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TECNOLOGIA DEL ADN 1
1
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO Yessica Huarachi Quispe
INDICE
AGRADECIMIENTO ........................................................................................................... 4
INTRODUCCION ................................................................................................................. 5
TECNICAS DE LA REACCION EN CADENA DE POLIMERO ...................................... 6
INTRODUCCIÓN DE LA REACCION POLIMERASA ................................................ 7
ORIGEN DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ........................... 7
PROTOCOLO DE REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA .................................................. 8
REQUERIMIENTOS PARA EL MONTAJE DE LA TÉCNICA. ................................... 9
ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LA PCR ........................................................ 9
APLICACIONES DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. ............ 9
DESARROLLO DE LA TECNICA DE REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA .................................................................................................................... 10
ESTRUCTURA PRIMARIA DEL DNA.......................................................................... 11
ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL DNA ................................................................... 12
ESTRUCTURA TERCIARIA Y CUATERNARIA DEL DNA.......................................... 12
ASPECTOS BÁSICOS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR ........................................ 12
REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA (PCR)................................................. 12
CONCLUSIONES ........................................................................................................... 14
TECNICA DE SECUENCIACION DE ADN (SANGER)................................................ 15
SECUENCIACIÓN SANGER POR ELECTROFORESIS CAPILAR .......................... 15
APLICACIONES DE LA SECUENCIACIÓN POR ELECTROFORESIS CAPILAR
.............................................................................................................................................. 16

PASOS DE LA SECUENCIACIÓN ............................................................................ 16
Amplificación .............................................................................................................. 16
Purificación .................................................................................................................. 16
Electroforesis capilar ................................................................................................... 16
ELECTROFORESIS DEL ADR Y ARN ............................................................................ 19
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................ 23

AGRADECIMIENTO
El presente trabajo es un esfuerzo que hice gracias al apoyo mis padres de mis hermnanos y al
doc: hebert soto Gonzales quien nos dio sus enseñanas para asi poder tener un conocimiento
solido de la materia u agradeciendo principalmente a dios que siempre esta en nuesros
corazones y dándonos fuerza para seguir adelante

INTRODUCCION
Todo organismo, aún el más simple, contiene una enorme cantidad de información
encuentra almacenada en una macromolécula que se halla en todas las células:
el ADN. Este ADN está dividido en gran cantidad de sub-unidades (la cantidad varía
de acuerdo con la especie) llamadas genes. Cada gen contiene la información
necesaria para que la células utilicé una proteína. Así, el genoma (y por
consecuencia el proteína), va a ser la responsable de las características de
individuo. Los genes controlan todos los aspectos de la vida de cada organismo,
incluyendo metabolismo, forma, genética y reproducción. Por ejemplo, la
síntesis una proteína X hará que en el individuo se manifieste el rasgo "pelo oscuro",
mientras que la proteína Y determinará el rasgo "pelo claro".
Vemos entonces que la carga genética de un determinado organismo no puede ser
idéntica a la de otro, aunque se trate de la misma especie. Sin embargo, debe ser en
rasgos generales similar para que la reproducción se pueda concretar. Y es que una
de las propiedades más importantes del ADN, y gracias a la cual fue posible la
evolución , es la de dividirse y fusionarse con el ADN de otro individuo de la misma
especie para lograr descendencia diversificada.
Otra particularidad de esta molécula es su universalidad. No importa cuán diferente
sean dos especies: el ADN que contengan será de la misma naturaleza: ácido
nucleico. Siguiendo este razonamiento, y teniendo en cuenta el concepto de gen,
surgen algunas incógnitas: ¿Son compatibles las cargas genéticas de especies
distintas? ¿Puede el gen de una especie funcionar y manifestarse en otra
completamente distinta? ¿Se puede aislar y manipular el ADN?
La respuesta a todas estas preguntas se resume en dos palabras:
Ingenieria genetica

TECNICAS DE LA REACCION EN CADENA DE
POLIMERO
Desde la aparición de la técnica de Southern Blot en 1975 1 se han experimentado

notables progresos en la detección de fragmentos específicos de ácidos nucleicos.
La identificación y caracterización de estos fragmentos constituyen un procedimiento
central en una gran cantidad de experimentos relacionados con la biología
molecular.2,3 Sin embargo? estas técnicas, utilizadas hasta el momento, carecían de
la especificidad y la sensibilidad que requieren estos procesos de identificación y
caracterización, haciéndose difícil la detección de copias únicas de genes presentes
en una muestra o la discriminación entre un gen salvaje y uno mutante.
La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Polymerase Chain

