Abstracto

La enfermedad diarreica contribuye a la desnutrición, el retraso del crecimiento, el deterioro del

desarrollo cognitivo y las altas tasas de morbilidad en los niños de todo el mundo. Escherichia
coli enterotoxigénica (ETEC) es uno de los principales contribuyentes a esta carga de enfermedad
diarreica. La ETEC causa enfermedad en el intestino delgado por medio de factores de colonización
y por la producción de una enterotoxina (LT) termolábil y / o una pequeña enterotoxina
termoestable (ST) no inmunogénica. En general, la mayoría de ETEC produce ST y LT. La LT induce
la secreción a través de una subunidad A enzimáticamente activa (LT-A) y una subunidad B
pentámera de unión celular (LT-B). La importancia de los anticuerpos anti-LT ha sido demostrada
en múltiples estudios clínicos y epidemiológicos, y varios candidatos potenciales a la vacuna ETEC
han incluido LT-B como un importante inmunógeno. Sin embargo, hay información limitada sobre
la posible contribución de LT-A al desarrollo de la inmunidad protectora. En el estudio actual,
evaluamos la respuesta inmune contra la subunidad A de la LT así como el potencial de la
subunidad A como antígeno protector cuando se administra solo o en combinación con la
subunidad B de la LT. Evaluamos los sueros humanos de individuos desafiados con una cepa de
ETEC prototípica de tipo silvestre, así como los sueros de individuos que viven en un área
endémica de ETEC para la presencia de anticuerpos anti-LT, anti-LT-A y anti-LT-B. En ambos casos,
un número significativo de individuos infectados de forma intencionada o endémica con ETEC
desarrollaron anticuerpos contra ambas subunidades LT. Además, los animales inmunizados con
las proteínas recombinantes desarrollaron respuestas robustas de anticuerpos que fueron capaces
de neutralizar los efectos citotóxicos y enterotóxicos de la LT nativa al bloquear la unión y entrada
a las células (anti-LT-B) o la actividad enzimática intracelular de la toxina (anti -LT-A). Además, los
anticuerpos contra ambas subunidades LT actuaron de forma sinérgica para neutralizar la
holotoxina cuando se combinaron. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la inclusión tanto de
LT-A como de LT-B en vacunas prospectivas contra ETEC

Introducción
Enterotoxigenic E. coli (ETEC) son una causa importante de enfermedad diarreica y
muerte, especialmente en niños en países en desarrollo. En 2010, la mortalidad anual por
enfermedad debida a ETEC enterotoxigénica se estimó en 157,000 muertes (9 por ciento de
todas las muertes atribuidas a diarrea) y aproximadamente 1 por ciento de todas las muertes
en niños de 28 días a 5 años [ 1 , 2 ]. Dentro de las poblaciones susceptibles, ETEC
promueve un ciclo de enfermedad diarreica grave, disfunción de barrera intestinal y
malnutrición, que impide el crecimiento saludable, la función cognitiva y la supervivencia a
largo plazo [ 3 , 4 ]. ETEC también es bien reconocido como una causa de enfermedad
diarreica en adultos sanos mientras viajan a áreas endémicas de ETEC [ 5 ] o por la
ingestión de alimentos contaminados [ 6 , 7], con un reconocimiento creciente de que estas
infecciones pueden conducir a disbiosis intestinal crónica y síndrome de intestino irritable
post-infeccioso [ 8 - 10 ].
La ETEC causa enfermedad en el intestino delgado por medio de factores de colonización
(CF) y por la producción de una enterotoxina lábil al calor (LT) y / o una pequeña
enterotoxina no inmunogénica termoestable (ST). En general, la mayoría de ETEC
producen ST y LT [ 5 , 11 - 14 ]. La LT induce la secreción a través de una subunidad A
enzimáticamente activa (LT-A) y una subunidad B pentámera de unión celular (LT-B)
[ 15 ]. La subunidad A está compuesta de dos componentes, A1 y A2. El componente A1
(21 kD), la porción enzimáticamente activa de la toxina, está unida de forma no covalente
al pentámero B a través del péptido A2 (7 kD) [ 16 - 18 ]. La expresión de LT también
facilita la adherencia bacteriana a las células epiteliales y la colonización intestinal
[ 19 , 20 ]. En áreas donde ETEC es endémico, el riesgo de episodios diarreicos recurrentes
disminuye después de los cinco años de edad, concurrente con el desarrollo de anticuerpos
anti-LT [ 11 , 21 , 22 ]. La importancia de los anticuerpos anti-LT en la protección contra la
enfermedad diarreica ETEC se ha demostrado con varios estudios de desafío ETEC en
adultos humanos y en un estudio de campo que monitorea a los lactantes que reciben de
forma natural leche materna que contiene IgA anti-LT [ 23 , 24 ]. Estos informes han
sugerido fuertemente que una respuesta anti-LT proporciona una inmunidad significativa
contra la secreción mediada por LT y posiblemente la colonización por ETEC; por lo tanto,
un antígeno relacionado con LT debe ser un componente importante de una vacuna de
ETEC efectiva.
La subunidad B de LT a menudo se presume que es el componente inmunodominante de la
toxina y las vacunas potenciales contra ETEC frecuentemente incluyen LT-B como uno de
los antígenos de la vacuna.La evidencia de inmunodominancia de la subunidad B en LT y
la enterotoxina del cólera estrechamente relacionada proviene de análisis de anticuerpos de
sueros de pacientes o estudios en animales con TC que encontraron una mayor capacidad
neutralizante de anticuerpos de la subunidad B que los anticuerpos anti-subunidad A
[ 25 - 29 ] Estos hallazgos llevaron a la creencia de larga data de que la subunidad B es el
principal antígeno protector contra la LT [ 24 , 30 - 32 ].
La subunidad A de LT, aunque crítica para la enterotoxicidad, no se ha evaluado
exhaustivamente para inmunogenicidad y a menudo se pasa por alto como un potencial
antígeno protector contra ETEC, aunque ha habido algunos intentos de desintoxicar
genéticamente la subunidad A para su uso como toxoide [ 33 ].Sin embargo, LT-A es
claramente antigénico y una serie de informes describen la producción de anticuerpos
monoclonales anti-A a partir de aislados clínicos de ETEC [ 34 - 36 ]. Además, un estudio
de 1984 sobre pacientes que se recuperaban del cólera o infección ETEC encontró
predominantemente anticuerpos séricos anti-B en pacientes con cólera pero anticuerpos
séricos anti-A y anti-B equivalentes en pacientes ETEC (aunque ambos análisis se
realizaron mediante ELISA usando subunidades CT) [ 37 ]. Por lo tanto, no se conoce bien
la importancia relativa de la subunidad A de LT como antígeno protector contra ETEC. El
propósito de este estudio fue evaluar la respuesta inmune contra la subunidad A de LT así
como su potencial como antígeno protector cuando se administra solo o en combinación
con la subunidad B de LT. Logramos este objetivo a través de un enfoque combinatorio,
evaluando las respuestas séricas humanas, los modelos de vacunación animal y los estudios
de neutralización de toxinas.
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Materiales y métodos

