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METABOLISMO GENÉTICO GENERAL

Composición del genomas

Replicación del DNA

Reparación del DNA

Recombinación del DNA

Elementos Transponibles

Transcripción

Traducción

Regulación de la expresión génica

Elementos del DNA recombinante

Aplicaciones biotecnológicas
INTRODUCCION A LA GENÉTICA MOLECULAR
El descubrimiento de la estructura de la doble hebra, a partir de la difracción de rayos X, y la aparición de la genética y del concep
to gen, dio a origen a un mecanismo para su copia, de modo que la información en él contenida pudiera ser transmitida de generac
ión en generación. La comprensión de como la información del DNA se convierte en proteína funcionales vino con el descubrimie
nto del mRNA (RNA mensajero) y el tRNA (RNA de transferencia) y con la elucidación del código genético.
Junto con otros avances mas, llevaron a la formulación del dogma central de la biología molecular:

Este dogma abarca los tres principales procesos celulares en los que se utiliza la información genética.
1ro: Replicación: copia del DNA parental para formar moléculas de DNA hijas con idéntica secuencia de nucleótidos.
2do: Transcripción: proceso mediante el cual parte del mensaje genético codificado por el DNA es copiado.
3ro: Traducción: en la cual el mensaje genético codificado en el mRNA es traducido en los ribosomas para dar un polipéptido con
una secuencia especifica de aminoácidos.

La biosíntesis de estas macromoléculas (DNA y proteinas), difiere de la biosíntesis de lipidos y glúcidos en la complejidad añadid
a debido a que el ensamblaje de los ácidos nucleicos y de las proteinas con sus secuencia especificas de nucleótidos y aminoácidos
debe respetar estrictamente a las características de un molde en que esta basada la propia vida. La formación de los enlaces fosfod
iéster en el DNA o de los enlaces peptídicos en las proteinas son una tarea fácil para el arsenal de enzimas especializadas para la c
atálisis de estos enlaces. Sin embargo, lo complicado de estas biosíntesis es que los enlaces deben formarse entre subunidades dete
rminadas, evitando errores de secuencia o de propagación. Esto implica un desgaste energético muy grande para la célula: así por
ejemplo:
La formación de un enlace peptídico requiere unos 21 KJ/mol.
Pero la formación de un enlace peptídico entre dos aminoácidos específicos en un punto particular de una hebra polipeptídica, la c
élula invierte unos 125 KJ/mol de energía química y hace uso de mas de 200 enzimas, moléculas de RNA y proteinas especializad
as. La reacción de formación es la misma, lo que cambia es de forma se lleva a cabo. La célula necesita asegurarse que el enlace p
eptídico se forme entre los aminoácidos correctos.
Por lo que es lógico, estas síntesis presentan muchas regulaciones, y están constantemente siendo revisadas por enzimas para verif
icar si la secuencia que esta siendo sintetizada es la correcta.
-------------------------------Composición de los genomas-------------------------------
INTRODUCCIÓN:
• El genoma es el conjunto de los genes de un organismo. En última instancia se define por la secuencia completa de DNA, aunqu
e en la secuencia completa no todos sean genes.
• El transcriptoma es el conjunto es el conjunto completo de los genes expresados en determinadas condiciones. Se define en funci
ón del conjunto de molécula de RNA presente y puede referirse a un solo tipo de célula, a cualquier ensamble de célula mas compl
ejo o al organismo completo. Debido a que algunos genes generan múltiples moléculas de mRNA, es probable que el transcriptom
a sea mayor que el numero de genes definidos directamente en el genoma. El transcriptoma incluye a las moléculas de RNA con c
odificadoras, así como a las moléculas de mRNA.
• El proteoma es el conjunto de proteínas. Debe corresponder a las moléculas de mRNA del transcrito a, aunque puede haber difer
encias de detalle que reflejen cambios de la abundancia relativa o la estabilidad de las moléculas de mRNA y de las proteinas. Pue
de ser utilizado para referirse al conjunto de proteínas codificadas por todo el genoma o producidas en cualquier célula o tejido es
pecifico
El numero de genes del genoma puede ser identificado directamente al definir marcos de lectura abierto (ORF). El mapeo de esta
naturaleza a gran escala es complicado porque los genes interrumpidos pueden estar formados por numerosos ORF separados. No
necesariamente tenemos información acerca de las funciones de los productos proteínicos ni tenemos una prueba de que leguen a
expresarse, de modo que este abordaje se restringe a la definición del potencial del genoma. Sin embargo, se presume con relativa
certeza que cualquier marco de lectura abierto conservado probablemente llegue a expresarse.
También se puede definir el numero de genes directamente en funcion del transcriptoma (identificando directamente todas las mol
éculas de mRNA) o del proteoma (identificando directamente todas las proteinas. Esto proporciona a la seguridad de que se trata c
on genes auténticos que se expresan en circunstancias conocidas y permiten investigar cuántos genes son expresados en un tipo de
célula o un tejido particular, que variación existe en los niveles relativos de expresión y cuántos de los genes expresados en una c
élula particular son únicos de esa célula o también son expresados en alguna otra parte.

DEFINICIÓN DE ALELO Y DE GEN


Los genes se presentan en múltiples formas denominadas alelos. Esto implica que un gen que define una caracteristica puede exist
ir en varias variantes, como pueden ser el color de los ojos o del pelo. El gen en este caso seria, por ejemplo, aquel que codifique p
ara el pigmento de los ojos. El gen para el color de ojos tiene variantes que expresan pigmentos de color celeste, verdes, marrones,
etc.
Todos los alelos para un gen en particular se localizan en un sitio específico del cromosoma denominado locus de ese gen. Esto qu
iere decir que existe un sitio en el cromosoma donde está determinado, por ejemplo, el color de ojos de una persona. Ese locus pue
de estar ocupado por un alelo para color de ojos verdes, azules o marrones.
Se utiliza el término alelo cuando aludimos a una versión especifica de un gen y el termino gen, para referirnos de manera general
a cualquier alelo ubicado en un locus determinado.

DNA REPETITIVO & DNA NO REPETITIVO


Las características generales del genoma eucariota pueden evaluarse por la cinética de reasociación del DNA desnaturalizado, técn
ica ampliamente utiliza antes de que fuera posible la secuenciación del DNA a gran escala.
Con la cinética de reasociación se identifican dos tipos generales de secuencias genómicas:
• El DNA no repetitivo: consta de secuencias únicas, es decir, sólo hay una copia en un genoma haploide.
• El DNA repetitivo: consta de secuencias presentes en mas de una copia en cada genoma.
• El DNA con secuencias invertidas
El DNA repetitivo con frecuencia se divide en dos tipos generales:
• El DNA moderadamente repetitivo: consiste en secuencia relativamente cortas que se repiten típicamente de 10 a 1000 veces en
el genoma, dispersas a lo largo de éste; son responsables del alto grado de formación de la estructura secundaria en el pre-mRNA,
cuando repeticiones (invertidas) en los intrones se aparean para formar regiones dúplex.
• El DNA altamente repetitivo está formado por secuencia muy cortas (típicamente < 100 bp) presentes muchos miles de veces en
el genoma, frecuentemente organizadas en forma de repetición es en tándem.
Ninguna de estas clases representa (expresa) proteínas.
La proporción del genoma ocupado por DNA no repetitivo varía mucho.
Las procariotas contienen solo DNA no repetitivo. En las eucariotas inferiores, la mayor parte del DNA no es repetitivo, solo el 20
% del genoma forma parte de componentes moderadamente repetitivos. En células animales, a menudo hasta la mitad del DNA es
ocupado por componentes moderada y altamente repetitivos. En las plantas y en los anfibios, los componentes moderada y altame
nte repetitivos puede representar hasta el 80 % del genoma, de tal manera que el DNA no repetitivo se reduce a un componente mi
noritario.
Una parte significativa del DNA moderadamente repetitivo consiste en transposones, secuencias cortas de DNA susceptibles de m
overse a localizaciones nuevas en el genoma y de crear copias adicionales de sí mismos. En algunos genomas eucariotas superiore
s puede ocupar incluso mas de la mitad del genoma.
En ocasiones se considera que los transposones se adaptan al concepto de DNA redundante, el cual se define como secuencias que
se propagan por sí mismas en un genoma sin contribuir al desarrollo del organismo. Los transposones suelen fomentar las reestru
cturas genómicas, y éstas podrían conferir ventajas selectivas. Sin embargo, es justo decir que en realidad no se sabe porqué las fu
erzas selectivas no contrarrestan el que los transposones se conviertan en una proporción tan grande
Otro término que se utiliza para describir el exceso aparente de DNA es DNA basura que define a secuencias genómicas sin una f
unción aparente. Obviamente, es probable que en el genoma haya un equilibrio entre la generación de secuencias nuevas y la elimi
nación de secuencias indeseables, y que cierta proporción del DNA aparentemente carece de función, esté en proceso de ser elimi
nada.
Algunas generalizaciones:
LAS REPETICIONES INVERTIDAS FORMAN ESTRUCTURAS PLEGADAS
El DNA eucariótico que se reasocia mas rápidamente, y que representa hasta el 10 % de algunos se genomas, se renaturaliza con u
na cinética de primer orden. Al parecer, este DNA contiene secuencias invertidas (autocomplementarias) muy próximas, que pued
en plegarse sobre si mismas formando estructuras plegadas.

Las repeticiones invertidas tienen una longitud entre 100 y 1000 pb. Se desconoce su funcion, sin embargo se esta estudiando com
o intervienen estas estructuras cruciformes en la formación de la cromatina.

EL DNA ALTAMENTE REPETITIVO ESTA AGRUPADO EN LOS CENTROMEROS


El DNA altamente repetitivo consiste en agrupaciones de secuencias casi idénticas de hasta 10 pb de longitud que están repetidas
en tándem miles de veces. Las secuencias de estos ADNs, denominados también como DNA satélite, son especificas de la especie
.
Se demostró que este DNA esta concentrado en la región heterocromática asociada con el centrómero cromosómico. Esto sugiere
que la funcion del DNA de secuencia simple, es alinear los cromosomas homólogos durante la meiosis y/o facilitar su recombinaci
ón. Finalmente, se confirmo al apreciar que los ADNs satélites son eliminados totalmente o en gran parte de las células somáticas
de una serie de eucariotas. Sin embargo, esto no ocurre en células germinales. Las proteinas que se unen a esas secuencias aun se e
stán investigando.
LOS ADNS MODERADAMENTE REPETITIVOS SE DISTRIBUYEN EN REPETICIONES DISPERSAS
Los ADNs moderadamente repetitivos se presentan como fragmentos de 100 a varios miles de bp, interrumpidos por grandes bloq
ues de DNA único. Parte de este DNA repetitivo consiste en grupos de genes repetidos en tándem que codifican productos requeri
dos por las células en grandes cantidades, como los rRNA, tRNA e histonas. La mayor parte de los ADNs moderadamente repetiti
vos, si bien pueden ser transcritos, no codifican ARNs de funcion conocida. El DNA mejor caracterizado de este tipo es conocido
como la familia Alu, debido a que la mayoría de sus segmentos de ~ 300 pb contienen un sitio de corte para la endonucleasa de res
tricción AluI.
Por otro lado, también existen ADNs moderadamente repetitivos que no se expresan pero que cumplen funciones. Entre las mas es
tudiadas (o están siendo estudiadas) están:
- Funcionan como secuencias de control que participan activando coordinadamente genes próximos.
- Funcionan como orígenes de replicación para el DNA.
- Incrementan la versatilidad evolutiva de los genomas eucarióticos, facilitando reordenaciones cromosómicas y/o creando reserva
s desde las que pueden ser incorporadas secuencias funcionales nuevas.
- Una gran parte puede tratarse de DNA egoísta o basura, en donde luego de muchas generaciones, se ha diseminado a través del g
enoma mediante algún proceso azaroso transposicional.
AGRUPACIONES DE GENES EN TÁNDEM
El DNA repetitivo en tándem (VNTR) está constituido por secuencias que no incluyen genes funcionales y que se disponen en arr
eglos de repeticiones, una al lado de la otra y cada una de ellas contiene una secuencia central básica. Se clasifican de acuerdo al t
amaño promedio del arreglo en: DNA satélite, DNA minisatélite y DNA microsatélite.
De estos tipos de DNA, el minisatélite y el microsatélite son los que mayor importancia tienen debido a que permiten resolver pro
blemas en identificación humana y pruebas de paternidad.
Cada individuo posee copias de un VNTR dado, uno proveniente del cromosoma materno y otro del cromosoma paterno, casi sie
mpre diferentes en el número de repeticiones que poseen. A esas dos variantes por individuo se corresponden las dos bandas obser
vadas (heterocigota), o una única banda (homocigota), cuando se hace el fingerpritting (huella digital).
ORGANIZACIÓN:
La mayoría de los genes son únicos en el genoma de un organismo haploide. Esta situación es factible, incluso para los genes que
codifican proteinas que se requieren en grandes cantidades, mediante la acumulación de sus ARNms. Sin embargo, la gran deman
da celular de ARNrs (que comprende el ~ 80% del RNA de una célula) y ARNts, todos ellos productos de la transcripción, solame
nte puede ser satisfecha por medio de la expresión de múltiples copias de los genes que los codifican,
=> Los genes del rRNA se organizan en grupos repetidos:
La ordenación de genes de rRNA es universal: se lee la hebra de RNA en la dirección 5' → 3', y es universal por que el extremo 5'
de rRNA procariota es homologo al extremo 5' del rRNA del eucariótico.
Los bloques de genes de rRNA eucariótico transcritos están ordenados en repeticiones en tándem, separadas por espaciadores no t
ranscritos. Estas repeticiones en tándem tienen habitualmente una longitud de ~ 12 kb, aunque la de los espaciadores no transcrito
s varia con la especie y, en menor grado, de un gen a otro.
=> Las secuencias repetidas se pueden generar y mantener mediante entrecruzamientos desiguales y/o conversión génica.
El mecanismo habitual de selección natural podría parecer ineficaz para mantener la identidad de las secuencias repetidas, ya que
mutaciones perjudiciales en unos pocos miembros de un grupo de genes idénticos, repetidos múltiples veces, tendría un efecto fen
otípico pequeño. En realidad, muchas mutaciones no afectan a la funcion de un producto génico y son, por consiguiente, selectiva
mente neutras. Los grupos de genes repetidos deben, por lo tanto, mantener su homogeneidad mediante algunos mecanismos adici
onales. Dos de estos mecanismos que parecen plausibles son:
1- En el mecanismo del entrecruzamiento desigual, la recombinación tiene lugar entre segmentos homólogos de cromosomas no al
ineados, escindiéndose así un segmento de uno de los cromosomas y añadiéndose al otro. Tales expansiones y contracciones repeti
das de un cromosomas generan, mediante un proceso al azar, una agrupación de secuencias repetidas que han procedido de una ag
rupación ancentral mucho menor.

2- En el mecanismo de conversión génico, un miembro de un grupo de genes repetidos "corrige", una variante próxima mediante u
n proceso parecido a la reparación mediante recombinación.

Dado que las mutaciones puntuales son acontecimientos raros comparados con los entrecruzamientos, cualquiera de los dos mecan
ismos dará como resultado una nueva copia de la secuencia repetida, ya sea eliminando la secuencia mutada o extendiendo su pred
ominio sobre la agrupación entera. Si una mutación que ha sido concentrada de esta forma es perjudicial, será eliminada por selecc
ión natural. Por el contrario, las variantes de los espaciadores, que no son objetos de un presión selectiva, serán eliminadas a una v
elocidad menor. La existencia de grupos repetidos de genes idénticos separados por espaciadores son objetos de una presión select
iva, serán eliminadas a una velocidad menor. La existencia de grupo repetidos de genes idénticos separados por espaciadores algo
heterogéneos puede, por lo tanto, ser explicada razonadamente por cualquiera de los dos modelos de homogenización.

POLIMORFISMOS
En la perspectiva mendeliana, solo podían haber dos tipos de alelos para un mismo locus, como máximo tres en ciertos patrones d
e herencia.
En alelos múltiples, se manifiestan mas de tres alelos por locus. La coexistencia de alelos múltiples en un locus se denomina poli
morfismo. Por definición, cualquier sitio en el cual existen alelos múltiples como componentes estables de la población es polimór
fico. Un alelo suele ser definido como polimórfico si su frecuencia en la población es de > 1 %
La explicación mas razonable del polimorfismo es que un gen haya sufrido diferentes mutaciones que modifiquen la función prote
ínica, produciendo cambios en el fenotipo.
El polimorfismo molecular consiste la variación que se presenta en individuos de una misma especie, bien sea al nivel genético o
al nivel de las proteínas. En otras palabras, describe el concepto de alelismo, es la existencia en una población de múltiples alelos
de un gen (mayor a tres). Los polimorfismos no son consideradas mutaciones.
Aunque probablemente, los polimorfismos hayan surgido de mutaciones de un gen, existe una gran diferencia:
• Mutaciones son cambios poco frecuentes en la secuencia de bases en el DNA.
• Polimorfismo son variaciones que debe aparecer necesariamente en al menos el 1% de la población.
Se describe tres tipos de polimorfismos:
A- Polimorfismo de nucleótido único (SNP, del inglés Single Nucleotide Polymorphism).
B- Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism).
C- Polimorfismos en el número de repetición en tándem (VNTR, del inglés Variable Number Tandem Repetition).

SNP:
Por definición, es una variación en la secuencia de DNA que afecta a una sola base de una secuencia del genoma.
Esta definición se vio modificada, siendo un tipo mas abarcativo que incluye:
- Variaciones de unos pocos nucleótidos.
- Inserciones y deleciones de un/unos pocos nucleótidos.

RFLP:
Se refiere a secuencias especificas de nucleótidos en el DNA que son reconocidas y cortadas por las enzimas restricción y que varí
an entre individuos.

VNTR:
Son repeticiones de secuencias de 9 a 100 pb. El numero de repeticiones es variable pero en general ronda entre 100 y 1000 pb.

Técnicas basadas en el polimorfismo


La frecuencia del polimorfismo significa que cada individuo tiene una constelación única de SNP, RFLP y VNTR. La combinació
n especifica de los sitios encontrados en una región especifica se denomina haplotipo, un genotipo en miniatura. El concepto de ha
plotipo actualmente se ha extendido a la descripción de combinaciones particulares de alelos o sitios de restricción (o cualquier otr
o marcador genético) de algún área definida del genoma.
• Mediante los SNP se creó un detallado mapa de haplotipos del genoma humano que facilita el trazado de los mapas de los genes
provocadores de enfermedades.
• La existencia de RFLP constituye la base de una técnica que permite establecer relaciones inequívocas entre los progenitores y s
u progenie. Cuando se duda de la paternidad, la comparación del mapa RFLP de una región cromosómica adecuada de los progeni
tores potenciales y del hijo permite asignar de manera absoluta el parentesco. El uso del análisis de restricción del DNA para la id
entificación de individuos se ha denominado huella genética.
• El análisis de secuencias VNTR especialmente variables se utiliza en el mapeo del genoma humano.

ESTRUCTURA DE LOS GENES


La naturaleza hereditaria de todo organismo viviente es definida por su genoma, el cual consiste en un secuencia larga de acido nu
cleico que proporciona la información necesaria para construir el organismo. Se utiliza el termino "información" debido a que el g
enoma por si mismo no desempeña ninguna funcion activa en la construcción del organismo, mas bien es la secuencia de las subu
nidades individuales (bases) del acido nucleico la que determina las características hereditarias. Por una compleja serie de interacc
iones, esta secuencia se utiliza para producir todas las proteinas del organismo en el momento y el lugar apropiados. Las proteinas
forman parte de la estructura del organismo o tienen la capacidad de construir estructuras o llevar a cabo las reacciones metabólica
s necesarias para la vida.
El genoma contiene el conjunto completo de información hereditaria para cualquier organismo. Físicamente, el genoma puede ser
dividido en varias moléculas diferentes de acido nucleico y funcionalmente, en genes. Cada gen es una secuencia que dentro del a
cido nucleico representa a una sola proteína. Cada una de las moléculas de acido nucleico que componen el genoma puede conten
er gran numero de genes.

DEFINICION DE GEN:
Según la biología clásica, "un gen es una parte de un cromosoma que determina o afecta un solo carácter o fenotipo"
Según la biología molecular, "un gen es un segmento de material genético que determina o codifica una proteína"
Según la bioquímica, "un gen es una secuencia de DNA que codifica un producto final con funcion estructural o catalítica"
TAMAÑO DE UN GEN:
El tamaño mínimo global de los genes que codifican proteinas puede calcularse de forma directa sabiendo que por cada aminoácid
os de una hebra polipeptídica, intervino tres nucleótidos consecutivos en una de las hebras del DNA.
El conjunto de tres nucleótidos se lo conoce como codón. Estos están dispuestos en una secuencia que corresponde a la secuencia
de aminoácidos del polipéptido codificado por el gen. A una hebra polipeptídica de tamaño medio de 350 aminoácidos le correspo
nderían 1050 pares de bases. Muchos genes de organismos eucariotas y unos pocos de bacterias y arqueas se encuentran interrump
idos por segmentos de DNA no codificante y son, por lo tanto, considerablemente mas largos que el tamaño sugerido mediante est
e calculo sencillo.

 ESTRUCTURA DE LOS GENES:

• ESTRUCTURA DE UN GEN EUCARIOTA

CARACTERISRICAS:
- La mayoría de los genes eucariotas contienen exones e intrones.
- Todo gen comienza con el exón 1.
- El transcrito primario, el mRNA sin procesar, se extiende desde el nucleótido +1 hasta el nucleótido final del gen.
- El promotor es una región ubicada "upstream" (no se transcribe) que es necesaria para que la enzima RNA polimerasa (RNApol)
pueda sintetizar el transcrito primario.
- El mRNA maduro o procesado contiene solo los exones mas el CAP (5') y Poli A (3').
- Los ribosomas comienzan a traducir la proteína a partir del codón de inicio del mRNA, generalmente AUG, y terminan en el cod
ón de STOP, por ejemplo UGA.

Caperuza o Casquete CAP


Es un nucleótido modificado de guanina, la 7-metilguanosina trifosfato, Esta caperuza es necesaria para el proceso normal de trad
ucción del RNA y para mantener su estabilidad; esto es fundamental para el reconocimiento y el acceso apropiado del ribosoma.
Codones AUG y STOP
Estos codones no están en los extremos 5' y 3'respectivamente del mRNA maduro. Existen por lo tanto regiones 5' y 3' no traducid
as (5' y 3' UTR del ingles "UnTranslated Region") en el mRNA maduro.
Se denomina ORF (Open Reading Frame) o marco de lectura abierta a la región del DNA que codifica para una proteína. En otras
palabras, el ORF es la secuencia del DNA equivalente a la secuencia del mRNA maduro que se extiende desde el codón de inicio,
AUG, hasta el codón de STOP de la traducción.
Debido a la presencia de intrones, el ORF de un gen eucariota es discontinuo.

• ESTRUCTURA DE UN GEN PROCARIOTA

CARACTERISTICAS
-La mayoría de los genes procariotas no tiene intrones.
- La transcripción de los genes procariotas requiere de un promotor al igual que los genes eucariotas.
- En la mayoría de los genes procariotas el mRNA no sufre procesamiento.
- Los genes procariotas poseen regiones 5' y 3' UTR al igual que los genes eucariotas.
- La región 5' UTR de los genes procariotas contiene un RBS (Ribosome Binding Site, o sitio de unión al ribosoma) próximo al co
dón de inicio de la traducción AUG.
- Para expresar un gen eucariota en una célula procariota se requiere un vector de expresión que contenga un promotor, un RBS y
una secuencia terminadora de la transcripción que sean reconocidos por la maquinaria de la célula huésped.

EN RESUMEN =
• Un gen es una secuencia de DNA que codifica un producto final con funcion estructural o catalítica. Empieza por el exón +1. La
transcripción de un gen es promovida por un promotor: La región promotora está compuesta por una secuencia específica de DNA
localizada justo donde se encuentra el punto de inicio de la transcripción del DNA y contiene la información necesaria para activa
r o desactivar el gen que regula. Existen secuencias promotoras tanto en procariotas como eucariotas.
• El ORF o el marco de lectura abierto es la porción de material genético del gen que se transcribe. A pesar de que se transcribe to
dos los exones e intrones del gen, hay un segmento del exón 1 y del ultimo exón que no se lo considera parte de la ORF porque est
os son segmentos de donde se agarra la RNApol para sintetizar el transcrito primario.
• El transcrito primario es la secuencia complementaria de RNA del gen incluyendo los anticodones de iniciación y de stop, que so
n las secuencias complementarias de los codones de los mismo.
• El RNA maduro es el transcrito primario luego de sufrir un proceso de maduración. Este proceso (splicing) consiste en:
- Desaparición de los intrones
- Solapamiento de los exones
- Adición de la GAP y de una cola poli-A.
• Finalmente, el RNA maduro, mas comúnmente llamado RNA mensajero (mRNA) es traducido. El segmento de mRNA es menor
que lo que realmente mide el mRNA. Lógicamente, y esto se debe a los codones de iniciación y de finalización, que son posicion
es en donde se agarra el ribosoma para la traducción.
En células procariotas: El codón de inicio es: ATG
En células eucariotas: El codón de inicio es: AUG

COMPLEJIDAD DE LOS GENES Y CROMOSOMAS:


Las bacterias suelen tener un solo cromosomas por célula y en prácticamente todos los casos el cromosoma contiene únicamente u
na copia de cada gen. Unos pocos genes, como los del rRNA, están repetidos varias veces. Los genes y sus secuencias reguladoras
ocupan gran parte del DNA en las bacterias. Además, casi todos los genes son exactamente colineales con la secuencia de aminoá
cidos (o de RNA) que codifican.
La organización de los genes en el DNA eucariótico es mucho mas compleja, tanto estructural como funcionalmente. Muchos gen
es eucarióticos, tienen una estructura caracteristica: sus secuencias de nucleótidos contienen uno o mas segmentos intercalados de
DNA que no codifican la secuencia de aminoácidos del producto polipeptídico. Estas inserciones no traducidas interrumpen la pre
cisa relación colineal entre la secuencia de nucleótidos del gen y la secuencia de aminoácidos del polipéptido que codifica. Estos s
egmentos de DNA no traducido se denominan secuencias intercaladas o intrones, y los segmentos codificantes se denominan exon
es. Pocos genes bacterianos contienen intrones.
En los eucariotas superiores, los genes tienen en general mas secuencias en los intrones que en los exones. La funcion de las mism
as no esta clara en la mayoría de los caos. En total, solo el 1,5 % del DNA humano es codificante o exónico, con información para
productos proteicos o RNA. Sin embargo, cuando los intrones, de mayor tamaño, se incluyen en el cómputo, los genes representa
n hasta el 30 % del genoma humano.
La relativa escasez de genes en el genoma humano deja la funcion de una gran cantidad de DNA por definir.
Una gran parte del DNA no génico consiste en secuencias repetidas de diferentes tipos. Alrededor de la mitad del genoma humano
consiste en secuencias moderadamente repetitivas derivadas de elementos transponibles, segmentos de DNA de unos pocos cente
nares a varios miles de pb de longitud que pueden moverse de un ligar a otro del genoma. Los elementos transponibles, o transpos
ones, son un tipo de parasito molecular, que se aloja eficazmente en el genoma del huésped. Muchos poseen genes que codifican l
as proteinas que catalizan el proceso de transposición. Algunos transposones del genoma humano son activos, con baja frecuencia
de transposición, pero la mayoría son reliquias inactivas alteradas por mutación a lo largo de la evolución. A nivel evolución, los t
ransposones juegan el papel de poder generar nuevas secuencias genómicas (debido a su redistribución).
Aprox un 3 % del genoma humano consiste en secuencias altamente repetitivas, (SSR, repeticiones de secuencia simple). Son sec
uencias cortas (<10), que pueden estar repetidas millones de veces. El DNA de secuencia simple también ha sido denominado DN
A satélite, porque su inusual composición de bases hace que migre como bandas separadas del resto del DNA, cuando se centrifug
an muestras de DNA celular fragmentado en gradientes de densidad de cloruro de cesio. Na parece que el SSR codifique proteinas
o RNA. En contraste con los elementos transponibles, el SRR puede que tenga una importancia funcional identificable en el meta
bolismo celular humano puesto que en buena parte esta asociado con dos importantes estructuras de los cromosomas eucariotas: lo
s centrómeros y los telómeros.
Se han construido cromosomas artificiales con el propósito de comprender mejor el significado funcional de muchas de las caracte
rísticas estructurales de los cromosomas eucarióticos. Un cromosoma artificial y lineal requiere para ser razonablemente estable so
lamente tres componentes: un centrómero, los telómeros en los extremos y las secuencias que controlan el inicio de la replicación
del DNA. Los cromosomas artificiales de levadura por ejemplo, han sido desarrollados respondiendo a los requerimientos de la in
vestigación biotecnológica. También se están desarrollando cromosomas artificiales humanos para el tratamiento de enfermedades
genéticas por terapia génica somática.

A- CENTROMERO: consiste en una secuencia de DNA que actúa de punto de unión de las proteinas que fijan el cromosoma al h
uso mitótico. Esta unión resulta esencial para que se produzca la segregación igual y ordenada de los conjuntos de cromosomas en
tre las células hijas durante la división celular.
Las secuencias esenciales para la funcion de los centrómero en eucariotas son largos que generalmente contienen SSR, que 9consi
ste en miles de copias den tándem de una o unas pocas secuencias cortas de 5 a 10 pb en la misma orientación. Todavía no se cono
ce el papel exacto del DNA de secuencia simple en la funcion del centrómero.
B- TELOMEROS: son secuencias con funcion estabilizadora del cromosoma situadas en los extremos de los cromosomas eucariót
icos. Los telómeros terminan con secuencias del tipo:

donde:
x e y suelen oscilar entre 1 y 4. El numero de repeticiones en el telómero, n, esta entre 20 y 200 en la mayoría de eucariotas unicel
ulares y es generalmente superior a 1500 en mamíferos. Los extremos de una molécula lineal de DNA no pueden ser replicados de
manera rutinaria por la maquinaria de replicación celular (ello puede ser una de las causas de la circularidad del DNA bacteriano).
Las secuencias repetidas de los telómeros se añaden a los extremos de los cromosomas eucarióticos principalmente por la enzima
telomerasa.
EVOLUCIÓN DE GENOMAS
Existen principalmente cinco cambios a nivel genético que contribuyen a la evolución:
• Las mutaciones (mutation within a gene)
• La duplicación de genes (gene duplication)
• La deleción de genes (gene deletion)
• Reordenamientos de exones (exon shuffling)

 MUTATION WITHIN A GENE


Ocurre espontáneamente por procesos de inserción de elementos móviles. Estos pueden interrumpir la estructura y/o funcionalidad
de un gen, ya sea:
• Alterando al promotor
• Afectando el ORF
• Influenciando las secuencias de intrones y exones reguladoras del splicing
 GENE DUPLICACION
La duplicación de genes ocurre por un proceso conocido como unequal crossing over (entrecruzamiento desigual). El unequal cros
sing over también produce deleciones (gene deletion).

 GENE DELETION
La deleción de genes ocurre por procesos de transposición seguidos de recombinación homologa:
* las líneas representan dsDNA

 EXON SHUFFLING
Existen dos mecanismos de exon shuffling:
• Por recombinación homologa entre secuencias repetitivas dispersas:

• Por transposición:
-----------------------------------Replicación del DNA------------------------------------
La necesidad de la transmisión de la información genética a las siguientes generaciones suficientemente fidelidad, pero con capaci
dad para admitir las mutaciones beneficiosas, ha llevado a la evolución de complejos mecanismos para la replicación, reparación y
recombinación del DNA.
El modelo de la doble hebra del DNA planteado por Watson & Crick, sugiere un posible mecanismo de reproducción del material
genético. Mas tarde, postulan dicho mecanismo: "Una hebra de DNA puede actuar como molde para dirigir la síntesis de su hebra
complementaria".

REPLICACION DEL DNA EN PROCARIOTAS


ENZIMOLOGIA
A- HORQUILLAS DE REPLICACION
La replicación del DNA se lleva a cabo mediante enzimas conocidas como DNA polimerasas (DNApol). Estas enzimas utilizan u
na hebra del DNA como molde sobre el que catalizan la síntesis de la hebra complementaria, a partir de los desoxinucleósidos trif
osfato adecuados.
Los nuevos nucleótidos se seleccionan por su capacidad para aparearse, según la complementariedad demostrada por Watson & C
rick, con las bases de la molécula molde, de modo que la hebra recién sinterizada forma una doble hebra con la hebra molde. Casi
todas las DNApol conocidas puede añadir únicamente el nucleótido aportado por un nucleósido trifosfato, al grupo 3'-OH libre de
un polinucleótido, que tiene sus bases apareadas, de forma que la hebra de DNA se extiende solo en la dirección 5' → 3' (recordar
por ejemplo en PCR que se requiere únicamente un extremo 3’ libre para que la Pol pueda replicar, de manera que sintetizara siem
pre en dirección 5’ – 3’):

La replicación es semiconservativa
Las primeras pruebas sobre el mecanismo de replicación de los cromosomas se obtuvo mediante autorradiografías de DNA en repl
icación. Estas autorradiografías de cromosomas circulares creciendo en un medio que contenía [3H]timidina mostraban la existenc
ia de "burbujas" de replicación. Estas estructuras, denominadas estructuras theta indican que el DNA dúplex se replica por una pro
gresiva separación de las dos hebras paternas, acompañado de una síntesis de sus hebras complementarias, dando lugar, de forma s
emiconservadora, a dos dobles hebras hijas.
El punto de separación de las dos hebras en el ojo de replicación, donde la síntesis tiene lugar, se denomina horquilla de replicació
n. Una burbuja de replicación puede contener una o dos horquillas de replicación (replicación unidireccional o bidireccional), sien
do la replicación en la mayoría de las veces bidireccional.
El DNA procariótico y el de los bacteriófagos solo poseen un único origen de replicación (punto donde se originan las burbujas de
replicación).

La replicación es semidiscontínua
Las dos hebras antiparalelas del DNA dúplex se replican simultáneamente a medida que avanza la horquilla de replicación. Pero, t
odas las DNApol conocidas tan solo pueden extender las hebras en la dirección 5' → 3', lo que implica que para la hebra complem
entaria del molde (la hebra molde que va en 5' → 3') se debe replicar mediante otro mecanismo de replicación.
Okazaki, basándose en sus experimentos, planteo un modelo de replicación, que además de ser semiconservativa, es semicontínua,
lo que implica que las dos hebras paternas se replican de modo diferente:
- La hebra de DNA sintetizada de nuevo, que crece en dirección 5' → 3', al igual que el avance de la horquilla de replicación, es la
denominada hebra conductora y es sintetizada de manera continua.
- La otra hebra de DNA sintetizada de nuevo, que crece también en dirección 5' → 3', pero en contra al avance de la horquilla de r
eplicación, es la denominada hebra retrasa y es sintetizada de forma discontinua, mediante fragmentos de DNA, llamados fragmen
tos de Okazaki. Estos fragmentos se unen covalentemente, despues de su síntesis, en una reacción catalizada por la enzima DNA li
gasa.
Ahora bien, todas las DNApol necesitan, para extender la hebra de DNA, un extremo 3'-OH libre. La síntesis de la hebra retrasada
parten de extremos 5' que consisten en segmentos de RNA de 1 a 60 nucleótidos, que son complementarios a la hebra de DNA m
olde.