Reaction), creada y desarrollada por Millis y col. de la Cetus Corporation, 4 ha
devenido una poderosa herramienta que cumple con los requisitos de especificidad y
sensibilidad que exigen la caracterización de los ácidos nucleicos, pudiendo detectar
con ella de forma fácil la presencia de estas biomoléculas en una muestra, aún
cuando sus cantidades se enmarcan en el orden de los picogramos. 5,6 La PCR es un
método enzimático in vitro que permite la amplificación de una secuencia específica
del ADN.
Esta técnica se basa en el uso de dos oligonucleótidos que luego de reconocer la

secuencia complementaria en la molécula de ADN, son alargados cíclicamente
mediado por la acción de la ADN Polimerasa. Cada ciclo de la técnica generalmente
20 ó 30 en total, implica la desnaturalización del ADN, el apareamiento de los
oligonucleóticos y la síntesis del nuevo fragmento de ADN a partir del
oligonucleótido, lo que resulta en un crecimiento exponencial de millones de copias
del fragmento seleccionado.7 La reacción de síntesis es catalizada por una ADN
Polimerasa termoestable, obtenida del Thermus aquaticus.8
En menos de una hora de actividades enzimáticas se generan microgramos del

fragmento de ADN de interés, a partir de una copia única existente en la muestra. La
especificidad de esta reacción se mantiene aún cuando en la muestra original existe
una mezcla compleja de ácidos nucleicos, permitiendo así manipular en el
laboratorio cantidades muy limitadas de material genético.

Esta técnica ha disminuido el tiempo de trabajo requerido para producir suficiente

material de experimentación, comparado con el tiempo empleado cuando se utilizan
los métodos tradicionales de amplificación biológica. En todos aquellos
procedimientos donde se necesita el aislamiento y purificación del ácido nucleico, se
hace más fácil el trabajo cuando aplicamos la técnica de PCR, ya que el fragmento
de interés es el que prevalece en la muestra.
La existencia del Proyecto Genoma 2000 permitirá al mundo científico del nuevo
siglo tener un mapa genético del hombre. Tanto en la ejecución de este proyecto
como en su aplicación práctica es fundamental la técnica de PCR.
La aparición de un número cada vez mayor de artículos científicos donde se refiere

la técnica de PCR motivó la realización de esta revisión con el objetivo de informar al
lector sobre los principios de la misma, sus múltiples aplicaciones en diferentes
campos del conocimiento científico, así como informar sobre otros aspectos que
permiten comprender y aplicar este procedimiento con mayor facilidad.
INTRODUCCIÓN DE LA REACCION POLIMERASA
Los problemas que se presentan con el uso del fragemento Klenow de la ADN
polimerasa I de E. coli, se superaron cuando aparece la ADN polimerasa
termoestable Taq. Esta enzima fue aislada de la bacteria Thermus aquaticus, que
habita en aguas termales y que tienen una temperatura óptima alrededor de los
90°C. Esta enzima al igual que la ADN polimerasa de E. coli, tiene tres centros
activos en su cadena polipeptídica única, cada uno claramente separado del otro.
Existe un centro con actividad ADN Polimerasa 5´ a 3´, otro con actividad
exonucleasa (correctora de prueba) 3´ a 5´ y que desempeña una importante función
en la polimerización al eliminar bases no complementarias.
Por último muestra actividad exonucleasa 5´ a 3´ que completa la actividad 3´ a 5´

exonucleasa, pero que es totalmente diferente a ésta y se produce por ruptura de un
enlace fosfodiester terminal o en un enlace alejado del extremo 5´ que se encuentre
o no en una zona de doble hélices. Su índice de error de incorporación es de 1 en 4
x 10 bases y amplifica segmentos de hasta 3000 pb.
ORIGEN DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Este novedoso y revolucionario proceso fue ideado en 1985 por Karry B. Mullis, un
investigador de la Cetus Corporation, en Emerville, California. Ese mismo año otros
investigadores del grupo de Mullis perfeccionaron la técnica y la aplicaron al
diagnóstico clínico de la anemia de células falciformes.9 Desde entonces la aparición
de artículos que tratan sobre aplicaciones de esta metodología en diferentes áreas
de la biomedicina ha sido exponencial, también la nueva tecnología ha tenido su
efecto en bola de nieve sobre el avance del conocimiento científico de otras