Purificación de toxinas y subunidades

LT, LT-B, el mutante LT no tóxico LT (R192G / L211A), o dmLT, se produjeron a partir
de clones recombinantes que expresan LT, LT-B o dmLT basados en LT a partir del
aislado E de ETEC humana. coliH10407 como se describió anteriormente
[ 16 , 17 , 38 ]. Brevemente, los organismos se cultivaron durante la noche en 10 litros de
medio de extracto de levadura Casamino Acids, las células se lisaron, el lisado se clarificó
por centrifugación y las proteínas relacionadas con LT se purificaron por cromatografía de
afinidad con galactosa. Las proteínas se almacenaron liofilizadas y recién resuspendidas
antes de su uso.His-tagged LT-A y LT-A1 marcado con His se prepararon a partir de
cuerpos de inclusión solubilizados por HPLC con una columna de afinidad de níquel como
se describió anteriormente [ 18 ]. La composición y la pureza de cada proteína se
confirmaron mediante SDS-PAGE y ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (Lonza,
Inc.). El contenido de endotoxina de los productos finales fue <1 UE / mg.

Muestras de suero humano

El suero humano se reunió 10 días después de que el desafío de ETEC fuera proporcionado
por David A. Sack (Johns Hopkins University). Los sueros de pacientes humanos
irradiados de Sierra Leona fueron proporcionados por Robert F. Garry (Universidad de
Tulane). Las muestras de Sierra Leona se obtuvieron de pacientes con sospecha de virus
Lassa febril o controles afebriles entre diciembre de 2009 y abril de 2010 [ 39 ]. Las
muestras desidentificadas se irradiaron y almacenaron a -20 ° C. 37 muestras se incluyeron
en el análisis final de pacientes de 7-74 años. El suero humano comercialmente disponible
se adquirió como control (Sigma).

Inmunizaciones de ratón y colección de muestras

Para estos estudios, empleamos ensayos tanto in vitro (ELISA, célula CaCo-2) como in
vivo (ratón patentado) después de la inmunización por dos rutas mucosales diferentes
(intranasal, sublingual). Grupos de 5 ratones BALB / c se inmunizaron intranasalmente tres
veces a intervalos semanales con 10 μl de solución salina que contenía 5 μg LT-A, LT-A1,
LT-B, LT-A + LT-B (ambos a 5 μg) o dmLT .Alternativamente, se anestesiaron grupos de
ratones con ketamina / xilazina y se inmunizaron con una única dosis sublingual que
contenía 5 μg de LT-A, LT-A1, LT-B, LT-A + LT-B o LT en 10 μl de solución
salina. Todos los ratones fueron sacrificados 21 días después de la inmunización
primaria. El suero fue recolectado por punción cardíaca. Las muestras fecales se procesaron
en tampón de proteasa para el análisis de anticuerpos sobrenadantes como se describió
previamente [ 17 ]. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las
recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los
Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de
Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tulane (Número de Garantía A4499-01).