Las procariotas posee dos enzimas que catalizan la formación de estos cebadores de RNA: la RNA polimerasa (RNApol), y otra d
e menor tamaño, la primasa. La primasa es resistente a la acción de la rifampicina (antibiótico), mientras que la RNApol no.
La observación de que la rifampicina inhibe únicamente la síntesis de la hebra conductora esta indicando que la primasa es la enca
rgada de sintetizar los cebadores de los fragmentos de Okazaki.
Con respecto a la hebra conductora, in vitro puede ser sinterizada tanto por la RNApol como la primasa. Pero el proceso es altame
nte estimulado cuando las dos enzimas están presentes. Es por ello, que estas dos enzimas deben actuar sinérgicamente in vivo en
el inicio de la síntesis de la hebra conductora.
El DNA replicado, ya maduro, no contiene ningún fragmento de RNA. Los cebadores de RNA se eliminan durante el proceso de l
a replicación y los huecos monohebra que dejan son llenados con DNA.

B- NUCLEASAS
Las nucleasas son enzimas que degradan a los A.N. Mas específicamente, se llaman ADNsas a aquellas que degradan al DNA, y
ARNasas a las que degradan al RNA.
Todas las células contienen varias nucleasas diferentes, que pueden clasificarse en dos grandes grupos:
- las exonucleasas degradan los A.N. desde un extremo de la molécula. Muchas actúan solo en dirección 5' → 3' o bien en direcció
n 3' → 5' eliminando nucleótidos solo de los extremos 5' o del 3' respectivamente, de una hebra de acido nucleico de doble hebra.
- las endonucleasas pueden empezar a degradar en sitios interno específicos de una hebra o molécula de A.N., reduciéndolo a frag
mentos cada vez mas pequeños. Unas pocas exonucleasas y endonucleasa degradas exclusivamente DNA de hebra sencilla. Hay u
nas pocas clases de endonucleasas de gran importancia que degradan secuencias de nucleótidos especificas, las mas importantes s
on las endonucleasas de restricción.

C- ENZIMAS DE REPLICACION
La replicación del DNA es un proceso complejo en el que intervienen gran variedad de enzimas y otras proteinas. Las principales
son:
1- DNA girasa
2- Maquinaria proteica que opera en la horquilla de replicación
3- Una DNApol
4- Una exonucleasa
5- Una DNA ligasa

1- DNA girasa
La separación de las hebras de un DNA dúplex circular tiene diferentes problemas topológicos. La separación de las hebras de la d
oble hebra sufre un proceso de desenrollamiento de la estructura.
La separación de las dos hebras de una molécula de DNA circular (o una molécula lineal que no puede girar con libertad, como oc
urre en un gran cromosoma eucariota) genera un aumento de la tensión a medida que se desenrolla que no puede liberarse por rota
ción de la molécula.

Una molécula de DNA sobrenrollada adquiere un superenrollamiento positivo. Por lo tanto, el movimiento de la horquilla de repli
cación genera un superenrollamiento positivo en la porción no replicada del DNA por delante de la horquilla. Cuando se considera
que un cromosoma circular completo de procariotas contiene alrededor de 400000 vueltas y lo duplican dos horquillas de replicac
ión en 40 min, se planteo que había un mecanismo que debía alivianar la tensión.
Las células contienen enzimas, llamadas topoisomerasas, capaces de cambiar el estado de superenrollamiento de la molécula de D
NA. Una enzima de este tipo, denominada DNA girasa, una topoisomerasa de tipo II, libera la tensión mecánica que se crea durant
e la replicación en procariotas. Las moléculas de la DNA girasa se desplazan a lo largo del DNA por delante de la horquilla de rep
licación y eliminan los superenrollamiento positivos. La DNA girasa realiza esta tarea al cortar las dos hebras del DNA dúplex; un
segmento del DNA pasa a través de la rotura de la doble hebra hacia el otro lado y entonces se ligan los cortes de nueva cuenta, u
n proceso que se lleva a cabo por liberación de energía durante la hidrolisis de ATP. Las células eucariotas poseen enzimas similar
es que realizan esta funcion.

2- Maquinaria proteica que opera en la horquilla de replicación


Son proteinas que separan las hebras del DNA en la horquilla de replicación e impiden la nueva unión de las hebras antes de su re
plicación. La replicación supone mas que la incorporación de nucleótidos. El desenrollamiento del dúplex y la separación de las h
ebras requiere la ayuda de dos tipos de proteinas que se unen al DNA, una helicasa (o enzima que desenrolla al DNA) y proteinas
que unan al DNA monocatenario SSB (que impiden que se unan nuevamente hasta su replicación). Las DNA helicasa desenrollan
al dúplex del DNA en una reacción que utiliza energía liberada a partir de la hidrolisis del ATP para separar los puentes de H2 que
mantienen juntas a las dos hebras, lo cual expone a los moldes de DNA monocatenario. procariotas tiene por lo menos 12 helicasa
s diferentes, que usa en distintos aspectos del metabolismo de los A.N. Una de estas helicasas sirve como la maquinaria principal
de desenrollamiento durante la replicación. La DnaB helicasa consiste en seis subunidades estructuradas que forman una proteína
semejante a un anillo que encierra a una sola hebra de DNA. La DnaB helicasa se coloca primero sobre el DNA en el origen de re
plicación (con ayuda de la proteína DnaC) que se desplaza en una dirección 5' → 3' a lo largo de la plantilla de la hebra retrasada,
lo que desenrrolla la hélice durante este proceso.
El desenrollamiento del DNA por la helicasa se mantiene por la unión de las proteinas SSB a las hebras separadas de DNA.
Estas proteinas se unen de manera selectiva al DNA monocatenario manteniéndolo en un estado extendido y evitando que se vuel
va a enrrolla o se dañe.
En las bacterias, la primasa y la helicasa se relacionan de manera transitoria para formar un "primisoma". De los dos miembros del
primisoma, la helicasa se mueve a lo largo de la plantilla de la hebra retrasada de manera procesiva (sin separarse de la plantilla d
e la hebra durante el tiempo que dura la horquilla de la replicación). Conforme la helicasa "viaja" a lo largo de la plantilla de la he
bra retrasada y abre las hebras del dúplex, la primasa se une de manera periódica a la helicasa y sintetiza los iniciadores cortos de
RNA que comienzan la formación de cada fragmento de Okazaki. Los iniciadores de RNA permite la posterior elongación como
DNA por medio de una DNApol, llamada DNApol III.

3- DNA polimerasas
En la procariotas existen al menos 5 DNA polimerasas. En todas, comparten 2 características en común:
1- Todas las DNApol requieren un molde. La reacción de polimerización esta dirigida por una hebra molde de DNA según las regl
as de apareamiento de bases predichas por Watson & Crick.
Este proceso es el primero en descubrirse en donde se aprecio que la información genética se transmite empleando moldes de mate
rial genético existente.
2- Las polimerasas requieren un cebador. Un cebador es un segmento de hebra (complementario del molde) con un grupo 3'-OH li
bre al cual pueden añadirse nucleótidos. El extremo 3' del cebador se denomina extremo terminal del cebador. Parte de la nueva he
bra ya tiene que encontrarse en su lugar; todas las DNApol, sin excepción, únicamente son capaces de añadir nucleótidos a una he
bra preexistente.
Despues de añadir un nucleótido a una hebra de DNA en crecimiento, la DNApol se disocia o bien se traslada a lo largo del molde
y añade otro nucleótido. La disociación y la reasociación de la polimerasa pueden limitar la velocidad global de polimerización. E
l proceso es generalmente mas rápido si la polimerasa añade mas nucleótidos sin disociarse del molde. El numero medio es el núm
ero de nucleótidos añadidos antes de que una polimerasa se disocie.
La DNApol I fue la primera en descubrirse. Esta cataliza la transferencia de un grupo fosforilo. El nucleófilo es el grupo 3'-OH del
nucleótido en el extremo 3' de la hebra en crecimiento. El ataque nucleofílico se produce sobre el fosforo alfa del desoxinucleósid
o 5'-trifosfato entrante. En la reacción se libera pirofosfato inorgánico. La ecuación general:
(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
donde dNMP y dNTP son desoxinucleósidos 5'-monofosfato y 5'-trifosfato, respectivamente. La reacción aparentemente tiene lug
ar con solo un cambio mínimo de energía libre, puesto que se forma un enlace fosfodiéster a expensas de un anhídrido fosfórico al
go menos estable. Sin embargo, las interacciones no covalentes de apilamiento y de apareamiento de bases estabilizan el DNA ala
rgado en relación con el nucleótido libre. Además, en la célula la formación de productos esta favorecida por los 19 kJ/mol genera
dos por la subsiguiente hidrolisis del producto pirofosfato por la enzima pirofosfatasa.
Poco tiempo despues, se determino experimentalmente que la DNApol I no podía actuar en solitario. Estos resultados arrojaron qu
e:
A- Su velocidad es demasiado lenta para explicar la velocidad del movimiento de la horquilla de replicación en las células bacteria
nas.
B- El DNApol I tiene una procesividad relativamente baja.
C- Estudios genéticos han demostrado que en la replicación intervienen muchos genes y, por lo tanto, muchas proteinas, lo cual da
un indicio de que la DNApol I no actúa aisladamente.
D- Al estudiar una cepa bacteriana con el gen de la DNApol I alterada, y ver que dicha enzima estaba inactiva, pero que al emplea
r agentes que dañaban al DNA, las bacterias eran viables, confirmo dicho hipótesis.
La búsqueda de otras polimerasa llevo al descubrimiento de la DNApol II y de la DNApol III en procariotas. La DNApol II es una
enzima implicada en un tipo de reparación del DNA. La DNApol III es la enzima principal de replicación en procariotas.
Las DNApol IV y V están implicadas en un tipo de reparación del DNA poco habitual.
La DNApol I no es la enzima principal de la replicación; en cambio realiza una multitud de funciones de limpieza durante la replic
ación, la recombinación y la reparación. Estas funciones especiales están potenciadas por su actividad exonucleotílica 5' → 3'. Est
a actividad esta localizada en un dominio estructural que puede ser separado de la enzima mediante un tratamiento proteolítico sua
ve. Cuando se elimina el dominio exonucleotílico 5' → 3', el fragmento grande o de Klenow, retiene las actividades de polimeriza
ción y de corrección de pruebas. La actividad exonucleasa 5' → 3' de la DNApol I intacta puede reemplazar un segmento de DNA
(o RNA) apareado a la hebra molde, en un proceso llamado proceso llamado translación de la mella. La mayoría de DNApol resta
ntes carecen de actividad exonucleasa 5' → 3'.
La DNApol III, con diez tipo de subunidades, es mucho mas compl3ja que la DNApol I. Sus actividades de polimerización y de c
orrección de pruebas reside en las subunidades alfa y épsilon, respectivamente. La subunidad theta se asocia con las subunidades a
lfa y épsilon para formar la polimerasa núcleo, capaz de polimerizar el DNA, pero de procesividad limitada. Dos polimerasas núcl
eo se pueden unir mediante otro conjunto de subunidades, un complejo de carga de la abrazadera, o complejo gamma, consistente
en cinco subunidades de cuatro subtipos diferentes. Las polimerasas núcleo se unen a través de las subunidades tau. Dos subunida
des adicionales chi y psi, están unidas al complejo de la abrazadera.

El conjunto completo de 13 subunidades proteicas (de nueve tipos diferentes) se denomina DNApol III*.
Las DNApol III* puede polimerizar DNA, pero con una procesividad mucho menor que la necesaria para la replicación organizad
a del cromosoma completo. El necesario aumento de procesividad resulta de la unión de las subunidades beta, cuatro de las cuales
completan la holoenzima de la DNApol III. Las subunidades beta se asocian por pares para formar una estructura toroidal que rod
ea el DNA y que actúa como una abrazadera. Cada dímero se asocia con un subconjunto núcleo de la polimerasa III* (una abrazad
era dimérica por subconjunto núcleo) y se desliza a lo largo a medida que avanza la replicación. La abrazadera beta deslizante imp
ide la disociación de la DNApol III del DNA, lo cual aumenta de forma espectacular la procesividad.

*Todas las DNApol presentan actividad polimerizadora 5’ – 3’, sin embargo, solo la DNApol I presenta actividad exonucleasa
en la misma dirección 5’ – 3’. La DNApol III es la enzima principal en el proceso de replicación, por su alta procesividad.

4- Exonucleasa
La DNApol I presenta diferentes propiedades que son desconcertantes, entre ellas, que la misma presenta actividad de exonucleas
a, lo cual es contradictorio para una enzima que aparentemente cataliza la síntesis de DNA y no su degradación.
Se demostró que todas las polimerasas bacterianas poseen la actividad de exonucleasa, por lo que la DNApol I tiene tres actividad
es:
- actividad de exonucleasa 5' → 3'
- actividad de exonucleasa 3' → 5' (corrección de pruebas)
- actividad de polimerización 5’ – 3’
Estas tres actividades se localizaron en diferentes dominios de un solo polipéptido. De esta forma, la DNApol I posee tres enzimas
en una. Las dos actividades de exonucleasa tienen funciones por completo diferentes en la replicación.
Además, casi todas las nucleasas son especificas para DNA o RNA pero la exonucleasa 5' → 3' de la DNApol I puede degradar lo
s dos tipos de A.N. El inicio de los fragmentos de Okazaki por medio de la primasa deja un segmento de RNA en el extremo 5' de
cada fragmento, el cual se remueve por la actividad de exonucleasa 5' → 3' de la DNApol I. A medida que la enzima remueve los
ribonucleótidos del iniciador su actividad de polimerasa rellena de manera simultanea el espacio resultante con desoxirribonucleót
idos. El ultimo desoxirribonucleótido incorporado se liga de manera covalente al extremo 5' terminal del fragmento de DNA antes
sinterizado por medio de una DNA ligasa.

5- DNA ligasa
En el contexto de la replicación, la DNA ligasa se encarga de unir los fragmentos de DNA que reemplazan los cebadores de RNA
con los fragmentos de Okazaki.
Su función es catalizar un enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-hidroxilo extremo de una de las hebras de DNA y el grupo 5'-difosf
ato del extremo de la otra hebra de DNA. Para llevar a cabo esta reacción, la célula necesita energía:
- En las células eucariotas y en las arqueas, la fuente de energía es el ATP.
- En las bacterias obtienen la energía del NAD+.

MECANISMO DE REPLICACION
- MODELO DEL CIRCULO RODANTE (BACTERIÓFAGOS)
La replicación por medio de círculos rodantes es común entre bacteriófagos. Los genomas unitarios pueden ser separados de la col
a desplazada y generar monómeros que es posible empacar en partículas de fagos o utilizar para ciclos de replicación posteriores.
El destino de la cola desplazada determina el tipo de productos generados por los círculos rodantes. La división de una uni
dad genera monómeros, que pueden ser convertidos en estructuras dúplex o circulares. La división de los multímeros gene
ra una serie de copias repetidas en tándem de la unidad original. La conversión a hebra doble podría ocurrir antes de que
la hebra se desprenda del circulo rodante.
En general, un fago esta formado por un DNA circular de hebra individual conocido como hebra positiva (+); por otra parte, se sin
tetiza una hebra complementaria denominada hebra negativa (-). Por esta acción se genera el circulo dúplex que es replicado poste
riormente por un mecanismo de circulo rodante.
El circulo dúplex se transforma en una estructura cerrada de manera covalente, la cual se superenrrolla. Una proteína codificada p
or el genoma del fago, la proteína A, hace una hendidura en la hebra (+) del DNA dúplex en un sitio especifico que define el orige
n de la replicación. Despues de que se forma la hendidura en el origen, la proteína A se mantiene conectada con el extremo 5' que
genera, mientras que el extremo 3' es extendido por la DNApol.
La estructura del DNA tiene una funcion importante en esta reacción, pues solo puede ser hendido cuando este superenrrollado ne
gativamente. La proteína A es susceptible de unirse a un fragmento decámero de hebra individual de DNA que rodea al sitio de he
ndidura, lo cual sugiere que el superenrrollamiento es necesario para facilitar la formación de una región de hebra individual que p
roporciona a la proteína A su sitio de unión. La hendidura genera un extremo 3'-OH y uno 5'-P (adherido de manera covalentemen
te a la proteína A), los cuales tienen un papel que desempeñar en la replicación de fagos.
Utilizando el circulo rodante, el extremo 3'-OH de la hendidura se extiende en una nueva hebra que se alarga en torno a la hebra m
olde (-) circular hasta que llega al punto de inicio y desplaza al origen, cuando la proteína A vuelve a funcionar.
Permanece conectada al circulo rodante y también al extremo 5' de la cola desplazada, de modo que se mantiene cerca, mientras q
ue el punto creciente regresa y rebasa al origen. Por consiguiente, la misma proteína A vuelve a estar disponible para reconocer el
origen y hendirlo, adhiriéndose ahora al extremo generado por la nueva hendidura. El ciclo puede repetirse indefinidamente. Desp
ues de este evento de formación de la hendidura, la hebra individual (+) desplazada es liberada en forma circular. La proteína A pa
rticipa en la formación del circulo, de hecho, la unión de los extremos 3' y 5' de la hebra (+) producida se logra a través de ella co
mo parte de la reacción por la cual es liberada al final de un ciclo de replicaci6n para que empiece otro. La proteína A tiene una pr
opiedad inusual posiblemente relacionada con estas actividades. In vivo actúa en configuración cis. (No es posible reproducir este
comportamiento in vitro, como puede observarse a partir de su actividad en cualquier molde de DNA de un sistema sin células.) L
a implicación es que, in vivo, la proteína A sintetizada por un genoma en particular puede adherirse solo al DNA de dicho genoma
, pero se desconoce como. Sin embargo, su actividad in vitro muestra como se mantiene asociada a la misma hebra molde (-) prog
enitora. La proteína A tiene dos sitios activos, lo cual le permite dividir el origen "nuevo" mientras aun conserva el "antiguo"; des
pues se liga a la hebra desplazada en un circulo. Una vez formada la estructura circular, la hebra (+) desplazada puede tener dos de
stinos. Durante la fase de replicación de la infección vírica puede ser utilizada como molde para sintetizar la: hebra (-) complemen
taria; el circulo dúplex puede ser utilizado despues como circulo rodante para generar mas progenie. Por otra parte, durante la mor
fogénesis del fago, la hebra (+) desplazada se empaqueta en el virión fágico.

- MODELO THETA (PROCARIOTAS)


La síntesis de una molécula de DNA se divide en tres fases: inicio, elongación y terminación. Estas fases se distinguen por las reac
ciones que tienen lugar y por las enzimas implicadas. La síntesis de los principales biopolímeros que contienen información (DNA
, RNA y proteinas), se puede entender también en términos de las tres misma fases, cada una con sus características peculiares.
A- INICIO:
El origen de replicación consta de aprox 245 pb, que contienen secuencias de DNA muy conservadas entre los orígenes de replica
ción bacterianos.
En la fase de inicio de la replicación participan al menos 10 enzimas o proteinas diferentes. Estas se encargan de abrir la hélice del
DNA en el origen y establecen un complejo precebador para las reacciones posteriores. El componente clave en el proceso de inic
io es la proteína DnaA un miembro de la familia proteica de las AAA+ ATPasa (ATPasas asociadas con diversas actividades celul
ares).
B- ELONGACION:
La fase de elongación en la replicación consiste en dos operaciones distintas, pero relacionadas: la síntesis de la hebras conductora
y la síntesis de la hebra rezagada. En la síntesis de ambas hebras son importantes varias enzimas que se encuentran en la horquilla
de replicación. El DNA parental primero es desenrrollado por DNA helicasas y la tensión topológica resultante es liberada por las
topoisomerasas. Las SSB estabilizan a continuación cada una de las hebras separadas. A partir de este punto, los procesos de sínte
sis de la hebra conductora y de la hebra rezagada difieren radicalmente.
La síntesis de la hebra conductora, la mas sencilla de las dos, empieza por la síntesis de un corto cebador (10 a 60 nucleótidos) de
RNA por la primasa (proteína DnaG) en el origen de replicación. La DnaG interacciona con la helicasa DnaB para llevar a cabo es
ta reacción y el cebador es sintetizado en dirección opuesta a la del movimiento de la helicasa DnaB. En efecto, la helicasa DnaB s
e mueve a lo largo de la hebra que se convierte en la hebra rezagada durante la síntesis de DNA; sin embrago, el primer cebador d
epositado en la primera interacción DnaG - DnaB sirve para cebar la síntesis de la hebra conductora en dirección opuesta. Los des
oxirribonucleótidos son añadidos a este cebador por un complejo de DNApol III unida a la helicasa DnaB anclada en la hebra de
DNA opuesta. Seguidamente, la síntesis de la hebra conductora transcurre de manera continua, al mismo ritmo que el desenrollam
iento del DNA en la horquilla de replicación.
La síntesis de la hebra rezagada, se realiza a trozos de corta longitud, los fragmentos de Okazaki. Primero, la primasa sinteriza un
cebador de RNA y, como en la síntesis de la hebra conductora, la DNApol III se une al cebador de RNA y añade desoxirribonucle
ótidos.
La complejidad de la síntesis de la hebra rezagada reside en la coordinación de la síntesis de la hebra conductora y de la hebra reza
gada. Ambas hebras son producidas por un único dímero asimétrico de DNApol III. Para ello la hebra rezagada forma un lazo, que
aproxima los dos puntos de polimerización:
La síntesis de los fragmentos de Okazaki en la hebra rezagada pone en juego complejas actividades enzimáticas. La helicasa DnaB
y la primasa DnaG constituyen una unidad funcional dentro del complejo de replicación, denominado primisoma.
La DNApol III usa un juego de sus subunidades núcleo (la polimerasa núcleo) para la síntesis continua de la hebra conductora, mi
entras que el otro juego de subunidades núcleo circula entre un fragmento de Okazaki y el siguiente sobre el bucle formado por la
hebra rezagada. La helicasa DnaB, unida por delante de la DNApol III, desenrrolla el DNA en la horquilla de replicación, a medid
a que viaja a lo largo del molde de la hebra rezagada en dirección 5' → 3'. La primasa DnaG se asocia ocasionalmente con la helic
asa DnaB y sintetiza un corto cebador de RNA. Una nueva abrazadera deslizante beta es entonces posicionada en el cebador por el
complejo de carga de la abrazadera de la DNApol III. Cuando se ha completado la síntesis de un fragmento de Okazaki, la replica
ción se detiene y las subunidades núcleo de la DNApol III se disocian de su abrazadera desliza te beta (y del fragmento de Okazak
i completado) y se asocian con la siguiente abrazadera.
Ello inicia la síntesis de un nuevo fragmento de Okazaki. El conjunto del complejo responsable de la síntesis coordinada en la hor
quilla de replicación se denomina replisoma.
El replisoma efectúa una rápida síntesis de DNA a un ritmo de unos mil nucleótidos por segundo en cada hebra. Una vez ha finaliz
ado la síntesis de un fragmento de Okazaki, su cebador de RNA es eliminado y reemplazado con DNA por la DNApol I y la mella
restante es sellada por la DNA ligasa.
La DNA ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un 3' hidroxilo, al final de un hebra de DNA y un 5' fosfato al
final de otra hebra. El fosfato debe ser activado por adenililación. Las DNA ligasas aisladas de virus y eucariotas utilizan ATP con
este fin. Las DNA ligasas de bacterias son especiales ya que utilizan NAD+, un cofactor que normalmente se utiliza en las reaccio
nes de transferencia de hidruro como fuente del grupo activador AMP.
C- TERMINACION:
Finalmente, las dos horquillas de replicación del cromosoma circular se encuentran en una región terminal que contiene múltiples
copias de una secuencia denominada Ter. Las secuencias Ter están dispuestas en el cromosoma para crear una especie de trampa d
onde una horquilla de replicación puede entrar pero no salir.
Las secuencias Ter son lugares de unión para una proteína denomina Tus. El complejo Tus-Ter puede detener solo la replicación d
esde una única dirección. Dado que las horquillas de replicación que se mueven en direcciones opuestas se detienen al encontrarse
, se piensa que las secuencias Ter sirven para evitar la sobrerreplicación por una de las horquillas de replicación, en el caso de que
la otra se haya retrasado o detenido a causa de daños en el DNA u otro motivo.
En resumen, cuando alguna de las horquillas de replicación se topa con este complejo Tus-Ter se detiene; la otra horquilla se detie
ne cuando choca a la primera horquilla que ya esta detenida.

REPLICACION DEL DNA EN EUCARIOTAS


Las moléculas de DNA de las células eucariotas son considerablemente mayores que las de las bacterias y están organizadas en est
ructuras nucleoproteícas complejas. Los rasgos esenciales de la replicación del DNA son los mismos en las eucariotas y en las bac
terias, y muchos de los complejos proteicos están conservados funcional y estructuralmente. No obstante, la replicación en las euc
ariotas esta regulada y coordinada con el ciclo celular, lo que obliga al proceso de replicación ser un poco mas complejo.
Los orígenes de replicación tienen una estructura bien caracterizada en algunas eucariotas inferiores, pero están mucho menos defi
nidos en las eucariotas superiores. En los vertebrados, diversas secuencias ricas en A - T pueden utilizarse en el inicio de replicaci
ón, y los sitios pueden variar de una a otra división celular.
Las levaduras tienen orígenes de replicación definidos, denominados secuencias de replicación autónoma (ARS) o replicadores. L
os replicadores de levadura abarcan unos 150 pb y contienen varias secuencias esenciales conservadas. En el genoma haploide de l
evadura se encuentran unos 400 replicadores repartidos a lo largo de los 16 cromosomas.
La replicación del DNA celular una sola vez por ciclo esta sometida a regulación, que depende en gran parte de proteinas denomin
adas ciclinas y de las quinasas dependientes de ciclinas (CDK) que forman complejos. Las ciclinas son rápidamente destruidas por
proteólisis dependientes de ubiquitina al final de la fase M (mitosis), y la ausencia de ciclinas permite la formación de complejos
prerreplicativos (preRC) en los sitios de inicio de la replicación. En las células de crecimiento lento no se forman hasta el final de
G1. La formación de los preRC permite que la célula sea competente para la replicación, hecho en ocasiones denominado autoriza
ción.
Como en las bacterias, el evento clave del inicio de la replicación en todas las eucariotas es la carga de la replicasa replicativa, un
complejo heterohexamérico de proteinas de mantenimiento del minicromosoma (MCM).
La helicasa MCM2-7 con forma de anillo y de funcionamiento muy similar a la helicasa DnaB, se asocia al DNA mediante otro co
mplejo de proteinas denominado ORC (complejo de reconocimiento del origen). El ORC tiene cinco dominios AAA+ ATPasa en
sus subunidades y es funcionalmente análogo a la AADN bacteriana.
La velocidad del movimiento de la horquilla de replicación en las eucariotas es de unos 50 nucleótidos/segundo. A esta velocidad,
la replicación de un cromosoma humano de tamaño medio que transcurriera a partir de un solo origen tardaría mas de 500 horas. L
a replicación de los cromosomas humanos de hecho tiene lugar de forma bidireccional a partir de múltiples orígenes situados entre
30 y 300 kb uno de otro. Los cromosomas eucarióticos son casi siempre mucho mayores que los cromosomas bacterianos; la pres
encia de múltiples orígenes es, pues muy probablemente una caracteristica general de las células eucarióticas.
Al igual que en las bacterias, en las células eucarióticas hay varios tipo de DNApol. Algunas se han asociado a funciones especial
es tales como la replicación del DNA mitocondrial (ADNmt). En la replicación de los cromosomas nucleares interviene la DNApo
l alfa, en asociación con la DNApol delta.
- La DNApol alfa es típicamente una enzima formada por múltiples subunidades, de estructura y propiedades similares en todas la
s células eucarióticas. Una de las subunidades tiene actividad primasa y la otra contiene actividad de polimerasa. Sin embargo, est
a polimerasa carece de actividad exonucleasa 3' → 5' correctora de pruebas, lo que hace inadecuada para la síntesis fiel de DNA.
La DNApol alfa probablemente actué solamente en la síntesis de cebadores cortos (de DNA o de RNA) para los fragmentos de Ok
azaki de la hebra rezagada.
- La DNApol delta se encarga de alargar estos cebadores. Esta enzima, formada por múltiples subunidades, esta asociado a una pr
oteína, que lo estimula, denominada antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), que se encuentra en grandes cantidades en
el núcleo de las células en proliferación. La estructura tridimensional del PCNA es sorprendentemente parecida a la subunidad bet
a de la DNApol III de procariotas, aunque la estructura primaria no es homologa. Obviamente (como la estructura tridimensional
define la funcion), la funcion de la PCNA es similar a la de la subunidad beta, puesto que forma una abrazadera circular que poten
cia mucho la procesividad de la polimerasa. La DNApol delta tiene una actividad exonucleasa 3' → 5' correctora de pruebas y par
ece ser que realiza la síntesis de las hebras conductora y rezagada formando un complejo al de la DNApol III dimérica bacteriana.
- La DNApol épsilon, puede reemplazar a la DNApol delta en algunas situaciones, tales como la reparación del DNA. La DNApol
épsilon puede actuar también en la horquilla de replicación, tal vez con un papel análogo al de la DNApol I bacteriana, eliminand
o los cebadores de los fragmentos de Okazaki de la hebra rezagada.
Otros dos complejos proteicos también actúan en la replicación del DNA eucariótico. La RPA (proteína de replicación A) es una p
roteína eucariótica de unión a DNA de hebra sencilla, equivalente funcionalmente a la proteína SSB de procariotas. El RFC (facto
r de replicación C) es un cargador de abrazadera para PCNA que facilita el ensamblaje de complejos de replicación activos. Las su
bunidades del complejo RFC tienen una similitud de secuencia significativa con las subunidades del complejo bacteriano (gamma)
de carga de la abrazadera.
La terminación de la replicación de los cromosomas eucarióticos lineales requiere la síntesis de unas estructuras especiales denom
inadas telómeros en los extremos de cada cromosoma.

ENZIMA TELOMERASA
La secuencia de los telómeros de múltiples organismos, ha mostrado que la mayoría son oligómeros repetitivos con un alto conten
ido de G en la hebra con su extremo 3’ al final del cromosoma. La secuencia repetitiva telomérica en los vertebrados es TTAGGG
. El extremo 3’ de las hebras ricas en G se extienden 12 – 16 nucleótidos mas allá del extremo 5’ de la hebra complementaria rica
en C. Esta region esta unida por proteinas especificas que protegen los extremos de los cromosomas lineales del ataque por parte d
e las nucleasas.
La necesidad de una region especializada en los extremos de los cromosomas eucariotas es evidente cuando se considera que toda
s las DNApol conocidas alargan las hebras de DNA en el extremo 3’, y todas requieren un cebador de RNA o DNA. A medida qu
e la horquilla de replicación se aproxima al final de un cromosoma lineal, la síntesis de la hebra conductora continua hasta el final
de la hebra molde de DNA, completando una doble hebra de DNA hija.
Sin embargo, debido a que el molde de la hebra retardada se copia de manera discontinua, no se puede replicar en su totalidad.
Cuando se elimina el cebador de RNA final, no existe hebra en dirección 5’ sobre la cual la DNApol pueda trabajar para llenar los
huecos resultantes. Sin algún tipo de mecanismo especial, la hebra de DNA hija, resultante de la síntesis de la hebra rezagada, se
acortaría en cada división celular.
El problema del acortamiento de los telómeros se resuelve mediante una enzima que añade las secuencias repetidas teloméricas (T
EL) al extremo de cada cromosoma. La enzima es un complejo de RNA-proteina llamada transferasa terminal telomérica o telome
rasa. Debido a que la secuencia de RNA asociada a la telomerasa, sirve como molde para la adición de desoxirribonucleótidos a lo
s extremos de los telómeros, la fuente de enzima y no la fuente del cebador de DNA telomérico determina la secuencia añadida.
La telomerasa es una forma especializada de una transcriptasa reversa que transporta su propio molde de RNA interno para dirigi
r la síntesis de DNA.
El extremo 3’ de una hélice final de un telómero extendido por la telomerasa, contrarrestando la incapacidad del mecanismo de re
plicación del DNA para sintetizar el extremo final de DNA lineal.
Principales Características:
La telomerasa alarga este extremo de una hélice mediante un mecanismo de transcripción inversa reiterativo.
La telomerasa añade una unidad de repetición T2G4; otras telomerasas añaden secuencias levemente diferentes.
La telomerasa contiene un molde de RNA que forma apareamiento de bases con el extremo 3’ del molde de la hebra retrasada.

MECANISMO

1- La enzima contiene RNA telomerásico con un sector complementario a la secuencia de los telómeros.
2- La unión del DNA telomérico con al RNA telomerásico se produce por apareamiento de bases complementarias.
3- La enzima alarga el telómero usando como molde el RNA.
4- Al completar un alargamiento la enzima se desplaza y comienza un nuevo ciclo de alargamiento y así sucesivamente.

5 – La replicación de la hebra rezagada termina cuando un cebador de RNA sintetizado por la DNApol alfa se utiliza como extrem
o 3’ libre para la DNApol delta.

REGULACION DE LA DIVISION CELULAR: PARTICION DE LOS CROMOSOMAS


=> PROCARIOTAS
Las procariotas se reproducen por un tipo de división celular denominada fisión binaria o bipartición. La mayoría de los genes bac
terianos son transportados en un único cromosoma bacteriano que se compone de una única molécula circular de DNA y proteinas
asociadas. Aunque las bacterias son mas pequeñas y mas sencillas que las células eucariotas, el problema de replicar sus genomas
en forma ordenada y distribuir las copias equitativamente a dos células hijas, es que el cromosoma de la bacteria debe estar muy e
nrollado y plegado dentro de la célula.
En general, el proceso de división celular comienza cuando el DNA del cromosoma bacteriano comienza a replicarse. A medida q
ue el cromosoma continua replicándose, la célula se estira. Cuando la replicación se completa y la bacteria ha alcanzado alrededor
del doble de su tamaño inicial, su membrana plasmática crece hacia dentro, dividiendo la célula progenitora en dos células hijas. C
ada célula hereda un genoma completo.
Las dos copias replicadas del cromosoma bacteriano se mueven hacia los polos opuestos. Se cree que esta relacionado con que co
mo las dos horquillas de replicación terminan en extremos opuestos de la célula las dos copias vayan a parar a estos dos puntos. El
secuestro de las dos copias del cromosoma en dos mitades separadas de células facilita su adecuada separación en la división celu
lar.
=> EUCARIOTAS
El ciclo celular está regulado por ciclinas y proteínas quinasa dependientes de ciclinas. La célula tiene varios métodos
para interrumpir el ciclo celular si algo anda mal. Se analiza:
1- Que se complete la síntesis de DNA:
Lo hace monitoreando la desaparición de los fragmentos de Okazaki. El ciclo celular no continúa hasta que desaparezcan c
ompletamente.
2- Daño en el DNA:
Se chequea antes de entrar en fase S (chequeo en G1), durante la fase S y luego de la replicación (chequeo en G2)
3- Formación del huso mitótico :
Si el uso mitótico no se une a los cinetocoros o si no está bien alineando la célula se queda en fase M. Si el daño es irr
eparable se desencadena la apoptosis.