disciplinas como la criminalística y la paleontología, así como en el estudio de la

evolución y de las plantas.10
Los primeros ensayos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realizaron en

forma manual, utilizando para la amplificación al fragmento Klenow de la ADN
polimerasa I de la bacteria E. coli, los cambios de temperatura que exigen cada paso
en los diferentes ciclos se lograban utilizando varios baños de agua a la temperatura
deseada. Luego de cada paso de desnaturalización era necesario añadir nueva
cantidad de enzimas que reemplazara a la incluida inicialmente, ya que la alta
temperatura requerida en este paso la inactivaba, con la nueva adición de enzimas.
También se incluían en la muestra otras sustancias que acompañaban a la
preparación enzimática (Glicerol) y que al final terminaban inhibiendo la enzima lo
que limitaba la eficiencia catalítica de la ADN polimerasa I.4 Todo esto hacía el
proceso costoso, muy laborioso y complejo además de ser poco eficiente
PROTOCOLO DE REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA
No podemos referir un protocolo único que permita el montaje de esta técnica en el

laboratorio, ya que diferentes compañías anuncian en sus revistas especializadas
estuches comerciales de aplicación en el diagnóstico o la investigación, donde se
describe la técnica con especificaciones de tiempo, temperatura y número de ciclos.
Como puede verse todos los parámetros cambian según el fabricante, pero de forma
general todos los protocolos descritos cumplen con un procedimiento de tres pasos
en cada ciclo, estos son: Desnaturalización, Alineamiento y extensión.
A continuación se describe en qué consiste cada uno de ellos.
Desnaturalización: Aquí se separan o desnaturalizan las dos cadenas

complementarias del ADN blanco, esto se logra aumentando la temperatura de la
reacción 9298°C durante un tiempo que va de 30 a 90 segundos.
Alineamiento: Consiste en el apareamiento específico entre los fragmentos

iniciadores (oligonucleótidos) y las cadenas simples del ADN desnaturalizado, para
ello se disminuye la temperatura de la reacción hasta 50 ó 60ºC. Este paso tiene una
duración de 30 a 60 segundos.
Extensión: En este paso la ADN polimerasa extiende la longitud de los fragmentos

iniciadores que se encuentran unidos al ADN blanco, originando nuevas cadenas
complementarias a las dos cadenas sencillas del ADN desnaturalizado presente al
inicio de la reacción debe aumentarse hasta 70 ó 74°C. Esta etapa tiene una
duración promedio de 30 a 90 segundos.

El próximo ciclo se inicia en el mismo tubo, con los mismos componentes de la

mezcla de reacción que se han puesto en cantidad suficiente desde el primer ciclo,
solo que ahora existe el doble de cadenas sencillas de ADN blanco a copiar.
REQUERIMIENTOS PARA EL MONTAJE DE LA TÉCNICA.
Si se desea poner en marcha esta tecnología, el laboratorio debe contar con los
equipos que se relacionan en el ANEXO III, donde no solo se incluyen los equipos y
materiales necesarios para realizar la PCR, sino también los necesarios para el
análisis del producto amplificado.
Generalmente estos equipos, materiales y reactivos que se citan, se encuentran

disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular. Algunos son
específicos para la PCR, como lo es el termociclador. Este equipo se introduce luego
que aparece la ADN polimerasa Taq? que es un equipo automatizado, programable
donde se ajusta la temperatura y el tiempo que exige el protocolo para cada ciclo.
Esto permite realizar el proceso en un solo tubo al que no hay que adicionar ningún
reactivo durante el tiempo que dure la PCR. Su introducción ha significado la técnica
que en sus inicios requería de la utilización de diferentes baños de agua a diferentes
temperaturas, se ha acortado el tiempo a utilizar en la misma y se logra una alta
especificidad.
ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LA PCR
La PCR es altamente específica. Solo las secuencias de ADN que se amplifican son
aquellas que se encuentran entre los dos fragmentos iniciadores que han
hibridizado. Un gen presente en una muestra donde el mismo constituya una parte
de millón del total del material genético que se analiza, es accesible por PCR. La
PCR es exquisitamente sensitiva. Una única molécula de ADN en una muestra
puede ser detectada y amplificada.4-7
APLICACIONES DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA.
La secuenciación y clonaje del ADN han sido grandemente simplificados con la

