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Libro de técnicas

de

COAGULACION.

Técnicas de Coagulación.

1) Tiempo de Sangramiento. Método de Duke.


2) Tiempo de Sangramiento. Método de Ivy.
3) Tiempo de Coagulación de la Sangre Total. Tiempo de Coagulación. Método de
Lee White.
4) Conteo de Plaquetas . Método de Brecher
5) Tiempo de Protombina. Método de Quick
6) Tiempo Parcial de Tromboplastina Activado. Método de Rapaport
7) Consumo de Protombina o Protombina Residual.
8) Retracción del Coágulo.
9) Prueba del Lazo. Método de Rumpel Leede.
10) Test de Gelación con Etanol (método grosero). Test de Paracoagulación.
11) Tiempo de Trombina.
12) Dosificación Cuantitativa de Fibrinógeno.
13) Disponibilidad del Factor III Plaquetario.
14) Técnica de Anticoagulante Lúpico. Factor Antiprotombina
15)Disponibilidad del Factor Plaquetario III (Hardisty).
16) Retracción del Coágulo (cuantitativa).
17) Tiempo de Lisis de Euglobulina.
18) Determinación de Tiempo de Reptilasa.

Coagulación. Pruebas que se deben realizar en un estudio de


Coagulograma Mínimo.
1) Tiempo de Coagulación. Método de Lee White.
2) Tiempo de Sangramiento. Método de Duke.
3) Prueba del Lazo. Método de Rumpel Leede.
4) Conteo de Plaquetas. Método de Breecker.
5) Tiempo Parcial de Tromboplastina con Kaolín (TPT Kaolín). Método de
Rapaport.
6) Tiempo de Protombina (TP). Método de Quick.
7) Protombina Residual. Método de Stefani.
8) Retracción del Coágulo.
Dependiendo de los resultados actuamos en las dosificaciones de los Factores de las
distintas fases, Extrínseca e Intrínseca.
Para medir la fase Intrínseca realizamos:
1) Tiempo de Coagulación.
2) Tiempo Parcial de Tromboplastina con Kaolín (TPT Kaolín).
3) Protombina Residual.
Factores que se miden en esta prueba:
V, VIII, IX, X, XI, XII, Plaquetas.
Para medir la fase Extrínseca realizamos:
1) Tiempo de Protombina (TP).
2) Fibrinógeno.
Factores que se miden en esta prueba:
I, II, V, VII, X.
Cuando tengamos Tiempo de Coagulación prolongado. Kaolín prolongado y una
Protombina Residual tenemos que dosificar los factores dependientes de la Fase
Intrínseca.
V, VIII, IX, X, XI, XII, Plaquetas.
Cuando tenemos un Tiempo de Protombina alterado, debemos dosificar los factores
dependientes de la Fase Extrínseca.
I, II, V, VII, X.
Los Factores comunes a ambas pruebas son: V, X

Tiempo de Sangramiento.( Método de Duke ).


Fundamento:
Hacer una herida en el lóbulo de la oreja y medir el tiempo que demora en formarse
el trombohemostático. Los factores que fundamentalmente intervienen son: la
elasticidad de la piel, el tono capilar, líquidos tisulares y la función mecánica y química
de las plaquetas.

Medidas a tomar para la realización de la prueba:


El paciente no debe ingerir aspirina 2 semanas antes de esta prueba.
En el caso de pacientes femeninas quitarle el arete 1 ó 2 min antes de la prueba
Desarrollo de la técnica:
Esterilizar el lóbulo de la oreja (por ser la parte menos vascularizada) con alcohol y
secar, haciendo una herida de 3 mm de profundidad con una lanceta poniendo el
cronómetro en marcha, esperar 1 min para recoger la primera gota con papel de filtro,
tratando de no tocar la oreja, después volver a recoger la gota cada 30 seg, hasta que
cese el sangramiento.
Valores Normales:
1 a 3 min.
El Tiempo de Sangramiento se ve prolongado en:
1) Trombocitopenias severas. ( menos de 50 x 109/l plaquetas ).
2) Déficit cualitativo plaquetario.
3) Trastornos o defectos vasculares.
4) Enfermedad hepática severa.
5) Déficit cuantitativo o cualitativo de los factores plasmáticos Von
Willebrand y fibrinógeno.
6) Leucemia.
7) Anemia aplástica.
8) CID.