Detección de anticuerpos anti-LT o anti-subunidad

Anti-LT, -A, o-B suero ELISA anticuerpos se realizaron en muestras de suero individuales
con pocillos recubiertos con 0,1 μ g de antígeno y cuantificado con un ratón externo IgG o
IgA estándar, tal como se describe anteriormente [ 40 , 41 ], o analizados para título de
punto final del suero usando un valor de corte de dos veces el valor de DO del suero de
control. Se realizaron ELISA humanos usando IgG-AKP de cabra antihumano (Sigma).
Las inmunotransferencias se realizaron como se describió previamente con geles cargados
con 1 μg de LT sin hervir o hervida en todas las pistas [ 18 ]. Después de la electroforesis y
la transferencia, las transferencias se sondearon con sueros humanos diluidos 1: 1000 en
tampón de bloqueo. Las transferencias se desarrollaron usando IgG-HRP de cabra anti-
humano (Invitrogen) y sustrato de peroxidasa TrueBlue (KPL).

Neutralización de la intoxicación por cAMP en células epiteliales

Las células Caco-2 (adquiridas de ATCC) se trataron durante 3 h con 0.1 μg de LT activada
con tripsina antes de que los niveles de cAMP intracelular se evaluaran usando un kit de
ensayo cAMP (R & D Systems) [ 17 , 18 ]. Para la neutralización de cAMP inducida por
LT, las células Caco-2 se trataron con 10 μl que contenían 0,1 μg de LT tripsinizada
preincubados durante la noche a 4 ° C con 10 μg de monosialogangliósido GM1 (Sigma) o
diluciones de anti-LTA de conejo, anti-LTB, suero anti-LT o control negativo.

Neutralización de la secreción de fluido intestinal mediada por toxinas

El ensayo de ratón patente (intestino no ocluido) se realizó como se describió previamente
[ 18 ]. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche y luego se les administró por
vía intragástrica 0,5 ml de solución salina que contenía 25 μg de LT preincubados durante
30 minutos a temperatura ambiente con diluciones de sueros (cantidades correspondientes a
las utilizadas en el ensayo AMPc ajustadas a escala para la cantidad incrementada de
LT). Después de 3 h, se sacrificaron los animales y se extirpó cuidadosamente todo el
intestino desde el duodeno hasta el ano. El tejido y las carcasas se pesaron por separado y
se calcularon las proporciones individuales de masa intestino / carcasa.

Neutralización de la unión a la toxina GM1

La prevención de LT vinculante para GM1 se detectó por ELISA como se describió
anteriormente [ 18 ].Brevemente, los pocillos se recubrieron con 10 μg de GM1 antes de la
adición de 0,1 μg de LT con o sin una preincubación de 1 h con 1 μl de suero a 25 ° C. La
unión a LT se detectó usando suero de ratón anti-LT preparado en nuestro laboratorio y
IgG-AKP anti-ratón (Sigma). La absorbancia se determinó espectrofotométricamente a 405
nm.

Neutralización de la entrada de células epiteliales de toxinas y ADP-

ribosilación
Se trataron monocapas confluentes de células Caco-2 en placas de 24 pocillos durante 3 h
con 1 μg de LT con o sin preincubación con 10 μl de antisuero a 4 ° C. Las células se
lavaron inmediatamente 3 veces, se lisaron y luego se analizaron mediante análisis de
Western Blot para proteínas ribosiladas con ADP usando el macrodominio marcado con
His rAF1521 (una generosa donación de Andreas Ladurner) seguido de anticuerpos anti-
peroxidasa de rábano picante (HRP) (Qiagen) o LT Subunidad B utilizando suero anti-B de
conejo preparado en nuestro laboratorio y anti-donkey-HRP (Santa Cruz).

Análisis de los datos

El análisis estadístico se realizó usando Prism (GraphPad Software, Inc.) para ANOVA de
una vía con la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey o el análisis del
coeficiente de correlación de orden de rango de Spearman (r). A menos que se indique lo
contrario, los valores P se codificaron de la siguiente manera: * <0,05, ** <0,01, ***
<0,001.
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Resultados
En estudios anteriores, hemos clonado con éxito los genes de LT, LT-A y LT-B y proteínas
individuales purificadas libres de contaminación cruzada [ 16 - 18 , 38 ]. Para examinar
críticamente las propiedades de las subunidades A y B, realizamos una variedad de análisis,
que incluyen ELISA, Western blot, inmunoblot y ensayo de neutralización de toxinas. La
combinación de estas técnicas nos permitió examinar tanto epítopos conformacionales
como lineales y diferentes fuentes de antígenos (subunidades recombinantes o toxina LT
desnaturalizada y coagulada).

