PADRONIZAÇÃO DO USO DE SWABS DE MUCOSA INTERNA DA BEXIGA

URINÁRIA PARA IDENTIFICAÇÃO HUMANA POR DNA DE CADAVERES SEM

SINAIS EVIDENTES DE DECOMPOSIÇÃO

Felipe Carlos de Araujo Brito

RIO DE JANEIRO - RJ
2014
 PADRONIZAÇÃO DO USO DE SWABS DE MUCOSA INTERNA DA BEXIGA
URINÁRIA PARA IDENTIFICAÇÃO HUMANA POR DNA DE CADAVERES SEM
SINAIS EVIDENTES DE DECOMPOSIÇÃO

Felipe Carlos de Araujo Brito

Trabalho de Conclusão de Curso de

Ciências Biológicas para obtenção do
título de Bacharel em Ciências
Biológicas das Faculdades São José.

Professor Orientador: Carolina

Conceição Bottino Gruszkowski

RIO DE JANEIRO - RJ
2014
 PADRONIZAÇÃO DO USO DE SWABS DE MUCOSA INTERNA DA BEXIGA
URINÁRIA PARA IDENTIFICAÇÃO HUMANA POR DNA DE CADAVERES SEM
SINAIS EVIDENTES DE DECOMPOSIÇÃO

Felipe Carlos de Araujo Brito

MONOGRAFIA SUBMETIDA À BANCA EXAMINADORA COMO PARTE DOS

REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE BACHAREL
EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS.

Aprovada por:

_______________________________________
Carolina Conceição Bottino Gruszkowski, M.Sc.

_______________________________________
Prof. Dr. Frederico Augusto Vieira de Castro, Dr.

_______________________________________
Dr. Rodrigo Grazinoli Garrido, Dr.

RIO DE JANEIRO – RJ – BRASIL

NOVEMBRO DE 2014
BRITO, FELIPE CARLOS DE ARAUJO.
Padronização do uso de swabs de mucosa interna da bexiga urinária para
identificação humana por DNA de cadáveres sem sinais evidentes de
decomposição/Felipe Carlos de Araujo Brito. Rio de Janeiro: FSJ, Escola de Saúde,
Ciências Biológicas, 2014.
xv, 48f.: il.; 29,7 cm.
Orientador: Carolina Conceição Bottino Gruszkowski.
Monografia (Bacharel). FSJ/Escola de Saúde/Ciências Biológicas, 2014.
Referências: f. 27-31.
1. Genética Forense. 2. Identificação humana. I. Gruszkowski, Carolina Conceição
Bottino. II. Faculdades São José, Escola de Saúde, Ciências Biológicas. III.
Monografia.

iv
DEDICATÓRIA

Dedico,

Aos meus pais Jadir Gomes de Brito e Rosali de Araujo Lucena, que, no
decorrer da minha vida, se dedicaram, cuidaram e trabalharam por mim, despertando e
alimentando-me, ainda na infância, a busca pelo conhecimento e a importância deste em
minha vida. Que proporcionaram-me, além de extenso amor e carinho, os
conhecimentos da honestidade, da persistência e de procurar sempre o meu
desenvolvimento como ser humano;

A minha noiva Marcelly Cristine Nascimento da Silva pelo imenso carinho e

companheirismo, que permaneceu sempre ao meu lado, nos bons e maus momentos;
além de me fazer feliz, ajudou-me, durante todo o percurso de minha vida acadêmica;

Aos amigos(as), familiares, professores(as) e todos aqueles(as) que, direta ou

indiretamente, contribuíram de alguma forma para esta realização pessoal;

Ao Curso de Ciências Biológicas da Faculdade São José, е às pessoas com quem

convivi nesses espaços ао longo desses anos. А experiência de uma produção
compartilhada com amigos nesses espaços foram а melhor experiência da minha
formação acadêmica.

v
AGRADECIMENTOS

À Instituição pelo ambiente criativo е amigável que proporciona e à

coordenadora do curso de Ciências Biológicas Gisele Almeida por todo apoio e atenção
durante o curso;

Aos professores da Faculdade São José, especialmente, ao Prof. Daniel Medina

pelos conselhos e confiança, pela contribuição imensurável a minha formação
acadêmica e pessoal e, principalmente, pela amizade e respeito. Ao Prof. Frederico
Castro pelos esclarecimentos e confiança, pela amizade e pelos conselhos para o
desenvolvimento desse trabalho. Ao Prof. Thiago Ávila, Prof. Fernanda Avelino, Prof.
Aline Meneguci e a Prof. Aliny Pires pelos ensinamentos, apoio e confiança. Nesse
curso eu aprendi muito mais do que é ser um Biólogo e vocês foram responsáveis por
isso. Não tenho palavras para descrever a minha gratidão!

A todos do Laboratório de Pesquisas e Pericias em Genética Forense

(IPPGF/PCERJ) pelos ensinamentos e oportunidades, e por acreditarem em meu
potencial, em especial à minha orientadora Carolina C. Bottino Gruszkowski, que, com
muita paciência e atenção, dedicou do seu tempo para me orientar neste trabalho, além
disso, tanto tem me inspirado para que eu me torne um profissional melhor a cada dia. À
“chefa” Sandra Marta e ao diretor Rodrigo Grazinoli pelas conversas, pela atenção,
pelos conselhos e, principalmente, por teres se importado comigo. Ao técnico David
Borges pelas dicas e conversas, e pelo apoio imensurável prestado para a realização
desde trabalho. Às estagiárias Jéssica Kreischer, Ada Matos e Aryanne Lopes pela
companhia, conversas e risadas, pela amizade e pelo auxílio imensurável na rotina
laboratorial. E aos demais integrantes do IPPGF não citados aqui que de alguma forma
contribuíram para a realização desse trabalho. Serei eternamente grato;

Aos meus colegas de classe Anderson Ferreira, “Claudinha” Favoreto, Edilene

Pontes, Fabiana Ferreira, Isabelle Cordeiro, Luise Victorio e Pedro Severo pela grande
amizade, pelos momentos bons e ruins que passamos ao longo desses semestres, pelo
carinho, apoio, paciência e pelo auxilio imensurável na minha formação profissional e
pessoal. Essa conquista eu compartilho com vocês com muita alegria, pois vocês
vivenciaram tão de perto cada momento quanto eu, vocês são parte dessa vitória!

vi
 A todos do Instituto Médico Legal Afrânio Peixoto pela contribuição da
principal “matéria-prima” para a realização desse trabalho, em especial ao técnico de
necropsia Marcilto por sua contribuição e dedicação sem medir esforços. Serei sempre
grato;

Agradeço também aos meus pais Jadir e Rosali, meu irmão Jairo e minha noiva
Marcelly, que de forma especial e carinhosa me deram forças e coragem, me apoiando
nos momentos de dificuldade, pelos direcionamentos, pelas palavras de incentivo e por
todos os momentos que estiveram ao meu lado.

Obrigado a todas as pessoas que contribuíram para meu sucesso e para meu
crescimento como pessoa. Sou o resultado da confiança e da força de cada um de vocês.

vii
"Ninguém baterá tão forte quanto a vida. Porém, não se trata de quão
forte pode bater, se trata de quão forte pode ser atingido e continuar
seguindo em frente. É assim que a vitória é conquistada."
Rocky Balboa

viii
Resumo da Monografia apresentada às Faculdades São José como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas (Bel.)