Materiales:
Lanceta comercial.
Papel de Filtro.
Cronómetro

Tiempo de Sangramiento.( Método de Ivy ).


Fundamento:
El método de Ivy empleando una lanceta comercial ( Simplate, General Diagnostics,
Morris Plains, N.J ), es el método de elección, ya que se puede estandarizar la presión
capilar y la incisión en esta área permite efectuar múltiples pruebas para un control
más fácil de la sangría.
Medidas a seguir para la realización de esta prueba:
No realizar esta prueba si el paciente en esa zona presenta mucha vellosidad, en
caso de ser necesario rasurar el área.
Materiales:
Esfigmomanómetro.
Lanceta comercial.
Cronómetro.
Desarrollo de la técnica:
Se aplica un manguito de esfigmomanómetro en el antebrazo y se hincha hasta
40 mmhg, se limpia la superficie anterior del antebrazo, con una torunda con alcohol y
se seca con una gasa estéril.
Empleando la lanceta se efectúan una o dos incisiones {3mm de longitud y 1mm
de profundidad} en la piel de la anterior del antebrazo evitando las venas superficiales
y las cicatrices .
Se pone en marcha el cronómetro en el momento de la incisión y cada 30
segundos se absorben con un papel de filtro, los puntos de sangría, tocando solamente
la punta de la gota de sangre con el papel de filtro.
Se cronometra hasta que cesa la sangría .
Se ha sugerido que se cuantifique la cantidad de sangre perdida, puesto que
incluso con tiempo de sangría normal, el volumen real de sangre perdida puede ser
excesivo como en el caso de la Enfermedad de Wilebrand.
Valores normales:
De 1 a 6 mints.
El tiempo de sangramiento se prolonga en:
Alteraciones cuantitativas y cualitativas de las plaquetas.
Trombocitopenias severas y moderadas
Enfermedad de Von Willebrand.
Déficit congénitos de factor 1 y V
Estados fibrinolíticos

Tiempo de coagulación de la sangre total.(Método de Lee White)


Fundamento:
Esta técnica mide el tiempo que demora la sangre en pasar del estado líquido al sólido
después de ser extraída del árbol circulatorio.
Objetivos:
Medir el mecanismo intrínseco de la coagulación sanguínea sin otra adulteración que la
punción venosa y el contacto de la sangre con el cristal.
Materiales:
3 tubos de ensayo de cristal de kan, marcados a 1 ml.
Cronómetro
Equipo:
Baño de María
Desarrollo de la técnica:
Se marcan tres tubos (1, 2, 3) y se colocan en el baño de María a 37 c.
Se extraen 5 ml de sangre mediante el método de las 2 jeringuillas y se pone en marcha
el cronómetro.
Se deposita 1 ml de sangre en cada tubo, empezando por el tubo marcado con el número
1, sacando la jeringuilla y dejando caer la sangre por las paredes del tubo.
Suavemente se inclina el tubo número 3(el último en recibir la sangre), cada 30
segundos hasta que la sangre forme un coágulo sólido. Se realiza la misma operación
con los tubos 2 y 1 hasta que no se observe movimiento de sangre al inclinarlos.
Valores normales:
Los valores oscilan entre 5 y 10 mint.
Los tiempos se prolongan en:
Las hemofilias, que es la causa más frecuente.
Déficit graves de factores de la coagulación(vía intrínseca y/o común).
Anticoagulante circulante o heparina.

Prueba del Lazo. Método de Rumpel Leede.


