Simulación y Análisis del artı́culo Rational Design of Evolutionarily
Stable Microbial Kill Switches
William Berrı́os Rojas, David Castillo Alavarado, Victor Hugo Cadillo Gutierrez, William Figueroa Mejı́a
Abstract— El presente trabajo presenta un review del ar-
ticulo Rational Design of Evolutionarily Stable Microbial Kill
Switches en donde se resalta los aspectos mas importantes del
artpiculo ası́ como también la simulación de los circuitos en cell
designer , análisis de estabilidad y diagrama de fase para el
sistema toxina-antitoxina. El articulo en referencia desarrolla 2
circuitos implementados utilizando la biologı́a sintética. Dichos
Modelos son los denominados ”Essentializer” y ”Cryodeath”
los cuales actuan como kill switches en el E.coli
Fig. 1. Esquema toxina-antitoxina planteado
I. HIPOTESIS
El kill switch debe causar muerte de la célula sin generar
una desventaja evolutiva, en el caso del essentializer matar
cuando hay ausencia de las proteı́nas Cro o cI y en el caso
del cryodeath matar cuando la temperatura está por debajo
de los 37◦ C.
II. INTRODUCCI ÓN
A. Importancia:
Las aplicaciones de bacterias genéticamente modificadas
son diversas y en constante expansión (EJM: En producción
farmaceutica, en suelos para facilitar el crecimiento del
cultivo, y también para producir productos quı́micos tóxicos
para las plagas de los cultivos,entre otros), pero la posibilidad
de que estos organismos escapen del confinamiento plantea
una amenaza ambiental. Por lo tanto, se han desarrollado
diversos enfoques para hacer que la supervivencia bacteriana
dependa de la presencia de componentes no nativos o no
naturales en el medio de cultivo. Sin embargo, algunos de
estos enfoques podrı́an fallar si los metabolitos requeridos
para el crecimiento están inesperadamente presentes en am-
bientes no controlados, y aquellos en los que el genoma
bacteriano necesita ser modificado a gran escala podrı́an ser
poco prácticos y engorrosos.
B. Definiciones importantes:
1) Biologı́a sintética : . La biologı́a sintética es un área
interdisciplinaria que implica la aplicación de principios de
ingenierı́a a la biologı́a. Tiene como objetivo el (re) diseño
y fabricación de componentes y sistemas biológicos que aún
no existen en el mundo natural. La biologı́a sintética combina
la sı́ntesis quı́mica del ADN con el creciente conocimiento
de la genómica para permitir a los investigadores fabricar
rápidamente secuencias de ADN catalogadas y ensamblarlas
en nuevos genomas.
2) Biological Containment: . Los contenedores biológicos
son métodos o estrategias utilizadas para proteger el medio
ambiente de organismos de laboratorio experimental poten-
cialmente peligrosos
3) Kill Switch: . Una definición común en el ambiente
netamente de ingenierı́a serı́a seguridad utilizada para apagar
un dispositivo en una emergencia. En este caso en el ambi-
ente de la biologı́a, para ser más especı́fico en el ambiente
de la Biologı́a sintética, se definen como sistemas artificiales
que provocan la muerte celular bajo ciertas condiciones, en
palabras más sencillas un switch entre la vida y la muerte
que depende del condiciones ambientales.
4) Sistema Toxina/Antitoxina: . Un sistema toxina-
antitoxina es un conjunto de dos o más genes unidos, que
codifican una proteı́na ’veneno’ y su ’antı́doto’ correspon-
diente. Cuando estos sistemas se encuentran en plásmidos
(elementos genéticos transferibles) aseguran que únicamente
las células hijas que heredan el plásmido sobrevivan después
de la división celular. Si el plásmido está ausente en una
célula hija, la antitoxina ’inestable’ se degrada y la proteı́na