PADRONIZAÇÃO DO USO DE SWABS DE MUCOSA INTERNA DA BEXIGA

URINÁRIA PARA IDENTIFICAÇÃO HUMANA POR DNA DE CADÁVERES SEM
SINAIS EVIDENTES DE DECOMPOSIÇÃO

Felipe Carlos de Araujo Brito

Novembro/2014

Na sociedade há necessidade de individualizar as pessoas, tanto para assegurar-

lhes direitos, como para exigir seus deveres. A identificação surgiu como referencial de
conhecimento do indivíduo, e a genética tem se mostrado um ótimo meio para
identificação de pessoas, tanto cível como criminalmente. Este trabalho teve por
objetivo padronizar o uso de swabs da mucosa interna da bexiga urinária como fonte de
DNA para identificação de cadáveres humanos sem sinal evidente de decomposição por
técnicas de Genética Forense. O DNA das amostras foi extraído utilizando o método
orgânico e o método da resina Chelex®; quantificado pelo método da PCR em tempo
real e submetido à amplificação com o kit de identificação humana AmpFLSTR®
Identifiler® Plus, para amplificação simultânea de 15 locais genéticos autossômicos
mais o marcador de gênero amelogenina. Os resultados deste estudo confirmam a
viabilidade do uso de swabs da mucosa interna da bexiga urinária como fonte de DNA
para identificação humana, pois além de apresentarem resultados reprodutíveis e
confiáveis, este tipo de amostra permite uma redução significativa no tempo e no custo
necessários para análise.

Palavras-chave: Bexiga urinária, Identificação humana, Swab, Genética forense.

ix
SUMÁRIO

DEDICATÓRIA ............................................................................................................... v
AGRADECIMENTOS .................................................................................................... vi
RESUMO......................................................................................................................... ix
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... xii
LISTA DE TABELAS................................................................................................... xiii
SIGLAS E NOMENCLATURAS ................................................................................. xiv

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
1.1. HISTÓRICO DOS MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO ........................................ 1
1.2. A IDENTIFICAÇÃO POR DNA ........................................................................... 3
1.3. MARCADORES GENÉTICOS ............................................................................. 4
1.3.1. VNTRs - Variable Number of Tandem Repeats.............................................. 4
1.3.2. STRs – Short Tandem Repeats ........................................................................ 5
1.3.3. SNP – Single Nucleotide Polymorphism ......................................................... 5
1.3.4. Y-STR e Y-SNP .............................................................................................. 5
1.3.5. DNA MITOCONDRIAL ................................................................................ 6
1.4. UTILIDADE DA ANÁLISE GENÉTICA ............................................................. 6
1.5. OBJETIVOS ........................................................................................................ 10
1.5.1. OBJETIVO GERAL ..................................................................................... 10
1.5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 10
2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 11
2.1. COLETA DAS AMOSTRAS ............................................................................... 11
2.2. EXTRAÇÃO DO DNA ........................................................................................ 12
2.2.1. AMOSTRAS DE OSSO................................................................................ 12
2.2.2. AMOSTRAS DE MÚSCULO ...................................................................... 12
2.2.3. AMOSTRAS DE SWABS DA MUCOSA INTERNA DA BEXIGA
URINÁRIA .................................................................................................. 13
2.2.3.1. EXTRAÇÃO ORGÂNICA .................................................................... 13
2.2.3.2. EXTRAÇÃO COM RESINA QUELANTE CHELEX 100® ................ 14
2.3. QUANTIFICAÇÃO DO DNA ............................................................................. 14
2.4. AMPLIFICAÇÃO DO DNA ................................................................................ 15
x
 2.5. ANÁLISE DOS RESULTADOS ......................................................................... 15
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................ 18
3.1. AMOSTRAS COLETADAS ............................................................................... 18
3.2. EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA ................................................... 19
3.3. AMPLIFICAÇÃO DO DNA ................................................................................ 22
3.4. OBTENÇÃO DOS PERFIS GENÉTICOS .......................................................... 22
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................... 26
5. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 27
ANEXOS ........................................................................................................................ 32

xi
LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Métodos de Identificação. A) identificação civil (Fonte: Roteiro de Campos);

B) ferrete marcando um boi (Fonte: Rural Centro); C) fotografia de um
criminoso (Fonte: Bocaiuva); D) arcada dentária (Fonte: Fórum IIPR); E)
tatuagem (Fonte: Geeky Tatoos); F) impressão digital (Fonte: Política na
Rede). ................................................................................................................. 3

Figura 2: Tipos de desastres. A) Evento aberto: desastre na região serrana do Rio de

Janeiro, em janeiro de 2011 (Fonte: IG); B) Evento fechado: destroços do avião
da banda Mamonas Assassinas que bateu na Serra da Cantareira em março de
1996 (Fonte: IG); C) Evento misto: acidente com avião da TAM que caiu em
casas no Estado de São Paulo em outubro de 1996 (Fonte: UOL). .................... 8

Figura 3: esfregaço da mucosa interna da bexiga urinária (Fonte: acervo pessoal). ...... 11

Figura 4: Eletroferograma obtido com a utilização do kit AmpFLSTR® Identifiler®

Plus, demostrando os 15 loci STRs analisados e o marcador de gênero
Amelogenina (Fonte: Acervo pessoal). ............................................................ 16

Figura 5: Variação na concentração de DNA dos diferentes tipos de amostras. ............ 21

Figura 6: Perfil completo, apresentando picos nos 16 loci STR (Fonte: acervo pessoal).
.......................................................................................................................... 23

Figura 7: Perfil parcial, apresentando picos em 10 loci STR (Fonte: acervo pessoal). .. 24

Figura 8: Perfil insuficiente para análise, não apresentando picos nos loci STR (Fonte:
acervo pessoal). ................................................................................................ 24

Figura 9: Eletroferogramas com perfil completo das amostras de osso, músculo, SORG
e SC do mesmo indivíduo demostrando a concordância entre eles (Fonte:
acervo pessoal). ................................................................................................ 25

xii
LISTA DE TABELAS

Tabela I: Tabela de coleta de amostras post mortem para os diferentes tipos de

cadáveres (INTERPOL, 2009). ........................................................................ 9

Tabela II: Localização cromossômica dos loci analisados, suas respectivas sequências e
seus marcadores fluorescentes (Fonte: AmpFlSTR® Identifiler® Plus User
Guide, Life Technologies™) ......................................................................... 16

Tabela III: Descrição de gênero, idade e causa mortis dos cadáveres necropsiados. .... 18

Tabela IV: Dados da quantificação de DNA das amostras de ossos, músculos e swabs da
mucosa interna da bexiga urinária com o emprego do kit Genomic de
Quantificação de DNA humano. .................................................................... 20

Tabela V: Valores do IPC, usado para verificar a presença de possíveis inibidores na

reação. ............................................................................................................ 21

xiii
SIGLAS E NOMENCLATURAS

Chelex – Resina quelante utilizada para extração de DNA.

CODIS – Combined DNA Index System.

Ct – Cycle Threshold.

DGPTC – Departamento Geral de Polícia Técnica Cientifica.

DNA – Ácido Desoxirribonucleico.

DTT – Ditiotreitol.

EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetracético.

FBI – Federal Bureau Investigation.

GRC – Guia de Remoção de Cadáver.

IML – Instituto Médico Legal.

IMLAP – Instituto Médico Legal Afrânio Peixoto.

INTERPOL – Polícia Internacional.

IPC – Internal Positive Control – Controle interno do kit de quantificação.

IPPGF – Instituto de Pesquisa e Perícias em Genética Forense.