Fundamento:
Consiste en apreciar el grado de resistencia de los capilares, al ejercer una presión en
el brazo del paciente, tratando de provocar la aparición de una púrpura experimental.
Desarrollo de la técnica:
Revisar el antebrazo del paciente antes de comenzar la prueba.
Se coloca un esfigmomanómetro en el brazo del paciente, por encima del codo a una
presión entre la mínima y la máxima alrededor de 80 mm de Hg, manteniéndose en
adultos por espacio de 5 mints y en niños pr 3 mints.
Decir al paciente una vez retirado el esfigmo que levante el brazo por encima de la
cabeza durante un mint; Seguidamente se observará la aparición o no de petequias.
Esta prueba tiene poco valor en:
Pacientes sangrantes.
Mujeres mayores de 40 años.
En gran número de alteraciones: metabólicas, inmunológicas y hematológicas.
Materiales:
Esfigmomanómetro.
Cronómetro.
Interpretación de los resultados:
Si en el antebrazo se observan petequias la prueba es positiva.
Si en el antebrazo no se observan petequias la prueba es negativa.
La prueba es positiva en:
1. Trombocitopenia severa.
2. Fragilidad capilar (congénita ó adquirida).
3. Vasculitis alérgica de Shonlein Henoch.
4. Tromboastenias. (positivo-negativo).
5. Trombopatías. (positivo-negativo).
6. Von Willebrand. (positivo-negativo).

La prueba mide:
 Lecho vascular.
 Plaquetas: a) Cualitativamente.
b) Cuantitativamente.
Retracción del coágulo
Fundamento:
La retracción normal del coágulo, precisa de plaquetas adecuadas, tanto cuantitativa
como cualitativamente, y está afectada por la trombostenina, que es una proteína
plaquetaria contráctil.
Equipo:
Baño de María
Objetivo:
Evaluar la cantidad y calidad de las plaquetas.
Desarrollo de la técnica:
Los tubos empleados para el tiempo de coagulación en sangre total se dejan en el baño
de agua a37 y se examinan1-2 hras después de coagular para que la retracción sea la
adecuada.
Interpretación:
La retracción del coágulo está deteriorada en trombocitopenias graves, tromboastenia
de Glanzman, policitemia, hipofibrogenemia y fibrinolisis. Una retracción del coágulo
deteriorada implica un coágulo frágil, débil e irregular y acompañado de un
desprendimiento y deposición aumentada de hematíes. La correlación entre la
retracción del coágulo y el contage de plaquetas es pobre, puesto que una
trombocitopenia puede no alterar el resultado de la prueba. La retracción del coágulo
de sangre total, es inversamente proporcional al hematocrito, la anemia lo acelera y la
eritrocitosis lo retarda.
Valores normales:
La retracción del coágulo se inicia 30 – 60 min después de coagular la sangre, y se
completa en dos horas, tiempo en el coágulo debe haberse retraido por lo menos de tres
lados del tubo, si fuera necesario hasta 6, 12 ó 24 horas.
La retracción del coágulo se informa como:
 Retráctil.
 Hiporetráctil.
 No retráctil.

Conteo de Plaquetas. (Método de Brecher).


Fundamento:
Utilizar oxalato de amonio con el fin de lisar los hematíes, diluir los leucocitos y dejar
libres las plaquetas.
Objetivo:
Determinar de forma cuantitativa las plaquetas.
Materiales:
 Lancetas.
 Pipetas de Thomas para glóbulos rojos.
 Tubos de ensayo 12 x 75.
 Cámara contadora de Newbauer.

Desarrollo de la técnica:
 Se punciona el pulpejo del dedo, desechando las dos primeras gotas, tomar de
una gota de sangre, hasta la marca 1 de la pipeta de Thomas, para glóbulos
rojos, completando hasta la marca 101, con oxalato de amonio al 1 %, quedando
así una dilución 1:100 (20µl de sangre total en 2 ml de diluente).
 Dejar en reposo de 5 a 10 mints. Agitar desechando las primeras gotas, montar
una cámara contadora de Neubauer, dejar en reposo en cámara húmeda de 5 a
10 mints. para sedimentar las plaquetas.
 Posteriormente se cuenta el cuadriculado central completo y se multiplica el
número de células por 1000 o se le agrega al No. contado x 109/l.
Valores Normales:
(Dilución 100) x (altura de cámara) = 1000 ó UI 150 – 350 x 109/l
(10)

Bibliografía:
Brecher. G. Crombite E/P. Morphology and anumeration of human blood platelets J.
Appl Physol 3: 365 1950.