tóxica ’estable’ ataca y elimina a la nueva célula; esto es
conocido como ’exterminio post - segregacionista’
Fig. 2. Representacion de un sistema Toxina-Antitoxina
 III. A SPECTOS IMPORTANTES DEL ART ÍCULO EN
ESTUDIO
A. Essentializer
Es un elemento de memoria biestable del sistema
toxina/antitoxina, requerido para mantener su funcionalidad
a través de las generaciones de E. Coli. Este elemento de
memoria usa factores de transcripción del Fago lambda,
los represores cl, Cro; operones OR1, OR2 modificados
para aumentar su afinidad con el cl y OR3. El represor
cl se une en los binding sites OR1, OR2 y el represor
Cro en OR3 El diseño debe ajustar los niveles de toxina
y antitoxina. Cuando cl y Cro están ausentes, siendo la
expresión de la toxina suficiente para matar la célula. Sin
embargo, cuando está presente cl o Cro la producción de
toxina debe estar reprimida, de tal manera que no afecta
al crecimiento celular. El sistema CcdB/CcdA ha sido
modificado genéticamente para cumplir con las hipótesis
de diseño, dando 3072 potenciales combinaciones. De las
combinaciones totales se toman 31 candidatos potenciales,
que son nombrados EE01-EE11. Los candidatos se someten
a 5 pruebas para determinar si mantienen su letalidad
durante 140 generaciones de E. Coli.
1) Pruebas en el essentializer: En la primera prueba
denominada prueba de letalidad, se recombina con cl857,
un mutante del represor CI sensible a la temperatura, el cual
es activo a 30◦ C, pero inactivo a 42◦ C. En la prueba se
somete a las células a 42◦ C, si mueren a esta temperatura,
pero sobreviven a menores, entonces el essentializer es un
candidato potencialmente letal. En la segunda prueba se le
introduce un lisato para remover el cl857, permitiendo que
recupere el operon biotin,en este caso, si crece sin presencia
del biotin, entonces la toxina no es letal, por lo que se debe
descartar como candidata. En la tercera prueba se transduce
cada essentializer en MG1655, sin fuente de cl o Cro en
MG, el candidato no debe transducir. En la cuarta prueba se
transduce el essentializer en PAS, una cepa con el elemento
de memoria, si transduce aquı́, pero no en la prueba cuatro,
entonces es candidata.
En la quinta prueba se le inserta resistencia a la ampicilina
por transducción, remplazando el elemento de memoria. Si
las células mueren sin el elemento de memoria, entonces es
una candidata viable. De las candidatas se observó que EE02
y EE06 presentaban mutaciones, pero la mutación EE02
fallaba en preservar el elemento de memoria y la mutación
EE06 solo variaba la ratio de expresión de toxina/antitoxina,
pero no afectaba su letalidad en más de 140 generaciones. Se
eligieron los EE10 y EE11 debido a su estabilidad evolutiva,
estas cepas mostraban la sobrepoblación de MG1655, lo
que significa que el elemento essentializer no generaba una
significante desventaja en el crecimiento.
B. Cryodeath
Se desarrolla este circuito en busca de una mejor aprox-
imación del sistema toxina/antitoxina, con la finalidad de
confinar a la bacteria dentro de un ambiente de temperatura
determinada. (Intestino de mamı́feros).
1) Diseño: La región reguladora sensible a la temperatura
de choque frio de la proteı́na A (PcspA) es modular y
confiere una expresión regulada por la temperatura para la
proteı́na de interés. PcspA contiene un promotor con una alta
transcripción en todas las temperaturas. Este es seguido por
un largo “ 5 UTR”, el cual adopta una estructura secundaria
inestable a los 37◦ C y es rápidamente degrado por RNaseE (
Mitta et al., 1997 ), sin embargo a bajas temperaturas forma
