina determinadas por qPCR con 338F / 518R y qbetGen_2260f / 340r. Antes de que se pudieran hacer
las estimaciones, se determinó el número promedio de 16S ARNr y β-tubulina copias del gen encontradas en
los genomas bacterianos y protozoarios. El análisis de todos los genomas bacterianos disponibles indicó que
las bacterias tienen un promedio de 4.3 copias del gen 16S rRNA por célula ( Lee et al., 2009 )
( http://rrndb.mmg.msu.edu/search.php ), mientras que el el número de copias del gen 18S rRNA puede
variar considerablemente entre los protistas y los individuos pueden tener entre 1 y 1000 copias de este gen
en su genoma ( Saito et al., 2002 ; Galluzzi et al., 2004).; Zhu y otros, 2005 ; Terrado et al., 2011 ). Esta
enorme variabilidad entre el número de copias del gen 18S rRNA dificultaría la extrapolación del número de
células en función de los resultados de la qPCR. Por lo tanto, el gen de β-tubulina se seleccionó para el
análisis de qPCR. El análisis de 74 genomas de protozoos diferentes mostró que los protozoos tienen un
promedio de 1.94 copias de genes de β-tubulina en su genoma ( Tabla S3 complementaria ).

Los números de células se estimaron a partir de las siguientes ecuaciones:

(1) Peso del gen para X copias:

donde S es el tamaño promedio del gen (pb); MW bp es el peso promedio de un par base: 660 g mol -1 ; N A es
la constante de Avagadro: 6.023 × 10 23  mol -1 ; y C cell es el número promedio de copias de genes por
célula. (En nuestro estudio C cell = 4.3 para 16S rRNA y 1.94 para β-tubulin ).

(2) Cantidad del gen de la muestra recolectada:

donde qPCR C es el número de copias del gen qPCR; W es el peso de una copia del gen; q ADN es la cantidad de
ADN extraído de la muestra; y V el volumen de agua subterránea recolectada en el filtro.

(3) Número de células por volumen de muestra:

Análisis filogenético

Los rRNA 16S y 18S y las secuencias de genes funcionales se ensamblaron con Geneious 5.6 y se compararon
con las bases de datos de nucleótidos y proteínas de GenBank con los algoritmos blastn y blastx ( Altschul et
al., 1998 ). Las alineaciones se realizaron en ClustalX ( Thompson et al., 1997 ) y se corrigieron con PROSEQ
v.2.9 ( Filatov, 2002) antes de que se construyeran árboles filogenéticos con MEGA v.4 ( Tamura et al.,
2007 ). El algoritmo de unión de vecinos se usó para construir todos los árboles filogenéticos ( Saitou y Nei,
1987 ). Todas las distancias evolutivas se calcularon con el método de corrección de Poisson con 1000
réplicas de arranque. Se realizaron cálculos de cobertura homóloga y análisis de rarefacción de cada
biblioteca como se describió previamente (Giloteaux et al., 2010 ).

Las secuencias de nucleótidos de los genes 18S rRNA, dsrA , β-tubulina y 16S rRNA amplificados a partir del
acuífero contaminado con uranio se han depositado en la base de datos GenBank con los números de
acceso HF568845-HF568867 y HF569144-HF569146 .
Resultados y discusión

Enriquecimiento específico de especies de Breviata en respuesta al crecimiento de Geobacter

La adición de acetato al agua subterránea durante el experimento de campo 2010 resultó en un aumento
significativo de las bacterias, seguido de un aumento en los protozoos ( Figura 1a ). Los números de células
bacterianas estimadas a partir de qPCR del gen 16S rRNA con la ecuación descrita en la sección Materiales y
métodos fueron similares a los estimados mediante análisis de hibridación de fluorescencia in situ ( Holmes
et al., 2013 ). En 2010, el número de células bacterianas estimadas por qPCR varió de 2,31 × 10 4 a 2,02 ×
10 6  células por ml y el número de células estimadas por hibridación fluorescente in situ varió de 3,89 ×
10 4 a 2,19 × 10 6 (Holmes et al., 2013 ). Los números de células de protozoos estimados a partir de qPCR
del gen protozoario β-tubulinaindicaron que el número de células protozoarias varió desde ca. 1,0 × 10 2 a
3,75 × 10 3  células por ml.

