UNINASSAU

DISCIPLINA: Funções Biológicas

DOCENTE: Profª Drª Valeska Santana de Sena Pereira

TÉCNICAS DE ANÁLISE
Cromatografia

■ Técnica usada para separar proteínas de

acordo com a carga, tamanho,
hidrofobicidade ou afinidade por outras
partículas.
Cromatografia

■ Fase estacionária: matriz sólida

porosa;
■ Fase móvel: solução tamponada;
Cromatografia de troca iônica

■ Separa as proteínas de acordo

com a carga elétrica em um
determinado pH;
■ A matriz é uma resina com
grupos carregados ligados;
■ À medida que as frações desse
efluente saem, são coletadas
em tubos de ensaio.
Cromatografia de exclusão por tamanho

■ Separa as proteínas de
acordo co
■ As proteínas grandes
emergem mais cedo do que
as proteínas menores;
Cromatografia de afinidade

■ Os grânulos da coluna
possuem um ligante;
■ A proteína com afinidade
para esse ligante se liga aos
grânulos, e sua migração
através da matriz é
retardada;
HPLC

■ Cromatografia líquida de alta

performance;
– Usa bombas de alta
pressão que aceleram a
separação das proteínas;
Eletroforese

■ Técnica de separação de moléculas que envolve a migração de

partículas por um gel durante a aplicação de um campo
elétrico;
■ Utilizada para separar proteínas e ácidos nucléicos.

Eletroforese de proteínas Eletroforese de DNA

Eletroforese

■ A separação ocorre em função da carga elétrica e do tamanho

da molécula (peso molecular);
Componentes

■ Campo elétrico;
■ Suporte;
■ Molécula carregada:
– DNA negativo;
– Proteínas negativas,
positivas ou neutras.
Suporte

■ O "gel" é o filtro que separa as cadeias de DNA:

– Papel-filtro
– Acetato de celulose
– Agarose
– Poliacrilamida
■ A velocidade de migração de macromoléculas em um campo
elétrico dependem da porosidade do gel.
Eletroforese de poliacrilamida

■ Utilizada para moléculas de tamanhos menores: 5 a 1.000 pb

Eletroforese de agarose

■ Ampla capacidade de separação – 50 a 20.000 pb;

Eletroforese capilar

■ A amostra e o gel estão dentro de um tubo capilar e a amostra

é detectada automaticamente por um detector;
■ Utilizada em sequenciadores de DNA.
Eletroforese capilar
Eletroforese de proteínas

■ SDS-PAGE;
– Usa um detergente que
interagem com as proteínas;
■ De acordo com o peso molecular
e carga elétrica as proteínas
percorrem distâncias distintas,
gerando diferentes bandas;
■ Proteínas do soro humano:
– Albumina e as globulinas
alfa, beta e gama.
Odontol. Clín.-Cient., Recife, 14(4) 801 -
808, out./dez., 2015
Espectrofotometria

■ Usa um espectro radiante para inspecionar sistemas

biológicos, especialmente soluções;
■ Um feixe de energia atravessa a solução e sua absorção
oferece informações sobre a qualidade e quantidade dos
componentes do sistema;
Espectrofotometria

■ Faixa mais utilizada vai do ultravioleta (200nm) ao

infravermenho (1000 nm)
Espectrofotometria

■ De absorção:
– Usada para identificar substâncias, indicar o grau de
pureza e determinar concentrações;
– Um feixe de energia radiante passa através da solução e
medir sua absorção;
– A absorção da luz é diretamente proporcional à
concentração da solução;
Intrumentação

■ Equipamento: espectrofotômetro.
– Fonte de radiação;
– Amostra;
– Detector - galvanômetro.
RGO - Rev Gaúcha Odontol., Porto Alegre, v. 58, n. 3, p. 363-368,
jul./set. 2010
Referências

■ Nelson, David L. Princípios de bioquímica de Lehninger. 6. ed.

– Dados eletrônicos. – Porto Alegre: Artmed, 2014.
■ Heneine, I. F. Biofísica básica. Porto Alegre: Artmed, 2000.
■ https://www.youtube.com/watch?v=pdExSwSZUvU