Tiempo de Protombina. (TP) (Método de Quick).

Fundamento:
Cuando en un plasma citratado le agregamos un exceso de tromboplastina y lo
recalcificamos, el tiempo que demora en formarse el coágulo lo podemos tomar como
índice de concentración de los factores que intervienen en la fase extrínseca de la
coagulación (I, II, V, VII, X).
La protombina llamada también factor II, se sintetiza en el hígado; siendo uno de los
factores Vitamina k dependiente (factor II).
Los anticoagulantes que inhiben los factores dependientes de la vitamina k son los
Dicumarínicos (II, VII, IX, X, proteína C y proteína S).
El calcio actúa en forma iónica y no se consume en el proceso de la coagulación.
El citrato previene la coagulación por extracción del calcio de la sangre, mediante
precipitación o unión en forma no ionizada.

Objetivos:
Medir la fase extrínseca de la coagulación sanguínea.

Materiales:
 Copillas del Coagulógrafo desechables ó tubos de 12x75 mm.
 Pipetas de cristal de 1 ml o automáticas de 100 µl.

Reactivos:
1. Citrato de Sodio (3,8%)
2. Cloruro de Calcio ( 0,025M)
3. Tromboplastina tisular de cerebro humano (curva patrón cada vez que se
prepare)

Equipo:
Baño de María ó coagulógrafo.

Toma de muestra:
Se hace una dilución de 1:10 con citrato de sodio (3,8%), o sea se toma 1 ml de citrato
de sodio (3,8%) para 9 ml de sangre total y se centrífuga a 3500 rpm durante 20 mint.

Desarrollo de la Técnica:

En un tubo añadir:

 0.1ml de plasma pobre en plaquetas.


 0.1ml de Tromboplastina.
 0.1ml de Calcio (0.025 m).

Echar a andar el cronómetro y esperar 8 seg a temperatura de 37oC agitándolo un


poco fuerte, posteriormente mirar la formación del coágulo.

Valores Normales:
Hasta 3 seg por encima del control.

Bibliografía:
Quick, A. J. Amen. J. Clin Path. 10. 222. 1940

Tiempo Parcial de Tromboplastina Activado. (TPTKAOLIN)

Fundamento:
Al poner en contacto un plasma citratado con el polvo de Kaolín este último es capaz de
activar en un determinado tiempo al Factor XII (factor de contacto) que a su vez en
presencia de fosfolípidos mas un buffer regulador de Ph y aportándole calcio se forma
un coágulo que estará en relación con los factores que intervienen en la fase intrínseca
de la coagulación.

Objetivo:
Este método mide la actividad procoagulante de la fase intrínseca de la coagulación
sanguínea.

Materiales:
 Copillas del Coagulógrafo desechables ó tubos de 12x75 mm.
 Pipetas de cristal de 1 ml o automáticas de 100 µl.

Reactivos:
1. Citrato de Sodio (3,8%).
2. Cloruro de Calcio ( 0,025M).
3. Solución de Kaolín (0,5%) en tampón de Imidazol, Salina 0,05 M, Ph: 7,35 o
Buffer Veronal.
4. Cefalina humana.

Equipo:
Baño de María ó coagulógrafo.

Toma de muestra:
Se hace una dilución de 1:10 con citrato de sodio (3,8%), o sea se toma 1 ml de citrato
de sodio (3,8%) para 9 ml de sangre total y se centrífuga a 3500 rpm durante 20 mint.

Desarrollo de la Técnica:

A 3,75 ml de solución de Kaolín (5 mg/ml) se añaden diferentes cantidades de cefalina


(30, 40, 50, 60, 70 µl) y se realiza un TPT activo con un plasma normal fresco, se toma
la muestra óptima que produzca un tiempo de coagulación mas corto, la mezcla se debe
agitar fuertemente a intervalos durante 20 mints.