ISFG – International Society for Forensic Genetics ou Sociedade Internacional de

Genética Forense.

KCl – Cloreto de potássio.

KH2PO4 – Fosfato monopotássico.

mtDNA – DNA mitocondrial.

Na2HPO4 – Fosfato dissódico.

NaCl – Cloreto de Sódio.

PBS – Tampão fosfato-salino.

PCERJ – Polícia Civil do Estado do Rio de Janeiro.

PCR – Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia de Polimerase.

xiv
RFLP – Restriction Fragment Lenght Polymorphism ou Polimorfismo no Comprimento
do Fragmento de Restrição.

SDS – Dodecil Sulfato de Sódio.

SC – Swabs cujo DNA foi extraído com o emprego da metodologia Chelex.

SNP – Single Nucleotide Polymorphism ou Polimorfismo de Nucleotídeo Único.

SORG – Swabs cujo DNA foi extraído com o emprego da metodologia orgânica
(Fenol:Clorofórmio).

STR – Short Tandem Repeats ou Repetições Curtas em Sequências –microssatélites.

Swab – Consiste em um pequeno pedaço de algodão fixado em uma haste de plástico

utilizado para esfregaços (cotonete).

Tampão TE-4 – Tampão Tris.EDTA

Tris-HCl – tris (hydroxymethyl) aminomethane – (hydrochloric acid) ou tris

(hidroximetil) aminometano–cloridrato.

VNTR – Variable Number of Tandem Repeats ou Número Variável de Repetições em

Sequência.

Y-SNP – SNP presente no cromossomo Y.

xv
 1

1. INTRODUÇÃO

A busca pela identidade, ou seja, o conjunto de caracteres capazes de

individualizar uma pessoa ou objeto, fazendo-a distinta das demais, data desde os
primórdios dos tempos até a atualidade. São diversos os atributos que tornam alguém
igual apenas a si próprio, tais como impressões digitais e o DNA. A identificação é
caracterizada pelo uso de técnicas e meios propícios para se chegar à identidade, tendo a
finalidade de determinar uma individualidade que a fazem diferente de todas as outras e
igual apenas a si mesma (FRANÇA, 2009).
Diante de uma sociedade, todas as pessoas precisam ter uma identificação que
possibilite a preservação e o acesso a valores essenciais, alguns constituídos na própria
Constituição da República Federativa do Brasil (1988), tais como a liberdade e a
dignidade. A identificação surgiu como referencial de conhecimento do indivíduo, ou
seja, ser conhecido e reconhecido por toda sociedade, nacional e internacional. Segundo
o Manual do Departamento da Polícia Federal (2004):

“Na sociedade há necessidade de individualizar as pessoas, tanto

para assegurar-lhes direitos, como para exigir seus deveres. Neste
particular a IDENTIFICAÇÃO é um importante instrumento de que se
utiliza para a aplicação dos direitos individuais e sociais.”

1.1. HISTÓRICO DOS MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO

Segundo ARAÚJO e PASQUALI (2006), dentre os primeiros processos de

identificação, civil e criminal, até os atuais podemos destacar:
a) O nome: O mais antigo de todos os métodos de identificação, utilizado até
hoje pelo homem para reconhecer seus semelhantes e as coisas que o circundam (Figura
1A).
b) O Ferrete: Processo que se baseava no uso de instrumentos de ferro aquecido
para se marcar os criminosos, escravos e animais (Figura 1B).
c) Tatuagem: Também conhecida como Sistema Cromodérmico, a tatuagem foi
oficialmente proposta como meio de identificação em 1832 pelo filósofo inglês Jeremy
Bentham. A proposta inicial era a de tatuar na parte interna do antebraço direito letras
 2

para a identificação civil de uma pessoa e números para a identificação criminal.

Atualmente as tatuagens encontradas em cadáveres que chegam aos Institutos Médicos
Legais (IMLs) são fotografadas e registradas, sendo de suma importância seu
reconhecimento e identificação (Figura 1E).
d) Fotografia: Criada pelos artistas franceses Niepce e Daguerre no século XIX,
a fotografia tinha a finalidade de reproduzir fielmente a realidade a sua volta e registrar
de forma verossímil os fatos históricos. Desde então este processo passou a ser
empregado na identificação de pessoas, além de seu uso no campo da documentação ou
como forma de expressão artística (Figura 1C).
e) Arcada dentária: Técnica desenvolvida pelo doutor cubano Oscar Amoedo
Valdés em 1897. O estudo dos dentes possui uma grande importância para a
determinação da identidade, especialmente em cadáveres carbonizados, tendo em vista
que os dentes precisam de uma elevada temperatura para ser calcinados. Nesse exame
são observados a fórmula dentária, o modo de implantação dos dentes, as anomalias, as
alterações patológicas, o desgaste, os aparelhos de prótese e etc. (Figura 1D)
f) Papiloscopia: Técnica que trata da identificação humana através das papilas
dérmicas existentes na palma das mãos e na sola dos pés, mais conhecida como estudo
das impressões digitais. A papiloscopia é dividida em três partes: Quiroscopia, processo
de identificação por meio das impressões palmares; Podoscopia, processo de
identificação por meio das impressões plantares; Datiloscopia, processo de identificação
por meio das impressões digitais (Figura 1F).
g) DNA (ácido desoxirribonucleico): Descrita pela primeira vez pelo geneticista
Alec Jeffreys (1985), a técnica é conhecida hoje como "DNA fingerprinting" ou
"tipagem de DNA". Jeffreys descobriu um conjunto de marcadores genéticos chamados
minissatélites com um número variável de repetições em série (VNTRs – Variable
Number of Tandem Repeats), que são altamente específicos para um indivíduo. Os
VNTRs são regiões altamente polimórficas de DNA compostas por um conjunto de
sequências repetitivas em um local definido no genoma, que podem ser usadas para
diferenciar membros de uma população.
 3

Figura 1: Métodos de Identificação. A) identificação civil (Fonte: Roteiro de Campos); B)

ferrete marcando um boi (Fonte: Rural Centro); C) fotografia de um criminoso (Fonte:
Bocaiuva); D) arcada dentária (Fonte: Fórum IIPR); E) tatuagem (Fonte: Geeky Tatoos); F)
impressão digital (Fonte: Política na Rede).

1.2. A IDENTIFICAÇÃO POR DNA

A molécula de DNA possui regiões específicas com uma variabilidade genética

notável, o que lhe oferece a capacidade de identificar e comparar indivíduos,
determinando inclusive a existência ou não de vínculo genético entre estes
(PARADELA, 2006). Segundo Jeffreys (1985), cada ser humano possui um perfil
genético exclusivo, com exceção de gêmeos monozigóticos que compartilham do
 4

mesmo conjunto de genes. Esta exclusividade se dá pela combinação do DNA dos

progenitores e também pelo processo de recombinação gênica, que proporciona um alto
grau de variabilidade entre os organismos vivos (PARADELA, 2006).
A evolução no campo da identidade (cível e criminal) se destacou a partir do
estudo do genoma humano. O avanço das técnicas de DNA contribuiu para um novo
campo da criminalística – a Genética Forense – que passou a analisar os vestígios
humanos com o uso de marcadores genéticos e polimorfismos do DNA que são de
utilidade forense (FRANÇA, 1998 apud SOUZA, 2011).