El pool de suero humano desafiado con ETEC contiene anticuerpos

contra las subunidades A y B de LT
Primero analizamos el suero inmune humano para la respuesta de anticuerpos a la
holotoxina LT o subunidades usando un conjunto de sueros de individuos desafiados 10
días antes con aislado ETECH10407 (O78: H11: K80 LT + ST + ), una cepa prototipo
de E enterotoxigénica. coli que produce diarrea de manera reproducible en estudios de
voluntarios humanos [ 42 ]. El suero humano comprado comercialmente se incluyó como
control negativo. Como se ve en la Fig. 1 , este suero ETEC-challenge dio positivo para
anticuerpos anti-LT, anti-A y anti-B por ELISA ( Fig. 1A ) en placas recubiertas con LT
nativa, LT-A o LT-B. Los resultados de ELISA indicaron que los anticuerpos tanto a la
subunidad A como a la subunidad B estaban presentes en los sueros de individuos
infectados con una cepa productora de LT. El ELISA detecta principalmente anticuerpos
contra epítopos conformacionales y el uso de la subunidad A contaminada con trazas de
holotoxina o subunidad B podría dar una impresión engañosa de la presencia de anticuerpos
de la subunidad A. Estos estudios usaron LT-A y LT-B producidos de forma recombinante
para reducir esa posibilidad. Además, utilizamos inmunoblots con preparaciones hervidas y
sin hervir de LT para distinguir entre la presencia de anticuerpos contra epítopes
conformacionales y lineales de LT en elH10407 challenge pool de suero. En geles de SDS-
PAGE sin hervir, LT se ejecuta como una proteína polimérica de 84 kD, subunidad B
pentamérica (56 kD) y LT-A (28 kD). Cuando se hierve y se somete a SDS-PAGE, LT se
separa en LT-A (28 kD) y LT-B monomérica (11,5 kD). Cuando inmunoblots con muestras
de LT sin hervir se sondearon con H10407 desafío suero ( Fig. 1B ), anticuerpos a LT,
pentamérica B (B5) y LT-A se observaron, mientras que predominantemente anticuerpos
anti-A se detectaron en la preparación de LT hervida. Esto sugiere que la respuesta anti-B
está contra epítopos conformacionales, mientras que la respuesta anti-A probablemente se
dirige contra determinantes lineales y conformacionales. Confirmamos este hallazgo
probando inmunoblots cargados con LT, LT-A, LT-A1 o LT-B purificado hervido o sin
hervir con H10407 suero de prueba ( Fig 1C ). Tomados en conjunto, nuestros resultados
muestran que los individuos infectados con una cepa ETEC de tipo silvestre desarrollaron
anticuerpos contra LT, LT-A, LT-A1 y LT-B.

Figura 1
El conjunto de sueros humanos expuestos a ETEC contiene anticuerpos contra las
subunidades A y B de LT.
(A) Suero de prueba ETEC (agrupado 10 días después de la administración oral Desafío H10407 )
respuestas de anticuerpos anti-LT, anti-A y anti-B detectadas mediante ELISA (línea gris, círculos)
en comparación con sueros control comercialmente adquiridos (líneas negras, círculos vacíos)
usando diluciones de cada muestra.(B) Prueba de inmunoblot de suero (1) de ETEC-desafío o suero
de control (2) para anticuerpos anti-LT usando carriles cargados de LT sin hervir o carriles cargados
de LT cargado. En geles de SDS-PAGE sin hervir, LT se ejecuta como una proteína polimérica de
84 kD, subunidad B pentamérica (56 kD) y LT-A (28 kD). Cuando se hierve y se somete a SDS-
PAGE, LT se separa en LT-A (28 kD) y LT-B monomérica (11,5 kD). (C) ETEC-desafío suero o
suero de control anti-LT, anti-A, o anti-B respuestas detectadas con una inmunotransferencia
modificada usando un aparato de transferencia de ranura para cargar 0.1 μg de proteína (LT, A, A1
o B) con raw imágenes (arriba) y densidad de banda cuantificada de estas imágenes para proteínas
cargadas sin hervir graficadas (abajo).