ALGUNOS EXPERIMENTOS DE IMPORTANCIA


EXPERIMENTO DE MESELSON & STALH
El experimento de Meselson & Stalh permitió determinar cual de los tres mecanismos posibles de replicación era el correcto: si el
conservativo, el semiconservativo o dispersadora. Para ello fue necesario distinguir las hebras de DNA sintetizadas a partir de las
de las hebras de DNA original que sirvieron como molde.
Para ello utilizaron bacterias e isotopos de nitrógeno pesado (15N) y ligero (14N) para distinguir entre las hebras de DNA parental
es y las resintetizadas. Estas bacterias fueron cultivadas en un medio que contenía cloruro de amonio marcado con 15N, como úni
ca fuente de Nitrógeno, y por consiguiente, las bases nitrogenadas del DNA de estas células solo contenían el isotopo pesado de ni
trógeno. Los cultivos de bacterias "pesadas" se lavaron para liberarlas del medio antiguo y se incubaron en medio fresco con comp
uestos ligeros que contenían 14N y que luego se removieron a intervalos crecientes durante un periodo de varias generaciones. Se
extrajo el DNA de las muestras de bacterias y se sometió a centrifugación de equilibrio de gradiente de densidad.
En este procedimiento, el DNA se mezcla con una solución concentrada de cloruro de cesio y se centrifuga hasta que las molécula
s de doble hebra de DNA entran en equilibrio de acuerdo con su densidad.
En el experimento de Meselson-Stahl, la densidad de una molécula de DNA es directamente proporcional al porcentaje de átomos
que contiene de 15N o 14N. Si la replicación es semiconservadora, cabría esperar que la densidad de las moléculas del DNA di
sminuyera durante el cultivo en el medio que contiene nitrógeno 14 (14N).
Después de una generación, todas las moléculas de DNA deben ser híbridas, 15N-14N, y su densidad de flotación debe ser la mit
ad entre las esperadas para las hebras pesadas y las ligeras de DNA.
Conforme la replicación continúa más allá de la primera generación, las hebras sintetizadas de nueva cuenta deben contener aún s
ólo los isótopos ligeros y aparecer dos tipos de dúplex en los gradientes: los que contienen híbridos 15N-14N y los que poseen só
lo 14N. A medida que prosigue el crecimiento en el medio de cultivo ligero, un porcentaje cada vez mayor de las moléculas de
DNA presentes debe corresponder a las ligeras. Sin embargo, si la replicación es todavía semiconservadora, las hebras pesadas pr
ogenitoras originales deben permanecer intactas y presentes en las moléculas de DNA híbridas que representan cada vez un porce
ntaje más y más pequeño del DNA total
Demostración experimental de que la replicación del DNA en bacterias es semiconservadora.
El DNA se extrajo de la bacteria en diferentes fases del experimento, se mezcló con una solución concentrada de cloruro de cesio
(CsCl) y se centrifugó hasta el equilibrio a alta velocidad en una ultracentrífuga. Los iones de cesio tienen suficiente masa atómic
a para afectarse por la fuerza de centrifugación y forman un gradiente de densidad durante el periodo de centrifugación con la con
centración más baja (más baja densidad) de cesio en la parte superior del tubo y la concentración más alta (más alta densidad) en l
a parte inferior del tubo. Durante la centrifugación, los fragmentos de DNA en el tubo se localizan en una posición que tiene una
densidad igual a la suya propia, que a su vez depende de la relación de 15N/14N presente en sus nucleótidos. Cuanto más grande
sea el contenido del 14N, mayores son los fragmentos de DNA en equilibrio en el tubo.

Resultados esperados en este tipo de experimento para cada uno de los tres posibles esquemas de replicación.
El tubo único de la izquierda indica la posición del DNA parental y las posiciones en las cuales los fragmentos de DNA ligeros o h
íbridos deberían generar las banda.
EXPERIMENTO DE OKAZAKI
El experimento de Okazaki permitió determinar como es que se sintetiza la hebra rezagada. El experimento es del tipo pulso y lav
ado, el cual consiste en dos ensayos:
A- Por un lado, durante el crecimiento de un cultivo se realizo marcajes con pulsos de 30 seg de [3H]timidina, de manera tal que l
a mayor parte de la radiactividad, proviene del nuevo DNA sintetizado. El mismo tiene un coeficiente de sedimentación en medio
alcalino de 7 a 11 S. Estos fragmentos, llamados fragmentos de Okazaki, son de 1 a 2 kb.
B- Luego se transfiere el cultivo a un medio no radiactivo. El DNA resultante, marcado radiactivamente, sedimenta a una velocida
d que se incrementa con el tiempo que las células han crecido en el medio no radiactivo.
Se tomaron las bandas que se formaron en el gradiente a partir de seis tubos (que representan los diferentes tiempos).
Tomando alícuotas desde la parte superior, siendo el X = 0 el tope, se midió la radiactividad en función de la distancia X hacia el t
ope del tubo, obteniendo el siguiente gráfico:
A partir de este experimento se deduce que: los fragmentos de Okazaki deben haber sido incorporados covalentemente a molécul
as de DNA de mayor tamaño.
Esto se ve al analizar que:
• A tiempos cortos despues del pulso, solo se ve radiactividad en la parte superior del tubo, lo que implica que son fragmentos peq
ueños. A su vez, a medida que pasa el tiempo (hasta aprox los 30 s), el numero de los fragmentos cortos marcados aumenta.
• Después de periodos de 60 a 120 s, la altura de los picos a tiempos cortos disminuye. Sin embargo, fragmentos ubicados al final
del tubo presentan radiactividad, el cual también aumenta a medida que transcurre el tiempo.
Debido a que la radiactividad solo proviene de una única fuente, y que primeramente fue asimilado por fragmentos pequeños de D
NA, se concluye que estos fragmentos marcados a tiempos largos son incorporados a una molécula de DNA de mayor tamaño.

EXPERIMENTO DEL MUTANTE LETAL CONDICIONAL


Se realiza ensayos de réplicas. El factor determinante (variable independiente) puede ser [mutágeno] o tiempo de exposición. Se re
aliza la gráfica de Bs en función de la variable independiente. Se localizan aquellas bacterias que no presentan una alta tasa de mut
aciones. Se utilizara estas condiciones para seguir con el experimento.

Una vez encontrado, el texp o [MUT] adecuado, se procede a un segundo ensayo de réplica, pero esta vez, empleando como factor
limitante a la T. Utilizando las condiciones recién obtenidas, con este ensayo se trata de aislar a letales condicionales sensibles a l
a T.
Esto se logra utilizando placas con distintas T de incubación, pero con las mismas propiedades nutritivas y [MUT]. Las T se las c
onocen como T restrictiva y permisiva debido a que en la primera el microorganismo no crece y en la segunda si.
A su vez, para detectar a bacterias que tengan mutaciones implicadas en la replicación del DNA se utilizara timina tritiada para se
guir la síntesis de DNA, y de esta manera evaluar que enzima puede estar afectada:
• En el caso I: se trata de una proteina que esta involucrada en el origen de replicación. Se requiere solo en el reconocimiento del o
rigen, por lo que solo aparecerá su efecto cuando se produzca un nuevo ciclo de replicación. A eso se debe que aun haya síntesis.
• En el caso II: se trata de una proteina que esta involucrada en todo el proceso de replicación, de manera que inmediatamente des
pues de que se produce el cambio de T, la replicación se detiene.
----------------------------------Reparación del DNA--------------------------------------
Una célula generalmente solo tiene una o dos copias de gDNA (DNA genómico). Las proteinas y las moléculas de RNA pueden s
er reemplazadas rápidamente en caso de resultar dañadas utilizando información codificada en el DNA; en cambio, las propias mo
léculas de DNA son irremplazables. El mantenimiento de la integridad de la información contenida en el DNA es, por lo tanto, un
a orden celular, al que responde un elaborado conjunto de sistemas de reparación de DNA. El DNA puede resultar dañado por div
ersos procesos, algunos espontáneos, otros catalizados por agentes ambientales. La propia replicación puede ocasionalmente dañar
la información genética contenida al dejar bases mal apareadas.
La química de las lesiones del DNA es compleja y diversa. La respuesta celular a las lesiones consiste en una amplia gama de siste
mas enzimáticos que catalizan algunas de las transformaciones químicas mas importantes del metabolismo del DNA.

MUTAGENESIS
Las mutaciones surgen en las células a causa de cambios en la secuencia de bases del material genético. En muchos casos, las mut
aciones conducen a cambios fenotípicos en el organismo; en la mayoría de las ocasiones estos cambios son perjudiciales o neutros
, pero a veces ocurren también cambios que son beneficiosos.
Las mutaciones pueden ser espontaneas o inducidas. Las mutaciones espontaneas pueden surgir como consecuencia de la acción d
e la radiación natural que alteran la estructura de las bases del DNA. También pueden ocurrir durante la replicación, como resultad
o de errores en el apareamiento de las bases, originando cambios en el DNA replicado.
Las mutaciones que implican un par de bases (o unos pocos pares) se conocen generalmente como puntuales. Las mutaciones punt
uales pueden ser resultado de sustituciones de pares de bases en el DNA o de la inserción o delación de un par de bases (microinse
rciones o microdeleciones). Como en toda mutación, el cambio fenotípico derivado de una mutación puntual depende de donde oc
urra exactamente la mutación en el gen, que cambio de nucleótido tuvo lugar, y que producto codifica dicho gen.

=> SUSTITUCION DE PARES DE BASES


Si dentro de la región codificante de un gen que codifica para una proteína ocurre una mutación puntual, cualquier cambio en el fe
notipo de la célula es probablemente consecuencia de un cambio en la secuencia de la proteína producida.
Al ocurrir un error en una estrecha región del DNA que codifica para una proteína, este error se puede transcribir al mRNA, y este
RNA erróneo se usa a su vez como molde en la traducción a proteína. (Puesto que solo se utiliza una de las bandas del DNA com
o molde para el mRNA, un par de bases AT no significa lo mismo que un par TA). El código triplete que dirige la inserción de un
aminoácido a través de un tRNA será por lo tanto erróneo.
Consecuencias de las sustituciones de pares de bases
Como el código genético es degenerado, no todas las mutaciones en los genes que codifican proteinas causan cambios en las prote
inas. Esto básicamente quiere decir que existe mas de un codón que codifica para un mismo aminoácido, de esta manera si se tiene
un codón en donde ocurre una mutación, y justo hay un intercambio de base, en el cual el nuevo codón codifica para el mismo am
inoácido, se obtendría la misma proteína y no habría problemas. Este tipo de mutaciones se las conocen como silenciosas, y en ge
neral ocurre en la tercera base del codón. Cambios en la primera o en la segunda base del triplete conducen con mucha mas frecue
ncia a cambios significativos en la proteína. Este tipo de mutaciones se la conocen como mutaciones con sentido erróneo, porque e
l "sentido" químico (o la secuencia de aminoácidos) del polipéptido resultante ha cambiado. Si el cambio ocurriera en una posició
n critica en la hebra polipeptídica, la proteína podría ser inactiva o tener actividad reducida. Sin embargo, no todas las mutaciones
que ocasionan la sustitución de un aminoácido por otro conducen necesariamente a proteinas no funcionales. El resultado depende
del lugar de la hebra polipeptídica en el que ha ocurrido la sustitución y como afecta al plegamiento y a la actividad catalítica de l
a proteína. Una mutación con sentido erróneo puede conducir a una enzima que es sensible a la T.
Se conocen mutantes bacterianos sensibles a la temperatura que funcionan normalmente a 30 °C pero no pueden crecer a 40 °C au
nque el wt (wt = wild type, o tipo salvaje) crezca bien a las dos T. Tales situaciones se denominan también mutantes condicionales
letales porque la bacteria no puede crecer bajo una condición pero puede hacerlo bajo otra. Los fenotipos sensibles a la T ocurren
frecuentemente porque la proteína mutante puede mantener su conformación correcta a la T mas baja pero se despliega parcialmen
te (desnaturaliza) a la T mas alta.
Otro resultado posible de la sustitución de pares de bases es la formación de un codón de parada, causaría la terminación prematur
a de la traducción, originando una proteína incompleta que, casi seguro, no seria funcional. Las mutaciones de este tipo se llaman
mutaciones sin sentido porque el cambio es de un codón para un aminoácido (codón con sentido) a un codón de terminación (codó
n sin sentido). A menos que la mutación sin sentido ocurra muy cerca del final del gen, la proteína incompleta será totalmente inac
tiva.

=> MUTACIONES POR DESFASE


Como el código genético se lee desde un extremo en bloques consecutivos de tres bases, cualquier deleción o inserción de un par
de bases origina un desfase en el marco de lectura y la traducción del gen es completamente alterada. A menudo, puede lograrse la
restauración parcial de la funcion de un gen mediante la inserción de otro par de bases cerca de la delecionada (una especie de mu
tación supresora). Despues de la corrección, la proteína formada puede tener algo de actividad biológica o incluso ser completame
nte normal dependiendo de los aminoácidos codificados por la región defectuosa.
Las microinserciones o microdeleciones solo son mutaciones por desfasaje si tienen lugar en la parte que incluye el marco de lectu
ra de un gen que codifica una proteína. La inserción de una sola base en el promotor de un gen podría originar un cambio dramátic
o en la capacidad funcional del gen (debido al incremento o disminución de su expresión o a cambios en su regulación), pero no se
ria una mutación por desfase. (De manera similar, sustituciones de pared de bases que no estén dentro de marcos de lectura, no so
n mutaciones de sentido erróneo o mutaciones sin sentido).

=> MUTACIONES DEBIDAS A MUCHOS PARES DE BASES


Las deleciones son mutaciones en las que se ha eliminado una región del DNA. Las microdeleciones, la eliminación de uno o vari
os pares de bases, son a menudo mutaciones por desfase y pueden inactivar un gen. Sin embargo, las deleciones pueden también i
mplicar la perdida de varios cientos o miles de pb. La deleción de un gran segmento de DNA ocasiona la perdida total de la funcio
n de cualquier gen implicado. Algunas deleciones son tan grandes que afectan a varios genes (si alguno de los genes es esencial, la
mutación será letal). Tales deleciones no pueden ser restauradas a través de otras mutaciones (reversiones) sino solo mediante rec
ombinación genética. De hecho, una de las maneras de distinguir las grandes deleciones de las mutaciones puntuales es que l
as segundas son revertidas por otras mutaciones mientras que las segundas no.
Las inserciones ocurren cuando se añaden nuevas bases al DNA. Las inserciones, al igual que las deleciones, pueden implicar una
sola base, o muchas. Las microinserciones resultan de errores durante la replicación, como las deleciones, pero las inserciones gra
ndes son el resultado de errores que ocurren durante la recombinación genética. Las inserciones inactivan el gen en el que ocurren.
Muchas de estas mutaciones son débiles a inserciones de secuencias de DNA especifica identificables de DNA de 700 pb - 1,4 kb
de longitud llamadas secuencias de inserción, un tipo de elemento transponible.
Incluso las mutaciones debidas a inserciones grandes pueden revertir por mutación posterior, es decir, por una deleción que elimin
a la inserción. Otros tipos de mutaciones a gran escala parecen implicar reordenamientos causados por errores en la recombinació
n. Estos incluyen translocaciones, en las que largos fragmentos de gDNA se mueven a una localización diferente (y en eucariotas f
recuentemente a un cromosoma diferente), y las inversiones, en las que la orientación de un segmento particular de DNA resulta i
nvertida con respecto DNA circundante.

=> MUTACIONES QUE SURGEN DE LA REPARACION DEL DNA


La mutación es un cambio heredable en el material genético. Por lo tanto, si se corrige un error en la síntesis del DNA antes de qu
e la célula se divida, no habrá mutación. Además, algunos daños en el DNA no pueden ser replicados y, por lo tanto, no pueden co
nvertirse en una mutación. Si tal daño no puede ser reparado, las células probablemente morirán. La mayoría de las células tienen
una variedad de sistemas de reparación de DNA para corregir errores o reparar daños. Sin embargo, en algunos procesos parecen s
er propensos a error, y el mismo mecanismo de reparación origina la mutación. Muchos tipos de mutaciones surgen como resultad
o de reparaciones defectuosas de los daños originados en el DNA por algunos de los agentes mutagénicos.
A menudo, el mismo daño en el DNA puede inducir sistemas de reparación del DNA. Un mecanismo celular complejo, llamado si
stema de reparación SOS, se activa como consecuencia de daños en el DNA y se pone en marcha un cierto numero de procesos de
reparación del DNA. Sin embargo, en el sistema SOS, algunas reparaciones ocurren en ausencia de las instrucciones del molde, e
s decir, sin apareamiento de bases, lo que ocasiona la creación de muchos errores y, por lo tanto, de muchas mutaciones.
En el sistema regulador SOS, el daño al DNA actúa como una señal de estrés para la célula, originando la depresión coordinada (i
nducción) de varias funciones celulares implicadas en la reparación del DNA.
Puesto que uno de los mecanismos de reparación del DNA del sistema SOS es inherentemente propenso a error, el daño al DNA p
or diversos agentes, tales como compuestos químicos y radiación, conduce mutagénesis. Gran parte de estas mutaciones son ocasi
onadas por la DNApol V, codificada por los genes umuC y umuD. La DNApol IV propensa a error también se induce como parte
de la respuesta SOS. Estas son enzimas DNA mutasas.
Una vez que el DNA dañado ha sido reparado, el sistema SOS se desconecta y cesa la mutagénesis. Además de su efecto sobre la
mutagénesis celular, el sistema regulador SOS juega un papel importante en la regulación de la replicación de los virus templados.
Debe resaltarse que no toda la reparación del DNA ocurre en ausencia de las instrucciones del DNA molde. En general, las células
tienen muchos sistemas de reparación que requieren las instrucciones del molde y llevan a cabo una reparación correcta. Parece q
ue estos sistemas funcionan la mayor parte del tiempo pero que no son suficientes para reparar la gran cantidad de daño provocada
por algunos de los agentes mutagénicos.

REACCIONES NO ENZIMATICAS DE LAS BASES NITROGENADAS


Estas reacciones son las mejores conocidas que lesionan al DNA. Muchos compuestos cancerígenos presentes en la comida, el agu
a o el aire ejercen sus efectos a través de la modificación de las bases del DNA. Sin embargo, la integridad del DNA como políme
ro se mantiene mejor que la del RNA o de las proteinas, gracias a que el DNA es la única macromolécula que posee sistemas bioq
uímicos de reparación, los cuales amortiguan en gran medida el impacto de las lesiones en la estructura.
Estas reacciones son:

A- DESAMINACION

Varias bases nucleotídicas sufren la perdida espontanea de sus grupos amino exocíclicos. La lenta reacción de desaminación de la
citosina es la causa por la que el DNA contenga timina en lugar de uracilo. Esto es básicamente por dos cosas:
- El producto de la desaminación de la citosina se lo puede reconocer rápidamente como extraño, y se elimina por un sistema de re
paración del DNA.
- Si el DNA contuviera normalmente uracilo, el reconocimiento de los uracilos procedentes de la desaminación de la citosina prov
ocaría entonces una disminución gradual en la cantidad de pb de G - C y un aumento en los A - U en el DNA de todas las células.

B- DEPURINACION
Es la hidrolisis del enlace N-beta-glucosídico entre la base y la pentosa. Esta reacción produce una lesión denominada sitio AP (ap
urínico, apirimidínico) o abásico. Esta reacción ocurre con mayor facilidad con las purinas que con las pirimidínas. La despurinac
ión de los ribonucleótidos y del RNA es mucho mas lenta y normalmente no se considera fisiológicamente significativa, a compar
ación de la despurinación del DNA. El proceso puede acelerarse empleando acido diluido: la incubación del DNA a pH 3 provoca
la eliminación selectiva de las bases purínicas, y produce un derivado denominado acido apurínico.

C- REACCION DE DIMERIZACION INDUCIDA POR RADIACION.


La luz UV puede inducir la condensación de dos grupos etileno para formar un anillo de ciclobutano. En la célula, la misma reacci
ón entre bases pirimidínicas adyacentes da lugar a dímeros de pirimidína en ciclobutano. Estos se observan con mayor frecuencia
entre residuos adyacentes de timina en la misma hebra del DNA. Existe un segundo tipo de dímero de pirimidína, llamado fotopro
ducto 6-4, que se forma también durante la irradiación UV.
Las radiaciones ionizantes como los rayos X y los rayos gamma pueden provocar la abertura de los anillos y la fragmentación de l
as bases, así como roturas en el esqueleto covalente de los ácidos nucleicos.
La radiación ionizante genera especies toxicas del oxigeno, como radicales oxidrilos, aniones superóxidos, etc.
D- REACCIONES CON REACTIVOS PROVENIENTES DEL AMBIENTE (EN ZONAS DE INDUSTRIA)

Estos productos pueden no ser peligrosos en sí mismos pero su metabolización por las células puede convertirlos en productos que
si lo sean. Hay dos clases principales de este tipo de agentes:
1- Agentes Dasaminantes: en particular el acido nitroso, o compuestos que generen acido nitroso o nitritos.
El acido nitroso, formado a partir de precursores orgánicos tales como nitrosaminas y sales de nitritos y nitrato, es un reactivo que
acelera poderosamente la desaminación de las bases.
El bisulfito tiene efectos similares. Ambos compuestos se usan como conservantes en alimentos preparados para evitar el crecimie
nto de bacterias toxicas. Parece ser que su utilización no aumenta significativamente el riesgo de cáncer, probablemente porque las
cantidades empleadas son pequeñas y su efecto sobre el DNA resulta despreciable.
Los riesgos potenciales para la salud a causa del deterioro que se produciría en los alimentos en el caso de que no se usaran esto
s conservantes son mucho mayores.
2- Agentes Alquilantes: Los agentes alquilantes pueden alterar ciertas bases del DNA. Muchas reacciones son producidas por age
ntes alquilantes normalmente presentes en las células, como la S-adenosilmetionina, que están reguladas y se producen por fin. Pe
ro, por ejemplo, el dimetilsulfato, puede metilar la guanina y dar lugar a O 6-metilguanina, que no puede aparearse con la citosina,
además que la reacción es irreversible:

E- REACCIONES CON AGENTES OXIDANTES


La causa principal de alteraciones mutagénicas en el DNA son los procesos oxidativos. Las especies que contienen oxigeno reacti
vo, tales como el peróxido de hidrogeno, los radicales hidroxilo y los radicales superóxido, aparecen durante la irradiación o como
productos secundarios del metabolismo aeróbico. De estas especies, los radicales hidroxilo son los responsables de una gran parte
del daño oxidativo sobre el DNA. Las células poseen un elaborado sistema de defensa para destruir estas especies de oxigeno reac
tivas, de que forman parte enzimas tales como la catalasa y la superóxido dismutasa que convierten especies de oxigeno reactivas
en productos inofensivos. Sin embargo, una fracción de estos agentes oxidantes escapa a las defensas celulares y se producen lesio
nes en el DNA, que resultan en un conjunto amplio y complejo de reacciones, que van desde la oxidación de la desoxirribosa y de
las bases hasta la rotura de las hebras. Todavía no se dispone de estimaciones precisas del alcance, pero esta claro que el DNA de t
odas las células humanas esta sometido cotidianamente a la acción de millones de reacciones oxidativas perjudiciales.

MUTÁGENOS
Mientras que la frecuencia de mutación espontanea es muy baja, hay una variedad de agentes químicos, físicos y biológicos que p
ueden incrementar la velocidad de mutación, y se dice que inducen a mutaciones. Estos agentes se conocen como mutágenos.
=> RADIACION
Varias formas de radiación son altamente mutagénicas. Podemos dividir la radiación mutagénica en dos categorías principales, ion
izantes y no ionizantes (electromagnéticas). Aunque ambos tipos de radiación se usan en genética microbiana, las radiaciones no i
onizantes se usan mas.
No ionizantes
Las bases púricas y pirimidínas de los ácidos nucleicos absorben intensamente radiación UV, y con un máximo de absorción para
el DNA y el RNA es de 260 nm. Las proteinas también absorben radiación UV, pero presentan un máximo a 280 nm debido a la a
bsorción de los aminoácidos aromáticos.
La muerte de células por radiación UV se debe principalmente a su acción sobre el DNA, de manera que la radiación de 260 nm e
s la mas efectiva y la mas letal. Aunque se conocen varios efectos, el mas importante es la inducción de dímeros de pirimidína en
el DNA, un estado en el que dos bases pirimídicas adyacentes (citosina o timina) se unen covalentemente, de manera que se incre
menta en gran medida la probabilidad de que durante la replicación del DNA, la DNApol inserte un nucleótido incorrecto en posic
ión.
El tipo mas frecuente de fuente de radiación UV que se usa en mutagénesis es la lámpara microbicida, la cual emite grandes dosis
de radiación UV en la región de 260 nm. Suele utilizarse una dosis de radiación UV que produce un 90-95% de muerte en la pobla
ción, y se buscan luego mutantes entre los supervivientes. Si se usan dosis mucho mas altas de radiación, el numero de células via
bles será demasiado bajo, mientras que si se usan dosis menores, se inducirán daños insuficientes en el DNA.
Su acción es mas superficial, es decir, no tiene mucho poder de penetración.

Ionizantes
La radiación ionizante es una forma de radiación mas potente e incluye los radiación de longitud corta, como los rayos X y los ray
os gamma. Estas radiaciones causan la ionización del agua y otras sustancias, y los efectos mutagénicos se producen indirectament
e a causa de esta ionización. Entre las potentes especies químicas formadas por la radiación ionizante están los radicales libre, de l
os cuales el mas importante es el radical hidroxilo OH•. Los radicales libres reaccionan e inactivan macromoléculas celulares, sien
do la mas importante el DNA. Con toda probabilidad, el DNA no es mas sensible que otras moléculas a la radiación ionizante, per
o dado que el DNA es el material genético, los cambios inducidos en el tienen un efecto permanente. A bajas dosis de radiación, s
olo ocurren unos pocos impactos en el DNA, pero a altas dosis ocurren tantos impactos que conducen a la muerte de las células. A
l contrario que la radiación UV, la radiación ionizante penetra fácilmente el vidrio y otros materiales. Por esta razón, la radiación i
onizante se usa con frecuencia para inducir mutaciones en plantas y animales (donde su poder de penetración hace posible alcanz
ar con facilidad las células germinales de estos organismos), pero debido a que es mas peligrosa de usar y esta menos disponible, s
e emplea poco en microorganismos ( donde la penetración de la radiación UV no es problema y alcanza).

=> MUTAGENOS QUIMICOS


Existen varias clases de mutágenos químicos. Algunos son análogos de bases, ya que se parecen estructuralmente a las bases púric
as y pirimídicas del DNA pero muestran propiedades erróneas de apareamiento. Cuando uno de estos análogos se incorpora al DN
A, la replicación puede ocurrir normalmente, pero ocasionalmente ocurren errores de copia que ocasionan la incorporación de una
base equivocada en la hebra copiada. La mutación se revela en la subsiguiente segregación de esta hebra.
Algunos mutágenos químicos reaccionan directamente con el DNA, causando cambios químicos en una u otra base, lo que ocasio
na apareamientos erróneos u otros cambios. Los agentes alquilantes, como la nitrosoguanidina, son poderosos mutágenos y genera
lmente inducen mutaciones con mayores frecuencias que los análogos a las bases. La acción de tales sustancias difiere de la de los
análogos a las bases en que las sustancias que reaccionan con el DNA son capaces de introducir cambios directos, incluso en DN
A que no se esta replicando, mientras que los análogos a las bases actúan solo tras su incorporación durante la replicación. Tanto l
os análogos a las bases como los agentes alquilantes tienden a inducir sustituciones de pares de bases.
Las acridinas son moléculas planas que actúan como agentes intercalantes. Estos mutágenos se insertan entre dos pares de bases d
el DNA, separándolas entre si. Durante la replicación esta conformación anormal puede conducir a microinserciones o microdelec
iones en el DNA tratado con acridina. Por tanto, las acridinas puede inducir mutaciones por desfase. El bromuro de etidio, utilizad
o en geles de electroforesis es también un agente intercalarte.

MUTACIONES & TIPOS DE MUTANTES


Por definición, un mutante difiere de su parental en el genotipo, es decir, en el conjunto de genes del organismo. Pero, además, las
propiedades observables del mutante, su fenotipo, pueden también estar alteradas en relación con la parental. Uno se refiere a este
fenotipo alterado como fenotipo mutante.
CEPAS WILDT TYPE
Normalmente, una cepa aislada de la naturaleza se considera una cepa silvestre (tipo salvaje, wild type wt). Se pueden obtener mut
antes de una cepa silvestre o de una cepa derivada de esta por ejemplo, de otro mutante.
Dependiendo de la mutación, un mutante puede o no mostrar un fenotipo diferente del de su cepa parental. Por convención, en gen
ética bacteriana, el genotipo de un organismo se designa por tres letras minúsculas seguidas de una mayúscula (todas en cursiva) q
ue indican el gen particular implicado.
El fenotipo de un organismo se designa por una letra mayúscula seguida de dos letras minúsculas con un signo mas o menos como
superficie para indicar la presencia o ausencia de tal propiedad.

Tipos de mutantes mas habituales:


FENOTIPO NATURALEZA DEL CAMBIO DETECCION DEL MUTANTE
Auxótrofo Perdida de una enzima de alguna vía biosi Incapacidad de crecer en el medio sin el n
ntética. utriente.

Sensible al frio Alteración de una proteína esencial de ma Incapacidad de crecer a una T (15/30 °C)
nera que se inactiva a bajas T. en la que normalmente crece.

Resistente a drogas Alteración en la permeabilidad a la droga, Crecimiento en el medio que contiene una
modificación de su diana, o capacidad de CIM del compuesto.
detoxificación.

No capsulado Perdida o modificación de la capsula. Colonias pequeñas y rugosas en vez de gr


andes y lisas.
Inmóvil Perdida de flagelos; flagelos no funcional Colonias compactas en vez de planas y ex
es. tendidas.
No pigmentado Perdida de una enzima de la ruta biosintéti Presencia de un color diferente o falta de c
ca que ocasiona la perdida de uno o mas p olor.
igmentos.

Colonia rugosa Perdida o cambio en el LPS en lugar mem Colonias agranulares e irregulares.
brana externa.

Fermentación de azucares Perdida de una enzima de una vía degrada Perdida de cambio de color en medio cont
tiva. eniendo el azúcar y un indicador de pH.

Alteración de una proteína esencial que no Incapacidad para crecer a una T (36/45 °C
Sensible a la temperatura rmalmente permite el crecimiento a T mo ) pero aun capaz de crecer a T mas bajas (
deradas. 25/35°C), de modo que se hace sensible a
la T.

Resistencia a virus Perdida del receptor del virus. Crecimiento en presencia de grandes
cantidades de virus.

=> REVERSIONES
Un revertante se define operativamente como una cepa en la que se ha restaurado el fenotipo silvestre. Los revertantes pueden ser
de dos tipos. En los revertantes de un mismo sitio, la mutación que restaura la actividad ocurre en el mismo sitio en el que ocurrió
la mutación original. (Si la mutación hacia atrás no solo es en el mismo sitio sino que, además, conduce a la secuencia silvestre, se
denomina verdadero revertante). En los revertantes de segundo sitio, la mutación ocurre en un sitio diferente en el DNA.
Las mutaciones en un segundo sitio puede restaurar un fenotipo silvestre debido a varios tipos de mutaciones supresoras que resta
uran el fenotipo original. Las mutaciones supresoras son nuevas mutaciones que compensan el efecto de la mutación original. Se c
onocen varios tipos de mutaciones supresoras:
1- una mutación en otra parte del mismo gen puede restaurar la funcion génica.
2- una mutación en otro gen puede restaurar la funcion del gen mutado original y la del fenotipo silvestre.
3- una mutación en otro gen puede originar la producción de otra enzima capaz de reemplazar a la mutada, usando una vía metabó
lica diferente a la usada por la enzima mutante. En este caso no existe producción de la enzima original, pero en los otros dos si.

TEST DE REPLICAS EN PLACAS


Permite detectar, mediante la selección o la comprobación de un fenotipo alterado, la formación de mutantes.
Se emplee o no un mutágeno, las células mutantes con mutaciones específicas siempre son muy poco prevalentes cuando se las co
mpara con otras células de la población. El problema es la detección de estos sucesos infrecuentes. Lo habitual es realizar los expe
rimentos con bacterias porque estas se reproducen con rapidez y por lo tanto pueden utilizarse grandes cantidades de microorganis
mos (más de 109 por mililitro de caldo nutritivo). Además, como las bacterias suelen tener una sola copia de cada gen por célula, l
os efectos de un gen mutado no son enmascarados por la presencia de una versión normal del gen, como en muchos organismos e
ucariotas.

La selección positiva (directa):


Implica la detección de células mutantes por eliminación de las células parentales no mutadas.
POR EJEMPLO:
Suponiendo que se trata de encontrar bacterias mutantes resistentes a la penicilina. Cuando las células bacterianas se siembran en
placas en un medio con penicilina la mutante puede identificarse directamente. Las escasas células resistentes (mutantes) de la pob
lación crecerán y formarán colonias mientras que las células parentales normales sensibles a la penicilina no podrán crecer.