1.3. MARCADORES GENÉTICOS

É considerado um marcador genético qualquer variação na sequência do DNA

de um ser vivo que o distinga de outro indivíduo ou grupo de indivíduos, ou que permita
a identificação de uma característica específica própria a esse ser (BUTLER, 2009).
Estes podem ser classificados como:

1.3.1. VNTRs - Variable Number of Tandem Repeats

VNTR refere-se a um número variável de repetições em série, consiste em uma

fração repetida de DNA denominadas minissatélites ou repetição em tandem de número
variável (VNTR – “variable number of tandem repeats”). Os VNTRs exibem uma
enorme variabilidade e são constituídos de 9 a 100 pares de bases repetidos
sequencialmente em loci cromossômicos. As primeiras sequências VNTR descritas
tiveram aplicação imediata na área forense, assim como no auxílio ao mapeamento do
genoma humano. Para a análise dos marcadores VNTR é utilizada a técnica RFLP
(“restriction fragment length polymorphism”). De modo geral, os VNTRs apresentam
probabilidades de paternidade/maternidade superiores a 99,999% com utilização de
poucas sondas. Índices tão elevados são decorrentes da alta variabilidade de loci VNTR.
Como desvantagem, o VNTR requer DNA íntegro e em grande quantidade (100-500
ng), tornando praticamente inviável a tipagem de amostras biológicas antigas,
degradadas ou com pouca quantidade de DNA. Atualmente, a metodologia é pouco
utilizada em investigações genéticas (GÓES, 2005).
 5

1.3.2. STRs – Short Tandem Repeats

Dentre os marcadores genéticos mais utilizados atualmente na área forense estão

os microssatélites (também conhecidos pela sua sigla em inglês STRs - Short Tandem
Repeats; em português, repetições de sequências simples ou repetições curtas em
tandem). Os STRs são sequências genômicas formadas por repetições de 2 a 5 pares de
bases, e o polimorfismo é baseado no número dessas repetições (BUDOWLE e VAN
DAAL, 2008). Os marcadores STRs correspondem a 3% do genoma humano e estão
localizados nos cromossomos em regiões especificas dos genes. (MARTINS, 2008).
Em 1983, Kary Mullis e colaboradores desenvolveram a técnica de PCR
(Polymerase Chain Reaction – Reação em Cadeia de Polimerase), permitindo que
pequenas quantidades de DNA fossem amplificadas, de maneira que fragmentos muito
curtos de DNA, como no caso dos microssatélites, pudessem ser utilizados (JEFFREYS,
2005).

1.3.3. SNP – Single Nucleotide Polymorphism

SNPs (single nucleotide polymorphism ou, em português, polimorfismo de

nucleotídeo único) são substituições, inserções ou deleções de bases que ocorrem em
posições únicas no genoma humano. Aproximadamente 85% das variações do genoma
são baseadas em SNPs, o que os torna útil para a identificação humana. Entretanto, essa
técnica também possui desvantagens, visto que a maioria dos SNPs são bi-alélicos eles
são menos informativos para testes de identidade quando comparados com loci de STR.
Além disso, um grande número de loci de SNPs são necessários para fornecer poder
discriminatório suficiente para uma identificação positiva de vitima (FUNABASHI,
2009).

1.3.4. Y-STR e Y-SNP

Localizados no cromossomo Y, os Y-STR e Y-SNP possuem diversas aplicações

no âmbito forense, tais como em investigações de pessoas desaparecidas, crimes
sexuais, testes de paternidade, investigações históricas e genealogia genética. Essas
aplicações se devem ao fato de que a maioria dos cromossomos Y (exceto em casos de
 6

mutação) é passada de pai para filho sem alterações, indicando uma linhagem patrilínea
comum (BUTLER, 2008).

1.3.5. DNA MITOCONDRIAL

O DNA mitocondrial (mtDNA) localiza-se na matriz mitocondrial como um

genoma pequeno de, aproximadamente, 16.569 pb na forma circular. Segundo Steffens
(1998), o teste de mtDNA pode ser realizado em diversos tipos de amostras, as quais
incluem manchas altamente degradadas, ossos, saliva, unhas e fios de cabelo. Por isso, a
análise do mtDNA é uma técnica excelente para usar na obtenção de informações nos
casos em que a análise do DNA nuclear não é viável. Uma vantagem do mtDNA é que
este possui uma herança matrilínea. Sendo assim, mesmo parentes maternos distantes
podem fornecer uma amostra de referência comparativa. Atualmente, o teste de mtDNA
envolve o sequenciamento de duas regiões hipervariáveis (HV1 e HV2) na região de
controle não codificante do mtDNA. Estas regiões são altamente variáveis na população
devido à taxa evolutiva do DNA mitocondrial (ISENBERG, 2002).

1.4. UTILIDADE DA ANÁLISE GENÉTICA

Atualmente a análise genética é uma ferramenta poderosa para testes de

identificação humana, tanto nas identificações civis como nas criminais, tais como na
identificação de autores de crimes violentos, (ex: homicídio e estupro), em assaltos,
casos de paternidade e na identificação dos restos mortais de pessoas desaparecidas
(THOMPSON, 2012), tal como ocorre em eventos de desastre de massa. De acordo com
o Manual da Interpol para Identificação de Vítimas de Desastres de Massa (2009), um
desastre é um evento inesperado causando a morte ou ferimentos a muitas pessoas. Pode
ser classificado como um evento aberto – um grande evento catastrófico, que resulta na
morte de um número desconhecidos de indivíduos, sendo difícil obter informações
sobre o número real de vítimas após este evento. Tal cenário frequentemente ocorre em
catástrofes naturais (Figura 2A). Ou um evento fechado – evento catastrófico, que
resulta na morte de um número conhecido de indivíduos, tais como uma queda de
aeronave com lista de passageiros (Figura 2B). Combinações destes dois eventos
 7

também são possíveis, por exemplo, acidente de avião em uma área residencial (Figura
2C).
Em eventos de natureza catastrófica, uma equipe multidisciplinar sempre deve
estar envolvida nos processos de identificação das vítimas, incluindo médicos legistas,
odontolegistas, papiloscopistas, geneticistas, entre outros (LESSIG & ROTHSCHILD,
2012). Juntamente com a papiloscopia e os exames odontológicos, a tipagem genética é
reconhecida como um dos métodos de identificação primários a serem utilizados
(HARTMAN, 2011). Em casos envolvendo cadáveres extremamente degradados, em
avançado estado de putrefação ou mesmo fragmentados, a análise genética mostra-se
particularmente útil (ZIĘTKIEWICZ et al, 2012).
Diversos tipos de amostras biológicas podem servir como fonte de DNA para
análises genéticas, tais como tecidos moles, ossos, dentes, cabelos, saliva, urina, entre
outros fluidos (PRINZ, 2007). Todavia, fatores como estado de conservação do cadáver,
condições ambientais e outros relativos à natureza do evento podem prejudicar
rigorosamente a qualidade do material genético obtido. Tentando contornar estes
problemas, a Sociedade Internacional de Genética Forense (ISFG – International
Society for Forensic Genetics) e a INTERPOL (2009) recomendam que diversas
amostras biológicas distintas sejam coletadas do cadáver assim que possível, seguindo
todos os cuidados necessários na sua identificação e conservação, inclusive ambas as
organizações sugerem a coleta de swabs da mucosa interna da bexiga urinária em
cadáveres carbonizados (Tabela I).
A explicação para o uso da mucosa interna da bexiga urinária é a semelhança
desta com a mucosa oral que é frequentemente usada em casos forenses como amostras
de referência. Por estar protegida internamente, a localização da bexiga urinária reduz a
possibilidade do DNA se degradar facilmente, resolvendo os problemas relacionados a
fatores como estado de conservação do cadáver, condições ambientais e outros relativos
à natureza do evento ocorrido.
Apesar de a recomendação existir desde 2007, este tipo de amostra não é
frequentemente coletado na rotina forense. Apenas um relato de caso está descrito na
literatura, no qual o uso de uma amostra da mucosa interna da bexiga urinária auxiliou
na identificação genética de uma vítima carbonizada (SEO, 2012).
 8

Figura 2: Tipos de desastres. A) Evento aberto: desastre na região serrana do

Rio de Janeiro, em janeiro de 2011 (Fonte: IG); B) Evento fechado: destroços
do avião da banda Mamonas Assassinas que bateu na Serra da Cantareira em
março de 1996 (Fonte: IG); C) Evento misto: acidente com avião da TAM que
caiu em casas no Estado de São Paulo em outubro de 1996 (Fonte: UOL).
 9

Tabela I: Tabela de coleta de amostras post mortem para os diferentes tipos de cadáveres (INTERPOL,
2009).