 0.1 ml de plasma pobre en plaquetas.


 0.1 ml de la mezcla (C. I. Kaolín ó C. V. Kaolín)
 Incubar 4 mints. a 37oC, mezclar bien.
 Añadir 0.1 ml de CL2Ca (0.025 M).

Valores Normales:
Hasta 10 seg por encima del control y 6 seg por debajo del control.
Disponibilidad del Factor plaquetario III. (HARDISTY)

Fundamento:
La incubación del PRP citratado con Kaolín hace posible que alrededor de un 50%
de los fosfolípidos plaquetarios sean aprovechados para coagulación. La máxima
aceleración de la formación del coágulo, inducido por el Kaolín requiere que las
plaquetas y los factores del plasma sean activados simultáneamente.

Objetivos:
Medir la función plaquetaria.

Materiales:
Tubos de 12x75 mm.

Reactivos:
Kaolín de 5 mg con agua.
Cloruro de Calcio (0.033 M)

Desarrollo de la Técnica:
1. Centrifugar a 1500 rpm por 10 mint. para obtener el PRP del paciente y del
control.
2. Decantamos parte del plasma entubos plásticos o siliconados.
3. Se vuelve a centrifugar la sangre restante a 3000 rpm durante 30 mints. para
obtener el PPP del paciente, procediendo de igual forma con el control normal.
4. Se preparan 4 tubos de Kaolín en Baño de María a 37oC procediéndose con cada
una de las muestras y los controles de la forma siguiente.

TUBOS 1 2 3 4
PRPC 0.1 0.1
PRPP 0.1 0.1
PPPC 0.1 0.1
PPPP 0.1 0.1

5. A cada tubo agregar 0,2 ml de Kaolín de 5 mg en agua (Kaolín del Hardity)


poniendo en marcha el cronómetro por espacio de 20 mints., mezclar suavemente
cada 2 mint. parar el cronómetro y por orden sucesivo.
6. Agregar a 0,2 ml de CL2Ca (0,033 M)(que debe de ponerce en el Baño de María
previamente) midiéndose como Tiempo de Protombina, se deja en el Baño de
María 30 seg. y se observa la formación de grumos.

Valores Normales:
3 seg. sobre el control.

Retracción del Coágulo. (Cuantitativa)

Muestra:
9 ml de sangre.

Reactivos:
1 ml de Citrato (3,8%).

Desarrollo de la Técnica:
1. Se pone a temperatura ambiente hasta obtener 1 ml (aproximadamente 1 hora).
2. Hacer conteo de plaquetas a ese plasma.
3. PPP de Control (Pool).
4. Preparar dos tubos ( 1 control y 1 paciente)

Tubo Control Tubo Paciente


1) 3,4 ml de Sln. Salina 1) 3,4 ml de Sln. Salina
2) 1 ml de PPPc (Control) 2) 1 ml de PPPc (Control)
3) 0,5 ml PRPc (Control) 3) 0,5 ml PRP (Paciente)
4) 0,1 ml Trombina de (50 ud/ ml) 4) 0,1 ml Trombina de (50 ud/ ml)

5. Mezclar rápidamente y esperar 2 a 3 mint. a temperatura ambiente.


6. Incube 1 hora a 370C.
7. Decantar el plasma y después se obtiene la proporción:

Ejemplo: 5 ml ------------ 100%


4 ml ------------ X

entonces: X= 400
5
X= 80%

Se considera normal hasta mas de 90 %.

Tromboplastina Parcial (extracto de cerebro en cloroformo).