Las muestras de suero de un área ETEC endémica contienen

anticuerpos contra las subunidades A y B de LT
A continuación, evaluamos 37 muestras de suero de pacientes humanos de Sierra Leona
para evaluar anticuerpos en el contexto de una infección natural. Si bien no hay datos
epidemiológicos específicos de la prevalencia de ETEC en esta área, Sierra Leona es un
país en desarrollo en el África subsahariana, una región asociada sistemáticamente dentro
de ETEC endémica [ 12 , 24 , 43 ]. Además, las recomendaciones actuales para los viajeros
a Sierra Leona incluyen precauciones contra alimentos y agua contaminados, identificando
ETEC como la causa más común de diarrea del viajero [ 5 ]. Estos sueros individuales se
obtuvieron de pacientes con sospecha de virus Lassa febril o controles afebriles, y aunque
se desconoce su estado de exposición a ETEC, es razonable suponer que algunos o todos
estos individuos se habrán infectado con ETEC en algún momento. Las muestras de suero
individuales se evaluaron por la presencia de anticuerpos contra LT, LT-A y LT-B
mediante ELISA. Primero evaluamos las diluciones en serie del suero del paciente
individual en placas ELISA recubiertas con LT, LT-A o LT-B para detectar la presencia de
anticuerpos contra la holotoxina y las subunidades individuales. Los títulos medios
geométricos de esos sueros se calcularon y representaron mediante el antígeno ( Fig
2A y S1 Fig ) y aproximadamente el 70% de las muestras fueron positivas para anticuerpos
contra uno de los tres antígenos. Además, las respuestas de anticuerpos a la holotoxina LT
se correlacionaron significativamente con anti-A ( P <0.0001) y anti-B ( P <0.0001) ( Fig
2B ), aunque hubo heterogeneidad dentro de las muestras individuales, incluidas muestras
positivas para anticuerpos anti-LT y ambas subunidades o pruebas fuertes para anticuerpos
anti-LT y solo anticuerpos anti-A o anti-B. Similar a H10407 challenge pool de suero,
anticuerpos a la subunidad B fueron predominantemente conformacionales y no fueron
aparentes en las inmunotransferencias (usando LT hervida), aunque las bandas
correspondientes a la subunidad A se detectaron fácilmente ( S1 Fig ).Tomados en
conjunto, estos resultados confirman nuestros hallazgos previos de que los individuos
infectados con ETEC desarrollaron anticuerpos contra LT, LT-A, LT-A1 y LT-B.
 Abrir en una ventana separada
Figura 2
Las muestras de suero de un área endémica de ETEC contienen anticuerpos contra las
subunidades A y B de LT.
El suero del paciente humano de Sierra Leona se evaluó para anticuerpos contra LT, subunidad A y
subunidad B en comparación con suero de control adquirido comercialmente usando un análisis de
título de punto final.(A) Titulaciones de anticuerpos anti-LT, anti-A, y anti-B ELISA para todas las
muestras de pacientes analizadas con medios geométricos indicados (líneas). (B) Correlaciones
entre títulos anti-LT y anti-A (cuadrados vacíos) o anti-B (diamantes grises) mediante el análisis del
Coeficiente de correlación de orden de rango de Spearman (r). Las respuestas de anticuerpos a la
holotoxina LT se correlacionaron significativamente con anti-A ( P <0,0001) y anti-B ( P <0,0001).
Ambas subunidades A y B son inmunogénicas e inducen anticuerpos
anti-LT después de la inmunización de la mucosa, con respuestas
máximas observadas cuando ambas subunidades están presentes
El análisis de los sueros de individuos infectados experimental o naturalmente con ETEC
reveló que la infección induce anticuerpos contra la subunidad A y la subunidad B de la
LT. A continuación, quisimos comparar la respuesta de anticuerpos después de la
inmunización con subunidades individuales solas o en combinación. Para estos estudios,
empleamos ensayos tanto in vitro (ELISA, célula CaCo-2) como in vivo(ratón patentado)
después de la inmunización por dos rutas mucosales diferentes (intranasal, sublingual).Para
la inmunización intranasal, los animales se inmunizaron con LT-A, LT-A1, LT-B, LT-A y
LT-B mezclados entre sí (LT-A + B), o el mutante dtLT de la subunidad A no tóxica. Un
gel de SDS-PAGE de las proteínas purificadas se muestra en la Fig . 3A . El suero de estos
animales se recogió y se ensayó en placas de ELISA recubiertas con LT nativa, LT-A o LT-
B para examinar la amplitud de las respuestas anti-LT inducidas por cada
inmunógeno. Como se ve en la Fig. 3B , LT-A1 era un inmunógeno pobre y no inducía
anticuerpos por ELISA. Por el contrario, LT-A, que incluye tanto la subunidad A1 como el
dominio A2, indujo anticuerpos que reconocían LT y LT-A. LT-B también indujo
anticuerpos a LT y a sí mismo, pero no a LT-A. Sorprendentemente, la adición de LT-A y
LT-B indujo respuestas significativamente más altas contra LT, LT-A y LT-B que
cualquier antígeno solo, lo que sugiere que la función adyuvante de LT-A se mantuvo
incluso cuando las moléculas se disociaron. Específicamente, LT-A puede adyuvar la
respuesta a la subunidad B, incluso cuando las moléculas se mezclan y no están presentes
en la configuración fisiológicamente normal de AB5. Las respuestas anti-LT observadas
con el agregado LT-A + B fueron equivalentes a las observadas con el mutante dmLT de la
subunidad A no tóxica, que también retiene la actividad inmunogénica y adyuvante
[ 17 , 18 ]. Se observaron respuestas similares cuando los animales se inmunizaron por vía
sublingual con LT-A, LT-B, la mezcla LT-A + B, o dmLT para IgG sérica e IgA fecal
( Fig. 3C ). Estos resultados indican que la subunidad A o B puede ser inmunogénica
cuando se administra como una vacuna, pero las respuestas antitoxinas se maximizan
cuando ambas subunidades se incluyen en la inmunización.
Fig. 3
Ambas subunidades A y B son inmunogénicas e inducen anticuerpos anti-LT después de la
inmunización de la mucosa.
Para estos estudios, empleamos un ensayo ELISA in vitro después de la inmunización mediante dos
rutas mucosales diferentes (intranasal, sublingual). Para inmunizaciones intranasales, se
inmunizaron ratones BALB / c semanalmente durante tres semanas con 10 \ mu l de solución salina
que contenía 5 \ mu g de antígenos proteicos A1, A, B, A + B o dmLT. Para las inmunizaciones
sublinguales, los ratones BALB / c se inmunizaron por vía sublingual una vez con 10 μl de solución
salina que contenía 5 μg de antígenos proteicos A, B, A + B, dmLT o LT. Todos los ratones fueron
sacrificados 21 días después de la inmunización primaria. La integridad de los antígenos se
demostró mediante SDS-PAGE (A). Las respuestas de IgG sérica anti-LT (B, C) o IgA fecal (C) se
detectaron mediante ELISA. La prueba de significación para los paneles de ELISA se realizó
usando un ANOVA de una vía con la prueba posterior de Tukey's Multiple
Comparison. Los valores P se codificaron de la siguiente manera: * <0,05, ** <0,01, *** <0,001.