Condição do corpo Amostras recomendadas

Cadáveres completos sem sinal evidente Sangue (Swab ou papel FTA) e esfregaços
de decomposição bucais
Cadáveres multilados sem sinal evidente Se disponível: sangue e tecido muscular
de decomposição vermelho (~1,0 g)
Cadáveres completos em decomposição Amostras de ossos longos ou curtos;
ou restos multilados ou
Dentes saudáveis (de preferência
molares);
ou
Qualquer outro osso disponível (~ 10 g, se
possível, de preferência osso cortical com
tecido denso);
Cadáveres severamente queimados Todos os exemplos listados acima e
dentes impactados ou raízes dos dentes se
presente
ou
Esfregaços da bexiga.

Considerando os motivos acima descritos, a padronização do uso de swabs de

mucosa interna da bexiga urinária pode contribuir para a melhora da rotina forense,
especialmente em casos de identificação de cadáveres por exames de DNA cuja
obtenção de amostras biológicas é prejudicada em razão de seu mau estado de
conservação.
 10

1.5. OBJETIVOS

1.5.1. OBJETIVO GERAL

Padronizar o uso de swabs de mucosa interna da bexiga urinária como fonte de

DNA em casos de identificação de cadáveres humanos por técnicas de Genética
Forense;

1.5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Averiguar a viabilidade do uso de swabs de mucosa interna da bexiga urinária

como fonte de DNA em casos de identificação de cadáveres humanos sem sinais
evidentes de putrefação.
Fornecer um padrão para a técnica de utilização deste material no âmbito do
Instituto de Pesquisa e Perícias em Genética Forense (IPPGF) da Polícia Civil do Estado
do Rio de Janeiro (PCERJ).
 11

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. COLETA DAS AMOSTRAS

As amostras biológicas utilizadas neste estudo foram coletadas durante

necropsias realizadas no Instituto Médico Legal Afrânio Peixoto (IMLAP) durante o
mês de setembro de 2013, sendo a referida coleta feita sob a supervisão do Perito
Legista responsável pela necropsia e a de um Perito do Instituto de Pesquisa e Perícias
em Genética Forense (IPPGF).
Foram coletadas amostras de 11 (onze) cadáveres com idade, sexo e causa
mortis diferentes. Todos os cadáveres foram considerados frescos, ou seja, o tempo
máximo decorrido entre o óbito e a realização da necropsia foi de aproximadamente 24
horas e nenhum apresentava sinais evidentes de putrefação. Todas as amostras foram
identificadas com o número da Guia de Remoção de Cadáver (GRC), sexo, e a data da
coleta.
Para cada cadáver foram coletados 4 (quatro) swabs de mucosa interna da bexiga
urinária (Figura 3), os quais foram acondicionados secos dentro de microtubos de forma
individualizada e conservados em freezer (-20°C) até o momento de sua utilização. Para
amostra de referência, foi coletado um segmento ósseo e/ou um fragmento de músculo
de cada cadáver. Estas amostras foram acondicionadas em embalagens plásticas em
freezer (-20°C) até o momento de sua utilização.

Figura 3: esfregaço da mucosa interna da bexiga urinária

(Fonte: acervo pessoal).
 12

2.2. EXTRAÇÃO DO DNA

2.2.1. AMOSTRAS DE OSSO

As amostras de ossos foram extraídas pelo método orgânico, também referida

como extração por Fenol:Clorofórmio, conforme descrito por Butler (2009). Os
segmentos ósseos foram limpos e cortados em segmentos de aproximadamente, 1 cm³
com o auxílio de uma microrretifica e pulverizados no 6750 Freezer/Mill (Spex
Certiprep, Metuchen, EUA). Cerca de 1,5g a 2g de pó de osso foram incubados com 3
ml de Tampão de Incubação (Tris-HCl 10mM – NaCl 100mM – EDTA 10mM – SDS
2%, pH 8,0), 35 l de Proteinase K (20mg/ml) e 40 l de DTT (1 mol/l) overnight em
banho-maria a 56°C. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 7.000 rpm
por 5 minutos e o sobrenadante transferido para um microtubo de 2 ml, onde foi
adicionado igual volume de Fenol:Clorofórmio: Álcool Isoamílico (25:24:1). A
separação das fases orgânica e aquosa foi realizada por centrifugação a 10.000 rpm por
5 minutos. A fase aquosa foi transferida para um novo microtubo, a qual foram
adicionados 10% do volume obtido de NaCl (5mol/L) e 2x o volume obtido de etanol
absoluto, seguida de uma incubação por 2 horas a -20°C para a precipitação do DNA.
Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 15 minutos a 4°C e o
sobrenadante descartado. 1 ml de etanol 70% gelado foi adicionado ao pellet, seguido
de uma segunda centrifugação a 10.000 rpm por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi
descartado e as amostras foram centrifugadas no concentrador Eppendorf Concentrator
5301™ (Hamburg, Alemanha) a 45°C por tempo variável para evaporação do etanol. O
DNA obtido foi ressuspenso em 30 l de Tampão TE-4 (Tris-HCl 10mM,– EDTA
0,1mM, pH 8,0) e mantido a -20°C até o momento de uso.

2.2.2. AMOSTRAS DE MÚSCULO

As amostras de músculos foram extraídas pelo método orgânico, também

referida como extração por Fenol:Clorofórmio, conforme descrito por Butler (2009). As
amostras de músculo (cerca de 200 mg) foram incubadas com 300 µl de Tampão de
extração (Tris-HCl 10mM – NaCl 100mM – EDTA 10mM – SDS 1%, pH 8,0) e 24 µl
de Proteinase K (20mg/ml), homogeneizadas e incubadas em banho-maria a 56°C por 2
 13

horas. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 5 minutos e
o sobrenadante transferido para outro microtubo de 1,5 ml, onde foi acrescentado igual
volume de Fenol:Clorofórmio: Álcool Isoamílico (25:24:1). A separação das fases
orgânica e aquosa foi realizada por centrifugação a 10.000 rpm por 5 minutos. A fase
aquosa foi transferida para um novo microtubo, a qual foram adicionados 10% do
volume obtido de NaCl (5mol/L) e 2x o volume obtido de etanol absoluto, seguida de
uma incubação por 2 horas a -20°C para a precipitação do DNA. Em seguida, as
amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 15 minutos a 4°C e o sobrenadante
descartado. 1 ml de etanol 70% gelado foi adicionado ao pellet, seguido de uma segunda
centrifugação a 10.000 rpm por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e as
amostras foram centrifugadas no concentrador Eppendorf Concentrator 5301™
(Hamburg, Alemanha) a 45°C por tempo variável para evaporação do etanol. O DNA
obtido foi ressuspenso em 50 l de Tampão TE-4 (Tris-HCl 10mM,– EDTA 0,1mM, pH
8,0) e mantido a -20°C até o momento de uso.