introducción de esta técnica, lo que a su vez ha favorecido la tecnología del ADN
recombinante.
En medicina su valor diagnóstico es amplio. La detección de bacterias y virus es

posible si se utilizan los segmentos iniciadores necesarios. Mediante PCR se puede
revelar la presencia del HIV1 en individuos que no muestran una respuesta

inmunológica eficiente ante este agente y que pueden pasar como no infectados
cuando se utilizan las técnicas de inmunodiagnóstico rutinarias. La búsqueda del
Mycobacterium tuberculosis en tejidos es lenta y laboriosa, con la PCR la presencia
de tan solo 10 bacilos por millón de células humanas, puede ser detectada.
El PCR constituye un método promisorio en el diagnóstico precoz de determinados

tipos de cáncer. Esta técnica permite determinar la mutación de determinado gen
controlador del crecimiento celular, por ejemplo los RAS, genes involucrados en la
transformación cancerosa. Monitorear la quimioterapia del cáncer es otra posibilidad
que nos da la técnica, resultando ideal detener el tratamiento cuando las células
cancerosas han desaparecido o reiniciarlo cuando aparecen las recidivas.
En el diagnóstico prenatal, la aparición de nuevos métodos diagnósticos que utilizan

la PCR permiten identificar individuos enfermos. El transplante de órganos se facilita
cuando por la PCR se hace un estudio del HLA (Human Leucocit Antigen) del
donante y del receptor.
En medicina legal su aplicación es amplia. El repertorio genético de un individuo es

altamente distintivo. La amplificación de múltiples genes puede esclarecer el grado
de parentesco entre dos individuos o su procedencia racial.
El análisis de la sangre o semen de un individuo por PCR puede ser valioso en caso
de asaltos y violaciones. Los restos celulares presentes en una colilla o un cabello
presente en la escena del crimen, pueden donar suficiente material genético como
para llegar al autor.
La técnica ha tenido gran impacto en la reconstrucción del material genético fósil. Se

ha podido amplificar material genético proveniente de momias con más de 2 400
años, así como otros restos fósiles de hasta 7 500 años. El más antiguo de los ADN
analizados por PCR es el correspondiente a una termita fósil, embalsamada en
ámbar que tiene una edad entre 25 y 30 millones de años. El estudio de plantas
fósiles también es posible con esta técnica.
DESARROLLO DE LA TECNICA DE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
En los años setenta se desarrollaron los métodos que permitieron de manera simple
y relativamente rápida para determinar la secuencia nucleotídica de cualquier
fragmento de DNA. Estos primeros intentos de secuenciar los ácidos nucleicos
siguieron los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper las
moléculas en pequeños fragmentos, determinar su composición de bases y deducir
la secuencia a partir de fragmentos solapantes. Este método resulta más o menos
sencillo para proteínas que resultan de la combinación de hasta veinte aminoácidos
distintos, pero constituye un problema en el caso de los ácidos nucleicos donde la
secuencia resulta de la combinación de únicamente cuatro nucleótidos diferentes.
REACCION EN CADENA DE POLIMERO
Para abordar de lleno el tema de la técnica de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) debemos hablar primero de Biología Molecular, esta es una
ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos
procesos celulares que contribuyen a que la información genética se transmita

eficientemente de uno seres a otros y se exprese en los nuevos individuos, este

conocimiento nos permite cruzar las barreras naturales que existen entre las
especies y "colocar" genes de un organismo otro llamado hospedero, empleando
técnicas de ingeniería genética. Gracias a este avance, se pueden producir
fragmentos de ácidos nucleicos a gran escala, abriendo así las puertas a la
secuenciación de los ácidos nucleicos y por ende a nuevas disciplinas como el
diagnóstico molecular, la terapia génica o la obtención de organismos superiores
recombinantes..
Si pudiésemos regresar en el tiempo, nos encontraríamos con hechos que
contribuyeron en forma decisiva en el desarrollo de la biología molecular, por
ejemplo:
En 1866 Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de
segregación y clasificación independiente de los genes.
En 1869 Frederick Miescher, científico suizo descubre en el núcleo de
las células una sustancia de carácter ácido a la que llamó nucleón.
En los años veinte el químico alemán Robert Fulgen, utilizando una tinción
específica descubrió que el DNA estaba situado en los cromosomas.
En 1944 Avery McCleod y Mc Carty comprueban que el DNA es el portador de la
información genética.
En 1953 Watson y Crick deducen la estructura del DNA Este último hecho dio la
pauta para nuevos descubrimientos que conducirían a lo que se llama tecnología
del DNA Recombinante Hablando específicamente de DNA según el modelo de
Watson y Crick, la molécula está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos
con polaridad opuesta, unidas entre sí formando una doble hélice. Cada nucleótido
está formado por :
1.- Molécula de azúcar (desoxirribosa)