La selección negativa (indirecta):


Para identificar mutaciones en otros tipos de genes puede usarse la selección negativa (indirecta). Este proceso selecciona una célu
la que no puede realizar una función determinada, mediante el método de réplicas en placas.
POR EJEMPLO:
Suponiendo que se desea utilizar una réplica para identificar una célula bacteriana que ha perdido la capacidad de sintetizar el ami
noácido histidina. En primer lugar, alrededor de 100 células bacterianas se inoculan en una placa de agar. Esta placa, llamada plac
a madre, contiene un medio con histidina donde pueden crecer todas las células. Después de 18 a 24 horas de incubación cada célu
la se reproduce para formar una colonia. Entonces se presiona sobre la placa madre una almohadilla de material estéril, como látex
, papel de filtro o terciopelo, y algunas de las células de cada colonia se adhieren al terciopelo. Luego el terciopelo se presiona con
la cara impregnada hacia abajo en dos (o más) placas estériles. Una placa contiene un medio sin histidina y la otra contiene un me
dio con histidina sobre el cual pueden desarrollarse las bacterias originales no mutantes. Cualquier colonia que crezca en el medio
con histidina en la placa madre pero que no sea capaz de sintetizar su propia histidina no podrá crecer en el medio sin histidina. En
tonces puede identificarse sobre la placa madre la colonia mutante. Por cierto, dado que las mutantes son raras (incluso las inducid
as por mutágenos), deben evaluarse muchas placas con esta técnica para aislar una mutante específica.
El método de réplicas en placa es muy eficaz para aislar mutantes que requieren uno o más factores de crecimiento nuevos. Todos
los microorganismos mutantes que requieren un nutriente que está ausente en la célula parental se conocen como auxótrofos.

● PROTOCOLO
TEST DE AMES
Se ha descubierto que muchos mutágenos conocidos son carcinógenos, sustancias que causan cáncer en los animales, incluidos los
seres humanos. En los últimos años diversas sustancias químicas presentes en el ambiente, en el lugar de trabajo y en la dieta han
sido implicadas como causas de cáncer en los seres humanos. Por lo general se utilizan animales para las pruebas destinadas a dete
rminar carcinógenos potenciales y los procedimientos de comprobación son prolongados y costosos. En la actualidad se dispone d
e procedimientos más rápidos y menos costosos para la selección preliminar de carcinógenos potenciales. Uno de ellos, denomina
do prueba de Ames, utiliza bacterias como indicadores de carcinógenos.
La prueba de Ames se basa en la observación de que la exposición de las bacterias mutantes a las sustancias mutagénicas puede ca
usar nuevas mutaciones que reviertan el efecto (el cambio del fenotipo) de la mutación original. Básicamente, permite determinar
si un compuesto es mutagénico al poder revertir la mutación. Estas mutaciones se denominan reversiones, y a las células capaces d
e revertir se llaman revertantes. Específicamente, la prueba mide la inversión de los auxótrofos para histidina de Salmonella (las c
élulas his-, es decir, las células mutantes que han perdido la capacidad de sintetizar histidina) a células que sintetizan histidina (his
+) después del tratamiento con un mutágeno.
Las bacterias se incuban en presencia y en ausencia de la sustancia que se quiere probar. Además, muchas sustancias químicas deb
en ser activadas (transformadas por medios químicos en las formas químicamente reactivas), por enzimas de origen animal para q
ue aparezca la actividad mutagénica o carcinogénica, la sustancia que se quiere probar y las baterías mutantes se incuban juntas co
n extracto de hígado de rata, una fuente rica en las enzimas necesarias para la activación. Si la sustancia que se va a evaluar es mut
agénica, producirá la inversión de las bacterias his- a bacterias his+ con una tasa mayor que la tasa de inversión espontánea. La ca
ntidad de bacterias que sufren inversiones proporciona una indicación del grado de mutagenicidad de esa sustancia y por consiguie
nte de su posible efecto carcinogénico.
Existen formas alternativas de este ensayo:
Pueden utilizarse mezclas como vino, sangre, humo condensado y extractos de alimentos para comprobar si contienen mutágenos
.
Cerca del 90% de las sustancias que resultan mutagénicas por la prueba de Ames también mostraron ser carcinogénicas en animal
es. Además, cuanto más mutagénica sea una sustancia mayor será su poder carcinogénico.
El ensayo de Ames en bacterias ha introducido un elemento mas (además del uso del hígado de rata) que lo hacen mucho mas efic
iente. Este es el uso de cepas bacteriana que usan casi exclusivamente vías de reparación propensos a error, para evitar de esta ma
nera que mutaciones espontaneas den lugar, asegurándonos que la restauración sea debido al mutágeno y no la replicación errónea
.

● PROTOCOLO
Test de Ames cualitativo:
El test de Ames se usa para evaluar la mutagenicidad de un compuesto. En el cultivo se inoculo Salmonella entérica que requiere
de histidina. El medio no contiene histidina, de modo que solo podrán crecer las células que reviertan al wt. En la placa aparecerán
revertantes espontáneos, representados en la región mas lejana al disco de papel de filtro de la placa. Se dice que son espontáneos
porque la concentración de mutágeno es mínima o no llega a esa distancia, de manera que estas reversiones no surgen por acción d
el mutágeno . Existen una región intermedia mas cercana al disco de papel de filtro que ha aumentado la frecuencia de mutación, l
o cual se refleja en el aumento de números de colonia en torno al disco. En la región mas cercana al disco, no se ven colonias, y po
r lo tanto, no se ven revertantes, debido a que la concentración de mutágeno es letal.

MECANISMO POR EL CUAL UN MUTÁGENO GENERA REVERTANTES:


Dependiendo de la naturaleza del mutágeno, existen 4 mecanismos posibles de como un mutágeno puede mutar:
• Por analogía de bases: son estructuralmente similares a las bases nitrogenadas normales y pueden incorporarse a la hebra de nuc
leótidos en crecimiento durante la replicación del DNA. Una vez en posición, estos compuestos presentan de forma característica
propiedades de apareamiento diferentes de las de las bases a las que sustituyen y con el tiempo tienen la capacidad de provocar un
a mutación estable.
Ejemplo:
El 5-bromouracilo (5-BU), un análogo de la timina. Sufre un cambio tautomérico desde su forma ceto normal a la forma enol con
mucha mayor frecuencia que una base normal. La forma enol establece puentes de hidrógeno como la citosina y dirige la incorpor
ación de guanina en vez de la de adenina.
• Por apareamiento específico incorrecto: se produce cuando un mutágeno cambia la estructura de una base y por lo tanto altera s
us características de apareamiento, Algunos mutágenos de esta categoría son bastante selectivos; reaccionan de forma preferente c
on algunas bases y producen un tipo específico de daño del DNA.
Ejemplo:
La metil-nitrosoguanidina, un agente alquilante que añade grupos metilo a la guanina haciendo que se aparee de forma incorrecta
con la timina. Un ciclo de replicación subsiguiente podría entonces provocar una transición de GC a AT. El daño del DNA tambié
n estimula los mecanismos de reparación de errores.
• Por ser un agente intercalantes: distorsionan el DNA e inducen la inserción y la deleción de un par de bases. Estos mutágenos s
on planares y se insertan (intercalan) entre las bases apiladas de la hélice. Esto conduce a una mutación, posiblemente a través de l
a formación de un lazo en el DNA.
Ejemplo:
Entre los agentes intercalantes se incluyen las acridinas, como la proflavina y la naranja de acridina.
• Por alteración en los puentes de H:
Muchos mutágenos, y en realidad muchos carcinógenos, provocan daños directos a las bases de tal intensidad que se altera o evita
la formación de puentes de hidrógeno entre los pares de bases y el DNA dañado ya no puede servir de molde.
Ejemplo:
La radiación UV genera dímeros de tipo ciclobutano, habitualmente dímeros de timina entre pirimidínas adyacentes. Este tipo de d
año del DNA generalmente sería letal, pero puede activar un mecanismo de reparación que restablece gran parte del material genét
ico dañado aunque con una considerable incorporación de errores.
De esta manera, los mecanismos de mutagénesis de los mutágenos consiste en dañar seriamente la integridad del DNA dejando qu
e los sistemas de reparación mas propensos al error sean los que reparen el daño. La restauración del material genético puede ser q
ue restaure la auxotrófia en el test de Ames, por ejemplo, donde solo esta funcionando los mecanismos de reparación con mayor ta
sa de error.

REPARACION DEL DNA EN PROCARIOTAS


TODAS LAS CELULAS TIENEN MULTIPLES SISTEMAS DE REPARACION DEL DNA
El numero y diversidad de los sistemas de reparación refleja a la vez la importancia de la reparación del DNA para la supervivenci
a de la célula y la variedad de causas que originan las lesiones en el DNA.
Algunos tipos de lesiones comunes, tales como los dímeros de timina, pueden ser reparados por varios sistemas diferentes. Mucho
s procesos de reparación del DNA son extraordinariamente ineficaces en términos energéticos, en contraste con la mayoría de las r
utas metabólicas, donde cada ATP se utiliza de manera optima y con razón de su utilización.
BASICAMENTE: Cuando esta en juego la integridad de la información genética, la cantidad de energía química invertida en un
proceso de reparación no es escatimada.
La reparación del DNA es posible en gran parte debido a que la molécula de DNA consta de dos hebras complementarias. La lesió
n del DNA en una hebra puede ser eliminada y reemplazada en forma precisa, usando de molde la hebra complementaria no dañad
a.
Entre los tipos de mecanismos de reparación del DNA recientemente estudiados, los mas importantes son:
- REPARACION DE APAREAMIENTOS INCORRECTOS (MISMATCH REPAIR)
La corrección de los poquísimos apareamientos incorrectos despues de la replicación, mejora la fidelidad de la replicación en un f
actor de 102 a 103. A su vez, los apareamientos incorrectos se corrigen casi siempre de acuerdo con la información contenida en la
hebra vieja (molde); por ello el sistema tiene que ser capaz de discriminar de algún modo entre la hebra molde y la recién sintetiza
da.
El mismatch repair es un sistema de reparación basado en el reconocimiento de apareamientos incorrectos.
PASOS:
I – En bacterias, la discriminación de hebra se basa en la acción de la Dam metilasa, que metila el DNA en la posición N6 de tod
as las adeninas presentes en las secuencias (5’) GATC. Esto ocurre previo a la replicación.
II - Luego de la replicación, la hebra molde esta metilada, y la hebra recién sintetizada no lo esta. En el caso de haber apareamie
ntos incorrectos, este sistema de reparación sensa esto, y puede distinguir cual es la hebra molde de la recién sintetizada gracias
a la metilación.
III – El proceso de reparación comienza con el complejo MutS – MutL, el cual barren el DNA en busca del mismatch (actividad d
e la MutL).
IV – El DNA formara un bucle, cuando la proteina MutL interaccione con una proteina MutH, el cuál estará unida a una secuenc
ia (5’) GATC metilada.
VI – MutH además, presenta actividad endonucleasa, de manera que produce un corte en el extremo 5’ de la secuencia GATC no
metilada.
V - Los siguientes pasos de la ruta dependen del lugar donde este situado el apareamiento incorrecto en relación con el sitio de c
orte.
=> Cuando el desapareamiento se encuentra en el lado 5' del sitio de corte, la hebra sin metilar es desenrrollada y degradada en
dirección 3' → 5', a partir del sitio de corte hasta mas allá del desapareamiento, siendo despues reemplazada por nuevo DNA. E
ste proceso requiere la acción de DNA helicasa II, SSB, exonucleasa I o bien exonucleasa X (ambas degradan las hebras del DN
A en dirección 3' → 5'), DNApol III y DNA ligasa.
=> La ruta para la reparación de apareamientos incorrectos en el lado 3' del sitio de corte es similar, excepto que la exonucleas
a es reemplazada por la exonucleasa VII (que degrada ssDNA en dirección 3' → 5', o en 5' → 3') o por la nucleasa RecJ (una exo
nucleasa que degrada DNA monohebra en dirección 5' → 3').

- REPARACION POR ESCISION DE BASE (BER)


El BER repara las secuencias que presentan bases extrañas.
PASOS:
I - Las DNA glucosilasas (especificas de bases) rompen el enlace N-glucósido, quedando un azúcar sin su base. El corte crea sitio
s apurínicos o apirimidínicos en el DNA, normalmente conocidos como sitios AP o abásicos.
II - Una vez formado un sitio AP por acción de la DNA glucosilasa, la AP endonucleasa corta la hebra de DNA que contienen el s
itio AP. La posición de la incisión en relación con el sitio AP (5' o 3') varia según el tipo de AP endonucleasa.
III - A continuación se elimina un segmento de DNA que contiene el sitio AP, el DNA es reemplazado por la DNApol I (empleand
o su actividad exonucleasa 5’ – 3’ y luego su actividad polimerasa 5’ – 3’) y la mella restante es sellada por la DNA ligasa.

REPARACION POR ESCISION DE NUCLEOTIDO (NER)


El sistema NER se activa en presencia de una distorsión en la doble hélice.
PASOS:
I – El complejo enzimático ABC excinucleasa hidroliza dos enlaces fosfodiéster, uno a cada lado de la distorsión provocada por l
a lesión. Esta formado por tres subunidades, UvrA, UvrB y UvrC.
• Un complejo de las proteinas UvrA y UvrB (A2B) efectúa un barrido del DNA y se une al lugar de la lesión.
• A continuación, el dímero de UvrA se disocia, dejando UvrB fuertemente unida al DNA.
• UvrC se une entonces a UvrB, y ésta realiza una incisión en el lado 3' de la lesión.
• Esto es seguido por una incisión efectuada por UvrC en el lado 5'.
II - El fragmento resultante de ~ 12 nucleótidos es eliminado por la helicasa UvrD.
III - El pequeño hueco así creado es rellenado por la DNApol I y la DNA ligasa.

REPARACION DIRECTA
Varios tipos de lesiones se reparan sin eliminar la base o el nucleótido.
Dímeros de pirimidína, una reacción revertida por las DNA fotoliasas.
Los dímeros de pirimidína son producto de una reacción inducida por la luz UV. Las fotoliasas utilizan energía proveniente de la l
uz absorbida para invertir la lesión.
Las fotoliasas generalmente contienen dos cofactores que actúan de agentes de absorción de la luz o cromóforos. Uno de los crom
óforos es siempre el FADH-. En procariotas y en levadura, el otro cromóforo es un folato. El mecanismo de reacción conlleva la g
eneración de radicales libre. Las DNA fotoliasas no se encuentran en mamíferos placentarios (incluyendo mamíferos).
Lesiones por agentes alquilantes.
El nucleótido modificado O6-metilguanina se forma en presencia de agentes alquilantes, y es una lesión común altamente mutagén
ica, pues tiende a aparearse con timina en lugar de citosina durante la replicación y, por lo tanto, genera mutaciones de G - C a A -
T. La reparación directa de la O6-metilguanina la lleva a cabo la O6-metilguanina-DNA metiltransferasas, que cataliza la transfere
ncia del grupo metilo de la O6-metilguanina a uno de sus propios residuos de Cys. Esta metiltransferasas no es propiamente una e
nzima, porque una única transferencia de metilo la metila permanentemente, inactivándola.
Un mecanismo completamente diferente, pero también directo, se utiliza para reparar la 1-metiladenina y la 3-metilcitosina. Los g
rupos amino de los residuos de A y C se metilan ocasionalmente en el DNA de hebra sencilla y la metilación afecta directamente
el correcto apareamiento de las bases. En procariotas, la proteína AlkB, participa en la desmetilación oxidativa de estos nucleótido
s alquilados.

REPARACIÓN POR MECANISMO SOS


La respuesta SOS es un mecanismo de reparación basado en la inducción de la expresión de un conjuntos de genes.
Este mecanismo surge cuando
• Hay entrecruzamiento
• Hay doble ruptura del DNA
• Cuando ambas hebras de DNA están dañadas
Estos inconvenientes ocurren cuando la horquilla de replicación se topa con una lesión que no esta reparada (produciendo el blo
queo de la horquilla de replicación), por lo que indirectamente, el sistema SOS se activa cuando el DNA presenta un daño tal que
es imposible repararlo o no es suficiente empleando los sistemas de reparación convencionales.
Este conjuntos de acontecimientos produce la activación del sistema de reparación de ultimo recurso o SOS, en donde se expresa
n un conjunto de genes encargados en la reparación del DNA. Cuando este mecanismo esta activado, la reparación del DNA es m
ucho menos precisa, lo que redunda en una elevada tasa de mutación. El conjunto de genes que activa la respuesta SOS se encarg
a de un tipo de reparación conocido como síntesis de DNA a través de lesión propensa al error (o síntesis trans-lesión, TLS).
PASOS:
• Debido a los daños producidos en el DNA, hay regiones del gDNA que la DNApol III que no puede replicar quedando como ssD
NA.
• Estas regiones reclutan a la proteina RecA.
• El complejo RecA-ssDNA tiene la propiedad de activar al sistema SOS, al eliminar al represor LexA, el cual inhibe la expresión
de los genes TLS. Esto ocurre debido a que RecA estimula la actividad autoproteolítica de LexA, liberándose la represión que pro
ducía LexA sobre los genes que intervienen en el sistema SOS.
• Entre las proteinas involucradas en el sistemas SOS se encuentran:
- UvrA y UvrB (presenta dos promotores, un independiente, y otro dependiente de RecA)
- UmuC y UmuD (UmuD se escinde en un proceso regulado por SOS para dar una forma mas corta, denominada UmuD',
que forma un complejo con la proteína UmuC para crear una DNApol especializada, DNApol V, que puede replicar a tr
avés de muchas lesiones que normalmente bloquearían la replicación. El apareamiento correcto de las bases es a menud
o imposible en el sitio de tales lesiones, por lo que este tipo de replicación es propenso al error)
- Otra polimerasa, la DNApol IV, es inducida durante la respuesta SOS. La replicación por la DNApol IV, también es muy
propensa al error. Las DNApol bacterianas IV y V pertenecen a una familia de TLS polimerasas presente en todos los o
rganismos. Carecen de actividad exonucleasa correctora de pruebas y la fidelidad en la selección de base puede reducir
se en un factor de 102, lo que disminuye la fidelidad global en la replicación a un error cada ~1000 nucleótidos.

REPARACION DEL DNA EN EUCARIOTAS


- REPARACION DE APAREAMIENTOS INCORRECTOS (MISMATCH REPAIR)
Todas las células eucarióticas tienen proteinas estructural y funcionalmente análogas a las proteinas bacterianas MutS y MutL (per
o no MutH). Las alteraciones en los genes humanos que codifican proteinas de este tipo causan algunos de los síndromes hereditar
ios de susceptibilidad al cáncer mas comunes, lo cual constituye una prueba mas de la importancia de los sistemas de reparación d
e DNA para el organismo.
Las proteinas homologas principales de MutS en la mayoría de eucariotas son la MSH2, MSH3 y MSH6.
- Los heterodímeros de MSH2 y MSH6 se unen generalmente a desapareamiento de un solo par de bases y con menor afinidad a l
azos desapareados algo mayores.
- En muchos organismos, los desapareamientos mayores (de 2 a 6 pb) pueden unirse, en cambio, a un heterodímero de MSH2 y M
SH3 o por ambos tipos de heterodímeros en tándem.
Los homólogos de MutL, principalmente un heterodímero de MLH1 y PMS1, se unen y estabilizan a los complejos MSH.
Los detalles en el proceso de reparación en los apareamientos incorrectos en eucariotas están en estudiándose, principalmente inter
esa conocer, el mecanismo de identificación de las hebras de DNA recién sintetizadas. Sobre esto, solo se sabe que la identificació
n de hebras no usa secuencias GATC.

REPARACION POR ESCISION DE NUCLEOTIDO (NER)


El mecanismo de las excinucleasa eucarióticas es similar a la de la enzima bacteriana, aunque son necesarios 16 polipéptidos, que
no guardan ningún parecido con las subunidades de la excinucleasa de procariotas, para efectuar la doble incisión. Algunos mecan
ismos de reparación por escisión de base y de nucleótido en las eucariotas están estrechamente asociados a la transcripción. Las de
ficiencias genéticas en la reparación por escisión en humanos dan lugar a varias enfermedades graves.
Se rellena el fragmento perdido (de aprox ~30 nucleótidos) a través de una DNApol épsilon.

REPARACIÓN POR MECANISMO SOS


Los mamíferos tienen muchas DNApol de baja fidelidad pertenecientes a la familia TLS. Sin embargo, la presencia de estas enzim
as no redunda necesariamente en una tasa de mutación inaceptable, pues muchas de estas enzimas también tienen funciones especi
alizadas en la reparación del DNA. Así, la DNApol eta, que esta presenta en todas las eucariotas, promueve la síntesis a través de l
esiones como los dímeros T - T de ciclobutano. En este caso se producen pocas mutaciones porque la enzima inserta preferenteme
nte dos residuos de A delante de dos residuos de T unidos. Otras varias polimerasas de baja fidelidad, entre las que se encuentran l
as DNApol beta, iota y gamma, tienen funciones especializadas en la reparación por escisión de base eucariótica. Todos estas enzi
mas tienen una actividad 5'-desoxirribosa fosfato liasa, además de la actividad polimerasa. Despues de la eliminación de la base p
or una glucosilasa y el corte del esqueleto por una AP endonucleasa, estas polimerasas eliminan el sitios abásico (un 5'-desoxirrib
osa fosfato) y llenan el pequeño hueco resultante. La frecuencia de mutaciones debidas a la actividad DNApol eta es reducida a ca
usa de la corta longitud (a menudo un solo nucleótido) de DNA sintetizado.
En muchos casos, la perdida de funcion de una de estas proteinas provoca inestabilidad genómica y un aumento de la incidencia d
e la oncogénesis. Estos sistemas de reparación están a menudo integrados con los sistemas de replicación del DNA y están comple
mentados con los sistemas de recombinación.

PRINCIPALES MECANISMOS DE REPARACION


=> REPARACION DE APAREAMIENTOS INCORRECTOS
Enzimas/Proteinas Mecanismo
Metilasa Dam - En los 245 pb de oriC hay 12 secuencias GATC conservadas. Estas secuencias son sustrato
de la enzima Dam metilasa, que metila el DNA en la posición N6 de todas las adeninas prese
ntes en estas secuencias.
- Luego ocurre la replicación. La metilación permite distinguir la hebra molde de la recién si
nterizada. En el caso de haber apareamientos incorrectos, ocurre la reparación basándose en l
a hebra metilada.

Proteinas MutH, MutL y MutS - La proteína MutL forma un complejo con la proteína MutS y el complejo se une a todos los
pares de bases mal apareados. Esto da aviso que hay mal apareamientos a la proteína MutH,
esta se une al complejo MutL - MutH, empieza a desplazarse hasta encontrar la secuencia G
ATC mas cercana a la región del apareamiento incorrecto.
- MutH tiene una actividad endonucleasa con especificidad de secuencia, que se mantiene ina
ctiva hasta que el complejo encuentra una secuencia GATC semimetilada.
- MutH cataliza el corte de la hebra no metilada por el lado 5' de la G en GATC, que de este
modo marca la hebra que ha de reparase.

DNA helicasa II, SSB, Exonuclea - Cuando el desapareamiento se encuentra en el lado 5' del sitio de corte, la hebra sin metilar
sa I, Exonucleasa X, es desenrrollada y degradada en dirección 3' → 5', a partir del sitio de corte hasta mas allá de
l desapareamiento, siendo despues reemplazada por nuevo DNA. Este proceso requiere la ac
ción de DNA helicasa II, SSB, exonucleasa I o bien exonucleasa X (ambas degradan las hebr
as del DNA en dirección 3' → 5').

Exonucleasa VII & RecJ La ruta para la reparación de apareamientos incorrectos en el lado 3' del sitio de corte es simi
lar, excepto que la exonucleasa es reemplazada por la exonucleasa VII (que degrada ssDNA
en dirección 3' → 5', o en 5' → 3') o por la nucleasa RecJ (una exonucleasa que degrada DN
A monohebra en dirección 5' → 3').

DNApol III & DNA ligasa Finalmente, se elonga y se unen las mellas, reconstituyendo nuevamente el DNA.

=> REPARACION POR ESCISION DE BASE


Se activa en casos de encontrar bases no habituales; bases alquiladas; dímeros de timina; etc.
Enzimas/Proteinas Mecanismo

DNA glucosilasas Reconocen lesiones del DNA muy frecuentes y eliminan la base afectada rompiendo el enlac
e N-glucosilo. El corte crea sitios apurínicos o apirimidínicos en el DNA, normalmente cono
cidos como sitios AP o abásicos.

Endonucleasas AP Una vez formado un sitio AP por acción de la DNA glucosilasa, la endonucleasa AP, cortan
do la hebra de DNA que contiene el sitio AP. Luego realiza otro corte en dirección 5' o 3' del
sitio AP. Luego se elimina el segmento de DNA que contiene el sitio AP.

DNApol I La DNApol rellena el hueco en la hebra.

DNA ligasa Las mellas resultantes se elimina por DNA ligasa.

=> REPARACION POR ESCISION DE NUCLEOTIDO


Se activa en casos de lesiones del DNA que provoquen importantes cambios estructurales como dímer
os de pirimidínas.
Enzimas/Proteinas Mecanismo

ABC excinucleasa La enzima excinucleasa hidroliza dos enlaces fosfodiéster, uno a cada lado de la distorsión p
rovocada por la lesión. Los oligonucleótidos limitados por las dos incisiones es liberado del
dúplex.

DNApol I El hueco resultante es rellenado por la DNApol I

DNA ligasa Las mellas son eliminadas por DNA ligasa.

=> REPARACION DIRECTA


Proteína/Enzima Repara: Mecanismo
DNA fotoliasas Dímeros de pirimidína El mecanismo de reacción conlleva la gen
eración de radicales libres
O6-metilguanina-DNA metiltransferasa O6-metilguanina Cataliza la transferencia del grupo metilo
de la O6-metilguanina a uno de sus propi
os residuos Cys.
Proteína AlkB 1-metilguanina & 3-metilcitosina La proteína AlkB participa en la desmetil
ación oxidativa de estos nucleótidos alqui
lados.
---------------------------------Recombinación del DNA----------------------------------
El reordenamiento de la información genética dentro y entre moléculas de DNA comprende diversos procesos conocidos conjunta
mente como recombinación genética. Las aplicaciones practicas de los reordenamientos del DNA en la alteración de los genomas
de un numero creciente de organismos están siendo investigadas.
Los procesos de recombinación genética se dividen en tres clases generales:
- la recombinación genética homologa (o recombinación genética general, HR):
Consiste en el intercambio genético entre dos moléculas de DNA cualesquiera (o segmentos de la misma molécula) que comparta
n una región extensa de secuencia casi idéntica. La secuencia concreta de bases es irrelevante, siempre que sea similar en los dos
DNA.
- la recombinación por unión de extremos no homólogos (NHEJ):
Es un mecanismos de reparación imperfecto, ya que se pierde información genética. Sin embargo, es menos dañino que dejar los e
xtremos libres, ya que de ser así ocurrirían reordenamientos cromosomales (translocación por ejemplo). Esta situación es análoga
al resultado del mecanismo SOS. En este caso, se eliminan algunos nucleótidos para permitir el empalme de los extremos. Esto ge
nera mutaciones al igual que el sistema SOS. Sin embargo, en eucariotas es el sistema mas común.
- la recombinación especifica de sitio:
Los intercambios solo tienen lugar en una secuencia de DNA particular.
- la recombinación por transposición:
Normalmente interviene un segmento corto de DNA con la capacidad de trasladarse de un lugar a otro del cromosoma.

Además de estas tres clases bien caracterizadas, hay una amplia gama de reordenamientos genéticos poco frecuentes para los que
aun no se ha propuesto ni mecanismos ni finalidad.
Las funciones de los sistemas de recombinación genética, entre los mas relevantes, son:
- participar en sistemas de reparación de DNA especializados.
- actividades especializadas en la replicación del DNA.
- la regulación de la expresión de ciertos genes.
- contribuyen a la segregación correcta de los cromosomas durante la división celular en las eucariotas.
- contribuyen al mantenimiento de la diversidad genética
- contribuyen a los reordenamientos genéticos programados durante el desarrollo embrionario.
En general, la recombinación genética esta íntimamente integrada con otros procesos del metabolismo.

=> RECOMBINACION GENETICA HOMOLOGA


En las bacterias, la recombinación genética homologa es básicamente un proceso de reparación del DNA y en este contexto se den
omina reparación del DNA por recombinación. Actúa en la reconstrucción de horquillas de replicación bloqueadas en las lesiones
del DNA. La recombinación genética homologa puede ocurrir también durante la conjugación bacteriana (apareamiento), cuando
el DNA cromosómico es transferido de una célula (donante) a otra (receptora). La recombinación durante la conjugación, aunque r
ara en las poblaciones bacterianas salvajes, contribuye a la diversidad genética.
En las eucariotas, la recombinación genética homologa puede desempeñar diversos papeles en la replicación y en la división celul
ar, entre los que se encuentra la reparación de horquillas de replicación bloqueadas. La recombinación ocurre la máxima frecuenci
a durante la meiosis, proceso mediante el cual una célula germinal diploide que tiene dos conjuntos de cromosomas se divide para
producir gametas haploides (células espermáticas u óvulos) en animales (esporas haploides en plantas), cada una de los cuales sol
o tiene un miembro de cada pareja de cromosomas.
La meiosis empieza con la replicación del DNA en las células germinales, de modo que cada célula contiene cuatro copias de las
moléculas de DNA. La célula experimenta seguidamente dos divisiones celulares sucesivas sin que se produzca replicación del D
NA, lo cual reduce el contenido de las gametas hasta el nivel haploide.
Despues de la replicación del DNA durante la profase de la primera división meiótica, las cromátides hermanas resultantes perma
necen asociadas a sus centrómeros. En esta fase, cada conjunto de cuatro cromosomas homólogos (tétrada) se presenta como dos p
ares de cromátides. La información genética es ahora intercambiada entre las cromátides homologas estrechamente asociadas por r
ecombinación genética homologa, proceso que implica el corte y el empalme del DNA.

Este intercambio, denominado también entrecruzamiento, une las dos pares de cromátides hermanas en puntos denominados quias
mas
El entrecruzamiento une efectivamente las cuatro cromátides homologas, siendo esta unión esencial para la correcta segregación d
e los cromosomas en las posteriores divisiones meióticas. El entrecruzamiento no es un proceso enteramente al azar, pues se han d
etectado lugares con alta probabilidad de entrecruzamiento en muchos cromosomas eucarióticos. Sin embargo, la suposición de qu
e el entrecruzamiento ocurre con igual probabilidad en casi cualquier punto a lo largo de la longitud de dos cromosomas homólog
os sigue siendo una aprox razonable en muchos casos. En esta suposición se basa el cartografiado de los genes. La frecuencia de r
ecombinación homologa en cualquier región que separe dos puntos de un cromosoma es aproximadamente proporcional a la dista
ncia entre los puntos, lo cual permite determinar las posiciones relativas y las distancias entre diferentes genes.

MECANISMO:
La recombinación genética homologa es un mecanismo de reparación a la rotura de doble hebra (DSB). A diferencias de los meca
nismos de reparación de única hebra, este mecanismo presenta mayor importancia porque una sola rotura de la doble hebra puede
causar anormalidades cromosómicas serias y, al final, son letales para las células. Las DSB pueden repararse por medio de diferen
tes vías alternativas, dependiendo del tipo y del estadio celular.
1- Ocurre una ruptura de la doble hebra en uno de los dos homólogos. Los extremos con 3' se degradan menos que aquello con 5' f
inales, produciendo extensiones 3' simple hebra.
2- Uno de los extremos 3' del final se exponen con su homologo intacto. La otra hebra se desplaza.
3- La invasión del extremo 3' es ampliado por la DNApol y se da la migración de la otra hebra, generando una molécula de DNA c
on dos transiciones llamadas intermedios de Holliday.
4- La invasión de la otra hebra del extremo 3' también es ampliado por la DNApol.
5- El corte de los intermediarios de Holliday por nucleasas especializadas genera cualquiera de los dos productos de la nueva com
binación:

A- RECOMBINACION REQUIERE UNA MULTITUD DE ENZIMAS Y OTRAS PROTEINAS


En la actualidad, ya se aislaron algunas de las enzimas y proteinas (tanto bacterianas como eucarióticas), que catalizan algunas de
las etapas de recombinación homologa.
- En procariotas están las siguientes:
+ La enzima RecBCD, que tiene actividad helicasa y nucleasa.
+ La proteína RecA promueve todos los pasos básicos del proceso de recombinación homologa: el apareamiento de dos DNA, la f
ormación de los intermedios de Holliday y la migración de la ramificación.
+ Las proteinas RuvA y RuvB, que reparan el daño causado por el UV, desplaza la proteína RecA y promueve la migración de la r
amificación a velocidades mayores que RecA.

Se han aislado nucleasas de bacterias y levaduras que cortan específicamente los intermedios de Holliday, a menudo denominada r
esolvasas. La proteína RuvC es una de las, mínimo, dos nucleasas de este tipo procariotas.
La enzima RecBCD se une al DNA lineal en un extremo roto y se mueve hacia adentro a lo largo de la doble hebra, desenrronllad
o y degradando el DNA, en una reacción acoplada a la hidrolisis del ATP. Las subunidades RecB y RecD son motores helicasa, co
n RecB moviéndose en dirección 3' → 5' a lo largo de la otra hebra. La actividad RecC degrada a ambas hebras por igual, hasta qu
e, RecB interacciona con una secuencia denominada chi.
A partir de este punto, la degradación de la hebra con un extremo 3' disminuye considerablemente (formando un bucle simple hebr
a debido al desplazamiento del complejo y a la interacción de la secuencia chi con el sitio de barrido de la RecB).
Sin embargo, la degradación de la hebra con el extremo 5' continua. Este proceso genera un DNA de hebra sencilla con un extrem
o 3', estructura que se utiliza en las etapas posteriores de la recombinación.
La proteína RecA destaca entre las proteinas que intervienen en el metabolismo del DNA, pues su forma activa es un filamento he
licoidal ordenado formado por varios millares de monómeros unidos cooperativamente al DNA.
Este filamento normalmente se forma sobre DNA monohebra, tal como el generado por la enzima RecBCD. El filamento también
se forma sobre un dúplex de DNA con un hueco de hebra sencilla. En este caso, los primeros monómeros de RecA se fijan al DN
A monohebra en el hueco y a continuación el filamento se extiende rápidamente al dúplex vecino.
Varias proteinas regulan el ensamblaje y el desensamblaje de los filamentos de RecA.
Un modelo útil para ilustrar las actividades de recombinación del filamento de RecA es la reacción in vitro de intercambio de hebr
a.