Los anticuerpos de la subunidad anti-A o anti-B pueden neutralizar la

toxicidad de LT, con respuestas máximas observadas cuando los
anticuerpos contra ambas subunidades están presentes
Mientras que LT-B facilita la unión celular y la internalización de la toxina, LT-A media
las funciones enzimáticas intracelulares después de la división proteolítica y la reducción de
enlaces disulfuro en el dominio A1 activo [ 15 ]. Dentro del citoplasma de las células
epiteliales intestinales, el dominio A1 ADP-ribosila numerosas proteínas celulares,
incluyendo Gsα, lo que conduce a la activación irreversible de adenilato ciclasa,
acumulación de cAMP y desregulación de los mecanismos de transporte de iones que
controlan la osmolaridad luminal y la secreción de fluidos. Por lo tanto, existen varios
objetivos potenciales para anticuerpos protectores dentro de los pasos que conducen a la
enterotoxicidad LT. Para determinar cómo los anticuerpos específicos de cada subunidad
podrían contribuir a la protección contra la toxicidad de LT, empleamos dos ensayos
diferentes: el ensayo de enterotoxicidad oral de ratón patentado y el ensayo de cAMP de
células CaCo-2. Para el ensayo de patente de ratón, los animales se inocularon oralmente
con una cantidad de toxina nativa suficiente para inducir la secreción de fluido semimáxima
después de tres horas (es decir, 25 μg de LT). La toxina LT se preincubó con suero anti-A
de conejo, suero anti-B de conejo, suero de control negativo o tampón. Los sueros
policlonales de conejo se produjeron en nuestro laboratorio contra LT-A recombinante
purificada y LT-B. Como se ve en la Fig. 4A , tanto anti-A como anti-B pudieron
neutralizar eficazmente la actividad secretora de LT nativa en el ensayo de ratón patentado,
indicando que tanto la subunidad A de LT como la subunidad B son inmunoprotectores
contra la diarrea mediada por LT.