2.- Base orgánica nitrogenada: bases pirimídicas (Citosina, timina), bases puricas
(Adenina, Guanina).
3.- Grupos fosfato.
Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo fosfato formando cadenas
muy largas, quedando las bases nitrogenadas en la parte central unidas cada una
al carbono 1 del azúcar formando un ángulo recto con su eje.
Las cadenas de poli nucleótido que constituyen una molécula de ADN se mantienen
unidas entre sí gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre las bases
nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que quedan enfrentadas.
ESTRUCTURA PRIMARIA DEL DNA
La estructura primaria viene dada por la secuencia de nucleótidos. Cuando se quiere

representar la secuencia de un oligonucleótido o de un ácido nucleico, se representa
mediante la terminología de cada una de las bases. Por ejemplo:
5 -ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3 Esta secuencia representa un oligonucleótido
con veinte bases, de las cuales seis son Adenina (A), tres son Timina (T), ocho son
Citosinas (C) y tres son Guanina (G).
El orden de la secuencia es muy importante, ya que en él reside la información
contenida en el ácido nucleico; la orientación viene dada en el sentido 5 3 o 3 5 ; el 5

representa el extremo terminal del fosfato y el 3 el extremo final del átomo de

carbono de la desoxirribosa.
ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL DNA
El DNA es una doble hélice anti paralela ya que el enfrentamiento entre las bases
nitrogenadas es constante; la Adenina siempre se enfrenta con la timina formando
dos puentes de hidrógeno y la Guanina siempre se enfrenta con la Citosina
formando tres puentes de hidrógeno. Esta característica provoca que las dos
cadenas sean complementarias. Las dos cadenas de la doble hélice tienen sentidos
opuestos, mientras una va en sentido 5 3 y la otra lo hace en sentido 3 5.
ESTRUCTURA TERCIARIA Y CUATERNARIA DEL DNA
Recordemos que la longitud de una hebra de DNA humano es de varios metros, por
necesidad debe adoptar otras estructuras para poder estar en el interior de las
células. Estas estructuras, terciaria y cuaternaria, permiten el empaquetamiento del
DNA formando los cromosomas. En las células eucariotas existen varios
cromosomas y en los procariotas, existe un DNA empaquetado denominado
pseudocromosoma.
ASPECTOS BÁSICOS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
La aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico

de Ingeniería genética y referidas indistintamente como clonación, DNA
recombinante o manipulación génica han sido la causa de pocas áreas de la
biología molecular permanezcan inalteradas. Antes del desarrollo de la ingeniería
genética no era posible aislar un gen concreto eucariótico en cantidades suficientes
para su estudio molecular o el de su producto.
Una de las sustancias mas importantes y de participación decisiva en distintos
procesos de la Biología Molecular son las enzimas; existen varias que podemos
destacar
REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA (PCR)
Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de

adn en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de
moléculas idénticas, a partir de una molécula de adn. Esto se puede conseguir en
unas horas.
La reacción es muy sencilla, necesita cantidades de adn muy pequeñas y sólo se
precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas
cadena de nucleótidos que actúan como cebadores.

La reacción es un proceso cíclico:

 La molécula de adn que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice y se
separe las dos hebras.
 Cada una de las hebras es copiada por la adn-polimerasa. (se utiliza la adn-
polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, thermus aquaticus, así la
enzima puede trabajar a altas temperaturas).
 Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro
nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta que se obtiene el número de
copias deseado.

CONCLUSIONES
La Reacción en Cadenas de la Polimerasa, como nueva tecnología, ha

revolucionado el avance del conocimiento científico en los últimos años. Su efecto
"bola de nieve" se hace notar en diferentes áreas de la biología, la medicina, la
criminalística, la paleontología, la botánica, el estudio de la evolución, entre otras. En
todas las versiones, la manipulación del material genético ha notables avances en la
obtención de nuevos conocimientos y el examen de los métodos de investigación y
de diagnóstico sin precedentes por su especificidad y sensibilidad Y por tanto
conocer y controlar las causas de los trastornos que a este nivel se experimentan.