MODELO DE INVASIÓN DEL dsDNA al ssDNA


• RecA se une primero a un DNA de hebra sencilla para establecer el filamento de nucleoproteína.
• El filamento de RecA incorpora un dúplex de DNA homologo y lo alinea con la hebra sencilla unida.
• La rotación del DNA produce un efecto carrete que desplaza la region de tres hebras de izquierda a derecha.
• Una de las hebras DNA dúplex es transferida al ssDNA original, mientras que la otra es desplazada.
• A medida que continua la rotación, se van separando las hebras

La unión de ATP (pero no su hidrolisis) es necesaria para lo formación de un filamento de RecA activo que pueda alinear dos mol
éculas de DNA.
Una vez formado el intermedio de Holliday, hacen falta una multitud de enzimas, para completar la recombinación . La proteína R
uvC de procariotas corta los intermedios de Holliday para generar productos cromosómicos completos no ramificados

B- RECOMBINACION DURANTE LA MEIOSIS SE INICIA EN ROTURAS DE DOBLE HEBRA


En la meiosis se cumple el mecanismo general de reparación por recombinación homologa:
En este modelo de reparación, de roturas de doble hebra para la recombinación se usan los extremos 3' para iniciar el intercambio
genético. Una vez estos se han apareado con la hebra complementaria del homologo intacto, se crea una región de DNA hibrido q
ue contiene hebras complementarias de dos DNA parentales diferentes. Cada uno de los extremos 3' puede actuar entonces de ceb
ador para la replicación del DNA. Las estructuras así formadas, llamadas intermedios de Holliday, son una caracteristica común d
e la recombinación genética homologa en todos los organismos.
Los detalles de la recombinación homologa pueden variar de una especie a otra, pero la mayor parte del mecanismo general suelen
estar presentes de una u otra forma. Hay dos maneras de cortar el intermedio de Holliday, de manera que los dos productos recom
binantes mantengan los genes en el mismo orden lineal que en los sustratos, es decir, los cromosomas originales no recombinados.
Si son cortados de una manera, el DNA que flanquea la región que contiene el DNA hibrido no es recombinada; si son cortados d
e la otra manera, el DNA flanqueante es recombinado. Ambos resultados son observados in vivo tanto en eucariotas como en proc
ariotas.
La recombinación homologa es un proceso muy elaborado con consecuencias moleculares sutiles para la generación de la diversid
ad genética. En el proceso que contribuye a la diversidad genética, los cromosomas homólogos que experimentan la recombinació
n no son necesariamente idénticos.
Las series lineales de genes pueden ser las mismas, pero las secuencias de bases pueden diferir ligeramente en algunos genes (en d
iferentes alelos).
BASICAMENTE: la recombinación homologa no cambia el ordenamiento lineal de los genes, pero puede determinar que alelos q
uedan ligados en un único cromosoma y pasan juntos a la siguiente generación.

C- TODOS LOS MECANISMOS DEL METABOLISMO DEL DNA PARTICIPAN EN LA REPARACION DE LAS HORQUI
LLAS DE REPLICACION BLOQUEDAS
Como todas la células, las bacterias deben afrontar elevados niveles de daño en el DNA, incluso en condiciones normales de creci
miento. La mayoría de las lesiones del DNA son reparadas rápidamente por reparación. No obstante, casi todas las horquillas de re
plicación bacterianas topan con una lesión o rotura no reparada en su trayecto desde el origen al termino de su recorrido.
La DNApol III no puede superar muchos tipos de lesiones; en estos casos, la DNApol III no puede avanzar y la lesión suele queda
r en un hueco de hebra sencilla. El encuentro con una rotura de la hebra de DNA crea una rotura de doble hebra. Ambas situacion
es requieren la reparación por recombinación del DNA. En condiciones de crecimiento normal, las horquillas de replicación bloqu
eadas se reactivan mediante un elaborado sistema de reparación que incluye la reparación por recombinación del DNA, la reanuda
ción de la replicación y la reparación de cualquier lesión que haya quedado atrás. En este proceso participan todos los componente
s del metabolismo del DNA.
Una vez la horquilla de replicación se ha detenido, puede ser reactivada a través de al menos dos vías principales; ambas requieren
la proteína RecA. La reparación de lesiones que se encuentran en huecos requiere además de otras proteinas. La reparación de rot
uras de doble hebra requiere la enzima RecBCD. Otras etapas adicionales de recombinación son seguidas por el proceso conocido
por reinicio de la replicación independiente de origen, en el que la horquilla de replicación se reorganiza con ayuda de un complej
o de siete proteinas. Este complejo se denomina actualmente primisoma de reinicio de la replicación. La reactivación de las horqui
llas de replicación también requiere DNApol II, con un papel aun no definido, pues acto seguido cede su lugar a la DNApol III par
a la replicación extensiva generalmente necesaria para completar el cromosoma. En algunos casos el reinicio de la replicación pue
de ocurrir mas allá de una lesión bloqueante del DNA antes de que la lesión sea reparada.
La reparación de horquillas de replicación bloqueadas supone transiciones coordinadas entre replicación y recombinación. Las eta
pas de recombinación sirven para rellenar el hueco del DNA o para unir la rama del DNA rota con el fin de recrear la estructura ra
mificada del DNA en la horquilla de replicación. Las lesiones dejada atrás, en lo que ya es DNA dúplex, son reparadas por rutas c
omo la reparación por escisión de base o por escisión de nucleótido. Por lo tanto, una amplia variedad de enzimas implicadas en c
ada uno de los aspectos del metabolismo del DNA desempeñan en ultimo termino un papel en la reparación de las horquillas de re
plicación bloqueadas. Este tipo de proceso de reparaciones una de las funciones principales del sistema de recombinación homolo
ga en cualquier célula y los defectos en la reparación del DNA por recombinación tienen un importante papel en patologías human
as.

=> RECOMBINACION POR UNIÓN DE EXTREMOS NO HOMÓLOGOS


Es el mecanismo predominante para la reparación de roturas en la doble hebra de organismos multicelulares. Implica la nueva uni
ón de los extremos no homólogos de dos moléculas de DNA. Aun si lo fragmentos de DNA unidos proviniesen del mismo cromos
oma, el proceso de reparación resultaría en la perdida de varios pares de bases en el punto de unión. Dado que el movimiento del
DNA dentro del núcleo denso de proteina es relativamente mínimo, los extremos correctos generalmente vuelven a unirse aunque
con perdida de pares de bases. Sin embargo, en ocasiones, los extremos rotos de diferentes cromosomas se unen entre si, llevando
a la translocación de trozos de DNA de un cromosoma a otro. Estas translocaciones pueden generar genes quiméricos que pueden
tener efectos drásticos en el funcionamiento normal de las células, tales como un crecimiento celular descontrolado. Un complejo
de dos proteinas, Ku y una proteina quinasa dependiente de DNA (DNA-PK) se une a los extremos del corte de doble hebra
Despues se eliminan unas pocas bases por acción de nucleasas y las dos moleculas de doble hebra se unen. Como resultado de ello
, se reparan los cortes en la doble hebra pero quedan eliminados varios pares de bases del sitio de corte.
=> RECOMBINACION SITIO-ESPECIFICA
La recombinación especifica de sitio, es un proceso muy diferente, pues esta limitado a secuencias especificas. Estas reacciones de
recombinación tienen lugar en prácticamente todas las células, pero sus funciones están especializadas y varían en gran medida de
una especie a otra. Entre estas funciones se encuentran la regulación de la expresión de ciertos genes, la promoción de reordenami
entos programados del DNA durante el desarrollo de muchos organismos o los ciclos de replicación de algunos DNA de virus y pl
ásmidos. Todos los sistemas de recombinación especifica de sitio requieren una enzima denominada recombinasa y una secuencia
única de DNA sobre la que actúa la recombinasa (el sitio de recombinación). Una o mas proteinas auxiliares pueden regular el mo
mento o los efectos de la reacción.
Hay dos clases generales de sistemas de recombinación especifica de sitio, que dependen de residuos Tyr o Ser en el sitio activo.
Los estudios in vitro de muchos sistemas de recombinación especifica de sitio de la clase tirosina han puesto de manifiesto alguno
s principios generales, incluida la ruta de reacción fundamental. Se han cristalizado varias enzimas de la ruta que han permitido co
nocer detalles estructurales de la reacción. Una recombinasa independiente reconoce y se une a cada uno de los dos sitios de reco
mbinación en dos moléculas de DNA diferentes o dentro del mismo DNA. Una hebra de DNA de cada sitio corta en un punto espe
cifico dentro del sitio y la recombinasa se une de manera covalente al DNA en el sitio de corte a través de un enlace fosfotirosina.
El enlace transitorio proteína-DNA preserva el enlace fosfodiéster que se pierde al cortar el DNA, por lo que no son necesarios cof
actores de alta energía tales como el ATP en los pasos posteriores. Las hebras de DNA cortadas se vuelven a unir a nuevas hebras
para formar un intermedio de Holliday, con nuevos enlaces fosfodiéster creados a expensas de la unión proteína-DNA. Para compl
etar la reacción, el proceso se ha de repetir en un segundo punto dentro de cada uno de los sitios de recombinación. En los sistema
s que emplean un residuo Ser en el sitio activo, las dos hebras de cada sitio de recombinación se cortan conjuntamente y vuelven a
unirse a las nuevas hebras sin intermedio de Holliday. En los dos tipos de sistema el intercambio siempre es reciproco y preciso, r
egenerando los sitios de recombinación una vez completada la reacción. Podemos considerar una recombinasa como una endonuc
leasa especifica de sitio y ligasa en el mismo paquete.
Las secuencias de los sitios de recombinación reconocidas por las recombinasas especificas de sitio son parcialmente asimétricas (
no palindrómicas) y los dos sitios de recombinación se alinean con la misma orientación durante la reacción de la recombinasa. El
resultado depende de la localización y la orientación de los sitios de recombinación.
Si los dos sitios están en la misma moléculas de DNA, la reacción da lugar a la deleción o a la inversión del DNA limitado por ell
os, según si los sitios tienen la misma orientación u opuesta, respectivamente. Si los sitios están en moléculas de DNA diferentes, l
a recombinación es intermolecular; si uno de los DNA, o los dos, son circulares se produce una inserción. Algunos sistemas de la r
ecombinasa son muy específicos para una de estas reacciones y actúan solamente sobre sitios con la orientación adecuada.

Un ejemplo de recombinación sitio especifica es infección del fago lambda a E. coli.

LA RECOMBINACION ESPECIFICA DE SITIO PUEDE SER NECESARIA PARA COMPLETAR LA REPLICACION DE


L CROMOSOMA
La reparación del DNA por recombinación del cromosoma circular bacteriano, aunque indispensable, a veces genera productos se
cundarios dañinos. La resolución de un intermedio de Holliday en una horquilla de replicación por una nucleasa tal como RuvC, s
eguida por la finalización de la replicación, puede dar lugar a uno de dos productos: los dos cromosomas monoméricos normales o
bien un cromosoma dimérico contiguo.
En este ultimo caso, los cromosomas unidos covalentemente no pueden segregarse en las células hijas durante la división celular,
y las células hijas quedan "pegadas". Un sistema especializado de recombinación especifica de sitio de procariotas, denominado X
erCD, convierte los cromosomas diméricos en cromosomas monoméricos, para que la división celular pueda continuar. La reacció
n consiste en una deleción especifica de sitio.

=> LA RECOMBINACION POR TRANSPOSICION


El tercer mecanismo de recombinación consiste en el movimiento de los elementos transponibles, conocidos también transposones
. Estos segmentos de DNA, presentes en prácticamente todas las células, que se mueven de un lugar del cromosoma (sitio donor) a
otro en el mismo o diferente cromosoma (sitio aceptor). La homología de las secuencias de DNA normalmente no es necesaria pa
ra este movimiento, denominado transposición; la nueva localización es elegida mas o menos al azar. La inserción de un transposó
n en un gen esencial podría matar la célula, por lo que la transposición esta estrechamente regulada y normalmente es muy poco fr
ecuente. Los transposones son tal vez los parásitos moleculares mas simples que han logrado replicarse pasivamente dentro del cr
omosoma de las células huésped. En algunos casos transportan genes que son útiles para la célula huésped, con la que mantienen u
na especie de simbiosis.
Los transposones bacterianos varían en estructura, pero la mayoría tienen cortas secuencias repetitivas en cada extremo, que sirve
n de lugares de unión de la transposasa. Cuando ocurre la transposición, una secuencia corta del sitio de inserción se duplica para f
orma una corta secuencia repetida adicional que flanquea cada extremo del transposón insertado.
Estos segmentos duplicados son producidos por el mecanismo de corte responsable de insertar el transposón en una nueva localiz
ación del DNA.
En las bacterias hay dos rutas generales para la transposición:
- En la transposición directa (o simple), el transposón es escindido por cortes en ambos extremos para permitir el movimiento hast
a una nueva localización. Este proceso deja una rotura de hebra doble en el DNA donor, que debe ser reparada.
En el sitio diana se produce un corte indentado, el transposón es insertado en la rotura y la replicación del DNA llena el hueco par
a duplicar la secuencia del sitio diana.
- En la transposición replicativa, se replica el transposón completa, dejando atrás una copia en el sitio que hace de dador. El cointe
grado es un intermedio de este proceso, consistente en la región dadora unida covalentemente al DNA del sitio receptor. En el coi
ntegrado hay dos copias completas del transposón, ambas con la misma orientación relativa en el DNA. En algunos transposones
bien caracterizados, el cointegrado intermedio se transforma por recombinación especifica de sitio, en la que recombinasas especia
lizadas promueven la necesaria reacción de deleción.
Las eucariotas también tienen transposones estructuralmente similares a los transposones bacteriano y, a veces, con mecanismos d
e transposición similares, en otros casos, sin embargo, el mecanismo de transposición parece utilizar un intermedio de RNA. Estos
transposones han coevolucionado con ciertas clases de virus de RNA.

PRINCIPALES DIFEENCIAS ENTRE RECOMBINACIÓN HOMOLOGA & RECOMBINACIÓN SITIO-ESPECÍFICA


• Para que ocurra recombinación homologa debe haber dos ADN con secuencias homologas. La recombinación puede ocurrir en c
ualquier punto del ADN en donde haya homología. En la recombinación sitio especifica, se requiere una secuencia en particular p
ara que haya recombinación.
• La recombinación homologa requiere de una maquinaria enzimática extensa, mientras que en la recombinación sitio-especifica s
i se requiere de unas pocas enzimas.
• La recombinación homologa hay perdida de material genético (se degrada una hebra para obtener extremos cohesivos). En la rec
ombinación sitio especifica hay una reacción de transesterificación (donde no hay ni síntesis ni degradación de ADN).
• La recombinación homologa no es reversible mientras que la recombinación sitio-especifica si (se desintegra, literal, el fragment
o integrado).

MECANISMOS DE RECOMBINACION EN PROCARIOTAS


Para generar variabilidad genética se deben cruzar cepas de un organismo que tienen diferentes genotipos (y fenotipos) y buscar re
combinantes. Para ello, se aprovecha los procesos naturales por el cual las bacterias intercambian material genético. Estos tres pro
cesos son:
- TRANSFORMACION: implica la incorporación de DNA libre en el ambiente.
- TRANSDUCCION: implica la transferencia de DNA mediada por virus.
- CONJUGACION: implica la transferencia de DNA por contacto célula-célula y la presencia de un plásmido conjugativo en la cé
lula donora.
=> TRANSFORMACION
La transformación genética es un proceso por el que el DNA libre se incorpora en una célula receptora y lleva a cabo un cambio g
enético.
Se han encontrado varias procariotas que son transformables en condiciones naturales, incluyendo ciertas especies de bacterias Gr
am positivas, Gram negativas y arqueas. Sin embargo, incluso dentro de los géneros transformables, solo ciertas cepas o especies r
esultan transformables. Una célula que es capaz de tomar una molécula de DNA y ser transformada se dice que es competente. Sol
o ciertas cepas son competentes; esta capacidad parece ser una propiedad determinada genéticamente. En la mayoría de las bacteri
as que se pueden transformar naturalmente, la competencia esta regulada y hay proteinas especiales que juegan un papel en el tran
sporte y procesamiento del DNA.
Las proteinas especificas de la competencia incluyen una proteína de membrana de unión del DNA, una autolisina de la pared celu
lar, y varias nucleasas. Una vía implicada en la competencia natural en algunas especies es parte de un sistema de quorum sensing
regulada por un sistema de dos componentes. Las células producen y excretan un pequeño péptido durante el crecimiento y llegan
a ser competentes a altas concentraciones de este péptido, a través de la acción de dos proteinas:
- la ComP, que es una quinasa sensora
- la ComA que es una proteína activadora, que regula un numero de genes que afectan la transformación.
El porcentaje de bacterias que se hacen competentes y el tiempo en que los son varia de especie en especie.

Incorporación de DNA
Una diferencia importante en la incorporación de DNA entre Gram negativas y Gram positivas es la producción del factor de com
petencia.
- En Gram positivas, es preciso que las bacterias se encuentren en una determinada fase de crecimiento. Cuando la población alcan
za una determinada densidad poblacional, es ahí cuando la población se vuelve competente. En ese momento, comienzan a segreg
ar una pequeña proteína denominada factor de competencia que estimula la producción de 8 a 9 nuevas proteinas necesarias para e
l proceso de transformación.
- En Gram negativas, no produce un factor de competencia para estimular el desarrollo de competencia, y sólo capta el DNA proc
edente de especies estrechamente relacionadas. El DNA bicentenario forma complejos con proteínas y es captado por vesículas de
membrana. La especificidad de la transformación se debe a una secuencia especial de pares de bases que se repite mas de mil vec
es en el DNA de la Gram negativa. El DNA debe contener esta secuencia para que una célula competente se una a él.
Esto implica que, mientras que las Gram negativas solo son competentes con determinadas moléculas de DNA. Las Gram negativ
as son menos exigentes en cuanto a la fuente de su DNA.
Las bacterias también difieren en la forma en que incorporan el DNA aunque en todos los casos solo entra en el citoplasma ssDN
A.
- En Gram positivas, las células toman ssDNA. En la bacteria se incorpora dsDNA a la vez que una de las hebras es degradada.
- En Gram negativos, la célula solo toma dsDNA, a pesar de que solo se incorporan en el genoma mediante recombinación segme
ntos monocatenarios. Parece que el dsDNA es degradado a hebra sencilla en el espacio periplásmico y solo penetra en el citoplas
ma una hebra sencilla.

Integración del DNA transformante


El DNA transformante se una a la superficie celular por una proteína de unión al DNA, tras lo cual el fragmento bicentenario com
pleto resulta captado por la célula o bien una nucleasa degrada una hebra y la otra es incorporada. Tras la incorporación, el DNA s
e asocia con una proteína especifica de la competencia que permanece unida al DNA, posiblemente para protegerlo del ataque por
nucleasas, hasta que alcanza el cromosoma, donde es sustituida por la proteina RecA. El DNA se integra luego en el genoma del r
eceptor por proceso de recombinación.

Competencia inducida
La transformación natural de alta eficacia ocurre solo en un grupo muy reducido de procariotas. Muchas procariotas se transforma
n muy pobremente o nada en absoluto bajo condiciones naturales.
=> Shock térmico/solución de calcio
La determinación de como inducir competencia en tales bacteria fue cuando se pudo inducir artificialmente a Escherichia coli cua
ndo se la trataba a altas concentraciones de iones de calcio, y luego se la somete a un shock térmico, cambiando drásticamente de
T muy bajas a T muy elevadas. procariotas de esta manera toma dsDNA, y así la transformación por pDNA (DNA plasmídico) es
relativamente eficiente.
Este tratamiento funciona para un gran numero de bacterias Gram negativas.
=> Electroporación
Otra forma de hacer a las bacterias competente consiste en exponer a laces células a campos eléctricos pulsados para abrir pequeñ
os poros en sus membranas. Cuando existen moléculas de DNA fuera de las células durante el pulso eléctrico, pueden entrar en las
células a través de estos poros. La electroporación requiere un suministro de potencia sofisticado, ya que los pulsos deben ser con
trolados cuidadosamente y duran solo milisegundos. Esta técnica se ha usado para introducir DNA en un gran numero de especies
diferentes, tanto arqueas como bacterias, y también en muchas células eucariotas. Además, la electroporación permite transferir un
plásmido de una célula a otra si ambos están presentes durante la electroporación. Por lo tanto, la electroporación permite tanto la
salida como la entrada en la célula de pequeñas moléculas de DNA. Este tipo de "transformación" elimina las etapas requeridas pa
ra aislar el plásmido de la primera cepa antes de introducirlo en la segunda.

=> TRANSDUCCION
En la transducción, el DNA se transfiere de una célula a otra mediante un virus. La transferencia genética de genes del huésped po
r virus puede ocurrir de dos maneras. En ambos casos, la partícula viral es defectiva, ya que algunos genes virales han sido reempl
azados por genes bacterianos.
• En la primera, llamada transducción generalizada, el DNA del huésped, que puede proceder de cualquier parte del genoma, pasa
a formar parte del DNA de la partícula madura del virus en lugar del genoma del virus. En la transducción generalizada, si los gen
es del donor no sufren recombinación homologa con el cromosoma de la bacteria receptora se perderán. No pueden replicarse inde
pendientemente y no son parte de un genoma viral.
• En la segunda, llamada transducción especializada, ocurre solo en algunos virus atemperados (virus provenientes de cepas lisogé
nicas); el DNA de una región especifico del cromosoma bacteriano se integra directamente en el genoma del virus, generalmente r
eemplazado algunos de los genes del virus. En la transducción especializada también puede ocurrir recombinación homologa. Sin
embargo, puesto que el DNA de la bacteria donora es ahora parte del genoma de un fago temperado, hay dos posibilidades:
1- el DNA puede integrarse en el cromosoma del huésped durante la lisogenización
2- el DNA puede replicarse en el receptor como parte de una infección lítica.
No todos los fagos pueden transducir, y no todas las bacterias son transducibles; pero el fenómeno esta lo suficientemente extendi
do para suponer que desempeña un importante papel en la transferencia genética en la naturaleza.

Transducción generalizada
En la transducción generalizada se puede transferir prácticamente cualquier marcador genético desde el donor al receptor. Este pro
ceso requiere fagos líticos.
Cuando la población de bacterias sensibles se infecta con un fago, pueden iniciarse las etapas del ciclo lítico del fago. Durante una
infección lítica, las enzimas responsables del empaquetamiento del DNA vírico en el fago, a veces introducen DNA del hospedad
or de forma accidental, debido a que el genoma bacteriano se rompe en fragmentos pequeños. La partícula resultante es una part
ícula transductora, la misma solo presenta DNA bacteriano. Cuando la célula se lisa, estas partículas se liberan junto con los virus
normales, de manera que el lisado contiene una mezcla de viriones y partículas transductantes. Puesto que las partículas transduct
antes no pueden iniciar una infección viral normal (no contienen DNA vírico, o le falta en parte), se les llama defectivas. Cuando
este lisado se usa para infectar una población de células receptivas, la mayoría de las células resultan infectadas por un virus norm
al. Sin embargo, una pequeña proporción de la población recibe partículas transductantes que inyectan el DNA que recibieron de
la anterior bacteria hospedadora. Aunque este DNA no puede replicarse (no puede formar virus maduros, ya sea por falta de pro
teinas estructurales o por falta de enzimas involucradas en la replicación codificadas en su genoma,, puede sufrir recombinación
genética con el DNA del nuevo hospedador.
Puesto que solo una pequeña proporción de las partículas del lisado son del tipo transductor defectivo, y cada uno contiene solo un
pequeño fragmento de DNA donor, la probabilidad de que una partícula transductora contenga un determinado gen es muy baja, y
normalmente alrededor de una célula de cada 106-108 resulta transducida con un marcador genético dado.
Los fagos capaces de formar partículas transductantes pueden ser atemperados o virulentos, y los principales requisitos son que po
sean un mecanismo de empaquetamiento del DNA que permita el reconocimiento accidental del DNA del hospedador y que el em
paquetamiento ocurra antes de que el genoma del hospedador sea completamente degradado. La detección de la transducción es m
as segura cuando la multiplicidad de infección del fago con respecto al hospedador es baja, de manera que una célula huésped es i
nfectada por solo una partícula fágica; a alta multiplicidad de infección, los viriones del lisado pueden matar células.

Transducción especializada
Como la transducción generalizada, la transducción especializada requiere la transferencia de genes de una bacteria a otra por med
io de fagos, pero aquí solo se transfieren los genes cercanos a determinados sitios del cromosoma bacteriano. Este proceso requier
e fagos lisogénicos. Los profagos pueden escindirse del cromosoma bacteriano de manera imperfecta y transportar con ellos una p
orción pequeña del DNA bacteriano adyacente al sitio de la integración del profago. El fago que transporta este DNA lo inyectara
luego en otra célula bacteriana en el siguiente ciclo de infección. Este proceso es comparable a lo que sucede en las células F', en l
as que el plásmido F transporta genes de una bacteria a otra.
EJEMPLO: transducción de los genes de la gal por el fago atemperado lambda de procariotas:
Cuando la célula lisogénica es inducida, el DNA del fago se escinde como una unidad. Sin embargo, bajo ciertas condiciones raras
, el genoma del fago puede escindirse de forma incorrecta. Alguno de los genes bacterianos adyacentes se escinde junto con el DN
A del fago. Al mismo tiempo, algunos genes fágicos se quedan allí. Un tipo de partícula fágica alterada, dgal (defectivo de galacto
sa), es defectiva a causa de los genes fágicos perdidos y no forma virus maduros. Sin embargo, un fago auxiliar, puede suministrar
las funciones que faltan en las partículas defectivas. Este fago "auxiliar" es idéntico al fago original. Así, el lisado del cultivo obte
nido contiene algunas partículas de dgal mezcladas con un gran numero de viriones del fago normales.
Para que el fago sea viable, existe un limite máximo en la cantidad de DNA del fago que puede ser reemplazado por DNA del hos
pedador, ya que se debe conservar suficiente DNA del fago para suministrar información para la producción de las proteinas de la
cubierta del fago, así como para otras proteinas necesarias para la lisis y la lisogenización.
Sin embargo, si se usa un fago auxiliar junto al defectivo en una infección mixta, entonces se necesita incluso menos información
en el fago defectivo para la transducción. En estas condiciones, la producción de una partícula transductante solo necesita:
- La región att: sitio de fijación al cromosoma del hospedador.
- El sitio cos: extremos cohesivos para el empaquetamiento
- El origen de replicación.
Una diferencia importante entre transducción generalizada y especializada radica en la forma en que se puede formar el lisado tran
sductor. En la transducción especializada debe ocurrir por inducción de un lisógeno, mientras que en la transducción generalizada
puede ocurrir de este modo o por infección de una bacteria no lisogénica, con posterior replicación del fago y lisis de la célula.
Cabe destacar que la transducción especializada no solo se utiliza para la galactosa, se pueden utilizar muchas regiones especificas
del genoma de la bacteria, o incluso que contengan genes de cualquier otro organismo.

=> CONJUGACION
Es el principal mecanismo de transmisión célula a célula y es una funcion codificada por algunos plásmidos. La conjugación es un
proceso replicativo y ambas células terminan con copias del plásmido.
Los plásmidos que gobiernan su propia transferencia de una célula a otra por contacto se llaman conjugativos, pero no todos los pl
ásmidos son conjugativos.
Algunos plásmidos conjugativos pueden transferir información genética entre organismos muy distantes filogenéticamente. Así, d
entro de las bacterias, se ha demostrado transferencia entre Gram negativas y Gram positivas, entre bacterias y células vegetales, y
entre bacterias y hongos. Incluso si el plásmido no puede replicarse en el nuevo hospedador, la transferencia del mismo, puede te
ner importantes consecuencias evolutivas, así como estar relacionada con procesos. patogénicos, si se puede recombinar con el g
enoma del nuevo hospedador.
Los mecanismos de transferencia por conjugación pueden ser diferentes dependiendo del plásmido concreto, pero la mayoría de lo
s plásmidos Gram negativas parecen emplear un mecanismo similar al usado por el plásmido F.
Los plásmidos conjugativos deben la transmisibilidad por conjugación a un conjunto de genes dentro del plásmido que constituye
la región tra.
La region tra contiene genes que codifican proteinas que funcionan en la transferencia del DNA y en su replicación, y otras que fu
ncionan en la formación de parejas conjugativas. Muchos genes de la region tra están relacionados con la síntesis de una estructur
a superficial, el pelo sexual.
El plásmido F y otros relacionados codifican pelos F.
La presencia de una region tra en un plásmido puede tener otra importante consecuencia si el plásmido se integra en el cromosoma
. En este caso, el plásmido puede movilizar la transferencia del gDNA de una célula a otra. Las cepas de bacterias que transfieren
grandes cantidades de gDNA durante la conjugación se llaman, Hfr (siglas en ingles de alta frecuencia de recombinación).
Todos los plásmidos, inclusive los conjugativos, deben llevar genes que aseguren si propia replicación.

Conjugación & movilización del cromosoma


La conjugación requiere una célula donora, que contiene un tipo particular de plásmido conjugativo, y una célula receptora que ca
rece de él. Dado que la conjugación se descubrió realizando cruces genéticos, las células donoras se llaman machos y las receptora
s hembras. Solo las células donoras tienen estos pelos (lo que explica la razón por la que los fagos RNA que se unen a ellos se lla
man "específicos de machos"). Plásmidos conjugativos diferentes pueden tener regiones tra diferentes, y, en algunos casos, los pel
os pueden ser también distintos.
Los pelos permiten el apareamiento especifico entre la célula donora y la receptora. En Gram negativas, se cree que toda conjugac
ión depende del apareamiento ocasionado por los pelos sexuales. Estos pelos establecen contactos específicos con un receptor de l
a otra célula y luego se retraen, empujando una célula hacia la otra. Luego, los contactos entre las células donora y receptora se est
abilizan, probablemente por fusión de las membranas externas, y el DNA se transfiere de una célula a otra.
La transferencia de DNA requiere síntesis de DNA, y la evidencia sugiere que una de las bandas deriva de la célula donora y la otr
a se sintetiza de nuevo en el receptor durante el proceso de transferencia. Algunos genes de la region tra están implicados en la tra
nsferencia y replicación del DNA.
El modelo de replicación por circulo rodante es el que mejor explica la transferencia de DNA durante la conjugación.
Todo el proceso parece ponerse en marcha tras el contacto célula a célula, en cuyo momento se rompe una hebra del DNA circul
ar del plásmido y se transfiere una banda parental.
La enzima responsable del corte necesario para iniciar el proceso, TraI, esta codificada por el operón tra del plásmido F. Esta pr
oteina tiene también una actividad helicasa y, por lo tanto, esta implicada en el desenrrollamiento de la banda que se va a transfe
rir. A medida que ocurre la transferencia, la síntesis de DNA según el modelo del circulo rodante, reemplaza a la banda transferi
da en el donador. A su vez, una banda complementaria se sintetiza también en el receptor. Por lo tanto, al final del proceso, tanto
el donador como el receptor poseen plásmidos completamente formados
La transferencia del pDNA es extremadamente eficiente; bajo condiciones apropiadas prácticamente cada célula receptora que se
aparea adquiere un plásmido. Cuando los genes del plásmido se expresan en el receptor, el propio receptor se convierte en donado
r y puede transferir el plásmido a otros receptores. De este modo, los plásmidos conjugativos se extienden rápidamente entre las p
oblaciones, comportándose como agentes infecciosos. La naturaleza infecciosa de este fenómeno tiene gran importancia en ecolog
ía, puesto que la introducción de algunas células con plásmidos, en una población adecuada de receptores, convierte a toda la pobl
ación receptora en portadora del plásmido en poco tiempo, siempre que el plásmido contenga genes que confiera alguna ventaja se
lectiva. La amplia distribución de la resistencia a drogas debida a plásmidos conjugativos ha ocasionado serios problemas a la qui
mioterapia de las enfermedades infecciosas. Sin embargo, los plásmidos también pueden perderse por un proceso llamado curació
n. Esto puede ocurrir en poblaciones naturales donde no existe presión selectiva para mantener el plásmido.
El plásmido F de procariotas no solo es conjugativo sino que tiene la propiedad de movilizar el cromosoma de modo que pueda se
r transferido durante el contacto célula a célula. El plásmido F es un episoma, es decir, es un plásmido que puede integrarse a el cr
omosoma del hospedador.
Cuando el plásmido F se integra en el cromosoma, la conjugación puede ocasionar la transferencia de grandes regiones del cromos
oma del hospedador y la recombinación genética entre el donador y el receptor puede ser muy extensa.
Las células que posean un plásmido F no integrado se llaman F+, y las que tienen un plásmido F integrado en el cromosoma se lla
man Hfr.
Tanto las cepas F+ como las Hfr actúan como donoras, pero la conjugación que usa un donor Hfr conduce a la transferencia del cr
omosoma del hospedador puesto que el plásmido forma parte del cromosoma. La integración del plásmido es un mecanismo muy
simple para movilizar otros elementos genéticos. El termino alta frecuencia de recombinación hace alusión a la recombinación gen
ética entre el cromosoma del donor y el del receptor. Las células que carecen del plásmido F se llaman F- y actúan como receptora
s. En general, las células que contienen un plásmido conjugativo son receptores muy pobres para el mismo plásmido o plásmidos r
elacionados. Esto es debido a que se bloquea la entrada del plásmido.
Por lo tanto, la presencia del plásmido F origina tres alteraciones distintas en las propiedades de una célula:
1- capacidad para sinterizar el pelo F.
2- movilización del DNA para su transferencia a otra célula.
3- alteración de receptores de superficie de manera que la célula ya no es capaz de comportarse como receptora de conjugación.
La integración del plásmido F en el cromosoma del hospedador puede tener lugar en varios sitios específicos llamados secuencias
de inserción o IS. Estos sitios son regiones de homología entre el cromosoma y el DNA del plásmido F.
De esta manera, por ejemplo, para un Hfr dado, el sitio de integración esta entre los genes cromosómicos pro y lac. Una vez integr
ado, el plásmido ya no controla su propia replicación, pero la region tra aun funciona normalmente y la cepa sintetiza pelo. Cuand
o encuentra un receptor, se dispara el proceso de conjugación como si fuera un célula F+ y se inicia la transferencia de DNA en or
iT (origen de la transferencia). Sin embargo, puesto que el plásmido es ahora parte del cromosoma, tras la transferencia de parte d
el plásmido comienzan a transferirse genes cromosómicos. La region que se transfiere que presenta material génetico plasmídico y
material genético cromosómico se la conoce como region mob.
Así, decimos que se moviliza el cromosoma. La integración de un plásmido es un mecanismo simple de movilización.
Puesto que existen varios sitios de inserción diferentes, son posibles varias cepas Hfr distintas. Una determinada cepa Hfr siempr
e dona los genes en el mismo orden, comenzando en la misma posición, pero cepas Hfr de origen independiente transfieren los ge
nes en secuencias diferentes.
Generalmente, debido a la rotura de la hebra de DNA durante la transferencia, solo se transfiere parte del cromosoma donor. A ca
usa de ello, esa parte no puede replicarse por si misma en la célula receptora. Por consiguiente, los genes del receptor no se detecta
n a menos que ocurra recombinación entre el fragmento que ha entrado y el cromosoma del receptor.
Aunque las cepas Hfr transmiten con elevada frecuencia genes cromosómicos, por lo general, no convierten las células F- a F+,
ya que raramente se transfieren el plásmido F completo. Por otra parte, las células F+ convierten con eficiencia, las células F- a
F+ porque se transfiere el plásmido entero.
En algunos sitios de inserción, el plásmido F se integra con el origen en una dirección, mientras que en otros sitios el origen esta e
n dirección opuesta. La dirección en la que se inserta el plásmido F determina cuales son los genes cromosómicos que se transferir
án al receptor en primer lugar.
Al igual que en otros sistemas de transferencia de genes en bacterias, tras la conjugación deben seleccionarse los recombinantes, ll
amados transconjugantes.
Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en la transformación y en la transducción, en la conjugación, tanto en donor como el re
ceptor son viables, de manera que se hace necesario escoger un medio selectivo donde pueda crecer los recombinantes deseados, p
ero en el que ni el donor ni el receptor puedan formar colonias.
Normalmente, se usa un resistente a un antibiótico pero auxótrofo para alguna sustancia, y un donor que es sensible al antibiótic
o pero es prototrófico para la misma sustancia
La compresión del mecanismo de la conjugación y el conocimiento de que una cepa Hfr es una célula con una plásmido F integrad
o en el cromosoma, es esencial para comprender que, en una cepa dada Hfr, la transferencia de los genes cromosómicos ocurrirá si
empre en el mismo orden y desde un sitio determinado. La naturaleza orientada y fragmentaria de la transferencia de genes, se des
cubrió en un procedimiento denominada conjugación interrumpida. Los pares de células conjugadas se mantienen unidos débilme
nte y pueden separarse por agitación en una coctelera. Si se agitan mezclas de células Hfr y F- a distintos tiempos tras la mezcla y
se buscan recombinantes, se concluye que cuanto mayor es el tiempo que transcurre entre el apareamiento y la agitación, mayor es
el numero de genes del Hfr que aparecerán en el F- recombinante.
Los genes mas cercanos al origen entran primero en la F- y están siempre presentes en un mayor porcentaje de recombinantes qu
e los genes que entran mas tarde. Además de demostrar que la transferencia de genes es un proceso secuencial, este tipo de experi
mentos suministra un método para determinar el orden de los genes en el DNA bacteriano. La disposición de los distintos locus ge
néticos en el cromosoma se denomina mapa genético.
En ocasiones, los plásmidos F integrados se pueden escindir del cromosoma, y existe la posibilidad de que en el proceso se incor
poren genes cromosómicos en el plásmido F liberado. Esto puede ocurrir porque tanto el plásmido F integrado como el cromoso
ma contienen varios sitios IS idénticos donde puede ocurrir recombinación. Los plásmidos F que contienen genes cromosómicos s
e llaman plásmidos F prima (F'). Estos plásmidos F' difieren en los plásmidos F normales en que contienen genes cromosómicos i
dentificables y los transfieren a receptores con una frecuencia muy alta. La transferencia mediada por F' es muy similar a la transd
ucción especializada en el sentido de que solo se transfiere un grupo restringido de genes cromosómicos. La transferencia de un F'
conocido a un receptor permite la formación de diploides en una region limitada del cromosoma (los diploides parciales se llaman
merodiploides). Esto es importante para llevar a cabo pruebas de complementación.