1. Obtener cerebro humano post morten (preferentemente no mas de 24-48 horas


después de la muerte).
2. Remover y descartar las meninges y el cerebro bajo agua fría. Quitar todos los
vasos pequeños que sean posible.
3. Cortar el cerebro en partes pequeñas, quitar todos los pequeños vasos
sanguíneos y pequeños coágulos y volver a enjuagar los cortes con agua
corriente.
4. Colocar los cortes de cerebro en Mezclador de Waring y agregar 4 o 5 volumenes
de acetona. Mezclar 2 mint a velocidad máxima y centrifugar el homogenato a
2500 rpm durante 10 mint. Decantar el sobrenadante.
5. Repetir el paso 4 cuatro veces.
6. Secar el sedimento de polvo, granular en embudo de Buchner con vidrio bajo
succión y guardar el tubo plástico a 150C.
7. A 1 gr de polvo de cerebro secado con acetona agregar 20 ml de acetona e
incubar a temperatura ambiente durante 120 mints.
8. Centrifugar la mezcla a 2500 rpm durante 10 mint. a temperatura ambiente y
extraer cuidadosamente el sobrenadante. Secar el polvo de cerebro en embudo
Buchner bajo succión.
9. Extraer el polvo con 20 ml de CH CL3 durante dos horas a temperatura ambiente
en frasco de erlenmeyer agitando continuamente.
10.Filtrar la mezcla en filtro Whatman No. 1 con embudo de Buchner y recoger el
filtrado en un frasco de base redonda de 250 ml con junta de vidrio estándar en
punta 24/40, conectar el frasco que contiene el filtrado a un evaporador rotativo
y evaporar
CH CL3, al vacío.
11. Suspender nuevamente el residuo de lípidos en 10 ml de soln. Salina al (0,9 %)
por sonicación suave y conservar a –200C en alícuotas de 0,2 ml.
12.Diluir la solución stock de cerebro con solución salina (0,85 %) (1:50 – 1:100) y
determinar la dilución que da el PTT mas corto con NPP usando Kaolín o zeolita
como activador.

Nota: El agitador magnético de cristal es de investigaciones.

Preparación de Trombina.

 Trombina 50 NIH E/ug, (Fco. 1 gr)

Preparación:
Se le agrega al frasco 100 ml de agua dstilada (Matriz).
A partir de aquí para preparar:
 Trombina 50 u: 2,5 ml de matriz más 22,5 ml de agua destilada.
 Trombina 20 u: 1 ml de matriz más 24 ml de agua destilada.
 Trombina 10 u: 1 ml de matriz más 48 ml de agua destilada.
Preparación de Tromboplastina. (Tromboplastina de cerebro con solución salina
fisiológica).

1. Bajo agua corriente lave pequeños trozos de cerebro.


2. Limpie los vasos sanguíneos y de restos de tejido meninges, etc.
3. Quite cuanta materia blanca le sea posible.
4. Utilice alrededor de 150 ml de solución salina precalentada (entre 370C – 390C)
por cada 100 gr de tejido cerebral.
5. Mezcle el cerebro y la salina en proporciones de 100 gr/150 ml en mezcladora
eléctrica durante 10 mint por porciones o manualmente en un mortero hasta que
se obtenga una dispersión sin partículas visibles de materia.
6. Mezcle todas las porciones en un beaker de vidrio que se sitúa en un Baño de
María a 370C.
7. Después de 2 horas de incubación añada buffer salino hasta una 1/3 del cerebro
disperso (medir con una regla tomar la tercera parte).
8. Centrifugar en porciones durante 30 mint. a aproximadamente 3000 rpm.
9. Recoger los sobrenadantes y ajustar Ph de 7,3 con HCL o NaOH.
10.Dividir en alícuotas y congelar.
11. Realizar tiempos sobre plasma fresco. Si el tiempo es inferior a 10 seg añadir
suficiente volumen salino hasta que el tiempo de protombina supere los 10 seg.

Nota: la tromboplastina debe mantenerse congelada a – 200C.

Tromboplastina a partir de la placenta.

1. Veronal Buffer Ph 7,3:


Disolver: 5,88 gr de Sodio Barbiturato
7,34 gr de NaCL.
En 600 ml de agua desionizada.
Añadir 215 ml de HCL (0,1 N).
Ajustar Ph 7,3.
Completar a 1L con agua desionizada.

2. Buffer Salino (Salina buffereada)


7 partes de salina.
3 partes de Veronal Buffer 7,3.