TECNICA DE SECUENCIACION DE ADN (SANGER)
En 1975, Frederick Sanger desarrolló el método de secuenciación de ADN conocido

como método de Sanger. Dos años más tarde empleó esta técnica para secuenciar
el genoma del bacteriófago Phi-X174, el primer ácido nucleico secuenciado
totalmente en la historia. Realizó este trabajo manualmente, sin ayuda de ningún
automatismo. Este trabajo fue base fundamental para proyectos tan ambiciosos
como el Proyecto Genoma Humano, y por él se le concedió su segundo Premio
Nobel en 1980, que compartió con Walter Gilbert.
El método de secuenciación por dideoxinucleótidos, más conocido como el método
Sanger se basa en el proceso biológico de la replicación del ADN. El método de
secuenciación ideado por Sanger se basa en el empleo de dideoxinucleótidos que
carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos
nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no
puede continuar elongándose. Esto sucede porque la ADN polimerasa necesita un
grupo terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el dideoxinucleótido
incorporado carece de este grupo hidroxilo.
El método comienza una vez que se aísla y se clona el ADN que se desea
secuenciar. Este DNA se desnaturaliza y se emplea una sola hebra para la
secuenciación. En la secuenciación se utiliza un cebador (denominado “primer” en
inglés), que se encarga de suministrar el terminal 3’OH que necesita la ADN
polimerasa para comenzar a elongar. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada
polimerasa, con el “primer” y con los cuatro nucleótidos trifosfatados.
A cada tubo se le añade una pequeña proporción de un dideoxinucleótido trifosfato;
un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP.
En cada uno de estos tubos se producen cadenas de ADN de distintas longitudes,
todas las cuales terminan en el lugar en el que se incorporó el dideoxinucleótido
correspondiente añadido al tubo. Los productos de las 4 reacciones, cada una
conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, se
cargan en un gel de agarosa y se someten a electroforesis. Así obtendremos un
patrón de bandas en orden, del cual es posible deducir la secuencia del ADN
introducido.
SECUENCIACIÓN SANGER POR ELECTROFORESIS CAPILAR
La secuenciación por el método de Sanger más llevada a cabo en la actualidad, emplea la

electroforesis capilar, permitiendo su automatización.
Implica una previa fragmentación del ADN a secuenciar, seguido de la amplificación

de estos fragmentos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A
continuación se adopta el método Sanger: cada fragmento acabado en
didesoxinucleótido está marcado fluorescentemente, de manera que cada
didesoxinucleótido (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) implica un color de fluoróforo

diferente. De este modo, se produce una "escalera" de ADN de fragmentos que

difieren en una base de longitud.
Posteriormente, cada fragmento marcado se separará por tamaño por electroforesis
capilar, con detección automatizada de los fragmentos de ADN marcados
fluorescentemente, proporcionando la secuencia ordenada de los fragmentos en
cromatogramas.
La secuencia del ADN inicial a partir de los fragmentos de ADN secuenciados, se
deduce bioinformáticamente por análisis de secuencias solapadas de los fragmentos
de ADN.
APLICACIONES DE LA SECUENCIACIÓN POR ELECTROFORESIS CAPILAR
La secuenciación de ADN por electroforesis capilar incluye las siguiente

aplicaciones: detección de SNP s ("single nucleotide polymorphisms"), análisis de
polimorfismos de conformación de cadena simble (SSCP) y análisis de las
repeticiones cortas en tándem (STR).
PASOS DE LA SECUENCIACIÓN
Amplificación
Amplificación por PCR de los fragmentos de ADN en un termociclador, añadiendo

dNTPs marcados con fluoróforos al mix estándar.
Purificación
Para eliminar los componentes del mix de PCR, dejando nuestro ADN amplificado
puro. Puede ser llevado a cabo por kits de purificación comerciales.
Electroforesis capilar
Los fragmentos de ADN se inyectan en el capilar de electroforesis, y los picos de

fluorescencia correspondientes a cada nucleótido, llegarán a un detector en tiempo
real, y cuyos datos se pueden transformar informáticamente en un cromatograma
que nos dará los datos de la secuencia de nuestra muestra de ADN