EJEMPLO:
Se realiza una conjugación entre una cepa:
• Hfr: estreptomicina sensible (StrS); Treo+ y Leu+; Gal+
• F-: estreptomicina resistente (StrR); Treo- y Leu-; Gal-
Se mezclan 0,2 ml de Hfr con 1,8 ml de F-, ambos provenientes de cultivos en caldos en fase logarítmica que contienen 2×109 UF
C/ml.
La mezcla de conjugación se incuba a 32°C durante 100 minutos y se seleccionan los transconjugantes Treo+- Gal+ en una caja de
Petri conteniendo el medio selectivo A.
En dicha caja se sembraron 0,1 ml de la dilución 1/10 de la mezcla de conjugación. Después de incubar a 37°C una noche se cont
aron 170 colonias.
También se pudo determinar el mapa génetico para estos genes, obteniendo:
A- Como se determina la frecuencia que aparecen los transconjugantes Treo +- Gal+?
Frecuencia = [Transconjugantes]/[Aceptoras finales]
Las transconjugantes se calculan viendo el número de colonias que crecen en el medio de cultivo A, luego eso se lo multiplica por
el factor de dilución. Finalmente, se determina la concentración, en la mezcla de reacción:

[TRANSCONJUGANTES] = 3,40 × 104 UFC/2 mL


[ACEPTORAS FINALES] = 3,6 × 109 UFC/ 2 mL
Frecuencia = 3,40 × 104 UFC/3,6 × 109 UFC = 9,44 × 10-6

B- Indique la composición del medio selectivo A


Sabiendo que:
• Los FaC+ (factores de crecimiento positivos) significa que pueden sintetizar dicho factor de crecimiento, no se debe usar medios
ni medios que tengan extractos ni peptonas, dado que estos aportan distintos factores de crecimiento, ni tampoco se lo debe adicio
nar al medio.
• Los FuC+ (fuente de carbono positivos) significa que pueden usar esa fuente de carbono como tal. De esta forma, no se debe em
plear medios con extractos y peptonas dado que estos pueden aportar otras fuentes de carbono.
De esta manera, el medio A debe ser un medio selectivo y sintético, que contenga estreptomicina, de modo que solo los recombina
ntes pueden crecer.
La composición de cada medio selectivo varia dependiendo de las características genotípicas de los recombinantes deseados. Así,
para transconjugantes de Treo+- Gal+, el medio pueden ser:
• Estreptomicina
• Galactosa
• Leucina
Se pone estreptomicina debido a que todas las transconjugantes deben ser resistentes al mismo, ya que la aceptora era resistente.
Se pone galactosa porque se supone que lo puede usar como fuente de carbono.
No se pone treonina porque se supone que la puede biosintetizar.
Se pone leucina porque se supone que no puede sintetizarlo.

C- Cuál es el orden relativo de los marcadores en el cromosoma? Justificar


Treonina/Leucina - Galactosa - Triptófano

MECANISMOS DE CONJUGACION

F+ × F -
HFr × F-

F' × F -

COMPLEMENTACION
Los métodos de transferencia de genes en bacterias implican la transferencia se solo una porción del cromosoma donor, por lo tan
to, a memos que ocurra recombinación con el cromosoma receptor, el DNA del donor que entra en la célula se perderá ya que no p
uede replicarse independientemente. Tan solo en dos casos puede mantenerse un estado de diploidia parcial:
- en la transducción especializada, en la que los genes del donor se mantienen como parte del genoma viral.
- en el uso de plásmidos F', en donde los genes del donor se han incorporado al genoma del plásmido F.
Puesto que es posible crear un fago transductor especializado o plásmidos recombinantes mediante técnicas de DNA recombinante
, resulta ahora posible pones esencialmente cualquier porción del cromosoma bacteriano en un fago o plásmido.
Esto es útil en el test de complementación.
Cuando se cruzan genéticamente dos cepas mutantes (se conjugan), la recombinación homologa puede generar recombinantes del
tipo silvestre a menos que ambas mutaciones incluyan cambios en los mismo pares de bases. Así, si dos cepas Trp- se cruzan y se
obtienen recombinantes Trp+, resulta claro que las mutaciones no afectan a los mismos pares de bases. Sin embargo, este experim
ento no puede detectar si las mutaciones están en el mismo gen. Esto puede determinarse mediante un test, llamado test de comple
mentación.
La complementación se uso inicialmente en organismos eucarióticos diploides. En los organismos diploides la célula tiene pares d
e cromosomas, cada miembro procedente de un padre. Cuando dos mutaciones están presentes en miembros separados de un par (
es decir, una mutación de cada padre), se dice que están en configuración trans. Por otro lado, si las dos mutaciones están en el mi
smo cromosoma se dice que están en configuración cis.
En procariotas no existen verdaderos diploides, pero se puede conseguir un estado diploide para una region del cromosoma por tra
nsferencia de un fragmento cromosómico de un donor. Sin embargo, el principio de la prueba y la nomenclatura (cis y trans) es la
misma.
Si uno de los genes del Trp se inactiva en una célula por una mutación, originando un fenotipo Trp-, la introducción de una copia
del gen silvestre de otra cepa en dicha célula debería restaurar el fenotipo silvestres de la misma; es decir, el diploide parcial result
ante debe ser Trp+, valido en el caso de que la mutación sea dominante. Entonces, se puede decir que el gen silvestre complement
a la mutación.
Incluso aunque en procariotas solo transfiere un fragmento cromosómico, este fragmento es por lo general suficientemente grande
como para contener varios genes. Los genes para la biosíntesis del Trp forman un operón, y por lo tanto, se puede transferir el ope
rón entero desde la célula donora. Incluso si el operón del donor también tiene una mutación, complementara al gen mutado en el r
eceptor si las dos mutaciones están en genes diferentes. Se dice que las dos mutaciones se complementan. Las mutaciones pueden
complementar porque los genes codifican proteinas que pueden difundir dentro del citoplasma de la célula.
No se puede complementar mutaciones en sitios regulatorios tales como los promotores, ya que estos funcionan a nivel de DNA. S
i cada molécula homologa de DNA proporciona un gen diferente de los requerido, entonces la célula tendrá todas las enzimas requ
eridas para sintetizar Trp.
La complementación no implica recombinación. Para hacer el test, las mutaciones deben estar en trans, si una molécula lleva amb
as mutaciones, la otra será del tipo wt y debería ser capaz por si misma de conferir el fenotipo silvestre, a menos que una de las m
utaciones sea dominante. Por lo tanto, dispones de las mutaciones en cis sirve de control.

CISTRÓN
Este tipo de prueba de recombinación, llamada test cis-trans se usa para definir si dos mutaciones están en la misma unidad genéti
ca (funcional). La unidad genética definida por el test cis-trans se denomina a veces un cistrón (no siempre es equivalente a gen).
Dos mutaciones en el mismo cistrón no pueden complementar, de modo que cuando se produce la complementación implica que l
as dos mutaciones se localizan en diferentes cistrones (esto es, en diferentes genes). El termino cistrón se usa ahora raramente, sol
o para describir si un mRNA tiene la información genética de un gen (mRNA monocistrónico) o de mas de un gen (policistrónico)
.

PROTOCOLO CONJUGACION
Supongamos el siguiente caso hipotético en el que se quiere transferir el gen marcador de resistencia al antibiótico Tetraciclina y e
l gen que codifica para la expresión de la proteína verde fluorescente entre dos cepas de procariotas.
Las cepas utilizadas son las siguientes:
- Donora: procariotas S17-1: portador del plásmido pMP 6 que contiene el gen para la expresión de la proteína verde fluorescente
(GFP+) y es tetraciclina resistente, kanamicina sensible (tetR, kmS)
- Aceptora: procariotas SM10: GFP-, tetS, kmR

Se preparan 5 mL de cultivo a T = 37 °C a t = 20 hs, con sus respectivos antibióticos.


A los tubos se le agrega el medio de cultivo y se deja crecer con agitación hasta fase logarítmica.
De aquí, se debe realizar un recuento en placa del tubo 3, para determinar el numero de aceptoras totales. El mismo se debe realiza
r con las diluciones correspondientes.

Se deja incubar las tres placas entre 24 - 32 hs a 37 °C.


Pasado este tiempo, empleando 1 mL de caldo sin antibiótico, resuspendemos el botón en un eppendorf.
De aquí, se realiza un recuento en placa del tubo 1, para determinar el numero de transconjugantes. El mismo se realiza emple
ando las diluciones correspondientes en presencia de ambos antibióticos.
Para los tubos 2 y 3, se sigue el mismo procedimiento que para el tubo 1. El mismo se realiza como un control negativo, debido a
que en ninguna de las dos placa s debería haber crecimiento (a lo sumo entre 3 y 5 colonias, debido a las mutaciones espontaneas)
debido a que ninguna es capaz de crecen en ambos antibióticos. De haber un desarrollo mayor implica error experimental, por lo q
ue se debe repetir el experimento.

GEN KNOCK OUT


La inactivación génica dirigida es la desactivación experimental de un gen para estudiar su funcion. Los knock out deben ser

• KNOCK OUT EN ORGANISMOS SIMPLES


Los primers a utilizar presenta una secuencia homóloga al gen target que no hibridara con el gen de inserción, y presentara una reg
ión homologa con el gen de inserción de manera que se pueda obtener como producto de amplificación al gen X mas las regiones
homólogas en donde se producirá la recombinación homologa.
El gen X es un marcador de selección, que permitirá, además del knockout del gen target, la supervivencia a la presión de selecció
n.
• En bacterias, la transformación se la realiza con antibióticos. (Generalmente neomicina)
• En eucariotas simples (como levaduras), como los antibióticos no funcionan, se los modifica químicamente, de manera que inhib
an procesos metabólico vitales, y tratando de modificarla de manera tal que aun el gen de la resistencia lo pude detectar y eliminar
. (Generalmente G418, análogo de la neomicina).
En estos organismos, como son relativamente sencillos y por ende, no presenta demasiadas secuencias repetitivas, con realizar una
doble recombinación homologa alcanza, para que este no vuelva a salirse (se escinda del genoma).
Las levaduras son diploides, por lo que probablemente solo ocurrirá recombinación homologa en una de las copias del cromosoma
, de manera que se convertirá en una levadura resistente. Esto no ocurre en bacterias debido a que son organismos haploides.
En levaduras esto se soluciona haciéndolas esporular de manera de obtener organismos haploides.

La recombinación homóloga con construcciones interruptoras transfectadas puede inactivar genes diana específicos en la levadu
ra.
• Se puede preparar una construcción adecuada para interrumpir un gen diana mediante PCR.
Los dos cebadores diseñados para este propósito contienen cada uno una secuencia de alrededor de 20 nucleótidos (nt) que es ho
móloga a un extremo del gen diana de levadura al igual que las secuencias necesarias para amplificar un segmento de DNA que l
leva un gen marcador de selección como kanMX. el cual confiere resistencia al G-418.
• Cuando las células diploides receptoras de Saccharomyces son transformadas con la construcción interruptora de genes.
La recombinación homóloga entre los extremos de la construcción y las secuencias cromosómicas correspondientes integrarán el
gen kanMX al cromosoma, reemplazando la secuencia del gen diana. Las células diploides recombinantes crecerán en un medio
que contenga G-418. mientras que las células no transformadas no lo harán. Si el gen diana es esencial para la viabilidad. la mit
ad de las esporas haploides que se formen luego de la esporulación de células diploides recombinantes serán no viables.

• KNOCK OUT EN EUCARIOTAS SUPERIORES (RATONES)


En estos procedimientos, se agrega un segundo marcador de selección, de manera de determinar a aquellas células que incorporaro
n el inserto en el gen target, de las que la incorporaron en otro lugar. Es por ello, que además de realizar la doble recombinación h
omologa, se agrega una presión de selección mas.
• La presión de selección positiva (PS+) se incorpora tanto por recombinación homologa como no homologa.
• La presión de selección negativa (PS-) se integra solamente (o con mayor probabilidad) en sitios en donde hubo recombinacione
s no homologa. La PS- es la timidina quinasa (tk) (mas específicamente una nucleósido quinasa), la cual convierte la timidina en ti
midina monofosfato. Finalmente, otra quinasas convierten al nucleósido monofosfato en difosfato y en trifosfato.
La timidina quinasa (tk) fosforila didesoxinucleósidos y análogos de nucleósidos, de manera que las células que están expresando
timidina quinasa, se convierten en análogos eficientes de nucleósidos trifosfato, de manera que se inhibe la síntesis de DNA.
La tk se puede utilizar como presión de selección, muriéndose las células que tengan la tk.
El ganciclovir (una prodroga) es un análogo de nucleósidos no toxico que se vuelve toxico cuando es fosforilado.
El gen de interés es alterado (anulado) en las células madres embrionarias (ES) mediante la recombinación homologa con un alelo
no funcional producido artificialmente. El aislamiento de células ES con el gen anulado requiere de selección positiva y negativa.
Se introduce un gen que confiere resistencia a G418 dentro del DNA del alelo artificial. Además se agrega DNA con el gen viral d
e la timidina quinasa (tk), por fuera de la region de homología. El medio de selección contiene a los marcadores de selección posit
ivo y negativo, el G418 y el ganciclovir. Las células no recombinantes y las que sufrieron recombinación no homologa en sitios al
eatorios no pueden crecer en ese medio. Las células no recombinantes permanecen sensibles a la neomicina, mientras que los reco
mbinantes son resistentes (selección positiva). El gen de la timidina quinasa confiere sensibilidad al ganciclovir, un análogo de un
nucleótido. A diferencia de la timidina quinasa de mamíferos, la enzima derivada del virus herpes simple es capaz de convertir al
ganciclovir en una forma de monofosfato. Esta se convierte luego en una forma trifosfatada, la cual inhibe la replicación del DNA
celular. Como las células ES con recombinación no homologa contienen el gen de tk en sitios aleatorios, son sensibles al ganciclo
vir y no pueden crecer en su presencia (selección negativa). Solo las células que sufrieron, ya que contienen al gen de resistencia p
ara la G418 y no contienen al de la tk.

 Células ES heterocigóticas para un gen interrumpido son usadas para producir ratones knockout con respecto a un gen.
Paso I: Las células madre embrionarias (ES) heterocigóticas para una mutación knockout en un gen de interés (X) y homocigótica
para un alelo dominante de un gen marcador (aquí, pelaje de color pardo. A) se trasplantan a la cavidad del blastocele de embrione
s de 4-5 días que son homocigóticos para un alelo recesivo del marcador (aquí pelaje de color negro.
Paso II: Los embriones tempranos se implantan luego en una hembra pseudopreñada. La progenie que contiene células derivadas
de las ES son quimeras, lo que se evidencia por su pelaje mezclado negro y pardo.
Paso III: Luego se hacen cruzamientos retrógrados de los ratones quiméricos con ratones negros; la progenie parda de esta cruza ti
ene células derivadas de ES en su línea germinal.
Pasos 4 - 6: Los análisis de DNA aislado de una pequeña cantidad de tejido de la cola pueden identificar a los ratones pardos heter
ocigóticos para el alelo knockout.
El entrecruzamiento de estos ratones produce algunos individuos homocigóticos para el alelo alterado es decir, ratones knockout.
 El aislamiento de células ES murinas con una interrupción dirigida a un gen es el primer paso en la producción de ratones
knockout.
• Cuando se introduce el DNA exógeno en células madre embrionarias (ES), la inserción aleatoria a través de la recombinació
n no homóloga sucede mucho más frecuentemente que la inserción dirigida a genes a través de una recombinación homóloga.
Las células recombinantes en las cuales un alelo del gen X (naranja y blanco) está interrumpido pueden obtenerse mediante el us
o de un vector recombinante que lleva el gen X interrumpido con neo (verde), el cual confiere resistencia al G-418, y, fuera de la
región de homología, el t05v (amarillo). el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple. La timidina quinasa viral. a dif
erencia de la enzima endógena del ratón, puede convertir el análogo de nucleótido ganciclovir a la forma monofosfato; ésta es lu
ego modificada a la forma trifosfato, la cual inhibe la replicación del DNA celular en las células ES. De este modo. el ganciclovir
es citotóxico para las células recombinantes ES que llevan el gen t05v. La inserción no homóloga incluye el gen t0sv. mientras q
ue la inserción homóloga no lo incluye; por ende. sólo las células con inserción no homóloga son sensibles al ganciclovir.
• Las células recombinantes son seleccionadas por tratamiento con G-418, puesto que las células que fallan en tomar el DNA o
integrarlo en su genoma son sensibles a este compuesto citotóxico.
Las células recombinantes sobrevivientes se tratan con ganciclovir. Sólo las células con una interrupción dirigida en el gen X. y q
ue por lo tanto carecen del gen t05v, sobrevivirán.

• KNOCK OUT TEJIDOS ESPECIFICOS (EUCARIOTAS SUPERIORES)


Para examinar los efectos de las mutaciones knockout en un tejido en particular (por ejemplo, de ratón), en un estadio específico d
el desarrollo se diseño una técnica para inactivar genes diana en tipos específicos de células somáticas o en momentos particulares
del desarrollo. Esta técnica emplea sitios específicos de recombinación del DNA (llamados sitios loxP) y la enzima Cre que catali
za la recombinación entre ellos. El sistema de recombinación loxP-Cre deriva del bacteriófago P1, pero este sistema de recombina
ción de sitios específicos también funciona cuando se lo ubica en células murinas. Una característica esencial de esta técnica es qu
e la expresión de Cre está controlada por un promotor específico del tipo de célula (cada tejido presenta un promotor en particular)
. En los ratones loxPCre, la inactivación del gen de interés (X) tiene lugar sólo en las células en las cuales el promotor que control
a el gen cre está activo.

El sistema de recombinación LoxP-Cre puede inactivar genes en tipos celulares específicos.


Se insertan dos sitios loxP a cada lado de un exón esencial (2) del gen de interés X (azul) mediante recombinación homóloga, prod
uciendo un ratón loxP. Puesto que los sitios loxP se encuentran en los intrones, no alteran la función de X. El ratón Cre transporta
un alelo knockout del gen X y un gen cre (naranja) introducido del bacteriófago P1 unido a un promotor específico del tipo celular
(amarillo) El gen cre es incorporado al genoma del ratón por recombinación no homóloga y no afecta la función de otros genes. E
n los ratones loxP-Cre que resultan del cruzamiento, la proteína Cre sólo es producida en aquellas células en las cuales el promoto
r está activo. Así, éstas son las únicas células en las cuales tiene lugar la recombinación entre los sitios loxP catalizados por el Cre,
conduciendo a la deleción del exón 2. Puesto que el otro alelo es un gen X constitutivo knockout, la deleción entre los sitios loxP
da como resultado una pérdida completa de la función del gen X en todas las células que expresan Cre. Al utilizar diferentes prom
otores, los investigadores pueden estudiar los efectos de la inactivación del gen X en diversos tipos de células.
GEN KNOCK OUT DE LA TELOMERASA
Aunque es un hecho comprobado que la actividad telomerasa es la que confiere ampliación a la expectativa de vida, deben existir
otros mecanismos que, sustituyendo a la telomerasa, permiten a las células seguir vivas en su ausencia.
Por Ejemplo =
- En levaduras se ha evidenciado una vía denominada ALT (alargamiento alternativo de los telómeros). Las células se dividen nor
malmente hasta que los telómeros se acortan y ello afecta la proliferación. En ese estado la mayor parte de las células mueren, per
o algunas sobreviven y continúan proliferando mediante un mecanismo de recombinación que mantiene la longitud telomerasa. E
stos mecanismos alternativos de alargamiento de los telómeros también existen en humanos. Los cromosoma que no poseen repeti
ciones teloméricas TTAGGG pueden adquirirlas mediante un mecanismo de recombinación. En levadura, los cromosomas que no
poseen telómeros los logran por recombinación homologa, reciproca o no reciproca.
- De la misma manera se da también en células de mamíferos. Los telómeros del ratón pueden favorecer el uso de tal recombinaci
ón no reciproca, ya que un telómero críticamente corto de un murino quizás puede recombinarse fácilmente con los largos telómer
os de otros cromosomas. Como la longitud del telómero decrece en sucesivas generación de animales KO del gen telomerasa, la ef
iciencia de estas vías de recombinación podría decrecer, posiblemente con frecuencias incrementadas de anormalidades cromosóm
icas observables en generaciones posteriores.
Al experimentar con ratones KO de la telomerasa y ver que ocurría se observa que:
-> Lo que se esperaba:
• No poder detectar la telomerasas en células derivadas de ratones KO homocigotos, apoyando la noción de un solo gen RNA de l
a telomerasa en el genoma murino.
-> Lo que no se esperaba:
• Los ratones KO nacieran vivos, ya que indicaba que la telomerasa no es esencial para el mantenimiento de lo telómeros.
• Los ratones sin telomerasa sean fértiles (dando lugar a múltiples generaciones posteriores de los animales KO), ya que indicaba
que la telomerasa no era necesaria para mantener los telómeros en la línea germinal.
Estos dos últimos aspectos se podrían explicar suponiendo que el acortamiento de los telómeros fue quizás ocurriendo a un ritmo
muy lento en las células, además de que podrían tener telómeros muy largos, o que haya otros mecanismos alternativos en las célu
las.
• Los ratones KO, si se continua con la endogamia, pueden sobrevivir hasta una F6, esto indica a que hay una disminución progres
iva de la fertilidad en machos y hembras y a una elevación en la letalidad embrionaria.
Se podría realizar una serie de experimento para poder demostrar que efectivamente los ratones no presentan el gen de la telo
merasa:
- No poder detectar la telomerasas en células derivadas de ratones KO homocigotos:
De tener la secuencia del ratón, se puede hacer una PCR, o en su defecto un Southern Blot que confirme la ausencia del gen de la t
elomerasa.
En ambos casos, la confirmación es por negativo, es decir, en la PCR no debe haber ampliación de un fragmento, y en el Southern
Blot, no tiene que haber marca radiactiva al revelar.
- Poder detectar un acortamiento de los telómeros:
Se podría reproducir segmentos de los telómeros, empleando siempre las misma condiciones en generaciones distintas. Luego a lo
s amplificados hacerlos correr en una electroforesis, y se tendría que ver que el amplificado es cada vez mas pequeño (menor num
ero de pb), lo cual indica que se están acortando.

ALGUNOS PRODUCTOS DE RECOMBINACIÓN


----------------------------------Elementos Transponibles---------------------------------
ELEMENTOS TRANSPONIBLES
Los elementos transponibles son secuencias de DNA móviles que aparecen en los genomas de todos los organismos. En muchos g
enomas son bastante abundantes: por ejemplo representan por lo menos el 50% del DNA humano. La mayoría de los elementos tr
ansponibles pueden insertarse en muchos sitios diferentes y esto depende de mecanismos distintos de los asociados con la recombi
nación homóloga. Con frecuencia estos elementos producen mutaciones, sea por medio de la inserción en otro gen o de su ruptura
o de la inducción de reordenamientos en la secuencia de DNA, como por ejemplo deleciones, duplicaciones e inversiones.

Características generales de los elementos transponibles


Hay muchos tipos diferentes de elementos transponibles: algunos tienen estructuras simples y solo cuentan con las secuencias nec
esarias para su propia transposición (movimiento), mientras que otros poseen estructuras complejas y codifican varias funciones q
ue no se relacionan con la transposición de manera directa. A pesar de estas variaciones muchos elementos transponibles tienen ci
ertas características en común: las repeticiones directas flanqueantes cortas, que miden entre 3 y 12 pares de bases de longitud, pu
eden hallarse a ambos lados de la mayoría de los elementos transponibles. Estas secuencias no forman parte del elemento transpon
ible y no se mueven con él. En cambio, se producen durante el proceso de transposición en el sitio en el que se inserta el elemento.
Las secuencias de estas repeticiones son variables pero su longitud es constante para cada tipo de elemento transponible. La prese
ncia de repeticiones directas flanqueantes indica que cuando el elemento transponible se inserta a sí mismo produce cortes escalon
ados en el DNA en el que se inserta.
Los cortes escalonados dejan fragmentos cortos de DNA de hebra simple a cada lado del elemento transponible. Luego la replicaci
ón del DNA de hebra simple produce las repeticiones directas flanqueantes. En los extremos de muchos elementos transponibles (
aunque no de todos) hay repeticiones terminales invertidas, que son secuencias que miden entre 9 y 40 pb de longitud y se comple
mentan entre sí en forma invertida. Por ejemplo, las siguientes secuencias son repeticiones invertidas:
5’ -ACAGT TCAG...CTGAACT GT -3’
3’ -TGT CAAGTC...GACT TGACA -5’
En la misma hebra las dos secuencias no son inversiones simples (como podría pensarse a partir de su nombre) sino secuencias tan
to invertidas como complementarias. (Obsérvese que la secuencia de izquierda a derecha en la hebra superior es la misma que la s
ecuencia de derecha a izquierda en la hebra inferior.) Las enzimas que catalizan la transposición reconocen las repeticiones termin
ales invertidas y estas secuencias son necesarias para que se produzca la transposición.

TIPOS DE TRANSPOSONES
Existen dos clases principales de elementos móviles autónomos:
• Aquellos que codifican proteínas que mueven al DNA directamente a una nueva posición o duplican el DNA para producir un el
emento nuevo que se integra en otro lugar. Estos se encuentran tanto en procariotas como en eucariotas (transposones clase II).
• Los que codifican una transcriptasa reversa con la que sintetizan DNA a partir de un RNA molde. Dicho DNA se integra luego e
n nuevos sitios del genoma (transposones clase I, retrotransposones, retroposones, etc.).

Transposición
La transposición es el movimiento de un elemento transponible de un sitio a otro. Este proceso es mediado por varios mecanismos
diferentes que funcionan tanto en las células procariotas como en las eucariotas. Sin embargo, todos los tipos de transposición tie
nen algunas características comunes:
1) en el DNA en el que se produce la inserción se generan cortes escalonados.
2) el elemento transponible se une a los extremos de hebra simple del DNA elegido.
3) el DNA presente en las brechas de hebra simple se replica.

Mecanismos de transposición
Algunos elementos transponibles se movilizan en forma de DNA (en lugar de transcribirse primero a RNA como transposones) y
se denominan transposones de DNA (conocidos también como elementos transponibles de clase I). Otros elementos transponibles
se movilizan en forma de un RNA intermediario. En este caso el elemento transponible (DNA) se transcribe a RNA y luego se vue
lve a copiar a DNA usando una enzima especial denominada transcriptasa inversa. Los elementos que se transponen a través de un
RNA intermediario se denominan retrotransposones (o transposones de clase II). La mayoría de los elementos transponibles halla
dos en las bacterias son transposones de DNA.
En los eucariotas se detectan tanto transposones de DNA como retrotransposones, aunque estos últimos son más frecuentes.
Los transposones de DNA pueden sufrir una transposición replicativa o no replicativa.
• La transposición replicativa consiste en la introducción de una copia nueva del elemento transponible en un sitio nuevo mientras
que la copia vieja permanece en el sitio original, lo que determina el aumento del número de copias del elemento transponible com
o consecuencia de la transposición.
• La transposición no replicativa consiste en la escisión del elemento transponible del sitio donde se hallaba y su inserción en un si
tio nuevo sin aumentar la cantidad de copias. La transposición no replicativa requiere la replicación de los pocos nucleótidos que c
onstituyen las repeticiones directas.
Los retrotransposones emplean solo la transposición replicativa.

Transposición replicativa
La transposición replicativa, a menudo denominada transposición de copia y pegado, puede involucrar dos moléculas de DNA dif
erentes o dos partes de la misma molécula de DNA.

En la figura se resumen los pasos de la transposición entre dos moléculas de DNA circular. Antes de la transposición hay una sola
copia del elemento transponible sobre una molécula.
• En el primer paso se unen las dos moléculas de DNA y se replica el elemento transponible para producir la estructura de cointegr
ación compuesta por las moléculas A y B fusionadas con dos copias del elemento transponible.
• A continuación veremos cómo se produce la copia, pero primero analizaremos el segundo paso del proceso de transposición repl
icativa. Después de la formación de la estructura de cointegración el entrecruzamiento de regiones dentro de las copias del elemen
to transponible produce dos moléculas, cada una con una sola copia del elemento transponible. Este segundo paso se denomina res
olución de la cointegración.
¿Cómo se desarrollan los pasos de la transposición replicativa (formación y resolución de la cointegración?
La formación requiere que se produzcan cuatro fenómenos. En primer lugar una enzima transposasa (con frecuencia codificada po
r el elemento transponible) produce rupturas de una sola hebra en cada extremo del elemento transponible y a cada lado de la secu
encia donde se desea insertar este elemento. En segundo lugar los extremos libres del elemento transponible se unen a los extremo
s libres de la secuencia en cuestión.
• En tercer lugar se produce la replicación sobre los moldes de hebra simple a partir de los extremos 3’ de las hebras simples y a tr
avés de los elementos transponibles. Esta replicación genera la estructura de cointegración, con sus dos copias del elemento transp
onible y de la secuencia donde se va a realizar la inserción, que en este momento se ubican al lado de cada copia. Las enzimas que
desempeñan las funciones de replicación y de ligadura son enzimas celulares que actúan en la replicación y la reparación del DN
A.
• En cuarto lugar, después de la formación de la estructura de cointegración ésta es sometida al proceso de resolución, que requier
e el entrecruzamiento de sitios localizados dentro del transposón. La resolución origina las dos copias del elemento transponible. E
l paso de resolución depende de las enzimas resolvasas (en algunos casos codificadas por el elemento transponible y en otros por u
n gen celular) que actúan en la recombinación homologa.

Transposición no replicativa
En la transposición no replicativa el elemento transponible se mueve de un sitio a otro sin replicarse en su totalidad, aunque sí se r
eplican secuencias cortas en el DNA en el que se produce la inserción que determinan la producción de repeticiones directas flanq
ueantes. A menudo denominada transposición de corte y pegado, la transposición no replicativa solo requiere el corte y la readhesi
ón del elemento transponible en el DNA en el que se producirá la inserción. La escisión requiere una enzima transposasa producid
a por el elemento transponible. Es probable que las enzimas que en condiciones normales intervienen en la replicación y la reparac
ión desarrollen la unión del elemento transponible y el DNA específico.
Si un elemento transponible se mueve a través de un mecanismo de transposición no replicativa,
¿Cómo aumenta la cantidad de copias de ese elemento en el genoma?
La respuesta proviene de la investigación del destino de la localización original del elemento. Después de la escisión queda un cor
te en el sitio de inserción original. Estos cortes son nocivos para la célula por lo que se reparan de manera eficiente. Un método ha
bitual para reparar estas rupturas es eliminar y luego replicar el segmento de DNA roto a partir del empleo del molde homólogo pr
esente en la cromátida hermana. Antes de la transposición ambas cromátidas tenían una copia del elemento transponible. Después
de la transposición (en la que el elemento transponible se trasladó a otro sitio) y de la reparación de la ruptura (que restablece la co
pia original) la cantidad de copias del elemento transponible habrá aumentado en una unidad. Por ende, el número de copias de los
elementos transponibles no aumenta durante la transposición pero tiende a incrementarse dentro del genoma debido al mecanismo
de reparación.