Preparación de la Tromboplastina:

 100 gr de placenta.
 150 ml de Salina buffereada a 370C - 390C.
 Mezclar después de dos horas de incubación con la salina buffereada.
 Centrifugar 30 mints a 3000 rpm.
 Filtrar.
 Con el sobrenadante de la centrifugación o con el resultado de la filtración,
utilizarlo para realizar TP a plasmas de pacientes normales.
Nota: el TP debe dar entre 10- 14 seg.
Nota: si el TP da < 19 seg. añadir salina buffereada hasta obtener TP > 10 seg.
 Dispensar la tromboplastina en pequeñas alícuotas y almacenar a - 200C
en tubos o viales plásticos.

Nota: Se procede a la disección del tejido placentario hasta la obtención de cotiledones


lo mas libres posibles de membranas y vasos sanguíneos, mediante tijeras y pinzas de
disección, con lavado constante con agua del grifo. 100 gr de tejido colocados en
solución salina precalentada (370C - 390C). Seguidamente el tejido limpio fue
homogenizado en una batidora electrica comercial durante 10 mint., utilizando como
vehículo líquido la solución salina buffereada a Ph 7,3 ( proporción de 1:3 con el
tejido).
La mezcla del tejido homogenizado se incuba a 370C durante 2 horas, centrifugar 30
mint a 3000 rpm y separado el sobrenadante ajustar el Ph a 7,3 con HCL ó NaOH
según sea necesario.
 Estabilidad del preparado a 40C aproximadamente 15 días.
 Estabilidad del preparado a -200C aproximadamente 6 meses.

Anticoagulante Lúpico. (T. Coagulación con Kaolín )

Introducción:
La detección del anticoagulante lúpico se ha convertido en un procedimiento de rutina
en los laboratorios de coagulación. EL Anticoagulante Lúpico (AL) al igual que el resto de los
anticoagulantes antifosfolipídicos se ha asociado al tromboembolismo venoso y arterial,
trombocitopenia y abortos espontáneos recurrentes, son un grupo heterogéneo de anticoagulante del
tipo IgG y/o IgM y existe la hipótesis de que esta familia de anticoagulantes presentan una afinidad
variable por complejos formados por proteínas y fosfolípidos.
Dada la heterogenicidad de su conducta se ha planteado que un solo ensayo no es suficiente para su
identificación. En estudios comparativos de los diferentes métodos usados para su determinación han
señalado el tiempo de coagulación con kaolín y el tiempo de veneno de víbora de Russell como
particularmente sensibles al AL.
Fundamento:
Se basa en la determinación del tiempo de coagulación de un plasma libre de contaminación con
fragmentos de plaquetas en presencia de un activador (kaolín )y omitiendo el sustituto plaquetario, lo
que lo hace sensible a la presencia de AL.
Muestra
Plasma pobre libre de plaquetas.

Medidas de seguridad:
 La extracción debe ser limpia, no traumática, desechándose toda muestra
hemolizada o con mallas de fibrina.
 Evitar la formación de burbujas de aire en la jeringuilla y verter la sangre con
cuidado en el tubo que contiene el anticoagulante e invertir rapidamente.
 Centrifugar lo antes posible después de extraída la muestra y decantar el plasma
rápidamente.
 Es esencial realizar la doble centrifugación del plasma durante el tiempo
establecidoya que es importante obtener un recuento de plaquetas inferior a
10x109/l.
 El controlnormal debe ser rigurosamente preparado al igual que el plasma del
paciente.
 Esta prueba deberá realizarse de ser posible con plasma fresco, de utilizarse
plasma congelado deberán extremarse los cuidados de en su preparación.
 Mantener el plasma en frío (40C) hasta la realización de la técnica.
 Hacer la determinación en las 3 horas siguientes a laextracción, de lo contrario
congelar el plasma rapidamente a – 700C.
 Chequear la temperatura del baño de maría.
 Chequear que el material esté perfectamente limpio.
 Mezclar bien la solución de Kaolín antes de usar.
 Si se realiza la técnica manual, mover el tubo con un ángulo fijo y
uniformemente.
 Respetar los tiempos de incubación.