ELECTROFORESIS DEL ADR Y ARN
La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologías

más utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos
nucleicos. Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN
en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma
determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una
estimación de su concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del
gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en
diferentes aplicaciones. La electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una
herramienta de importancia primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN
recombinante o ingeniería genética. La idea de utilizar la técnica de electroforesis a
través de una matriz para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne, un
bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow, quien a mediados de los años 60
del pasado siglo estaba interesado en caracterizar las distintas formas de ADN que
se obtenían de partículas purificadas de polyomavirus. Su razonamiento era que una
combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el desplazamiento y
separación en función del tamaño o topología de diferentes moléculas de ADN. Éste
es exactamente el principio en que se basa la electroforesis de ácidos nucleicos.
Sometidos a un campo eléctrico, la carga neta negativa del ADN y el ARN hará que
estos se muevan en dirección al ánodo (Figura 1A). Si se fuerza a los ácidos
nucleicos a moverse a través de un gel formado por una malla tridimensional de un
polímero como la agarosa, la fricción hará que las moléculas de mayor tamaño
migren con más lentitud, mientras las de menor tamaño avanzan más en el gel,
permitiendo que las diferentes moléculas se separen en función de su tamaño. Del
mismo modo, moléculas de ADN o ARN con topologías o estructuras
tridimensionales diferentes también se comportarán de forma diferente ante la
fricción con la malla del polímero, permitiendo su separación. Mediante la
electroforesis en gel de agarosa, Thorne logró separar y visualizar tres formas
topológicas diferentes del ADN del polyomavirus: superenrrollada, relajada y lineal,
tras haber marcado el ADN con [3H] timidina (Thorne 1966, 1967). El trabajo de
Thorne recibió poca atención hasta principios de los años 70, cuando el empleo de
enzimas de restricción permitió el análisis de moléculas de ADN mucho más grandes
que los genomas virales. También resultó de gran importancia el desarrollo de
métodos no radiactivos de tinción del ADN con suficiente sensibilidad para detectar
cantidades de ADN del orden de nanogramos e inferiores. La utilización de bromuro
de etidio para la detección de ADN en geles se desarrolló independientemente por
dos grupos (Aaij y Borst 1972, Sharp et al. 1973), cuyos métodos siguen utilizándose
hasta hoy sin apenas variaciones. La electroforesis de ADN puede realizarse en
geles de agarosa o de poliacrilamida. Ambos tienen características diferentes en
cuanto a sus propiedades y modo de preparación, por lo que se utilizará uno u otro

en función de la aplicación y objetivos que persigamos. La electroforesis en geles de

agarosa es el método estándar para separar y purificar fragmentos de ADN cuando
no requerimos un alto poder de resolución. Por su parte, la electroforesis en geles de
poliacrilamida, aunque tiene una mayor limitación en cuanto al tamaño de los
fragmentos que podemos separar (5-600 pb), posee un poder de resolución mucho
mayor, permitiendo la separación de moléculas que difieren en un sólo par de bases.
Los geles de poliacrilamida se corren de forma vertical y tienen la desventaja de ser
más complicados en su elaboración y manipulación. Electroforesis de ADN 29 Los
geles de agarosa tienen un poder de resolución mucho menor que los de
poliacrilamida, porque no permiten separar moléculas de ADN que difieren en
tamaño menos de unas 50 pb. Sin embargo, el rango de tamaños que pueden
separarse es mucho mayor en un gel de agarosa (moléculas desde 50 pb hasta
unas 40 kb) dependiendo de la concentración del mismo (0.3-2% p/v); cuanto más
baja es la concentración de agarosa mayor es el tamaño de las moléculas que
pueden separarse, y viceversa. Este rango de tamaños hace a los geles de agarosa
ideales para analizar el producto de digestiones con enzimas de restricción, lo que
puede combinarse con otras técnicas como el Southern blot, así como para analizar
los productos de una reacción de PCR. Los geles de agarosa convencionales se
corren en una cámara de electroforesis horizontal, con un campo eléctrico uniforme
y constante. La electroforesis en gel de agarosa tiene un límite superior de unas 40-
50 kb en el tamaño de las moléculas de ADN que puede separar. Por lo tanto, no es
posible separar el producto de digestiones con enzimas de restricción de corte
infrecuente, como NotI o SfiI, y menos aún separar cromosomas enteros (los
cromosomas de eucariotas inferiores tienen tamaños de entre 0.2 y 12 Mb). Reducir
la concentración de agarosa hasta un 0.1 o 0.2% puede incrementar el límite de
separación hasta los 750 pb, sin embargo estos geles son extremadamente frágiles
y muy difíciles de manipular. Esta limitación de tamaños se superó con el desarrollo
de una técnica denominada electroforesis en gel de campo pulsado Esta técnica fue
descrita inicialmente por Schwartz y Cantor (1984), quienes construyeron un aparato
de electroforesis ortogonal en el cual dos campos eléctricos en ángulo sobre el gel
funcionaban de forma alterna. El fundamento de esta técnica es la reorientación de
las moléculas cuando cambia la dirección del campo eléctrico; en la electroforesis
convencional las moléculas de ADN de gran tamaño quedan “atrapadas” en la malla
que forma la agarosa en su avance a través del gel, pero la aplicación de dos
campos eléctricos alternantes en ángulo permite una reorientación de las moléculas
que de esta forma avanzarán un tramo más, antes de quedar de nuevo atrapadas.
Cuanto más grandes son las moléculas mayor debe ser la duración de los campos
eléctricos alternos para permitir la reorientación y en última instancia la separación
de las mismas.
a) Obtención de las muestras de ADN
b) Preparación del gel de agarosa
c) Preparación de las muestras con el buffer de carga
d) Carga de las muestras
e) Corrida del gel