una configuración estable que permite la traducción ( Fang
et al., 1997; Giuliodori et al., 2010 ). El downtream Box
mejora la traducción.
2) Modificación de la toxina-Antitoxina: Para lograr una
gama de niveles de expresión de la toxina y la antitoxina,
se variaron diez bases: tres en el RBS de la antitoxina, dos
en la 10ma posición promotora de la antitoxina, uno en la
región 35 del promotor de la toxina, dos en la región 10 del
promotor de la toxina y dos en el dos en el RBS de la toxina.
Cada posición variada tenı́a la posibilidad de dos nucleidos
diferentes, haciendo posible 21024 constructos diferentes. Las
bases elegidas para variar siguieron una lógica similar a la
del elemento essentializer, generalmente con bases de menor
importancia dentro de las regiones 10 y 35, de acuerdo con
el análisis previo publicado del promotor de E. coli y los
sitios de unión a ribosomas.
3) Pruebas de laboratorio: Se identificaron 26 can-
didatos, de los cuales 2 tenı́an enlazador y 24 sin el. Los
enlazadores resultaron ser irrelevantes en las pruebas. Las
pruebas consistı́an en exposición a temperaturas de 37, 30 ,
22 y 15 ◦ C. La condición era que a menos de 37◦ C no se
logre el crecimiento de las bacterias. Resultando candidatos
solo 10 de ellas llamadas del CD01 al CD10, los no aptos
CD11-Cd26. Para los análisis se utilizo como elemento
de control negativo al CD12, considerado no letal. Las
pruebas consistı́an en pruebas a las diferentes temperaturas
anteriormente mencionadas, en la cual cada prueba duraba
aproximadamente 140 generaciones. Los diez candidatos
solo el CD01 y el CD10 presentaban la menor tasa de
supervivencia (∼10−5 ) por lo cual fueron los más aptos de
los 10. Sin embargo, el CD10 presenta mayor estabilidad
en el tiempo para retener al fenotipo retenedor regulador de
temperatura del kill switch. Concluyendo que el CD10 es el
candidato más apto para las funciones del kill Switch.
4) Pruebas en mamı́feros: Se realizaron pruebas con
ratones de laboratorios a los cuales se les cultivo estas
bacterias modificadas con el cryodeath en el intestino, para
posteriormente analizar las heces de estos animales a tem-
peraturas no permisivas para la supervivencia del E.coli,
resultado ratios de supervivencia semejantes a los realizados
in vitro. El tiempo de prueba fue de 1 a 10 dı́as, en donde
se observó una tasa de supervivencia del ∼10−5
IV. CONTRIBUCI ÓN
La contribución al articulo corresponde primero al analisis
en cell designer de los circuitos essentializer and cryodeath.
Dichos circuitos son circuitos experimentales sin embargo
no existe un analisis previo de simulación, por lo que en
este artı́culo se presenta su analisis en cell designer tratando
de encontrar el valor de las constantes de las reacciones
biológicas ası́ como tambien el analisis de las respuestas de
cada circuito.
1) Simulación en Cell designer del Essentializer: El cir-
cuito fue simulado en cell designer versión 4.4 para obtener
una visón mas representativa del comportamiento de dicho
circuito. Debido a que no se contaban con datos de constantes
en el paper, se decidió escoger dichos valores con tal que
cumplan las condiciones del artı́culo.Ver Figura 11.
• Análisis en estado estable:
para que a mı́nimos niveles de expresión de Cro o cI2 se
produzca la represión. Para que ccd=0 Sabiendo que al inicio
hay cierta cantidad e antitoxina CcdA
dP Ccd
=0
dt
0 = a1 ∗ mCcd − k2 ∗ P CcdB ∗ P CcdA − d5 ∗ P CcdB
Entonces para cumplir la igualdad, la proteı́na CcdB debe
ser 0 en estado estable. Si no hay efecto represivo, es decir,
Cro y cI2 son 0, entonces ccd6=0