2.2.3. AMOSTRAS DE SWABS DA MUCOSA INTERNA DA BEXIGA

URINÁRIA

As amostras de swabs da mucosa interna da bexiga urinária foram extraídas pelo

método orgânico, também referida como extração por Fenol:Clorofórmio, e pela
metodologia com a resina quelante Chelex 100® (Bio-Rad Laboratories, Califórnia,
EUA), ambas as metodologias foram empregadas conforme descrito por Butler (2009).

2.2.3.1. EXTRAÇÃO ORGÂNICA

Os swabs foram incubados em 500 µl de Tampão de extração (Tris-HCl 10mM

– NaCl 100mM – EDTA 10mM – SDS 1%, pH 8,0), 24 µl de Proteinase K (20 mg/ml)
e 48 µl de DTT (1 mol/l) em banho-maria a 56°C por 2 horas. Após a incubação, os
swabs foram centrifugados a 10.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante transferido
para outro microtubo, onde foi acrescentado igual volume de Fenol:Clorofórmio: Álcool
Isoamílico (25:24:1). A separação das fases orgânica e aquosa foi realizada por
centrifugação a 10.000 rpm por 5 minutos na qual a fase aquosa foi transferida para um
novo microtubo e foram adicionados 10% do volume obtido de NaCl (5mol/L) e 2x o
 14

volume obtido de etanol absoluto, seguida de uma incubação por 2 horas a -20°C para a
precipitação do DNA. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por
15 minutos a 4°C e o sobrenadante descartado. 1 ml de etanol 70% gelado foi
adicionado ao pellet, seguido de uma segunda centrifugação a 10.000 rpm por 15
minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e as amostras foram centrifugadas no
concentrador Eppendorf Concentrator 5301™ (Hamburg, Alemanha) a 45°C por tempo
variável para evaporação do etanol. O DNA obtido foi ressuspenso em 30 l de Tampão
TE-4 (Tris-HCl 10mM,– EDTA 0,1mM, pH 8,0) e mantido a -20°C até o momento de
uso.

2.2.3.2. EXTRAÇÃO COM RESINA QUELANTE CHELEX 100®

A extração do DNA por resina Chelex 100® (Bio-Rad Laboratories, Califórnia,

EUA) foi realizada conforme descrito por Butler (2009). A suspensão da resina foi
preparada a 5% (p/v) na véspera de sua utilização. Os swabs foram hidratados em 1 ml
de tampão PBS (NaCl 137mM; KCl 2,7mM; Na 2HPO4 10mM; KH2PO4 1,8mM; pH
7,2), agitados em vórtex e, em seguida, o líquido foi centrifugado a 10000 rpm por 7
minutos. Cerca de 700 ml do sobrenadante foi descartado e o restante incubado com 100
µl de suspensão de resina Chelex a 56°C por 30 minutos, seguido de uma segunda
incubação em água fervente (100°C) por 8 minutos. Após a incubação em água
fervente, as amostras foram resfriadas a temperatura ambiente e posteriormente
conservadas a -20°C até o momento de sua utilização.

2.3. QUANTIFICAÇÃO DO DNA

A quantificação de DNA foi realizada pelo kit Genomic de Quantificação de

DNA humano (São Paulo, SP) o qual se baseia na utilização de PCR em tempo real para
amplificar de forma específica sequências presentes nos cromossomos autossômicos. O
kit também apresenta um controle interno (IPC), constituído por uma sequência de
DNA sintético, com o objetivo principal de analisar a presença de possíveis inibidores
da reação presentes nas amostras extraídas.
A quantificação foi realizada em duplicata no aparelho ABI Prism® 7500 Real-
time PCR System (Applied Biosystems, Califórnia, EUA), com a utilização do software
 15

7500 software v2.0 para interpretação dos resultados, conforme as indicações do

fabricante especificadas no manual de utilização.

2.4. AMPLIFICAÇÃO DO DNA

Após a quantificação do DNA, as amostras de ossos, músculos e SORG (Swabs

extraídos com o emprego da metodologia orgânica) foram diluídas visando atingir uma
concentração final de 1ng/µl de DNA para posterior amplificação por técnica de PCR
(Polimerase Chain Reaction), enquanto que para as amostras de SC (Swabs extraídos
com a metodologia chelex) não foram realizadas diluições.
As amostras de DNA diluídas de ossos, músculos e SORG, assim como os SC,
foram submetidas à amplificação pelo método da PCR (Polimerase Chain Reaction)
com emprego do sistema de identificação humana AmpFLSTR® Identifiler® Plus, (Life
Technologies™, Califórnia, EUA), visando à amplificação de 15 locais genéticos STR-
autossômicos, mais o marcador de gênero amelogenina (Tabela II), sendo alguns desses
loci utilizados pelo FBI em seu banco de dados (CODIS). A reação foi realizada de
acordo com as especificações do manual do kit.

2.5. ANÁLISE DOS RESULTADOS

Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese capilar no

sequenciador 3130® Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Califórnia, EUA) e
gerenciada utilizando o software Data Collection 3130-Series versão v3.1 (Applied
Biosystems, Califórnia, EUA). Para a análise das amostras, 1 µl do produto de PCR foi
diluído em 8,7 µl de formamida HiDi, acrescido de 0,3 µl de padrão interno GeneScan-
500 LIZ Size Standard (Applied Biosystems, Califórnia, EUA) em placas de 96
orifícios. As amostras foram desnaturadas a 95°C por 3 minutos e, em seguida,
mantidas a 4°C por igual período antes do início da eletroforese capilar.
Após a eletroforese, os dados obtidos foram analisados utilizando o software
GeneMapper ID versão v4.1, (Applied Biosystems, Califórnia, EUA). A figura 4
exemplifica um eletroferograma, mostrando os 15 loci STR, assim como o marcador de
gênero Amelogenina utilizados em casos forenses.
 16

Tabela II: Localização cromossômica dos loci analisados, suas

respectivas sequências e seus marcadores fluorescentes (Fonte:
AmpFlSTR® Identifiler® Plus User Guide, Life Technologies™)

Localização Sequência Marcador

Locus
cromossômica repetitiva Fluorescente
[TCTA]
D8S1179 8
[TCTG]
[TCTA] 6-FAM™
D21S11 21q11.2-q21
[TCTG] (Azul)
D7S820 7q11.21-22 GATA
CSF1PO 5q33.3-34 TAGA
[TCTG]
D3S1358 3p
[TCTA]
TH01 11p15.5 TCAT
VIC®
D13S317 13q22.31 TATC
(Verde)
D16S539 16q24-qter GATA
[TGCC]
D2S1338 2q35-37.1
[TTCC]
D19S433 19q12-13.1 AAGG
[TCTG]
vWA 12p12-pter
[TCTA] NED™
(Amarelo)
TPOX 2p23-2per GAAT
D18S51 18q21.3 AGAA
X: p22.1-22.3
Amelogenina
Y: p11.2 PET®
D5S818 5q21-31 AGAT (Vermelho)
FGA 4q28 CTTT