Figura 1

Análisis de comunidades microbianas de muestras de agua subterránea recolectadas durante la fase de

reducción de Fe (III) del experimento de campo de 2010. ( a ) Estimaciones de los números de células
bacterianas y protozoarias calculadas a partir del ARNr 16S y del número de copias del gen protozoario β-
tubulina ( b2t ) estimado por qPCR (correlación de Pearson, r = 0.90, P = 0.015). ( b ) El número de copias del
gen Breviata β-tubulina y Geobacter citrato sintasa ( gltA ) por μg de ADN total ( r = 0.51, P = 0.02). ( c)
Desglose porcentual de las secuencias del gen 16S rRNA bacteriano detectado en bibliotecas de clones
construidas a partir de ADN genómico extraído de aguas subterráneas. ( d ) Desglose porcentual de las
secuencias del gen de rARN de protozoo 18S detectadas en bibliotecas de clones construidas a partir de ADN
genómico extraído de aguas subterráneas.

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Estas abundancias de protozoos fueron similares a las observadas en otros acuíferos subsuperficiales
contaminados y prístinos donde se detectaron 10 2 -10 4 individuos por ml ( Sinclair y Alexander,
1989 ; Sinclair et al., 1993 ; Ellis et al., 1998 ; Zarda et al. al., 1998 ; Ekelund et al., 2001 ). La relación de
número de protozoos a células bacterianas observada en el agua subterránea también fue consistente con
las proporciones previamente informadas de otros acuíferos de agua dulce ( Sinclair y Alexander
1989 ; Sinclair et al., 1993 ; Zarda et al., 1998 ); California. 1:10 2 en 2010 y ca. 1:10 3 en 2011.

Como se observó en estudios previos ( Anderson et al., 2003 ; Holmes et al., 2005 ; Vrionis et al.,
2005 ; Williams et al., 2011 ), el aumento de bacterias podría atribuirse al aumento del crecimiento
de especies de Geobacter , como evidenciado por un aumento en las copias del gen Geobacter gltA ( Figura
1b ). El análisis de secuencias del gen 16S rRNA demostró que las especies de Geobacter se convirtieron en la
especie bacteriana predominante en las aguas subterráneas, representando hasta 89% de la comunidad
bacteriana ( Figura 1c ) antes de una disminución en el número que coincidió con la mayor abundancia de los
protozoos ( Figura 1a ).

Antes de las inyecciones de acetato, la comunidad de protozoos era muy diversa con hasta 42 secuencias
diferentes de genes de rARN de protozoos 18S detectadas en el agua subterránea. Los índices
de diversidad Shannon-Wiener ( H ') y Simpson ( D ) calculados con las fórmulas descritas en la sección
Materiales y métodos fueron 2.81 y 0.9 ( Tabla S4B complementaria ). La comunidad de protozoos estaba
dominada por especies de las clases Spirotrichea (34.2% de las secuencias del gen 18S rRNA)
y Chrysophyceae (20.4% de las secuencias del gen 18S rRNA). La mayoría (63.6%) de las secuencias del
gen Spirotrichea 18S rRNA fueron más similares a las especies de protozoos ciliados Euplotes aediculatus(96%
similar) representado por el clon RDL11 en la Figura 2 . La mayoría de
las secuencias de Chrysophyceae(84.8%) fueron más similares al flagelado similar a Spumella JBM / S11 (98%
similar) representado por el clon RDL4 como en la Figura 2 .

Figura 2
Árbol filogenético que compara las secuencias del gen 18S rRNA detectadas en el agua subterránea con
secuencias de protozoos previamente caracterizados.

Imagen de tamaño completo

Ambas especies dominantes de protozoos se han detectado en otros ambientes contaminados. Por ejemplo,
las especies de Spumella se encuentran con frecuencia en acuíferos de agua dulce contaminados con aguas
residuales ( Novarino et al., 1994 ; Kinner et al., 1998 ); residuos de alquitrán de hulla ( Yagi et al., 2010 ) e
hidrocarburos poliaromáticos ( Lara et al., 2007 ) y especies de agua dulce de Euplotesse han aislado de lodos
de aguas residuales activados ( Salvado et al., 1997 ) y efluentes industriales ( Rehman et al ., 2008 ). Los
estudios también han demostrado que Euploteslas especies son resistentes a altas concentraciones de
metales pesados y pueden usar bioacumulación para eliminar hasta el 90% de estos metales del medio
ambiente ( Schlenk y Moore, 1994 ; Madoni et al., 1996 ; Shakoori et al., 2004 ; Martin-Gonzalez et al. al.,
2006 ; Chaudhry y Shakoori, 2011 ). Es posible que la eliminación continua de U (VI) observada en el sitio
Rifle después de las adiciones de acetato se haya detenido ( N'Guessan et al., 2008 ) podría deberse a la
bioacumulación de U (VI) por especies de Euplotes resistentes a metales en el subsuelo .