Ecuaciones de expresion de Genes: 1 1

0=( )( ) − (a1 ) ∗ mccd
P Cro n2 P CI2 n2
dmCro 1 1+( ) 1+( )
= − a2 ∗ mCro − d6 ∗ mCro k2 k1
dt P CI2 n3
1+( ) 1
k3 mccd =
a1
dmCcd 1 1 De la igualdad
=( )( )−(a1 )∗mccd
dt P Cro n2 P CI2 n2
1+( ) 1+( ) 0 = a1 ∗ mCcd − k2 ∗ P CcdB ∗ P CcdA − d5 ∗ P CcdB
k2 k1
dmCI 1 De la igualdad entonces CcdB>0 y además para que
= − a3 ∗ mCI − d7 ∗ mCI
dt P Cro n4 cumpla la hipótesis del essentializar PCcdB> PCcdA.
1+( )
k4
a1 ∗ mCcd = k2 ∗ P CcdB ∗ P CcdA
Accion de masas de Proteinas:
1
= P CcdB
dP Cro k2 ∗ P CcdA
= a2 ∗ mCro − d3 ∗ P Cro
dt P CcdB > P CcdA
dP cI2
= Kf 1 ∗ P cI − Kr 1 ∗ P cI2 − d2 ∗ P cI2 Finalmente se obtiene la siguiente simulación del essen-
dt
tializer.
dP cI • Ante la ausencia de Cro y cI se observa que se produce
= −Kf 1 ∗ P CI + Kr 1 ∗ P cI2 + a3 ∗ cI − d1 ∗ P cI2
dt la toxina que mata la célula y la antitoxina decae
dP Ccdb rápidamente
= a1 ∗mccd−K2 ∗P CcdB∗P CcdA−d5 ∗P CcdB
dt
dP CcdA
= K2 ∗ P CcdB ∗ P CcdA − d8 ∗ P CcdA
dt
dC
= K2 ∗ P CcdB ∗ P CcdA − d9 ∗ C
dt

En donde P [CccdA2 − CcdB2 ] es la proteina compleja

toxina-antitoxina la cual se llamará complejo C.
Ahora realizando el analisis en estado estable:
Asumimos que no hay degradaciones, por tanto di=0
dmCcd Fig. 3. Producción de Toxina ante auscencia de Cro y cI
=0
dt
1 1 • En la ausencia de cI y presencia de Cro se observa que
0=( )( ) − (a1 ) ∗ mccd la producción de antitoxina es mayor que la toxina lo
P Cro n2 P CI2 n2
1+( ) 1+( ) cual no conduce a un estado en especial sin embargo
k2 k1
está de acuerdo con las condiciones experimentales.
En el essentializer si hay expresión de Cro o de cI, no se pro-
duce suficiente toxina para matar a la E. Coli, CcdA>CcdB.
Entonces, se hace que:
Cro n2 cI2 n1
( ) → ∞, ( ) →∞
k2 k1
 TABLE I
C ONSTANTES EN EL E SSENTIALIZER

Constante Valor
a1 0.1
a2 0.1
k1 0.5
k2 0.5
n1 10.0
n2 10.0
d1 0.01
d2 0.01
d3 0.01
Fig. 4. Producción mayor de antitoxina con respecto a la toxina en d4 0.1
presencia de Cro y ausencia de cI d5 0.1
d6 0.1
Kr1 0.5
Kf1 0.9
• En la ausencia de Cro y presencia de CI se observa que a3 0.1
la produccion de antitoxina es mayor que la toxina lo d7 0.01
cual no conduce a un estado en especial sin embargo k3 1.0−8
k4 1.0−8
está de acuerdo con las condiciones experimentales n3 10
n4 10
d8 0.01
d9 0.01
K 0.01

Expresión de genes
dmccd 1
= − k1 ∗ mccd − d1 ∗ mccd
dt T
1 + ( )nT
kT
Acción de masas de proteı́nas
Fig. 5. Producción mayor de antitoxina con respecto a la toxina en
presencia de CI y ausencia de Cro dP CcdB
= k1 ∗ mccd − K ∗ P Ccd ∗ P CcdA − d2 ∗ P CcdB
dt
• En la presencia de ambos represores se observa que se dP CcdA
produce la toxina que permite matar las células. = −K ∗ P CcdB ∗ P CcdA − d3 ∗ P CcdA
dt
dC
= K ∗ P CcdB ∗ P CcdA − d4 ∗ P CcdA
dt
En donde P[CcdA2 -CcdB2 ] es la proteı́na complejo toxina-
antitoxina, se llamará C

Luego se puede apreciar los casos para los cuales:

• A una temperatura de 37◦ C o mayor se produce toxina

probacando la muerte de la célula

Fig. 6. Producción de toxina cuando se activan ambos represores Cro y

CI

Las constantes usadas en la simulación del essentializer se

pueden napreciar en la Tabla I.