Transposición a través de un RNA intermediario


Los retrotransposones se movilizan a través de RNA intermediarios. El retrotransposón es una molécula de DNA que primero se tr
anscribe a una secuencia de RNA, que puede sufrir algún tipo de procesamiento. El RNA procesado es sometido a transcripción in
versa mediante la acción de una enzima transcriptasa inversa para producir una copia del RNA en forma de DNA de doble hebra.
El DNA en el que se va a producir la inserción se corta con extremos escalonados y la copia del retrotransposón en forma de DN
A se inserta en el genoma. La replicación llena los espacios cortos producidos por los cortes escalonados y genera repeticiones dir
ectas flanqueantes a ambos lados del retrotransposón.
Efectos mutagénicos de la transposición
Como los elementos transponibles pueden insertarse en otros genes y alterar su función la transposición en general es mutagénica.
Más de la mitad de todas las mutaciones espontáneas que se producen en Drosophila se deben a la inserción de un elemento transp
onible en un gen funcional o cerca de él. Aunque la mayor parte de estas mutaciones son nocivas, en ocasiones la transposición pu
ede activar un gen o cambiar el fenotipo de la célula de una manera beneficiosa.
EJEMPLOS:
• un elemento bacteriano transponible puede ser portador de genes que codifican resistencia a los antibióticos.
• casos de neurofibromatosis. Es una enfermedad que produce numerosos tumores en la piel y los nervios, es consecuencia de mut
aciones en un gen denominado NFl. Esto se debe a la presencia de una copia de Alu en uno de los intrones del gen NF1. La secuen
cia Alu produjo un error de empalme en el RNA que determinó que uno de los exones quedara fuera del mRNA de la proteina NFl
. La ausencia del exón desencadenó un desvío en el marco de lectura y produjo una proteína anormal, que en definitiva causó la ne
urofibromatosis. El examen del DNA de la madre y del padre del paciente reveló que la secuencia Alu no estaba presente en sus g
enes NFl, lo que implica que la inserción era nueva.
Como la transposición implica el intercambio de secuencias de DNA y su recombinación, con frecuencia produce reordenamiento
s del DNA. La recombinación homóloga entre muchas copias de transposones también determina el desarrollo de duplicaciones, d
eleciones e inversiones. Los reordenamientos del DNA también pueden ser resultado de la escisión de elementos transponibles en
una transposición de corte y pegado. Si el DNA roto no se repara de manera apropiada se puede desencadenar un reordenamiento
cromosómico.
Regulación de la transposición
Muchos elementos transponibles se mueven por transposición replicativa y aumentan en cantidad con cada ciclo de transposición.
A medida que el número de copias del transposón aumenta la velocidad de la transposición también aumenta porque la concentrac
ión de transposones en la célula es mayor (se debe recordar que el transposón produce la transposasa). Si ningún mecanismo limit
ara la transposición el número de copias de los elementos transponibles aumentaría de manera continua y el DNA huésped se lesio
naría debido a la alta tasa de mutaciones resultante (producida por la inserción frecuente de elementos transponibles). Además, se
necesitarían grandes cantidades de energía y de recursos para replicar el DNA “adicional” en los elementos transponibles prolifera
ntes. Estas son las razones por las cuales no sorprende que las células hayan desarrollado mecanismos para regular la transposició
n, de la misma manera que crearon mecanismos para regular la expresión de los genes.
Cuando un elemento transponible ingresa por primera vez en una célula que no posee otras copias de ese elemento la transposició
n se desarrolla en forma frecuente. A medida que aumenta la cantidad de copias del elemento transponible la frecuencia de transpo
sición disminuye hasta alcanzar un estado estable. Esta regulación de la transposición implica que la mayoría de las células tengan
una cantidad característica de copias de un elemento transponible en particular. Muchos elementos transponibles regulan la transp
osición a través de la limitación de la producción de la enzima transposasa necesaria para el movimiento. En ciertos casos se regul
a la transcripción del gen de la transposasa pero con mayor frecuencia se controla la traducción del mRNA de esa enzima. Hay otr
os mecanismos reguladores que no interfieren sobre la transposasa; en cambio, estos mecanismos inhiben la transposición en form
a directa.

Estructura de los elementos transponibles


Las bacterias y los organismos eucariotas poseen varios tipos diferentes de elementos transponibles y sus estructuras varían en for
ma considerable. En esta sección consideraremos las estructuras de los tipos principales de elementos transponibles.
Elementos transponibles en las bacterias
Los transposones de DNA hallados en las bacterias (en las cuales no hay retrotransposones) constituyen dos grupos principales;
1) elementos transponibles simples que solo son portadores de la información necesaria para su movimiento y
2) elementos transponibles más complejos que contienen secuencias de DNA no relacionadas con la transposición en forma direct
a.
Secuencias de inserción
El tipo de elemento transponible más simple presente en los cromosomas bacterianos y en los plásmidos es la secuencia de inserci
ón (IS). Este tipo de elemento solo posee la información genética necesaria para su movimiento. Las IS son componentes comunes
de las bacterias; también pueden infectar plásmidos y virus y, de esta manera, pasar de una célula a otra. Cada tipo de IS recibe un
número de identificación.
EJEMPLO
ISl es una secuencia de inserción común en E. coli. Se han descrito más de 20 tipos diferentes de IS en las bacterias. Las formas tí
picas tienen entre 800 y 2 000 pb de longitud y poseen las dos características distintivas de los elementos transponibles: repeticion
es terminales invertidas y producción de repeticiones directas flanqueantes en el sitio en el que se insertan. La mayoría de las IS c
ontienen uno o dos genes que codifican transposasas. La ISl es una IS típica que posee 768 pb y repeticiones terminales invertidas
de 23 pb en cada extremo.
Cada una de las repeticiones directas flanqueantes producidas por ISl tiene 9 pb, que es la longitud más frecuente en estas estructu
ras.

Transposones compuestos
Cualquier segmento de DNA que posea dos copias de una IS (una a cada lado) puede trasladarse y pasar a denominarse transposó
n compuesto. Cada tipo de transposón compuesto recibe un nombre formado por la abreviatura Tn seguida por un número. Tn10 e
s un transposón compuesto que tiene alrededor de 9 300 pb y porta un gen (de alrededor de 6 500 pb) que codifica la resistencia a l
a tetraciclina entre dos IS IS10.

Las IS tienen repeticiones terminales invertidas; esto significa que el transposón compuesto también finaliza con repeticiones inve
rtidas. Los transposones compuestos también producen repeticiones directas flanqueantes en los sitios en los que se insertan. Las I
S presentes en los extremos de un transposón compuesto pueden tener la misma orientación o estar invertidas una con respecto a l
a otra (como en Tn10). Las IS halladas en los extremos de un transposón compuesto son responsables de la transposición. El DNA
entre las IS no es necesario para el movimiento y puede ser portador de información adicional (como por ejemplo relacionada con
la resistencia a los antibióticos). Es probable que los transposones compuestos se formen cuando una IS se traslada a una localiza
ción cercana a la de otro transposón del mismo tipo. La transposasa producida por una de las IS cataliza la transposición de ambas
IS, lo que permite que ambas se muevan en forma conjunta y transporten el DNA ubicado entre ellas. En algunos transposones co
mpuestos (como por ejemplo en Tn10) una de las IS puede ser defectuosa; esto implica que su movimiento dependerá de la transp
osasa producida por la otra secuencia.

Transposones no compuestos
Las IS solo poseen información para su propio movimiento, mientras que los transposones bacterianos son más complejos. Algun
os elementos transponibles presentes en las bacterias carecen de IS y se denominan transposones no compuestos. Por ejemplo, Tn
3 es un transposón no compuesto que mide alrededor de 5 000 pb, posee repeticiones invertidas terminales de 38 pb y produce rep
eticiones directas flanqueantes que miden 5 pb. Tn3 está compuesto por genes para la transposasa y la resolvasa, junto con un gen
que codifica la enzima P-lactamasa que le aporta resistencia a la ampicilina. Algunos genomas de bacteriófagos se reproducen por
transposición y usan este proceso para insertarse en un cromosoma bacteriano durante su ciclo lisogénico; el bacteriófago mejor es
tudiado entre los que emplean la transposición es Mu.

Aunque Mu no posee repeticiones invertidas terminales, produce repeticiones directas flanqueantes cortas (5 pb) cuando se inserta
en el DNA al azar. Mu se replica por transposición y determina el desarrollo de mutaciones en el sitio de inserción, propiedades q
ue son características de los elementos transponibles.

Elementos transponibles en los eucariotas


Los elementos transponibles presentes en los eucariotas pueden dividirse en dos grupos. Un grupo tiene una estructura similar a la
de los elementos transponibles hallados en las bacterias, que por lo general finalizan con repeticiones invertidas cortas se trasladan
en forma de DNA. El otro grupo está formado por los retrotransposones, que usan RNA intermediario y en muchos casos tienen e
structuras y movimientos similares a los de los retrovirus. Al considerar su estructura, su función y sus secuencias genómicas se p
uede determinar que algunos retrotransposones están relacionados con retrovirus desde el punto de vista evolutivo. Aunque su me
canismo para trasladarse es diferente del de otros elementos transponibles, los retrotransposones también producen repeticiones di
rectas en el sitio en el que se insertan. Los retrotransposones incluyen los elementos Ty en las levaduras y las secuencias Alu en lo
s seres humanos.

Elementos Ty en las levaduras


Los elementos Ty constituyen una familia de elementos transponibles comunes en las levaduras; muchas células de levadura tiene
n 30 copias de los elementos Ty. Estos elementos son retrotransposones que poseen alrededor de 6 300 pb de longitud y producen
repeticiones directas flanqueantes de 5 pb cuando se insertan en el DNA.

En cada extremo de un elemento Ty hay repeticiones directas denominadas secuencias delta que miden 334 pb de longitud. Las se
cuencias delta son análogas a las repeticiones terminales largas halladas en los retrovirus. Estas secuencias delta contienen promot
ores necesarios para la transcripción de los genes Ty y los promotores también pueden estimular la transcripción de genes localiza
dos en dirección 3’ con respecto al elemento Ty. Entre las secuencias delta presentes en cada extremo de un elemento Ty hay dos
genes {TyA y TyB, que codifican varias enzimas) relacionados con los genes gag y pol hallados en los retrovirus. Muchos elemen
tos Ty son defectuosos y esta alteración anula su capacidad de transposición.

Elementos transponibles en los seres humanos


Casi el 50% del genoma humano está compuesto por secuencias derivadas de elementos transponibles, aunque hoy la mayor parte
de estos elementos son inactivos y ya no pueden transponerse. Uno de los elementos transponibles más comunes en el genoma hu
mano es Alu, que recibe ese nombre por una enzima de restricción {AluY} encargada de dividir el elemento en dos partes. Todas l
as células humanas contienen más de 1 millón de copias de Alu relacionadas pero no idénticas en sus cromosomas. A diferencia d
e los retrotransposones descritos con anterioridad (elementos Ty en la levadura), las secuencias Alu no son similares a los retrovir
us; no tienen genes semejantes a gag y pol y en consecuencia, no son autónomas. En cambio, las secuencias Alu son similares al g
en que codifica la molécula de RNA 7S que transporta las proteínas recién sintetizadas a través del retículo endoplasmático. Las s
ecuencias Alu producen repeticiones directas flanqueantes cortas cuando se insertan en el DNA y tienen características que sugier
en que se habrían transpuesto a través de un RNA intermediario. La secuencia Alu pertenece a una clase de secuencias repetitivas
halladas con frecuencia en genomas de mamíferos y en algunos otros genomas. Estas secuencias se denominan en forma colectiva
SINE, por lo general tienen entre 200 y 400 pb de longitud y representan en total alrededor del 11 % del genoma humano. La may
or parte de las SINE están acortadas en el extremo 5’, lo que probablemente se deba a que el proceso de transcripción inversa utili
zado durante la transposición terminó antes de que se copiara la secuencia completa. Se ha determinado que las SINE producen la
s mutaciones observadas en más de 20 casos de enfermedades genéticas humanas. El genoma humano también tiene muchas LIN
E, que en cierta medida poseen una estructura similar a la de los retrovirus, pero no tan similar como la de los elementos Ty. Al ig
ual que las SINE, la mayor parte de las LINE presentes en el genoma humano están truncadas en el extremo 5’. Las LINE complet
as suelen tener alrededor de 6 000 pb pero como la mayoría de las copias están acortadas la LINE promedio tiene solo alrededor d
e 900 pb. El DNA humano contiene tres familias de LINE principales con secuencias diferentes. Hay aproximadamente 900 000 c
opias de LINE en el genoma humano, que en conjunto representan el 21% del DNA humano total. Una de cada 600 mutaciones qu
e producen enfermedades significativas en los seres humanos se producen debido a la transposición de una LINE o una SINE.
-----------------------------------------Transcripción----------------------------------------
INTRODUCCIÓN
La transcripción comprende la síntesis de una hebra de RNA que representa a una hebra del dsADN. Esto implica que el RNA tien
e una secuencia idéntica a una de las hebras del DNA, la cual se denomina hebra codificadora. Es complementaria a la otra, la cual
es la hebra molde para su síntesis.
La síntesis de RNA es catalizada por la RNApol. La transcripción comienza cuando la RNApol se une a una región especial, el pr
omotor, que se encuentra en el inicio del gen. El promotor rodea al primer par de bases (pb) que se transcribe en RNA, el punto de
inicio. A partir de este punto, la RNApol se desplaza a lo largo del molde, sintetizando RNA, hasta que alcanza a una secuencia te
rminadora (ter).
Las secuencias que se encuentran antes del punto de inicio se describen en flujo ascendente a él (upstream 3’- 5’); aquellas que se
encuentran despues del punto de inicio (dentro de la secuencia transcripta) se encuentran en flujo descendente a él (downstream 5’
- 3’).
Convencionalmente, las secuencias se escriben de tal manera que la transcripción proceda de izquierda a derecha (en flujo descen
dente). Esto corresponde a la escritura del mRNA en la dirección habitual 5’ – 3’.
La secuencia de DNA a menudo se escribe para mostrar solo a la hebra codificadora, la cual tiene la misma secuencia que el RNA
. Las posiciones de las bases se numeran en ambas direcciones lejos del punto de inicio, al cual se le asigna el valor +1:
• los números se incrementan (mas positivos) a medida que avanzan en flujo descendente.
• los números se disminuyen (mas negativos) si se avanza en flujo ascendente.
No hay ninguna base a la que se le asigne el numero 0.
Al producto inmediato de la transcripción se le denomina transcrito primario. Consiste en RNA que se extiende desde el promotor
hasta el terminador y posee los extremos originales 5’ y 3’. Sin embargo, el transcrito primario casi siempre es inestable.
• En las procariotas, se degrada con rapidez (a mRNA) o se divide para formar productos maduros (rRNA y tRNA).
• En las eucariotas, es modificado en los extremos (mRNA) o dividido para formar productos maduros (todos los RNA).
La transcripción es la primera etapa de expresión génica y el paso principal en el cual es controlada. Las proteinas reguladoras det
erminan si un gen particular esta disponible para ser transcrito por la RNApol. El paso inicial (y con frecuencia el único) en la reg
ulación es la decisión de transcribir o no un gen. La mayoría de los episodios reguladores ocurren en la iniciación de la transcripci
ón, aunque en ocasiones son reguladas etapas subsiguientes de la transcripción (u otras etapas de la expresión génica).

UNIDADES TRANSCRIPCIONALES
Una unidad de transcripción se extiende desde el promotor hasta el terminador. La característica determinante de la unidad de tran
scripción, es que constituye un fragmento de DNA expresado por medio de la producción de una sola molécula de RNA. Una unid
ad de transcripción puede incluir a mas de un cistrón.
Básicamente, un cistrón implica a los ORF. De esta manera se pueden distinguir dos tipos de unidades transcripcionales:
Los policistrónicos los cuales presentan mas de un ORF, y los monocistrónicos los cuales presentan un único ORF.
• Procariotas:
Los genes que están involucrados en una misma ruta sintética están agrupados, es decir, se transcriben todos juntos. De esta maner
a, las unidades transcripcionales contienen varios ORF, es decir, son unidades policistrónicas.
• Eucariotas:
Los genes que están involucrados en un misma ruta generalmente se encuentran dispersos en distintos cromosomas ubicándose en
distintas unidades transcripcionales, por lo que son generalmente monocistrónicos.
MODELO DEL OPERÓN

Cada uno de los cuadros celestes son ORFs. Los cuatros ORFs se transcriben de una única vez. Sin embargo, al tener sitios de uni
ón a ribosomas y secuencias terminadoras de traducción independientes entre si, de la misma unidad transcripcional se generaran
en este caso cuatro proteinas distintas.

UNIDADES TRANSCRPCIONALES: ELONGACIÓN

TRANSCRIPCION DEL DNA EN PROCARIOTAS


• RNA POLIMERASA
La RNApol es la enzima responsable de la síntesis de RNA dirigida por DNA. La enzima une entre sí los ribonucleósidos trifosfat
o ATP, CTP, GTP y UTP, utilizando moldes de DNA, en una reacción que es posible gracias a la liberación e hidrólisis posterior
de PPi.
La RNApol es una holoenzima. Una vez que ha comenzado la síntesis de RNA, la subunidad o factor sigma se separa de la holoen
zima quedando el núcleo (Core) de la enzima, que es la estructura que realmente lleva a cabo el proceso de polimerización.
Todas las células contienen RNApol. En las bacterias, una variedad de esta enzima sintetiza todos los RNA celulares exceptuando
los cortos cebadores utilizados en la replicación del DNA.
Varios bacteriófagos sintetizan también RNApol que sólo producen ARNs específicos de fago. Las células eucarióticas contienen
cuatro o cinco RNApol, cada una de las cuales sintetiza una clase diferente de RNA.
La RNApol no requiere primers. Al igual que la DNApol, la dirección de síntesis es de 5’ – 3’ pero no requiere un extremo 3’-OH
libre.

• UNIÓN A MOLDE
La síntesis de RNA se inicia, por lo general, únicamente en sitios específicos del molde de DNA. La RNApol se une a sus sitios d
e iniciación a través de secuencias de bases conocidas como promotores, que son reconocidas por el correspondiente factor sigma.
El promotor esta formado por una secuencia de aprox 40 pb que esta situada en el lado 5’ del sitio de inicio de la transcripción. Po
r convención se representa la secuencia de la hebra antisentido (codificante o no molde) del DNA molde, de forma que tenga la mi
sma dirección que el RNA que se transcribe. Un par de bases de una región promotora recibe una numeración que puede ser positi
va o negativa, según se encuentre respectivamente hacia 3’ o hacia 5’ del sitio de inicio de transcripción. Este sitio de inicio de la t
ranscripción recibe el número +1, y no existe ningún par de bases “0”. El RNA se sintetiza en la dirección 5’ – 3’. En consecuenci
a, el promotor queda en la 5’ (flujo ascendente, corriente arriba o upstream) del nucleótido inicial del RNA.
La holoenzima forma complejos muy fuertes con los promotores. Existen dos regiones en el promotor que une la RNApol.
• La caja de Pribnow es una región de 6 bp centrada alrededor de la posición -10. Su secuencia consenso es TATAAT, donde las
TA iniciales y la T final son altamente conservadas.
• Una secuencia de 8 a 12 bp situada sobre la region de – 35. También contienen una región conservada TCTTGACAT la cual, es
mas evidente en promotores eficientes.
• Los sitios de iniciación de la transcripción, que en muchos promotores están representados por único nucleótido de purina. El nu
cleótido iniciador, el cual casi siempre es A o G, esta en el centro de una secuencia CAT o CGT no muy conservada, situada entre
5 y 8 bases hacia 3’ de la caja de Pribnow.

UP ELEMENT: aumenta la fuerza del promotor (numero de veces que una unidad transcripcional es transcripta). Esto puede gr
acias a que aumenta la afinidad del elemento sigma por el promotor.

La mayoría de las secuencias promotoras varían considerablemente respecto de la secuencia consenso. No obstante, variaciones
en una de las regiones parcialmente conservadas puede incrementar o disminuir enormemente la eficiencia de iniciación del pro
motor afectado. Las velocidades de transcripción de los genes, que cubren un rango de tres órdenes de magnitud, varían directam
ente con la velocidad de formación de complejos de iniciación estables de sus promotores con la holoenzima.
El núcleo de la enzima, que no se une al promotor de manera especifica, se une estrechamente al dsDNA. Contrariamente, la holo
enzima, se une al DNA no promotor comparativamente con menor afinidad. Aparentemente, la subunidad sigma permite que la h
oloenzima se desplace rápidamente a lo largo de una hebra de DNA buscando el promotor correspondiente a la subunidad sigma
de que se trate. Una vez que se ha iniciado la transcripción y la subunidad sigma ha sido desechada, la fuerte unión entre el núcle
o de la enzima y el DNA estabiliza aparentemente el complejo enzima-DNA-RNA.
Hay horquillas de transcripción de manera que debe haber enzimas topoisomerasas que enrollen y desenrollen el DNA.
En la región que esta siendo transcripta, la hélice de DNA es desenrrollada en aproximadamente una vuelta, para posibilitar que la
hebra con sentido del DNA forme un corto segmento de RNA en dirección 5’ – 3’ dando una doble hélice hibrido DNA-RNA.
Este fragmento inicial de DNA-RNA presenta entre 8 – 10 nucleótidos. A partir de allí, a medida que agregan mas nucleótidos se
produce la liberación de la cadena, de manera que siempre haya un fragmento de 8 a 10 nucleótidos apareados.
Por otro lado, luego de incorporar el 10mo – 12vo nucleótido, el factor sigma ya no cumple mas su funcion de reconocimiento y s
e desprende del resto del complejo. La RNApol libre de sigma puede continuar transcribiendo hasta llegar a las secuencias de fin d
e transcripción.
La secuencia promotora libre ahora es diana para que otra RNApol con factor sigma pueda comenzar una nueva ronda de transcrip
ción. Por lo general ocurren sucesivas transcripciones de un mismo gen a la vez.
A medida que la RNApol avanza sobre el DNA molde, el DNA se desenrrolla por delante del extremo 3’ en crecimiento de RNA,
y se vuelve a enrollar por detrás, donde desplaza al RNA recién sintetizado de la hebra con sentido.
• Una forma de realizar este proceso podría ser que la RNApol siguiera la ruta marcada por la hebra con sentido a lo largo de la do
ble hélice de DNA, con lo que el transcrito acabaría envolviendo al DNA una vez por cada vuelta de dúplex.
• Una segunda posibilidad, mas probable, es que el RNA se desplace en línea recta al tiempo que el DNA gira por debajo. En este
caso, el RNA no se enrollaría alrededor del DNA, sino que el DNA situado por delante de la burbuja de transcripción se sobreenr
ollaría a medida que esta va avanzando, y se iría desenrollando por detrás.

La velocidad de transcripción in vivo es de entre 20 a 50 nucleótidos / segundo a 37 °C. Una vez que una molécula de RNApol ha
iniciado la transcripción y se ha desplazado del promotor, otra RNApol puede ocupar su lugar. La síntesis de RNA que son neces
arios en grandes cantidades, por ejemplo los rRNA, se inicia tantas veces como las restricciones estéricas lo permiten, aproximada
mente una vez cada segundo.
La frecuencia de errores en la síntesis de RNA, estimada a partir del análisis de transcritos de moldes sencillos, es de una incorpor
ación de base errónea por cada aprox 104 transcritos.
Esta tasa es tolerable debido a que la transcripción repetida de la mayoría de los genes, porque el código genético contiene número
s “sinónimos”, al ser degenerado.

TERMINACIÓN DE LA HEBRA DE RNA


- Terminación Rho independiente
El DNA contiene sitios específicos en los cuales se detiene la transcripción. Las secuencias de terminación de la transcripción co
mparten principalmente dos características:
• Una serie de 4 a 10 pares de bases T consecutivos, con la A sobre la hebra molde. El RNA transcrito acaba dentro o justo despue
s de esta secuencia, producto de la formación de una región rica en U.
• Una region rica de G + C con una secuencia palindrómica (de simetría doble) que precede inmediatamente a la serie de pares A
T.
El transcrito de RNA de esta región puede por tanto formar una estructura autocomplementaria, de horquilla, que acaba en varios r
esiduos U.
La estabilidad de una horquilla terminadora rica en GC y el debil apareamiento entre las bases de su cola poliU y el molde de DN
A aparecen ser factores importantes a la hora de asegurar una terminación correcta de la hebra.
La formación de la horquilla rica en GC provoca que la RNApol interrumpa su avance durante unos segundos en el sitio de termin
ación. Se ha propuesto que esto induce un cambio conformacional en la RNApol, lo cual permite que la hebra no codificante del D
NA desplace la unión debil de la cola poliU de la hebra molde acabando por tanto la transcripción.
La observación de que mutaciones que modifican la fuerza de estas asociaciones reducen la eficiencia de terminación de hebras y
a menudo la eliminación es consistente con esta idea.

- Terminación Rho dependiente


El factor Rho aumenta la eficiencia de terminación de los transcritos que terminan de manera espontanea, así como también induc
e la terminación de transcritos que no terminan de manera espontanea.
El factor rho es una enzima que cataliza el desenrrollamiento de dobles hebras formadas por RNA – DNA o por RNA – RNA. Est
e proceso recibe su energía de la hidrolisis de nucleósidos trifosfato (NTPs) a nucleósidos difosfato + Pi, con poca preferencia por
la identidad de la base hidrolizada. La actividad NTPasa es necesaria para la terminación dependiente de rho.
La terminación dependiente de rho requiere la presencia de una secuencia de reconocimiento especifica situada hacia 5’ del sitio d
e terminación. La secuencia de reconocimiento (Rut) esta situada sobre el RNA naciente.
El factor rho se une al RNA naciente por su secuencia de reconocimiento, y mira en dirección 5’ – 3’ hasta que encuentra a la RN
Apol, detenida en el sitio de terminación (si la RNApol no se detuviera, rho seria incapaz de alcanzarla.). Allí, rho desenrrolla el s
egmento bicatenario RNA-DNA formado en la burbuja de transcripción por lo que acaba liberando el transcrito de RNA.

EN PROCARIOTAS, LA TRADUCCIÓN OCURRE SIMULTANEAMENTE CON LA TRANSCRIPCIÓN


• En las células bacterianas, la transcripción y la traducción ocurren en forma simultánea; mientras se está transcribiendo el extrem
o 3’ de un mRNA, los ribosomas se unen a la secuencia de Shine-Dalgarno cerca del extremo 5’ e inician la traducción. Dado que
la transcripción y la traducción están acopladas, hay pocas oportunidades para que el mRNA se modifique antes de la síntesis prot
eica.
• Por el contrario, en las células eucariotas la transcripción y la traducción están separadas en forma temporal y espacial. La transc
ripción ocurre en el núcleo, mientras que la mayor parte de la traducción se produce en el citoplasma; esta separación proporciona
una oportunidad para que el mRNA eucariota se modifique antes de ser traducido. De hecho, el mRNA eucariota se altera extensa
mente después de la transcripción. Se hacen cambios en el extremo 5’, en el extremo 3’ y en la sección que codifica proteínas de l
a molécula de RNA.
El transcripto inicial de los genes que codifican proteínas de las células eucariotas se conoce como pre-mRNA, mientras que el tra
nscripto maduro procesado es el mRNA.
El mRNA es la molécula de RNA que ha sido procesada por completo y/o está lista para ser traducida. De ahí que en células bacte
rianas den mRNA directamente, aun sin tener un procesamiento previo.
TRANSCRIPCION DEL DNA EN EUCARIOTAS
El núcleo eucariótico contiene tres tipos de RNApol, que difieren en los RNA que sintetizan:
1 – RNApol I: localizada en el nucléolo (cuerpos granulares densos del núcleo que contienen los genes ribosomales, sintetiza los p
recursores de la mayoría de RNA ribosómicos.
2 – RNApol II: esta situada en el nucleoplasma, sintetiza los precursores del mRNA y de ciertos RNA pequeños nucleares estables
. La subunidad mayor de la RNApol II tienen una propiedad única, presenta una cola Ct, consistente en una secuencia consenso de
siete aminoácidos repetida múltiples veces. Este dominio Ct (CTD) esta separado del cuerpo principal de la enzima por una secue
ncia de unión no estructurada. El CTD tienen muchas e importantes funciones en la RNApol II.
3 – RNApol III: está presente en el nucleoplasma, sintetiza los precursores del rRNA, los tRNA y de una variedad de otros RNA p
equeños nucleares y citosólicos.
Además de estas enzimas nucleares, las células eucarióticas contienen RNApol mitocondriales y de cloroplastos que son independ
ientes.

La RNApol eucariotas presentan una alta procesividad de manera que pueden transcribir de una única vez una unidad transcripc
ional. La RNApol presentan baja fidelidad y no tienen actividad corrección de errores.

PROMOTORES DE LA RNApol II
El Core o núcleo del promotor es la zona mas pequeña que presenta funcionalidad promotora. Esta fragmento es suficiente para qu
e ocurra la transcripción por la RNApol II in vitro.
Los elementos que habitualmente forman parte del Core promoter son:
• TATA box: secuencia consenso localizado a aprox 30 bp upstream del sitio de inicio de la transcripción.
• Initiator element (Inr): localizado usualmente en el sitio de inicio de transcripción. Es una secuencia de 17 bp no conservada.
• Islas CpG: localizado dentro de las 100 bp upstream del inicio de transcripción. Es una zona rica en CG (de entre 20 – 50 nucleót
idos).
• BRE: elemento reconocedor de TFIIB (BRE). Se localiza entre -32 y -38 pb en dirección 5’ con respecto al sitio de iniciación (T
FIIB es la sigla en inglés de un factor de transcripción que se une a este elemento).
• DPE: promotor mínimo en dirección 3’ (downstream Core promoter element o DPE). Se encuentra aproximadamente 4-30 pb co
rriente abajo del sitio de iniciación en muchos promotores que también tienen Inr.
Todas estas secuencias consenso del promotor mínimo son reconocidas por factores de transcripción que se unen a ellas y sirven
como plataforma para el ensamblaje del aparato de transcripción basal (llamado también complejo pre-iniciación).

Los promotores reconocidos por la RNApol II son considerablemente mas largos y diversos que los de los genes procarióticos.
Los genes estructurales que se expresan en todos los tejidos también denominados constitutivos, son transcritos de forma constitut
iva, gracias a que poseen una o mas copias de la secuencia GGGCGG o de su complementaria (la caja GC) situadas hacia 5’ de su
s inicios de transcripción.
Los genes estructurales que se expresan de manera selectiva en uno o pocos tipos de células carecen a menudo de estas secuencias
ricas GC. En lugar de ello, contienen una secuencia rica en AT situada entre 25 y 30 bp hacia 5’ de sus sitios de inicio de transcri
pción. Esta secuencia recibe la denominación de caja de Goldberg-Hogness (TATA box).
Las funciones de estos dos elementos promotores no son estrictamente análogas, dado que la deleción de la TATA box no elimin
a necesariamente la transcripción. En lugar de ello, la deleción o mutación de la caja TATA genera heterogeneidades en el sitio de
iniciación de la transcripción, lo cual indica que la caja TATA participa en la selección de este sitio.
La región génica que se extiende entre -50 y -110 también contienen elementos promotores. Evidentemente, las secuencias promot
oras situadas hacia 5’ de la caja TATA constituyen los sitios iniciales de unión al DNA de la RNApol II y de las otras proteinas im
plicadas en la iniciación de la transcripción.

=> POTENCIADORES O ENHANCER


Los elementos transcripcionales en las eucariotas que complementan la actividad del promotor se conocen como potenciadores. E
stas secuencias son distintas a la de los promotores, con los cuales deben estar asociados a fin de disparar la iniciación de la transc
ripción especifica de sitio y de hebra (a pesar de que la caracterización de numerosos promotores y potenciadores indica que sus p
ropiedades funcionales son similares). Los potenciadores se encuentran tanto en genes de los virus eucarióticos como en los genes
celulares, y se las reconoce porque son secuencias que se encuentran cerca del promotor que al ser eliminadas disminuye drástica
mente la tasa de transcripción a pesar de no haber alterado el promotor.
Por lo tanto, los potenciadores son necesarios para la actividad completa de sus correspondientes promotores.
Existen dos teorías que explican un posible mecanismo de funcionamiento de estas secuencias.
• Los potenciadores son “puntos de entrada” al DNA para la RNApol II, gracias a su falta de afinidad para la unión de las histonas
que normalmente recubren al DNA eucariótico. Las histonas, probablemente, bloqueen la unión de la RNApol II. Alternativamen
te, los potenciadores podrían modificar la formación local del DNA de una forma que favoreciera la unión de la RNApol II. De he
cho, algunos potenciadores contienen un segmento de purinas y pirimidínas alternadas que corresponde al tipo de secuencia con m
ayor probabilidad para formar Z-DNA.
• Los potenciadores son reconocidos por proteinas especificas denominadas factores de transcripción, que estimulan la unión de la
RNApol al promotor que se encuentra próximo a ellos.
Todos los potenciadores celulares que han sido identificados hasta el momento están asociados con genes que se expresan de for
ma selectiva en tejidos específicos. Parece por tanto, que los potenciadores median gran parte de la expresión génica selectiva en
las eucariotas.

LA RNApol EUCARIOTA ES INHIBIDA SELECTIVAMENTE


La elongación de las hebras de RNA por la RNApol tanto en bacterias como en eucariotas es inhibida por el antibiótico actinomici
na D. La porción plana de esta molécula se intercala en el DNA doble hélice entre pares se bases GC sucesivos, deformando el D
NA. Esta alteración impide el movimiento de la RNApol a lo largo del molde. Debido a que la actinomicina D inhibe la elongació
n del RNA en células intactas así como en extractos celulares, resulta muy útil para identificar procesos celulares que dependen de
la síntesis de RNA. La acridina inhibe la síntesis de RNA de forma similar.
La rifampicina inhibe la síntesis de RNA en las bacterias uniéndose a la subunidad beta de las RNApol bacterianas, lo que impide
el desalojo del promotor en la transcripción. Ocasionalmente se administra como antibiótico.
El hongo Amanita phalloides ha desarrollado un mecanismo de defensa muy efectivo frente a los depredadores. Produce alfa-ama
nitina, que impide la formación de mRNA en las células animales al bloquear la RNApol II y a concentraciones mas altas, tambié
n a la Pol II. Ni la Pol I ni la RNApol bacteriana son sensibles a la alfa-amanitina, como tampoco la propia RNApol II del hongo.
COMPLEJO PRE INICIACIÓN
Es la asociación de todos los componentes de la maquinaria transcripcional en la secuencia TATA box dejando a la RNApol prep
arada para la transcripción.
La maquinaria de transcripción básica que se une al DNA en el sitio de iniciación se llama aparato de transcripción basal y es nece
saria para dar comienzo a niveles mínimos de transcripción. El aparato de transcripción basal está formado por una RNApol, una s
erie de factores de transcripción general y un complejo de proteínas conocido como mediador.
Los factores de transcripción general incluyen TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH; TFII significa factor de transcripción
para la RNA polimerasa II y las letras finales designan al factor individual.
• El TFIID se une a la caja TATA y determina la posición del sitio activo de la RNA polimerasa II para que comience la transcripc
ión en el lugar correcto.
• Este factor de transcripción consta de al menos nueve polipéptidos, uno de ellos, la proteína de unión a la caja TATA (TBP), rec
onoce a la caja TATA del molde de DNA y se une ella. Esta proteína se une al surco menor, lo curva y lo desenrolla en forma parc
ial.
• Los factores asociados con la TBP (TAF), se combinan con la TBP para formar el factor de transcripción TFIID completo.
La RNA polimerasa, los factores de transcripción adicionales y el mediador se ensamblan previamente y luego se unen al TFIID c
omo una unidad.
Los otros factores de transcripción desempeñan funciones adicionales:
• el TFIIA ayuda a estabilizar la interacción entre la TBP y el DNA.
• el TFIIB desempeña un papel en la selección del sitio de iniciación
• el TFIIH tiene actividad de helicasa y desenrolla el DNA durante la transcripción.
• el mediador desempeña un papel en la comunicación entre el aparato de transcripción basal y las proteínas activadores de la trans
cripción.
PROCESAMIENTO DEL RNA
• CAP y cola poliA
• Splicing
• Edición mRNA
• Transporte mRNA
• Procesamiento del rRNA y del tRNA.
• Degradación del RNA.
- Vías de decapping, deadenilación y endorribonucleolíticas.
- Mecanismos de supervivencia de RNA: NMD, NAS, NSD
- Presencia de secuencias AURE
El primer y el segundo paso ocurren en simultaneo con la transcripción. El formación de la cola poli A es al final de la transcripci
ón. La cola fosforilada es el punto de reclutamiento para las distintas enzimas del procesamiento.