Fig 4
Los anticuerpos de la subunidad anti-A o anti-B neutralizan la toxicidad de LT, con
respuestas máximas cuando ambas están presentes.
(A) Neutralización de la secreción de fluido intestinal mediada por toxinas en el ensayo de ratón
patentado después de la alimentación intragástrica con tampón (1) o 25 μg de LT combinado con
sueros de control negativo anti-A (2), anti-B (3) (4) o toxina sola (5). (B, E) Neutralización de la
intoxicación de cAMP de células epiteliales en células Caco-2 después de 3 h de tratamiento con
0.1 μg de LT preincubados con control positivo GM1 monosialogangliósido (GM1 + LT), varias
diluciones y combinaciones de antisuero, o toxina sola . (C) Bloqueo de la unión de la toxina GM1
mediante detección mediante ELISA usando 0,1 μg de toxina LT preincubada con antisueros o
sola. (D) Transferencia de Western de lisados de células Caco-2 después de 3 horas de tratamiento
con 0,1 μg de toxina LT preincubada con antisueros. Las transferencias se sondearon para proteínas
ADP-ribosiladas utilizando macrodominios de rAF1521 (transferencia de fondo) y luego se
volvieron a explorar para determinar la presencia de la subunidad B usando suero de conejo anti-B
(transferencia superior). Las casillas indican proteínas con ADP-ribosilación alterada,
potencialmente Gsα. Las pruebas de significancia para la secreción y los paneles de AMPc se
realizaron usando un ANOVA de una vía con la prueba posterior de Tukey's Multiple
Comparison. Los valores P se codificaron de la siguiente manera: * <0,05, ** <0,01, *** <0,001.
Para el ensayo de cAMP, las células CaCo-2 se trataron con una cantidad de LT suficiente
para provocar la acumulación máxima de cAMP en 3 horas (es decir, 0,1 μg). Para este
ensayo, el LT se preincubó primero con GM1 (control positivo) o diluciones en serie de
suero anti-A o anti-B de conejo ( Fig. 4B ).Curiosamente, se observaron dos efectos
diferentes. Para anti-LT-A, la neutralización de LT disminuyó gradualmente cuanto más se
diluyó el suero, comenzando de 1: 8 (100%) a 1: 256 (0%). Por el contrario, el anti-LT-B
parecía tener un umbral marcado en el que la neutralización pasaba de cero a ninguno en
una sola dilución de 2 veces (64-128). Esto sugiere que existe un nivel umbral de anti-B por
encima del cual se bloquea LT que se une a la célula y cualquier nivel inferior puede no ser
eficaz.
Posteriormente, examinamos si estos antisueros actúan para bloquear la actividad de unión
o enzimática de LT usando placas de ELISA recubiertas con GM1 o un ensayo de
ribosilación de ADP intracelular. Para ambos ensayos, se preincubó LT con conejo anti-A,
conejo anti-B, suero control negativo, o tampón antes de la adición. Los anticuerpos anti-B
impidieron la unión de GM1 ( figura 4C ), la entrada de toxina en la célula ( figura 4D ,
transferencia superior) y la actividad enzimática ( figura 4D , transferencia inferior).Por el
contrario, los anticuerpos anti-A solo previenen la actividad enzimática de la toxina dentro
de las células epiteliales. Estos resultados indican que los anticuerpos contra la subunidad B
evitan la unión de toxinas y la entrada a las células intestinales, mientras que los
anticuerpos contra la subunidad A previenen la actividad enzimática de la toxina dentro de
los compartimentos intracelulares.
También examinamos la sinergia potencial entre anti-A y anti-B para la neutralización de
toxinas. Para este ensayo, combinamos suero anti-A y anti-B a diluciones que no mostraron
una neutralización completa de la toxina en la figura 4B (por ejemplo, 1:16 anti-A; 1: 128-
256 anti-B). Como se ve en la Fig. 4E , las diluciones de anti-B a niveles de 1: 128-256
fueron incapaces de neutralizar la inducción de LT de cAMP, a menos que se combinara
con anti-A. Además, la capacidad neutralizante de anti-A se vio enormemente potenciada
por la presencia de anti-B. Por lo tanto, las respuestas antitoxinas se maximizan cuando los
anticuerpos a ambas subunidades están presentes.
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Discusión
El desarrollo de una vacuna efectiva contra ETEC se ha complicado por una serie de
factores, incluida la ausencia de un mercado de países desarrollados sustancial para
compensar el costo del desarrollo, el enfoque en los viajeros como objetivo primario de la
vacuna, la gran cantidad de serotipos potenciales y antígenos del factor colonizador y el
éxito (relativo) de la vacuna contra el cólera de la subunidad B de células enteras. Esto
condujo primero al desarrollo de candidatos de vacuna ETEC eliminados combinados con
la subunidad B de la toxina del cólera como el principal componente anti-toxina. Estudios
más recientes han utilizado cepas ETEC muertas o vivas atenuadas combinadas con la
subunidad B de LT [ 44 , 45 ]. Se han realizado algunos intentos para incluir un
componente de LT-A, que incluye un parche transcutáneo basado en LT que previene con
éxito la diarrea de ETEC solo con LT en los viajeros (aunque no en todas las diarreas de
ETEC) [ 40 ]. Además, LT-A es difícil de purificar sin contaminación con LT-B y es
insoluble en la mayoría de los tampones acuosos. Como resultado, la mayoría del desarrollo
de la vacuna ETEC ha incluido a la subunidad B como el único componente anti-toxina.
El propósito de este estudio fue evaluar la respuesta inmune contra la subunidad A de LT
así como su potencial como antígeno protector cuando se administra solo o en combinación
con la subunidad B de LT.Para evitar el problema de la contaminación cruzada con
pequeñas cantidades de proteínas competidoras (a menudo un problema en estudios más
antiguos que usan cromatografía de disociación), utilizamos LT, LT-A y LT-B
recombinantemente producidos purificados en columnas de cromatografía prístina como
antígenos e inmunógenos en una serie de ensayos in vitro e in vivo . Tenemos una amplia
experiencia en la purificación y caracterización de LT y sus subunidades, así como en la
evaluación de sus propiedades inmunológicas y fisiológicas [ 16 - 18 , 31 , 38 , 46 ].
Nuestros estudios muestran claramente que ambas subunidades LT son
inmunogénicas. Sueros humanos de individuos desafiados con una cepa prototípica de
ETEC de tipo salvaje, así como los sueros de individuos que viven en un área endémica de
ETEC, tenían anticuerpos detectables contra LT, LT-A y LT-B detectados mediante ELISA
e inmunoblot (Figs . y and22 y S1 Fig .). No se identificó una subunidad inmunodominante
clara para LT, sin embargo, los anticuerpos contra la subunidad A incluían a menudo tanto
epítopos conformacionales como no conformacionales, mientras que los de la subunidad B
eran principalmente conformacionales. ilustra que la subunidad A de LT es naturalmente
inmunogénica, como la subunidad B de LT, similar a estudios anteriores [ 34 - 37 ].