2) Simulación en Cell designer del Cryodeath: El circuito

fue simulado en cell designer versión 4.4 para obtener
una visón más representativa del comportamiento de dicho
circuito, debido a que no se contaban con datos de constantes
en el paper, se decidió escoger dichos valores con tal que Fig. 7. Producción de toxina a mayor igual que 37◦ C
cumplan las condiciones del paper. Ver Figura 12
 • A una temperatura menor de 37◦ C se produce mayor • Para las condiciones iniciales y parámetros dados, el sis-
antitoxina que toxina evitando la muerte de la célula. tema Toxina-Antitoxina en el circuito cryodeath (CcdB-
CcdA), es estable y converge al origen.

Fig. 8. Produccion mayor de antitoxina que toxina a menor de 37◦ C

Fig. 10. Plano de fase del sistema toxina-antitoxina
Las constantes utilizadas en el circuito cryodeath se observan
en la Tabla II.
V. CONCLUSIONES
• Se logró simular los circuitos Essentializer y Cryodeath,
TABLE II
los cuales actúan como kill sitwhes bajo ciertas condi-
C ONSTANTES EN EL C RYODEATH
ciones. En el caso del essentializer la activación del
sistema toxina-antitoxina se presenta ante la presencia
Constante Valor
o ausencia de las proteı́nas Cro y CI, mientras que en el
nT 100000
kT 36.99 circuito cryodeath el sistema toxina-antitoxina se activa
k1 1.0 ante un cambio de temperatura mayor a 37◦ C
k 1.0
d1 0.0 • Se realizó el análisis de estabilidad para el sistema
d2 0.0 toxina-antitoxina tanto en el circuito essentializer como
d3 0.0 en el circuito Cryodeath observando que ambos son
d4 0.0
estables, esto fue realizado con la solución ODE45
para las ecuaciones diferenciales multirelacionadas y
3) Análisis del plano de fase circuito Essentializer: Para con ayuda del software Matlab.
el análisis de plano de fase se utilizó el software Matlab R EFERENCES
mediante la solución paramétrica con el solver ODE45 para
[1] Ahrenholtz, I., Lorenz, M.G., and Wackernagel, W. (1994). A con-
el posterior ploteo del diagrama de fase del sistema toxina- ditional suicide system in Escherichia coli based on the intracellular
antitoxina. degradation of DNA. Appl. Environ. Microbiol. 60, 3746–3751
[2] Chan, C.T.Y., Lee, J.W., Cameron, D.E., Bashor, C.J., and Collins, J.J.
• Para las condiciones iniciales y parámetros dados, el
(2016). ‘Deadman’ and ‘Passcode’ microbial kill switches for bacterial
sistema Toxina-Antitoxina en el essentializer(CcdB- containment. Nat. Chem. Biol. 12, 82–86.
CcdA), es estable y converge al origen. [3] Kong, W., Wanda, S.Y., Zhang, X., Bollen, W., Tinge, S.A., Roland,
K.L., and Curtiss, R., 3rd (2008). Regulated programmed lysis of
recombinant Salmonella in host tissues to release protective antigens
and confer biological containment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105,
9361–9366.
[4] Finn Stirling, Lisa Bitzan,Samuel O’Keefe, Elizabeth Redfield, Molec-
ular Cell, Rational Design of Evolutionarily Stable MicrobialKill
Switches
[5] Collins Dictionary of Biology, 3rd ed. c W. G. Hale, V. A. Saunders,
J. P. Margham 2005
[6] Joana Osório, NATURE, Genetic kill switches a matter of life or death-
Review
[7] https://www.bio.org/articles/synthetic-biology-explained

Fig. 9. Plano de fase del sistema toxina-antitoxina

4) Análisis del plano de fase circuito Cryodeath: Para

el análisis de plano de fase se utilizó el software Matlab
mediante la solución paramétrica con el solver ODE45 para
el posterior ploteo del diagrama de fase del sistema toxina-
antitoxina
Fig. 11. Circuito essentializer diseñado simulado en cell desginer

Fig. 12. Circuito cryodeath simulado en cell desginer