Figura 4: Eletroferograma obtido com a utilização do kit AmpFLSTR® Identifiler® Plus, demostrando
os 15 loci STRs analisados e o marcador de gênero Amelogenina (Fonte: Acervo pessoal).
 17

Para a análise estatística, foi realizado o teste ANOVA com o auxílio do

programa estatístico Statistica v7.0, considerando estatisticamente diferentes os
resultados que apresentaram probabilidade de ocorrência da hipótese de nulidade menor
que 5% (p<0,05), seguido de comparações múltiplas utilizando o teste de Tukey.
 18

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. AMOSTRAS COLETADAS

As amostras utilizadas neste estudo foram coletadas de 11 (onze) cadáveres

frescos (sem sinal evidente de putrefação) durante as necropsias realizadas no IMLAP,
sendo amostras de swabs da bexiga urinária; músculos e osso quando possível. Os
cadáveres foram escolhidos conforme a demanda do IMLAP e apresentavam idade entre
16-73 anos, de ambos os sexos e a causa mortis variada. (Tabela III).
Em casos de morte violenta ou suspeita, a necropsia é obrigatória, sendo o
músculo a amostra preferencialmente coletada, assim como podem ser colhidas
amostras de osso se o músculo não é adequado, como por exemplo em casos avançados
de decomposição. Por este motivo foi utilizado amostras de músculos e ossos neste
estudo como amostra de referência, pois são utilizados rotineiramente.

Tabela III: Descrição de gênero, idade e causa mortis dos cadáveres necropsiados.

Amostra Gênero Idade Causa mortis

F1 M 60 Atropelamento
F2 F 73 Fibrose miocárdica e edema pulmonar
F3 M 18 Cardiopatia hipertrófica e edema pulmonar
F4 F 18 Edema pulmonar e congestão cerebral
F5 F 46 Pneumonia
F6 M 65 Edema pulmonar
F7 M 59 Edema pulmonar e cardiopatia dilatada
F8 F 50 Politraumatismo (cabeça e pescoço)
Múltiplas perfurações por projétil de arma de
F9 M 20
fogo
F10 F 16 Indeterminada
Hemorragia causada por perfuração por
F11 M 25 projétil de arma de fogo da artéria femoral
direita
 19

Os swabs da mucosa interna da bexiga urinária, possuem certas vantagens

comparados aos materiais de rotina, tais como ossos e músculos. A principal vantagem
é a facilidade e a rapidez na coleta do material, pois não é preciso serrar o osso ou cortar
um pedaço do músculo do cadáver para a coleta do material, é feito somente um corte
na bexiga urinária e realizado o esfregaço na parte interna. Outra vantagem dos swabs
da bexiga é o transporte desses materiais e o armazenamento, pois são pequenos e não
ocupam muito espaço.

3.2. EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA

Os protocolos de extração das amostras utilizados para este estudo foram o

método orgânico ou Fenol:Clorofórmio para amostras de ossos, músculos e swabs, e o
método Chelex somente para os swabs (BUTLER, 2009).
Com o objetivo de verificar as concentrações de DNA obtidas a partir dos
diversos métodos de extração utilizados, foram estudadas 11 amostras de swabs de
mucosa interna da bexiga urinária e suas respectivas amostras de referência, músculos e
ossos (quando possíveis). A extração ocorreu com sucesso em todas as amostras, como
demonstrado através da quantificação das mesmas na tabela IV. Todas as amostras,
exceto quatro amostras de SC, apresentaram quantidades suficientes de DNA para
análise (mais de 1 ng/ul). A concentração de DNA das amostras de ossos variou entre
432,53–8607,24 ng/ul, das amostras de músculo entre 147,83–1005,07 ng/ul, das
amostras de SORG entre 113,40–5331,62 ng/ul enquanto nas amostras de SC variou
entre 0,33–10,46 ng/ul (Figura 5).
Levando-se em consideração a análise estatística das diferentes fontes de DNA
(osso, músculo e swab da bexiga urinária), aplicando-se o teste ANOVA e o teste de
Tukey (anexos), verificou-se que à exceção dos ossos (p<0,05), as demais fontes de
DNA (músculo e swab da bexiga urinária) não apresentaram diferenças significativas
entre si.
A presença de possíveis inibidores que poderiam interferir na amplificação das
amostras foi determinada utilizando os valores do IPC, na qual espera-se um Ct de
aproximadamente 27 em condições padrão. Esses valores podem variar no valor de 1,5
acima ou abaixo estando ainda no padrão de normalidade. Valores do IPC acima do
esperado, indica a presença de inibidores na amostra. As amplificações do IPC de cada
 20

amostra apresentaram valores aceitáveis, sugerindo que não há presença de inibidores

na reação (tabela V).
Em relação à extração do material genético, os swabs de mucosa interna da
bexiga urinária dispõem de outra vantagem quando comparados aos materiais de rotina:
a rapidez na extração do material genético, pois os mesmos não precisam passar por
uma pulverização e uma fase de lise mais brusca, overnight, no caso de ossos, e a fácil
manipulação do material em comparação aos músculos.
A metodologia de extração por Chelex também apresentou certas vantagens,
como a não utilização de solventes orgânicos tóxicos e a redução no tempo e trabalho na
extração, corroborando o estudo feito por Jung (1991, apud Sweet et al. 1996), sobre
vantagens da extração pela resina chelex em relação à técnica de Fenol-Clorofórmio.
Os SORGs apresentaram um alto rendimento em relação ao mínimo aceitável
para a amplificação do DNA, enquanto os SCs mesmo não tendo um alto rendimento
ainda possibilitaram obter quantidades significativas de DNA para amplificação.
Segundo Wiegand et al (1993), a extração por chelex é menos eficaz do que a extração
orgânica (observável na tabela IV), mas sua rapidez mais do que compensa essa
desvantagem.

Tabela IV: Dados da quantificação de DNA das amostras

de ossos, músculos e swabs da mucosa interna da bexiga
urinária com o emprego do kit Genomic de Quantificação
de DNA humano.

Concentração do DNA (ng/ul)

Amostra
Swabs Swabs
Ossos Músculos
Orgânicos Chelex
F1 4674.08 0.95 966.33 578.46
F2 3142.30 4.80 5764.96 402.80
F3 264.71 0.34 6344.03 615.65
F4 153.95 1.24 6800.51 391.82
F5 113.41 0.89 7975.32 1005.07
F6 941.96 10.03 3456.46 331.13
F7 334.07 3.18 * 672.38
F8 5331.62 2.13 8607.24 544.89
F9 346.82 1.28 3821.08 295.27
F10 3307.08 10.46 432.53 228.70
F11 627.45 0.42 4371.88 121.28
* Não foi possível obter amostra de osso do cadáver F7.
 21

Figura 5: Variação na concentração de DNA dos diferentes tipos de amostras.

Tabela V: Valores do IPC, usado para verificar a presença de possíveis

inibidores na reação.