Durante la infección bacteriana con ETEC, la expresión de la toxina LT se produce
directamente en las superficies gastrointestinales y posiblemente utilizando sistemas de
administración especializados, como las vesículas de la membrana externa [ 47 ]. Hemos
demostrado previamente que la subunidad A de LT también es más susceptible que la
subunidad B a la escisión proteolítica en un dominio A1 y la degradación [ 18 ]. En
consecuencia, la inmunogenicidad de LT y sus subunidades podría ser distinta en el
contexto de la vacunación antigénica frente a la infección bacteriana. En nuestros estudios
de inmunización murina, confirmamos que se detectaron respuestas robustas de anticuerpos
después de la inmunización con subunidades individuales, pero estas se maximizaron en
combinación con construcciones A + B o AB5 mezcladas ( Fig. 3 ). Se observó una menor
respuesta sérica con la inmunización de la subunidad A después de la inmunización
sublingual que con la inmunización intranasal, como cabría esperar dada la dinámica más
complicada de la captación de antígenos en el epitelio sublingual (sin la presencia de una
subunidad B de unión a GM1) y presencia de proteasas salivales. Las propiedades
sinérgicas de A + B mezclado con respecto a niveles más altos de respuestas inmunológicas
se han visto previamente en nuestros estudios que evalúan las propiedades adyuvantes de la
subunidad A o B mezcladas [ 18 ]. Esto sugiere que la inmunogenicidad de la toxina LT, al
igual que la adyuvanticidad, no depende de la estructura de holotoxina AB5, aunque la
inducción de respuestas sistémicas de anticuerpos es máxima con al menos dos señales
recibidas de las subunidades A y B.
Una conclusión importante de nuestro estudio es que ambas subunidades pueden ser
inmunoprotectoras y neutralizar la secreción diarreica mediada por LT ( Fig. 4 ). También
establecimos ensayos específicos para evaluar en qué punto los anticuerpos neutralizan o
previenen la intoxicación de las células epiteliales, incluida la unión a GM1, la entrada
celular, la ribosilación de ADP y la acumulación de cAMP ( Fig. 4 ).Estos ensayos
representan un potencial para la evaluación mejorada de anticuerpos neutralizadores de LT
que es más cuantificable y específico que el análisis de células suprarrenales Y-1 utilizado
históricamente que evalúa el tratamiento de redondeo celular / no redondeamiento post-
toxina [ 33 - 36 ]. Los anticuerpos policlonales de suero de conejo pudieron neutralizar los
efectos citotóxicos y enterotóxicos de la LT nativa al bloquear la unión y entrada en las
células (anti-LT-B) o la actividad enzimática intracelular de la toxina (anti-LT-A y anti-LT-
B ) Además, los anticuerpos contra ambas subunidades LT actuaron de forma sinérgica
para neutralizar la holotoxina cuando se combinaron. Tomados en conjunto, estos datos
apoyan la inclusión tanto de LT-A como de LT-B en vacunas prospectivas contra ETEC.
Una pregunta importante que no fue respondida por este estudio es qué forma de antígeno
LT es óptima: un toxoide AB5, como dmLT, o combinaciones de proteínas derivadas de
toxinas, como LT-A + LT-B. Se observaron diferencias mínimas entre dmLT y LT-A +
LT-B en nuestros estudios de inmunización con ratones en dosis y rutas evaluadas. Sin
embargo, se necesitarían estudios más extensos para evaluar las diferencias entre estas
proteínas tanto en la estabilidad de la formulación como en los resultados de la vacunación
cuando se combina con otros antígenos de ETEC. La cuestión de la forma del antígeno LT
se complica aún más por la vía de administración y si también se desean las propiedades
adyuvantes de una proteína derivada de LT [ 17 , 18 ]. Lo que queda claro de estos
resultados es que los análisis de anticuerpos que incluyen holotoxina LT o ambas
subunidades A y B producen resultados más informativos que los obtenidos solo con la
subunidad B. Con estas técnicas de análisis en mente, futuros estudios de vacunas ETEC
pueden comenzar a responder a estas preguntas utilizando combinaciones de antígenos LT
con un enfoque de inmunización específico (por ejemplo, vacunas orales atenuadas vivas o
muertas por calor en contraste con subunidades inyectadas por vía parenteral) o proteínas
de fusión).
En conclusión, las subunidades A y B contribuyen a la inmunoprotección contra la diarrea
mediada por LT, dando como resultado respuestas de anticuerpos que se dirigen a aspectos
únicos de la biología de la toxina y proporcionan una mayor neutralización de la toxina
cuando se combinan. Por lo tanto, parece probable que la inclusión de ambos epítopos de
subunidades en los candidatos a la vacuna ETEC promueva una respuesta neutralizante más
robusta a la toxina LT que la subunidad B sola.
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información de soporte
S1 Fig
Las muestras de suero de un área endémica de ETEC contienen anticuerpos contra
las subunidades A y B de LT.
El suero del paciente humano de Sierra Leona se evaluó para anticuerpos contra LT,
subunidad A y subunidad B en comparación con suero de control adquirido
comercialmente. (A) Suero de paciente humano de Sierra Leona (líneas negras) o suero de
control (círculos vacíos) respuestas de anticuerpos anti-LT, anti-A y anti-B detectadas
mediante ELISA mediante densidad óptica de 405 nm (OD) (B) Paciente humano suero de
Sierra Leona, suero control, o ninguna prueba de inmunoblot en suero para anticuerpos
anti-LT no conformacionales para las subunidades A o B del monómero. Todos los carriles
se cargaron con proteína LT hervida con la ubicación de las bandas A y B indicadas.
(EPS)
Haga clic aquí para obtener un archivo de datos adicional. (1.2M, eps)
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Expresiones de gratitud
Los autores de este estudio desean agradecer al Dr. Robert F. Garry y al Dr. David Sach por
el acceso a muestras humanas, a Lisa Read por sus valiosas discusiones sobre literatura
ETEC, a David Bauer y Louise Lawson por asistencia de laboratorio y a Robin Baudier por
su asesoramiento editorial .
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Declaración de financiación
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud
(R56 AI099008-01A1). Este financiador proporcionó apoyo en forma de sueldos para el
autor [JDC], pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recopilación y
el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Las funciones
específicas de estos autores se articulan en la sección "Contribuciones del autor". La
afiliación actual del Dr. Branco, Zalgen Labs, no participó en este estudio.
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Disponibilidad de datos
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