Con la adición de acetato, la riqueza de especies de protozoos bajó a 7 y H 'y D fueron tan bajas como 0.78 y
0.31 ( Figura 1d y Tabla Suplementaria S4B ). Esta disminución en la diversidad de protozoos podría atribuirse
a un enriquecimiento específico de las secuencias del gen 18S rRNA más similar al flagelado ameboide
bacteriófago, B. anatema (95% similar, Figura 2 ), que representó tanto como el 86% de la población de
protozoos ( Figura 1d ). Como las concentraciones de acetato y Fe (II) comenzaron a disminuir después del
día 23 ( Figuras 1b yc y Figura 3A complementaria ), el número de BreviataLas secuencias de ARNr 18S
disminuyeron y la diversidad global de protozoarios aumentó ( H '= 1.56, D = 0.71) ( Figuras 1b yd y Tabla
Suplementaria S4B ). Este aumento y posterior disminución en el número de especies de Breviata rastreadas
con cambios en la abundancia de especies de Geobacter ( Figura 1b ), y el número de copias del
gen de Geobacter gltAy Breviata β-tubulina se correlacionaron (correlación de Pearson, r = 0.51, P = 0.02 )

En el experimento de campo de 2010, el muestreo se terminó tan pronto como el sulfuro comenzó a
acumularse en el agua, lo que indica el inicio de la reducción del sulfato ( Figura 3A complementaria ). En
2011, las enmiendas de acetato se realizaron en el mismo pozo y las adiciones y el monitoreo se extendieron
a través de la reducción de sulfato ( Figura 3B complementaria ). Similar al experimento de campo 2010,
cuando se agregó acetato al agua subterránea, se observó una correlación entre la abundancia de bacterias y
protozoos ( r = 0.59, P = 0.02) ( Figura 3a ), y la diversidad bacteriana y protozoaria disminuyó
significativamente durante el Fe (III ) fase de reducción del experimento; H'Para la comunidad bacteriana
disminuyó de 2.59 en el día 0 a 1.82 en el día 18 y H ' para la comunidad de protozoos disminuyó de 1.97 a
0.70 en estos mismos días ( Tablas complementarias 4C y D ). El número de células bacterianas estimadas por
qPCR varió de 2,30 × 10 4 a 1,09 × 10 7  células por ml y el número de células protozoarias varió de 3,32 ×
10 3 a 5,06 × 10 4 .

figura 3

Análisis de comunidades bacterianas y protozoarias en aguas subterráneas durante la fase de reducción de

Fe (III) del experimento de campo de 2011. ( a ) Estimaciones de números de células bacterianas y
protozoarias calculadas a partir del ARNr 16S y del número de copias del gen protozoario β-tubulina ( b2t )
por qPCR (correlación de Pearson, r = 0.59, P = 0.02 ( b ) El número de β-tubulina Breviata ( b2t ) y copias del
gen Geobacter citrato sintasa ( gltA ) por μg de ADN total ( r = 0.63, P = 0.01). ( c ) Porcentaje
de BreviataSecuencias del gen 18S y Geobacter 16S rRNA en bibliotecas de clones en comparación con las
concentraciones de Fe (II) ( r = 0,68, P = 0,01). ( d ) El número de transcritos de ARNm de Geobacter
gltA y Breviata β-tubulina normalizados frente al número de copias del gen Geobacter gltA y Breviata β-
tubulina ( r = 0,75, P = 0,1).

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El aumento inicial en el número de células bacterianas y protozoarias podría atribuirse nuevamente a un

enriquecimiento de especies de Geobacter y Breviata ( Figura 3b ), y
las especies Geobacter y Breviatarepresentaron hasta 79% y 67% de las comunidades bacterianas y
protozoarias detectadas durante este tiempo ( Figura 3c ).

La PCR de transcripción inversa cuantitativa de transcripciones del gen de β-tubulina de Breviata demostró
que la expresión relativa de este gen, y por lo tanto, supuestamente de la actividad metabólica de Breviata ,
fue alta durante el aumento en los números de Breviata ( Figura 3d ). La abundancia del transcripto del gen
de β-tubulinaBreviata correlacionó bien ( r = 0.75, P = 0.007), con la expresión relativa del gen de la citrato
sintasa de Geobacter , gtlA , que es un indicador de la actividad metabólica de Geobacter ( Holmes et al.,
2005 ) .