Média Ct IPC
Amostra
Swab Orgânico Swab Chelex Osso Músculo
F1 30.90 ± 0.13 27.22 ± 0.01 28.96 ± 2.17 28.01 ± 0.60
F2 27.84 ± 0.16 27.06 ± 0.11 28.29 ± 0.53 26.47 ± 0.66
F3 28.62 ± 0.25 27.18 ± 0.05 31.84 ± 0.16 28.87 ± 0.21
F4 27.57 ± 0.01 27.25 ± 0.08 28.78 ± 0.12 27.59 ± 0.02
F5 27.55 ± 0.18 27.15 ± 0.15 29.29 ± 0.39 27.75 ± 0.05
F6 29.22 ± 0.07 27.25 ± 0.00 36.41 ± 0.79 28.70 ± 0.66
F7 28.50 ± 0.15 27.13 ± 0.02 * 29.31 ± 0.15
F8 27.79 ± 0.13 27.21 ± 0.07 28.95 ± 0.26 27.77 ± 0.04
F9 28.33 ± 0.08 27.16 ± 0.06 35.86 ± 1.36 28.85 ± 0.56
F10 27.43 ± 0.04 27.17 ± 0.09 27.60 ± 0.08 27.69 ± 0.25
F11 28.71 ± 0.29 27.11 ± 0.07 36.64 ± 0.41 28.04 ± 0.40
* Não foi possível obter amostra de osso do cadáver F7.
 22

As possíveis explicações para a grande variação entre as quantidades de DNA

entre as amostras do mesmo grupo pode ter ocorrido por quantidades diferentes de
material no início da extração; no caso dos ossos, a variação pode ter ocorrido pelo fato
de ter sido coletado ossos de diferentes regiões, por ordens do médico legista
responsável devido normas do IMLAP; ou a quantidade de material genético coletado
pode não ter sido a mesma entre os cadáveres.

3.3. AMPLIFICAÇÃO DO DNA

Depois de realizadas as quantificações, as amostras foram submetidas à

amplificação pelo método de PCR com a utilização do Kit AmpFLSTR® Identifiler®
Plus. Os resultados obtidos na amplificação das amostras confirmam a viabilidade do
protocolo de extração utilizado para os swabs da mucosa interna da bexiga urinária,
visto que foi possível obter eletroferogramas de boa qualidade em 90,9% do total de
amostras. Segundo Solléro et al. (2004), a qualidade das amostras de DNA é
caracterizada pela sua capacidade de ser utilizado para amplificação de genes que
poderão ser submetidos à técnica de sequenciamento. À vista disso, as metodologias
empregadas para os swabs da mucosa interna da bexiga urinária, demonstraram ser úteis
por serem bastante sensíveis, reprodutíveis e não apresentam evidências de
contaminação, podendo assegurar excelente material capaz de ser aplicado a
amplificações de uso forense.

3.4. OBTENÇÃO DOS PERFIS GENÉTICOS

Para uma melhor representatividade dos resultados, os perfis genéticos

provenientes das amostras foram classificados em três tipos: Perfil completo, quando
apresentam picos nos 16 loci STR (Figura 6). Perfil parcial, quando apresentam picos
entre 10 a 15 loci STR (Figura 7). E perfil insuficiente para análise, quando apresentam
picos em até 9 loci STR (Figura 8).
Todas as amostras de ossos, músculos e swabs submetidas à extração orgânica
apresentaram perfis completos. Os swabs extraídos pelo método chelex apresentaram 07
amostras com perfis completos, duas amostras com perfis parciais (F1 e F11) e duas
amostras com perfis insuficientes para análise (F3 e F5).
 23

Todos os perfis genéticos dos swabs de mucosa interna da bexiga urinária

estavam de acordo com suas respectivas amostras de referência (Figura 9), tanto os
extraídos pela metodologia orgânica quanto os extraídos pelo método chelex. Os perfis
parciais obtidos também estavam de acordo com suas amostras de referência (dados não
mostrados).
O perfil genético obtido a partir do swab da bexiga, em geral, foi de qualidade
similar, ou melhor, quando comparado com a amostra de referência (Figura 9). Dentre
as amostras que apresentaram perfis parciais ou insuficiente para análise (método de
extração Chelex), este resultado se deve, provavelmente, a quantidade insuficiente de
DNA proposto pelo kit de amplificação (menor que 1 ng/ul), e os valores do IPC
sugerem que as amostras não apresentaram inibidores de PCR. Nestes casos,
considerando o baixo rendimento da extração por Chelex, é plausível melhorar a
qualidade do material fazendo um ajuste na concentração de DNA na etapa de
amplificação, ou como sugerido por Shibata et al (1994), aumentar os ciclos de
amplificação em cinco ciclos, de forma a garantir a amplificação de DNA, caso este
estiver presente e com qualidade para ser amplificado.

Figura 6: Perfil completo, apresentando picos nos 16 loci STR (Fonte: acervo pessoal).
 24

Figura 7: Perfil parcial, apresentando picos em 10 loci STR (Fonte: acervo pessoal).

Figura 8: Perfil insuficiente para análise, não apresentando picos nos loci STR (Fonte: acervo pessoal).
 25

Figura 9: Eletroferogramas com perfil completo das amostras de osso, músculo, SORG e SC do mesmo
indivíduo demostrando a concordância entre eles (Fonte: acervo pessoal).
 26

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo confirmou a viabilidade do uso dos swabs de mucosa interna

da bexiga urinária como fonte de DNA para a identificação humana de cadáveres
frescos, possibilitando a obtenção de perfis genéticos de boa qualidade para utilização
no laboratório. Em comparação com os materiais de rotina, tais como ossos e músculos,
os swabs da bexiga provaram ser uma forma eficiente e de baixo custo para a
identificação humana.
Entre as metodologias empregadas, o método orgânico se mostrou o mais
eficiente para a obtenção de perfis genéticos, pois teve êxito em todas as amostras,
enquanto o método chelex, embora tenha mostrado menos eficiência, não deve ser
desconsiderado, pois obteve perfis genéticos completos e parciais (acima de 10 loci) em
nove de onze amostras (81,8%). Por mais que os resultados obtidos com a extração pelo
método chelex tenham sido bem promissores, muito pouco é feito utilizando este
método de extração em amostras de mucosa interna de bexiga. Sendo assim, os
resultados obtidos neste trabalho podem ser utilizados como referências para futuros
estudos.
A utilização destas metodologias é possível e viável em laboratórios de análises
forenses, e a opção por uma delas fica a critério do laboratório, no que tange a fatores
como custo e adaptação à técnica.
Os resultados desse estudo contribuem com a melhoria da qualidade e
confiabilidade deste material quando outras amostras se encontram com dificuldades de
coleta, assim como economia de tempo e gastos. As amostras utilizadas nesse estudo
provaram ser altamente informativas e uma ferramenta importante na identificação
humana, porém, estudos adicionais são necessários para verificar a viabilidade desse
tipo de material em diferentes tipos de cadáveres, tais como carbonizados e em estado
de decomposição.
Em suma, nossos achados nos permitem concluir que, esse tipo de material
poderá atender aos interesses do Instituto de Pesquisa e Perícias em Genética Forense
(IPPGF - DGPTC/PECERJ) no desenvolvimento e no avanço na linha de investigação
da Genética Forense.
 27

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ANEXOS
 33

Anexo 1: Teste ANOVA realizado para comparar a variância entre os grupos.

ANOVA SQ gl MQ F p-valor
Entre colunas 147776035 3 49258678 17,75 p<0,0001
Nas colunas 108251839 39 2775688
Total 256027874 42

Anexo 2: Teste de Tukey realizado para comprar par a par os grupos de amostras estudados.

Teste Tukey;
Diferenças marcadas são significativas em p<0,05
{1} {2} {3} {4}
M=4854,10 M=471,59 M=1748,90 M=3,24
Osso {1} 0,000166 0,000810 0,000165
Músculo {2} 0,000166 0,289765 0,911712
Swab ORG {3} 0,000810 0,289765 0,083097
Swab Chelex {4} 0,000165 0,911712 0,083097