g) Visualización del gel con luz ultravioleta y análisis de resultado

f) Teñido del gel* Etapas de la técnica * Sólo en caso de no utilizarse bromuro de
etidio en el gel


REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Enciclopedia Encarta 98
Diario Clarín Digital en www.clarin.com.ar, febrero-agosto de 2000.
Diario La Nación en www.lanacion.com.ar, febrero-agosto de 2000.
Química II, Editorial Santillana.
Biología I, Editorial Santillana.
"El Genoma Humano" del Dr. Francisco Lenadro Loiácono en www.alfinal.com.
"Aplicaciones de la Ingeniería Genética" en www.geocities.com/genetica2000/
Declaración de la Asociación Médica Mundial sobre el Proyecto Genoma
Humano, en www.wma.net/s/policy/17-s-1_s.html.
"Trabajo Práctico de Genética", de Juan Andrés Toselli, en
www.monografias.com
"Genetic Engineering: A Costly Risk"; "The End of the World as we know it: The
Environmental Costs of Genetic Engineering", en www.greenpeace.org

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TECNOLOGIA DEL ADN 1

TECNICAS DE LA REACCION EN CADENA DE POLIMERO ...................................... 6

INTRODUCCIÓN DE LA REACCION POLIMERASA ................................................ 7

ORIGEN DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ........................... 7

PROTOCOLO DE REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA .................................................. 8

REQUERIMIENTOS PARA EL MONTAJE DE LA TÉCNICA. ................................... 9

ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LA PCR ........................................................ 9

APLICACIONES DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. ............ 9

DESARROLLO DE LA TECNICA DE REACCION EN CADENA DE LA

ESTRUCTURA PRIMARIA DEL DNA.......................................................................... 11

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL DNA ................................................................... 12

ESTRUCTURA TERCIARIA Y CUATERNARIA DEL DNA.......................................... 12

ASPECTOS BÁSICOS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR ........................................ 12

REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA (PCR)................................................. 12

TECNICA DE SECUENCIACION DE ADN (SANGER)................................................ 15

SECUENCIACIÓN SANGER POR ELECTROFORESIS CAPILAR .......................... 15

APLICACIONES DE LA SECUENCIACIÓN POR ELECTROFORESIS CAPILAR

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PASOS DE LA SECUENCIACIÓN ............................................................................ 16

Electroforesis capilar ................................................................................................... 16

ELECTROFORESIS DEL ADR Y ARN ............................................................................ 19

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................ 23

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solido de la materia u agradeciendo principalmente a dios que siempre esta en nuesros

corazones y dándonos fuerza para seguir adelante

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO Yessica Huarachi Quispe

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Alineamiento: Consiste en el apareamiento específico entre los fragmentos

Extensión: En este paso la ADN polimerasa extiende la longitud de los fragmentos

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El próximo ciclo se inicia en el mismo tubo, con los mismos componentes de la

REQUERIMIENTOS PARA EL MONTAJE DE LA TÉCNICA.

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