Materiales:
 Jeringuillas plásticas de 10 ml con aguja de 20.
 Tubos de 12 x 75 mm.
 Tubos plásticos graduados.
 Cronómetro.
 Centrífuga.
 Baño de María a 370C.
 Pipetas.
 Gradillas.
 Torundas de gasa o algodón.
 Alcohol.
 Reactivos.
 Citrato de sodio 3,8%.
 Tampón de Owren:
5,825 gr de dietilbarbiturato de sodio. ( No.47)
7,335 gr de Cloruro de Sodio. (No. 51)
Disolver en 750 ml de agua desionizada.
Añadir HCL (0,1 molar) hasta alcanzar un Ph de 7,35.
Llevar volumen hasta 1000 ml con agua desionizada.
 Kaolín 5 mg/ml en tampón de Owren: pesar 2 gr de kaolín llevar a 100 ml con
tampón de Owren.
 CLCa (0,025 M).

Procesamiento técnico:
 Extraer sangre por punción venosa con citrato de sodio al 3,8% en una
proporción de 1:10.
 Invertir el tubo rápidamente de forma suave.
 Centrifugar por 15 min. a 4000 rpm.
 Decantar el plasma a un tubo de centrífuga plástico evitando perturbar la
interfase célula-plasma.
 Volver a centrifugar el plasma por 15 mint a 4000 rpm.
 Decantar en tubo plástico .
 Preparar un control normal de la misma forma que el plasma del paciente.
 Colocar 0,2 ml de plasma del paciente o control en un tubo de ensayo a37C.
 Adicionar 0,1ml de Kaolin,agitar por inclinación suave del tubo.
 Incubar durante 3 min. a 37C ,pasado los cuales se añade 0,2ml de
ClCa(0,025M).Poniendo en marcha simultáneamente el cronómetro.
 Agitar suavemente y a los 60 seg sacar el tubo del baño y mirar la formación
del coágulo.
 Realizar el mismo procedimiento con una mezcla constituida por una parte de
plasma del paciente y 4 partes del plasma normal.

Interpretación

Calcular la relación de los tiempos de coagulación del plasma del paciente y el plasma
normal y la relación de los tiempos de la mezcla 4:1 y el plasma normal como sigue:
Relación de la =T de coagulación del plasma del paciente(seg)
prueba T de coagulación del plasma normal control(seg)

Relación de la =T de coagulación de la mezcla 4:1(seg)


mezcla T de coagulación del plasma normal control (seg)

 Una solución de la prueba :> 1,2 indica resultado anormal.


 Una relación de la mezcla:> 1,2 debe ser considerado como un resultado
positivo.
 Una relación entre :1,1 y1,2 es un resultado equívoco

Medidas de bioseguridad

Manejo adecuado de la sustancia química y biológica potencialmente peligrosas


(sangre).

Control de Calidad:
-Plan de mantenimiento y revisión de equipos por el departamento de electromedicina
-Técnicas de control de calidad del procedimiento :
a) Todas las determinaciones deberán hacerse por duplicado y la diferencia entre
estos no deberá exceder del 10%
b) Con cada grupo de muestras de paciente debe realizarse la técnica con una
mezcla de plasmas normales o un plasma normal adecuadamente preparada.
(como se indica en el procedimiento,un tiempo de coagulación en el control
inferior a 60 seg.sugiere contaminación con fragmentos plaquetarios e invalida el
resultado.
Condiciones de almacenamiento y conservación de reactivos
Los reactivos químicos se conservan en el estante dispuesto al efecto.
La cefalina se almacena a menos 300 C.
La solución de Kaolín es estable a temperatura ambiente al igual que CACL2
La mezcla de plasmas normales se guarda a menos 300 C.

Bibliografía:
Exuer T. , Richard A, Kronberg H A sensitive test demonstration lupus anticoagulant
and its behavioural patterns Br J Hematology 40: 143,1978.
Mach in SJ,Gedding JC,Greave M, Hutton RA, Mackine IJ, Malia RJ, Tobernes DA.
Guidelines on testing for the lupus anticoagulants , I Clin Pathol 44: 885,1991.