Enriquecimiento de Hexamitidae en la fase de reducción de sulfato

Similar a los experimentos de campo previos ( Dar et al., Presentado para su publicación ; Vrionis et al.,
2005 ; Miletto et al., 2011 ), la adición continua de acetato después de la fase de reducción de Fe (III)
promovió la reducción de sulfato. La reducción de sulfato durante el experimento de 2011 comenzó tan
temprano como el día 7 cuando el sulfuro comenzó a acumularse en el agua subterránea ( Figura 3B
complementaria ). Se observó un aumento drástico en el número de copias del gen dsrA asociadas con
bacterias reductoras de sulfato después del día 25 ( Figura 4a ).

Figura 4
Análisis de las comunidades bacterianas y protozoarias encontradas en el agua subterránea durante la fase
de reducción de sulfato del experimento de campo de 2011. ( Un ) H 2concentración S (μ M ) y el número
de DsrA copias de genes por ADN total g ( r = 0,67, P = 0,002). ( b ) Desglose porcentual de las secuencias
génicas del ARNr 16S bacteriano detectadas en las bibliotecas de clones. ( c ) Proporción de secuencias del
gen 16S rRNA de Peptococcaceae en comparación con el número de copias del gen dsrA por μg de ADN total
( r = 0,79, P = 0,002).

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En experimentos de campo previos, se encontró que los reductores de sulfato asociados filogenéticamente
con la familia Desulfobacteraceae o Peptococcaceae eran miembros significativos de la comunidad
bacteriana ( Anderson et al., 2003 ; Vrionis et al., 2005 ; Miletto et al., 2011 ; Dar et al. , presentado para su
publicación). En el experimento de campo de 2011, las Peptococcaceae fueron las predominantes,
representando el 89% de las secuencias del gen 16S rRNA bacteriano en el día 39, cuando
las concentraciones de H 2 S estaban en su punto máximo ( Figura 4b ). La mayoría de
los clones de Peptococcaceae fueron más similares aDesulfotomaculum acetoxidans (95% similar)
y Desulfosporosinus sp. A10 (96% similar) ( Figura 5 ). Hubo una fuerte correlación entre las concentraciones
de sulfuro en el agua subterránea y la proporción de secuencias de Peptococcaceae en las bibliotecas de
clones ( r = 0.72, P = 0.007) y el número de copias del gen Dessulfosporosinus dsrA estimadas por qPCR ( r =
0.67, P = 0.002 ) Además, hubo una fuerte correlación entre la proporción
de secuencias de Peptococcaceae y copias del gen dsrA ( r = 0.79, P = 0.002) ( Figura 4c).)

Figura 5
Árbol filogenético que compara secuencias del gen 16S rRNA de especies de Peptococcaceaereductoras de
sulfato detectadas en el agua subterránea a secuencias de procariotas reductores de sulfato previamente
descritos.

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El aumento en las concentraciones de sulfuro y las secuencias de Peptococcaceae se asoció con un cambio en
la comunidad de protozoos. Las especies de la familia Hexamitidae se volvieron predominantes y
representaron hasta el 100% de las secuencias del gen 18S rRNA detectadas en el agua subterránea durante
este período ( Figuras 6a yb). Todas las secuencias del gen Hexamitidae 18S rRNA fueron las más similares
a H. inflata (84% similar) o Trepomonas sp. steinii (83% similar), representado por los clones RDL14-15-16
como en la Figura 5 . La biblioteca de clones y los estudios de qPCR mostraron una correlación directa entre
el porcentaje y la abundancia de Peptococcaceae reductoras de sulfatoy especies de Hexamitidae y entre
las concentraciones de Hexamitidae y sulfuro ( r = 0.64 y 0.67, P = 0.02) ( Figura 6b ). El análisis de qPCR de
las copias del gen Hexamita β-tubulina y Desulfosporosinus dsrA también demostró una fuerte correlación
entre la abundancia de células Hexamitidae y Desulfosporosinus en el agua subterránea ( r = 0,57, P = 0,03)
( Figura 6c). Además, la PCR de transcripción reversa cuantitativa de Hexamita β-tubulina y Desulfosporosinus
dsrALa abundancia del transcrito de ARNm indicó que las especies de Hexamitidae eran metabólicamente
activas durante el período en que los Hexamitidae aumentaban en abundancia y cuando
el Desulfosporosinus presentaba una expresión relativa alta de dsrA ( r = 0,53, P = 0,05) ( Figura 6d ).
Figura 6

Análisis de la comunidad de protozoos asociada a la fase reductora de sulfato del experimento de campo
2011. ( a ) Desglose porcentual de las secuencias génicas del rARN del protozoo 18S detectadas en las
bibliotecas clónicas. ( b ) Porcentaje de secuencias delgen 16S rRNA Hexamitidae 18S y Peptococcaceae en
bibliotecas de clones en comparación con las concentraciones de sulfuro. Secuencias de rRNA
de Peptococcaceae frente a Hexamitidae ( r = 0,64, P = 0,02); Hexamitidae vs concentraciones de H 2 S ( r =
0.67, P = 0.02). ( c ) Comparación de Hexamita El gen de la β-tubulina ( b2t ) y el gen dsrA de
Desulfosporosinus se copia por μg de ADN total ( P = 0,57, P = 0,03). ( d ) El número
de transcritos de ARNm de Desulfosporosinus dsrA y Hexamita β-tubulina normalizados frente al número
de copias del gen dsrA y β-tubulina ( r = 0,53, P = 0,05).

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Trascendencia

Estos estudios demuestran que el enriquecimiento específico de bacterias asociadas con la adición de
acetato al subsuelo para promover la reducción de U (VI) a su vez promueve el crecimiento de protozoos
bacteriófagos específicos. Aunque parece probable que el enriquecimiento de diferentes géneros de
protozoos en respuesta a los cambios en los géneros de bacterias más abundantes está relacionado con las
preferencias de las presas, es posible que otros factores, como los cambios en la química del agua
subterránea, también sean importantes.

Las especies de Breviata que se vuelven predominantes durante la floración de Geobacter probablemente
tengan un impacto en el crecimiento y la actividad de las especies de Geobacter consideradas importantes en
la reducción de U (VI) en este sitio ( Lovley et al., 2011 ; Williams et al. 2011 ). Breviata no se han notado
como miembros dominantes de cualquier comunidad de protozoos informada previamente. Se recuperaron
secuencias de Breviata de suelos agrícolas holandeses ( Moon-van der Staay et al., 2006 ) y
se detectaron flagelados ameboides estrechamente relacionados del género Mastigamoeba en sedimentos
anóxicos recogidos de un acuífero contaminado con aguas negras (Novarino et al., 1997 ), un plano mareal
marino ( Dawson y Pace, 2002 ) y varios estanques de agua dulce ( Bernard et al., 2000 ). Aunque las
descripciones anteriores de B. anatema han clasificado a este organismo en su microaerófilo ( Klebs,
1892 ; Walker et al., 2006 ; . Minge et al, 2009 ), hemos sido capaces de crecer breviata bajo condiciones
estrictamente anaerobias con Geobacter uraniireducens proporcionado como una fuente de alimento (datos
no mostrados). Los protozoos relacionados con las especies de Hexamitidae que surgieron con el crecimiento
de reductores de sulfato después de la adición de acetato se han encontrado en otros ambientes acuáticos
de agua dulce (Lee et al., 2005 ; Luo et al., 2005 ), algunos de los cuales contienen altas concentraciones de
sulfuro ( Horie, 1969 ; Luo et al., 2005 ). Además, Trepomonas especies se han visto consumir bacterias en
cultivos de laboratorio, que proporciona apoyo para in situla depredación por Hexamitidae ( Dujardin,
1841 ; Proceedings of Societies: Dublin microscópico Club, 1879 ; Eyden y Vickerman, 1975 ).

En la actualidad, no hay datos suficientes para cuantificar el impacto que las especies
de Breviata y Hexamitidae que pastan en especies de Geobacter y Peptococcaceae pueden tener en
la reducción de U (VI) in situ . Estudios previos han sugerido que el pastoreo de protozoos puede acelerar el
metabolismo de las comunidades bacterianas ( Bloem et al., 1988 ; Verhagen et al., 1995 ; Strauss y Dodds,
1997 ; Biagini et al., 1998 ) y pueden prevenir la reducción de la permeabilidad subsuperficial al evitar la
acumulación de biomasa bacteriana ( Kinner et al., 2002 ; Mattison et al., 2002)) Sin embargo, cuando las
concentraciones de dador de electrones, es decir, acetato, son altas, como lo fueron durante los
experimentos de campo, es probable que el número de unidades catalíticas capaces de reducir U (VI) sea un
factor principal que controle la tasa de U ( VI) reducción. Por lo tanto, se esperaría que el pastoreo
de Geobacter , y posiblemente otras especies bacterianas, reduzca la tasa de reducción de U (VI). Estas
consideraciones indican que los intentos de modelar de manera predictiva la dinámica del crecimiento y la
actividad microbiana durante la biorremediación de uranio in situ ( Scheibe et al., 2009 ; Lovley et al.,
2011 ; Mahadevan et al., 2011 ) deben incluir el pastoreo de protozoos.