• CAP y cola poliA


La mayoría de mRNA eucarióticos tienen un casquete en 5’, un residuo de 7-metilguanosina unido al residuo 5’-terminal del mRN
A a través de un enlace 5’,5’-trifosfato poco común. El casquete en 5’ protege el mRNA de las ribonucleasas. El casquete también
se une a un complejo proteico especifico y participa en la unión del mRNA al ribosoma para iniciar la traducción.
El casquete 5’ se forma por condensación de una molécula de GTP con el trifosfato del extremo 5’ del transcrito. La guanina es m
etilada posteriormente en N-7 y a menudo se añaden grupos metilo adicionales en los 2’-OH del primer y segundo nucleótidos ady
acentes al casquete. Los grupos metilo proceden de la S-adenosilmetionina. Todas estas reacciones suceden en los primeros estadi
os de la transcripción, despues de añadir los primeros 20 o 30 nucleótidos del transcrito. Las tres enzimas responsables de la inserc
ión del casquete, y por su mediación el extremo 5’ del propio transcrito, están asociados al CTD de la RNApol II hasta que se sint
etiza el casquete. Entonces las enzimas de formación del casquete se separan del extremo 5’ y se une el complejo de unión al casq
uete.
La mayor parte de mRNA eucariotas tiene una serie de 80 a 250 residuos de A en el extremo 3’ que forman la cola poliA. Esta col
a sirve de lugar de unión a una o mas proteinas especificas. La cola de poliA y sus proteinas asociadas probablemente ayudan a pr
oteger el mRNA de la destrucción enzimática. Muchos mRNA bacterianos también adquieren colas de poliA, pero estas colas esti
mulan la degradación del mRNA en lugar de protegerlo.
La cola de poliA es añadida en un procesos que consta de múltiples etapas.
La adición de la cola poliA se encuentra estrechamente asociado a la terminación transcripcional de eucariotas.
El transcrito se extiende mas allá del sitio donde debe añadirse la cola de poliA y a continuación es cortado en el sitio de adición d
el poliA por un componente endonucleasa de un gran complejo enzimático, de nuevo asociado a la CTD de la RNApol II. El sitio
del mRNA en donde se produce el corte y la adición de poliA esta indicado por dos secuencias. El corte genera el grupo 3’-OH lib
re que caracteriza el extremo final del mRNA, al que se añaden inmediatamente los residuos de A por la poliadenilato polimerasa.
RNA + nATP  RNA – (AMP)n + nPPi
donde n = 80 a 250. Este enzima no requiere molde, pero necesita un mRNA cortado como cebador.

• Cis-Splicing
El otro tipo principal de modificación que se produce en el pre-mRNA eucariota es la eliminación de los intrones por el corte y em
palme de los exones. Esto ocurre en el núcleo habitualmente después de la transcripción y de la adición de la cola de poli(A), pero
antes de que el RNA se mueva hacia el citoplasma.

El mecanismo por el cual ocurre el splicing básicamente se puede resumir en reacciones:


1 – Ataque nucleofílico del 2-OH de un nucleótido (ya sea libre, como guanosina, o perteneciente al punto de ramificación, como
adenina) al 5-P de otro nucleótido, dando como productos al exon I con el extremo OH libre.
2 – El OH del exon I realiza el mismo ataque, en el nucleótido ubicado al final del intron I y al comienzo del exon II, dando como
producto al empalme de los exones y al intron, ya sea lineal (intrones tipo I) o con estructura de lazo (intrones tipo II y III).
Los grupos químicos que están involucrados deben estar en cercanía y orientados para que ocurra la reacción. Dependiendo del
mecanismo por el cual haga esto, se puede clasificar a lo entrones en tres grupos:

 INTRONES DEL GRUPO III


La tercera y mas numerosa clase de intrones se encuentra en los transcritos primarios del mRNA nuclear.
Se denominan intrones de espliceosoma, porque su eliminación ocurre en el interior y por acción de un gran complejo proteico de
nominado espliceosoma. En el espliceosoma, los intrones experimentan corte y empalme dando como producto RNA con estructur
a de lazo.
El espliceosoma esta formado por complejos RNA-proteínas especializados, denominados pequeñas ribonucleoproteína nucleares
(snRNP). Cada snRNP contiene un RNA de 100 a 200 nucleótidos de un tipo denominado RNA nuclear pequeño (snRNA). En los
núcleos eucarióticos se encuentran generalmente cinco snRNA (U1, U2, U4, U5 y U6) implicados en las reacciones de corte y em
palme.
U2 esta apareado con el intron en una posición que contiene el residuo A que actúa de nucleófilo durante la reacción de corte y e
mpalme. El apareamiento del snRNA U2 produce una protuberancia que desplaza y ayuda a activar la adenosina, cuyo 2’OH for
mara la estructura en lazo mediante un enlace 2’-5’-foafodiester.
Los RNA y las proteínas de las snRNP están muy conservados en los eucariotas, de las levaduras a los humamos.
Algunos componentes de la maquinaria de corte y empalme se encuentran unidos a la CTD de la RNApol II.

 INTRONES DEL GRUPO II


También puede ocurrir por secuencias que produzcan estructuras tridimensionales de manera tal que estos grupos queden en
cercanía y orientados perfectamente. Es decir que es similar al grupo III, solo que la orientación y disposición se debe a su estr
uctura terciaria que acomoda bien los grupos químicos, mientras que en el grupo III esta orientación se debe al espliceosoma.
En los intrones del grupo II el patrón de reacción es similar excepto para el nucleófilo del primer paso, que en este caso es el grup
o 2’-hidroxilo de un residuo de A situado dentro del intron. Se produce un intermediario ramificado con una estructura en forma d
e lazo.
Este RNA es autocatalítico y da como producto RNA con estructura de lazo.

 INTRONES DEL GRUPO I


Hay otro tipo, en donde hay una G que aporta um 3’OH realizando el primer ataque nucleofílico.
Al igual que los intrones del tipo II, su capacidad autocatalítica depende exclusivamente de su estructura secundaria, la cual debe s
er tal que acerque y oriente a los grupos reactivos.
Sin embargo, en este caso, la reacción de corte y empalme del grupo I requiere un nucleósido de guanina o un cofactor nucleotídic
o, pero el cofactor no se utiliza como fuente de energía, sino que el grupo 3’-hidroxilo de la guanosina se utiliza como nucleófilo e
n el primer paso de la ruta de corte y empalme. El grupo 3’-hidroxilo de la guanosina forma un enlace 3’,5’-fosfodiester normal co
n el extremo 5’ del intron. El 3’-hidroxilo del exón desplazado en este paso actúa seguidamente como nucleófilo en una reacción s
imilar en el extremo 3’ del intron. El resultado es la escisión exacta del intron y la ligación de los exones. El intron se libera como
una hebra (lineal).

Vías de procesamiento alternativo:


Existen varias vías de procesamiento alternativo, en que una única molécula de pre-mRNA se procesa de diferente forma para pro
ducir tipos alternativos de mRNA que conducen a la producción de diferentes proteínas a partir de una misma secuencia de DNA.
Entre ellos:
• Splicing Alternativo:
La misma molécula de pre-mRNA puede cortarse y empalmarse de más de una manera, para dar como resultado múltiples mRNA
que se traducen a proteínas con diferentes secuencias de aminoácidos.
• Múltiples sitios de corte 3’:
En el pre-mRNA se encuentran dos o más sitios potenciales para corte y poliadenilación.

El uso de un sitio de corte alternativo puede producir una proteína diferente o no producirla, según si el sitio se localiza antes o d
espués del codón de terminación. Tanto el corte y empalme alternativo como la existencia de múltiples sitios de corte 3’ pueden c
oexistir en el mismo transcrito de pre-mRNA.
La mayor parte de los mRNA se producen a partir de una sola molécula de pre-mRNA a partir de la cual los exones se escinde
n en conjunto. Sin embargo, en algunos organismos, los mRNA pueden ser producidos por el empalme de exones provenientes
de dos o más pre-mRNA; a este proceso se lo conoce como corte y empalme trans.

• Trans-Splicing
Es una forma especial de procesamiento de ARN en eucariotas donde exones de dos pre-RNA diferentes se unen de extremo a ext
remo y luego son ligados.
Trans-splicing genera un solo ARN transcripción de múltiples pre-mRNAs separados. Por lo tanto, el trans-splicing consiste en el
procesamiento de dos RNA diferentes. Una particularidad es que como producto se obtiene intrones con estructura de Y (Y – shap
ed) en lugar de lazo. Es muy raro en eucariotas superiores. El SL RNA es el que se encuentra involucrado en el trans-splicing, cuy
a secuencia presenta un leader que será adquirido por el pre-mRNA al finalizar el trans-splicing.
• Edición mRNA
La información genética reside en la secuencia de nucleótidos del DNA, a excepción del RNA en los virus. Esta información se tr
anscribe a mRNA y el mRNA luego se traduce a una proteína.
La suposición de que toda la información acerca de la secuencia de aminoácidos de una proteína reside en el DNA está violada po
r un proceso llamado edición del RNA. En este proceso, la secuencia codificante de una molécula de mRNA se altera después de l
a transcripción, de modo que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos distinta de la codificada por el gen.

La edición del RNA se detectó al comparar secuencias codificantes de mRNA con las secuencias codificantes de DNA y encontrar
discrepancias para algunos genes nucleares de las células de mamíferos y para los genes de las mitocondrias de las células vegetal
es.
En estos casos hubo sustituciones en algunos de los nucleótidos del mRNA.

Una edición más extensa del mRNA ocurre de algunos genes mitocondriales de los tripanosomas. En algunos mRNA de estos org
anismos, más del 60% de la secuencia está determinada por la edición del RNA.
Actualmente, se conocen diferentes tipos de edición del RNA en los mRNA, tRNA y rRNA de un amplio espectro de organismos
que incluyen la inserción y la deleción de nucleótidos, y la conversión de una base en otra.
Con respecto a como se especifica la secuencia del RNA editado, las moléculas conocidas como RNA guías (gRNA) desempeñan
un papel central. Los gRNA contienen secuencias que son parcialmente complementarias con segmentos del RNA preeditado, y la
s dos moléculas aparean las bases de esta secuencia. Después de que el mRNA se ha anclado al gRNA, el mRNA sufre cortes y se
añaden nucleótidos, se delecionan, o bien se alteran, de acuerdo con el molde provisto por la gRNA. Luego se unen los extremos d
el mRNA.
En otros casos, la conversión de bases es llevada a cabo por las enzimas. En los seres humanos, por ejemplo, un gen se transcribe
a un mRNA que codifica un polipéptido transportador de lípidos (apolipoproteina) sintetizado en los hepatocitos. Una forma trunc
ada de la proteína (otra apolipoproteina) se sintetiza en las células intestinales. La proteína truncada se produce a partir de una vers
ión editada del mismo mRNA, que codifica la hepática. Durante el proceso de edición, una enzima desamina una citosina y la con
vierte en uracilo. Esta conversión cambia un codón que especifica el aminoácido glutamina a un codón de terminación, que termin
a en forma prematura la traducción, y deja como resultado la proteína acortada.

• Transporte mRNA
Una vez procesado por completo (con CAP, sin intrones y poliadenilado), el mRNA se transporta desde el núcleo hacia el citosol,
donde se lo traduce para que sé su producto proteico. El movimiento desde el núcleo hacia el citoplasma no es un proceso pasivo.
El mismo se encuentra regulado debido a que el mRNA recién sintetizado no es el único RNA presente en el núcleo.
Desde el momento en que comienza su transcripción, una molécula de RNA se asocia con proteinas de varias clases: al principio, l
as proteinas que participan en la adición del CAP; luego, factores de empalme, y, por ultimo, las proteinas que median la poliadeni
lación. Algunas de estas proteinas se reemplazan en diversos pasos a lo largo del mecanismo de procesamiento, pero otras no, e in
cluso hay proteinas que se unen a otras proteinas adicionales.
Como consecuencia, un mRNA maduro típico porta una colección importante de proteinas asociadas que lo identifican como un
mRNA destinado a la exportación.
Los RNA que no son de exportación, pueden ser que no estén marcados con estas proteinas, o que presenten un conjunto propio d
e proteinas que bloqueen su exportación.
La exportacion se produce por una estructura especial en la envoltura nuclear llamada poro nuclear. Las moleculas pequeñas pued
en pasar por estos poros. Sin embargo, moleculas mas grandes o complejos riboproteicos, son transportados de forma activa. El m
ecanismo basico conskste en que algunas de las proteinas asociadas con el RNA es reconocida por receptores de exportacion en la
envoltura que guian al RNA en su salida a traves del poro. El transporte de proteinas desde el cktoplasma al nucleo funciona de la
misma manera, como por ejemplo, proteinas que asocian al rRNA que formara los ribosomas.
Una vez en el citoplasma, las proteinas se separan del mRNA y luego se las reconoce para su reimportacion hacia el nucleo, donde
se asocian con otro mRNA y asi se repite el ciclo.

• Procesamiento del rRNA y del tRNA


La maduración postranscripcional no se limita al mRNA. Los rRNA y los tRNA también sufren splicing. Se forman a partir de pre
cursores mas largos, denominados también como pre-rRNA y pre-tRNA.
Estos RNA también pueden contener diversos nucleósidos modificados.

• rRNA: en las eucariotas, un transcrito de pre-rRNA de 45S es sintetizado por la RNApol I y modificado en el nucléolo para dar l
os rRNA 18S, 28S y 5,8S, característicos de los ribosomas eucarióticos. La maduración consiste en reacciones de corte por endo y
exorribonucleasas y en reacciones de modificación de nucleósidos. Algunos pre-rRNA también contienen intrones que se han de
cortar y empalmar.
El proceso comienza en el nucléolo, en grandes complejos que se forman sobre el precursor de rRNA a medida que es sintetizado
por la Pol I. La transcripción del rRNA, la maduración del rRNA y el ensamblaje de los ribosomas en el nucléolo están perfectame
nte coordinados. Cada complejo contiene las ribonucleasas que cortan el precursor de rRNA, las enzimas que modifican determina
das bases, numerosas RNA nucleolares pequeñas o snoRNA, que guían las modificaciones de los nucleósidos, y algunas reaccione
s de corte y proteinas ribosómicas.
La composición de los complejos puede varias a medida que los ribosomas son ensamblados y muchos de los complejos intermedi
os pueden rivalizar en complejidad con los propios ribosomas y snRNP. El rRNA 5S de la mayoría de eucariotas es sintetizado co
mo un transcrito totalmente independiente por una polimerasa diferente (Pol III).
Las modificaciones mas comunes de los nucleósidos en los rRNA eucarióticos son de nuevo la conversión de la uridina en pseudo
uridina y la metilación de los nucleósidos dependiente de adoMet (a menudo en los grupos 2’-OH). Estas reacciones son realizada
s por complejos de proteinas y snoRNA, o snoRNP, formados por un snoRNA y cuatro o cinco proteinas, entre las que se encuentr
a la enzima que lleva a cabo la modificación.
Los snoRNA tienen de 60 a 300 nucleótidos de longitud. Muchos están codificados en los intrones de otros genes y son cotranscrit
os con estos genes. Cada snoRNA contiene una secuencia de 10 a 21 nucleótidos perfectamente complementaria de algún sitio de
rRNA. Los elementos de secuencia conservados del resto del snoRNA se pliegan en estructuras a las que se unen las proteinas de l
as snoRNP.
• tRNA: la mayoría de célula tienen entre 40 y 50 tRNA diferentes y en las células eucarióticas hay múltiples copias de muchos de
los genes de tRNA. Los RNA de transferencia proceden de precursores mas largos por eliminación enzimática de nucleótidos de l
os extremos 5’ y 3’. En los transcritos de tRNA de los eucariotas, ocasionalmente se encuentran intrones que deben ser eliminados
. Cuando dos o mas tRNA diferentes se encuentran en el mismo transcrito primario, son separados por corte enzimático. La endon
ucleasa RNAasa P, presente en todos los organismos, elimina RNA del extremo 5’ de los tRNA. La enzima contiene proteína y R
NA. El componente de RNA es esencial para la actividad y en las bacterias puede realizar su función con precisión aun en ausenci
a del componente proteico.
La RNAasa P es, por lo tanto, otro ejemplo de RNA catalítico. El extremo 3’ de los tRNA es modificado por una o mas nucleasas,
entre las que se encuentra la exonucleasa RNAasa D.
Los precursores del tRNA pueden ser sometidos a una ulterior modificación postranscripcional. El trinucleótido 3’-terminal CCA(
3’), al que se unirá un aminoácido durante la síntesis proteica, no se encuentra en algunos precursores de tRNA bacterianos y en to
dos los eucarióticos y es añadido durante la maduración. La adición corre a cargo de la tRNA nucleotidiltransferasa, enzima peculi
ar que une los tres ribonucleósidos trifosfato precursores en sitios activos separados y cataliza la formación de los enlaces fosfodié
ster para producir la secuencia CCA (3’). La creación de esta secuencia definida de nucleótidos es, por lo tanto, independiente de l
a presencia de un molde de DNA o de RNA; el molde es el sitio de unión de la enzima.
La etapa final de la maduración del tRNA consiste en la modificación de algunas bases por metilación, desaminación o reducción.
En el caso de la pseudouridina, la base (uracilo) es separada y vuelta a unir al azúcar en C5. Algunas de estas bases modificadas se
encuentran en posiciones características en todos los tRNA.

• Degradación del RNA (también ocurre en procariotas)


La expresión de los genes está regulada a muchos niveles. Un factor crucial en la expresión génica es la concentración celular del
correspondiente mRNA. La concentración de cualquier molécula depende de dos factores: su velocidad de síntesis y su velocidad
de degradación. Cuando la síntesis y la degradación de un mRNA están equilibradas, su concentración permanece en estado estaci
onario. Un cambio en las velocidades de síntesis o de degradación conduce a la acumulación o a la disminución de mRNA. Las ví
as de degradación garantizan que los mRNA no se acumulen en la célula y sean causa de la síntesis de proteinas innecesarias.
Las tasas de degradación de los mRNA de los diferentes genes eucarióticos varían ampliamente. Los productos génicos que solo s
on necesarios durante un breve espacio de tiempo pueden tener mRNA con vidas medias del orden de minutos o incluso segundos.
Los productos génicos que se necesitan constantemente por la célula pueden tener mRNA estables durante muchas generaciones c
elulares. La vida media promedio del mRNA en una célula de vertebrado es de unas 3 hs, con un recambio del contenido de cada t
ipo de mRNA de unas 10 veces por generación celular. La vida media de los mRNA bacterianos es mucho mas corta, solo unos 1,
5 min, tal vez por exigencias de la regulación.
El mRNA es degradado por ribonucleasas presentes en todas las células.
• En procariotas, el proceso comienza con uno o unos pocos cortes por una endorribosilnucleasa, seguidos por degradación 3’-5’ p
or exorribonucleasas.
• En los eucariotas inferiores la ruta principal consiste en primer lugar en el acortamiento de la cola de poliA, seguida de la perdid
a del casquete del extremo 5’ y la degradación del mRNA en dirección 5’ -3’.
También existe una ruta de degradación en dirección 3’-5’, que puede ser la ruta principal en los eucariotas superiores.
• Todos los eucariotas poseen un complejo de hasta 10 exorribonucleasas 3’-5’ conservadas, denominado exosoma, que esta impli
cado en la maduración del extremo 3’ de los rRNA y tRNA y algunos RNA de funcion especializada (incluidos los snRNA y snoR
NA), así como en la degradación de los mRNA.
Una estructura en horquilla presente en los mRNA bacterianos con un terminador independiente de rho confiere estabilidad frente
a la degradación. Estructuras en horquillas similares pueden estabilizar regiones seleccionadas de la estructura primaria de un tran
scrito y causar una degradación no uniforme de los transcritos. En las células eucarióticas, tanto la cola de poliA en 3’ como el cas
quete en 5’ son importantes para la estabilidad de muchos mRNA.

POLINUCLEOTIDO FOSFORILASA
In vitro, dicha enzima cataliza la reacción:
(NMP)n + NDP <-- (NMP)n+1 + Pi
La polinucleótido fosforilasa fue la primera enzima sintetizadora de A.N descubierta. La reacción catalizada por la polinucleótido
fosforilasa difiere fundamentalmente de las otras actividades polimerizantes debido a que es independiente de un molde. La enzim
a utiliza los ribonucleótidos 5’-difosfato y no puede actuar sobre los 5’-trifosfato homólogos o sobre los desoxirribonucleósidos 5’
-difosfato. El polímero de RNA formado por la polinucleótido fosforilasa contiene enlaces 3’,5’-fosfodiéster normales, que puede
n ser hidrolizados por la ribonucleasa. La reacción es fácilmente reversible y puede ser impulsada en la dirección de la degradació
n del polinucleótido incrementando la concentración de fosfato. La función probable de esta enzima en la célula es la degradación
de los mRNA hasta nucleósidos difosfato.
Debido a que la reacción de la polinucleótidos fosforilasa no utiliza molde, no forma un polímero con una secuencia de bases espe
cifica. La reacción transcurre con idéntica facilidad con cualquiera de los cuatro nucleósidos difosfato y la composición de bases d
el polímero resultante refleja solamente las concentraciones relativas de los sustratos 5’- difosfato presentes en el medio.
La polinucleótido fosforilasa se puede utilizar en el laboratorio para la preparación de muchos tipo diferentes de polímeros de RN
A con diferentes secuencias y frecuencias de bases. Los polímeros de RNA sintético con estas características hicieron posible ded
ucir el código genético de los aminoácidos.
------------------------------------------Traducción-----------------------------------------
CODIGO GENÉTICO
La forma en la cual la secuencia de bases de DNA especifica la secuencia de aminoácidos de su proteína esta dado por el código g
enético:
La unidad básica en el código genético (el conjunto de bases que codifica un aminoácido único) fue denominado codón. Los codo
nes debían contener un mínimo de tres nucleótidos. Cada posición de nucleótidos en el mRNA puede ser ocupada por una de cuatr
o bases: A, G, C o U.
- Si un codón consistía en un nucleótido único, entonces, serían posibles solo cuatro codones diferentes (A, G, C y U), lo que no e
s suficiente para codificar los veinte aminoácidos distintos que se encuentran por lo común en las proteínas.
- Si los codones estuvieran hechos por dos nucleótidos cada uno (p. ej., GU, AC, etc.) habría 4 x 4 = 16 codones posibles; aún no r
esulta suficiente para codificar para los veinte aminoácidos.
- Con tres nucleótidos por cada codón, hay 4 x 4 x 4 = 64 codones posibles, lo que es más que suficiente para especificar los veint
e aminoácidos.
Por tanto, un código de tripletes que requiriera tres nucleótidos por codón sería la forma más eficiente de codificar la totalidad d
e los veinte aminoácidos.
Cuando se estableció que el código genético es un conjunto de codones que tienen tres nucleótidos de longitud, el siguiente paso c
onsistió en determinar cuáles grupos de tres nucleótidos especifican cuáles aminoácidos. Lógicamente, la forma más sencilla de de
scifrar el código hubiera sido determinar la secuencia de bases de un trozo de RNA, añadirlo a un sistema de síntesis proteica libre
de células y permitir que dirigiera la síntesis de una proteína. La secuencia de aminoácidos de la proteína recién sintetizada se det
erminaría, y esta secuencia se compararía con la presente en el RNA.
Sin embargo, no existía en ese momento la posibilidad de determinar la secuencia de nucleótidos de un trozo de RNA, de modo qu
e debieron emplearse métodos indirectos para descifrar el código.

TRADUCCIÓN IN VITRO
Existen diferentes métodos para la traducción in vitro: en todos los casos se requiere de un sistema acelular (por lisis celular). La
mezcla de lisis tienen todos los componentes necesarios:
• ribosomas
• tRNA
• mRNA sintético
• solo se debe agregar de manera exógena ATP, y los aminoácidos marcados
• aminoacil tRNA sintetasa
Para ello, se crearon RNA sintético empleando una enzima llamada polinucleótido fosforilasa. A diferencia de la RNA polimeras
a, la polinucleótido fosforilasa no requiere un molde; une al azar cualquier nucleótido de RNA que esté disponible. Los primeros
RNA sintéticos fueron homopolímeros, moléculas de RNA que consistían de un único tipo de nucleótido.

Al añadir la polinucleótido fosforilasa a una solución de nucleótidos de uracilo se generaban moléculas de RNA que consistían co
mpletamente en nucleótidos de uracilo, de esta manera solo contenían codones del tipo UUU. Estos RNA poli(U) se añadieron lue
go a veinte tubos, cada uno de los cuales contenía un sistema de síntesis proteica libre de células y los veinte aminoácidos distinto
s, uno de los cuales estaba marcado radioactivamente. La traducción procedió en los veinte tubos pero la proteína radioactiva apar
eció solo en uno de ellos (el que contenía fenilalanina marcada). Ese resultado mostró que el codón UUU especifica el aminoácido
fenilalanina.
Los resultados de experimentos similares en los que se empleó RNA poli(C) y poli(A) mostraron que CCC codifica para prolina y
AAA codifica para Lisina; por razones técnicas, los resultados para poli(G) fueron imposibles de interpretar.
Para obtener información acerca de codones adicionales, crearon RNA sintéticos que contenían dos o tres bases diferentes. Dado q
ue la polinucleótido fosforilasa incorpora nucleótidos al azar estos RNA contenían mezclas al azar de las bases y por tanto se los ll
amó copolímeros al azar.
Por ejemplo, cuando los nucleótidos adenina y citosina se mezclaran con la polinucleótido fosforilasa, las moléculas de RNA prod
ucidas tuvieron ocho codones diferentes: AAA, AAC, ACA, ACC, CAA, CAC y CCC. En los sistemas de síntesis de proteínas lib
re de células estos RNA poli(AC) produjeron proteínas que contenían seis aminoácidos distintos: asparagina, glutamina, histidina,
lisina, prolina y treonina.
Las proporciones de los distintos aminoácidos en las proteínas dependían del cociente de los dos nucleótidos empleados en crear e
l mRNA sintético, y la probabilidad teórica de encontrar un codón particular se calcularía a partir de los cocientes de las bases.
Si se hubiera empleado un cociente 4:1 de C con respecto a A al elaborar el RNA, entonces:
• la probabilidad de que C apareciera en cualquier posición dada de un codón sería de 4/5.
• la probabilidad de que A estuviera en él sería de 1/5.

Esta técnica fue útil hasta acá. Esto se debe a que los cálculos teóricos dependían de la incorporación al azar de las bases, lo que n
o siempre ocurre, y dado que el código genético es redundante, en algunas ocasiones varios codones distintos especifican el mism
o aminoácido.
Para determinar los aminoácidos que codificaban los codones mas complejos se diseño otra metodología. Se lo conoció como unió
n de tRNA a los ribosomas.

ENSAYO DE UNIÓN A FILTRO DE NITROCELULOSA


Una secuencia muy corta de mRNA era capaz de unirse a un ribosoma. El codón de este mRNA corto apareará luego sus bases co
n el anticodón correspondiente en un tRNA que porta al aminoácido especificado por el codón. Los mRNA cortos unidos al riboso
ma se mezclaron con tRNA y aminoácidos, y esta mezcla se pasó a través de un filtro de nitrocelulosa. Los tRNA apareados con e
l mRNA unido a los ribosomas se quedaron unidos al filtro, mientras que los tRNA no unidos pasaron a través de él. Luego, aislar
on los tRNA unidos a los ribosomas y determinaron cuáles aminoácidos estaban presentes en los tRNA unidos.
Por ejemplo, el RNA sintético con el codón GUU retuvo un tRNA al cual se unió la valina, mientras que los RNA con los codones
UGU y UUG no lo hicieron.
Este método permitió determinar los aminoácidos codificados por más de 50 codones.

La tercera metodología permitió obtener información adicional acerca del código genético. Se emplearon técnicas químicas para si
ntetizar moléculas de RNA que contenían secuencias repetidas conocidas. La hipótesis consistía en que un mRNA que contenía, p
or ejemplo, nucleótidos alternantes uracilo y guanina (UGUGUGUGUGUG) se leería, durante la traducción, como dos codones al
ternantes, UGU GUG UGU GUG, produciendo una proteína compuesta por dos aminoácidos alternantes. Cuando se ubicaron este
mRNA sintético en un sistema de síntesis proteica libre de células, se produjo una proteína constituida por residuos alternantes de
cisteína y valina.
Esta técnica no permite determinar cuál de los dos codones (UGU o GUG) especificaba para cisteína o la valina (debido a que el c
ódigo genético es degenerado), pero en combinación con otros métodos constituyó una contribución crucial para desentrañar el có
digo genético.

• Degeneración del código genético


Un aminoácido está codificado por tres nucleótidos consecutivos del mRNA y cada nucleótido puede tener una de cuatro bases po
sibles (A, G, C, y U) en cada posición del nucleótido, lo que permitió así 43 = 64 codones posibles. Tres de estos codones son cod
ones de terminación, que especifican la finalización de la traducción. Así, 61 codones llamados codones con sentido codifican par
a los aminoácidos. Dado que hay 61 codones con sentido y solo 20 aminoácidos distintos, por lo común presentes en las proteínas,
el código contiene más información que la necesaria para especificar los aminoácidos, y se dice que es un código degenerado.
La degeneración del código genético significa que los aminoácidos pueden estar especificados por más de un codón. Solo el triptó
fano y la metionina están codificados por un único codón. Los otros aminoácidos están especificados por dos codones y algunos, c
omo la leucina, hasta por seis codones distintos. Los codones que especifican un mismo aminoácido se les denomina sinónimos.

tRNA isoaceptores
Los tRNA sirven como moléculas adaptadoras, que llevan aminoácidos particulares unidos y los entregan a un ribosoma, donde lo
s aminoácidos luego se ensamblan en cadenas de polipéptidos. Cada tipo de tRNA une un único tipo de aminoácido, es decir, son
específicos para cada aminoácido.
Las células de la mayor parte de los organismos poseen entre 30 y 50 tRNA distintos, los cuales, son bastante menos de lo que se
predice por los 64 codones existentes.
Aun así solo existen 20 aminoácidos distintos en las proteínas. Esto implica que un aminoácido puede ser transportado por más de
un tRNA.
Los diferentes tRNA que aceptan al mismo aminoácido pero tienen anticodones distintos se llaman tRNA isoaceptores. Algunos co
dones sinónimos codifican para diferentes isoaceptores.

Tambaleo o Balanceo
Muchos codones sinónimos difieren solo en la tercera posición.
Por ejemplo, la alanina es codificada por los codones GCU, GCC, GCA y GCG, todos los cuales comienzan con GC. Cuando el c
odón en el mRNA y el anticodón del tRNA se unen, la primera base (5’) del codón se aparea con la tercera base (3’) del anticodón
, estrictamente de acuerdo con las reglas de Watson y Crick: A con U; C con G.
Luego, las bases del medio del codón y del anticodón se aparean, también estrictamente de acuerdo con las reglas de Watson y Cri
ck. Después de que estos pares han formado puentes de hidrógeno, las terceras bases se aparean débilmente, esto implica que pued
e haber cierta flexibilidad o tambaleo en su apareamiento.
La hipótesis del balanceo propone que algunos pares de bases no convencionales podrían producirse en la tercera posición de un c
odón.
Las reglas del tambaleo indican cuáles bases en la tercera posición (extremo 3') del codón del mRNA pueden aparearse con bases
que se encuentran en el primer lugar (extremo 5') del anticodón del tRNA:

Por ejemplo, una G en el anticodón podría aparearse con una C o una U en la tercera posición del codón. El tambaleo permite que
algunos tRNA se apareen con más de un codón de un mRNA; de esta forma, entre 30 y 50 tRNA pueden aparearse con los 61 cod
ones con sentido. Algunos codones son sinónimos por tambaleo.

• El marco de lectura y los codones de iniciación


El código genético no se superpone. Un código que se superpone es aquél en el cual un nucleótido único está incluido en más de u
n codón, como se muestra a continuación:

Inserciones y/o deleciones en el mRNA producen desfasajes en el marco de lectura.


Habitualmente, sin embargo, cada secuencia de nucleótidos de un mRNA especifica un aminoácido único. En los virus se encuent
ran unos pocos codones superpuestos; pero los codones dentro del mismo gen no se superponen y el código genético se considera
generalmente no superpuesto. Para cualquier secuencia de nucleótidos hay tres conjuntos potenciales de codones (o tres modos en
que la secuencia puede leerse en grupos de tres). Cada modo diferente de lectura de la secuencia se llama un marco de lectura, y c
ada secuencia de nucleótidos tiene tres marcos de lectura potenciales. Los tres marcos de lectura tienen conjuntos completamente
distintos de codones, y por tanto, especificarán proteínas con secuencias de aminoácidos completamente distintas. Así, resulta ese
ncial para la maquinaria de traducción emplear el marco de lectura correcto.
El marco de lectura queda establecido por un codón de iniciación, es el primer codón del mRNA que especifica para un aminoácid
o. Después del codón de iniciación, los otros codones se leen como grupos sucesivos de tres nucleótidos. No se saltean bases entre
los codones, de modo que no hay marcas de puntuación para separarlos. El codón de iniciación, habitualmente es AUG, aunque G
UG y UUG se emplean en raras ocasiones. El codón de iniciación no es simplemente un signo de puntuación; especifica un amino
ácido. En las bacterias AUG codifica un tipo modificado de metionina, la N-formilmetionina; todas las proteínas de las bacterias c
omienzan con este aminoácido, pero el grupo formil (o en algunos casos, todo el aminoácido) puede eliminarse después que la pro
teína se ha sintetizado. Cuando el codón AUG se encuentra en una posición interna de un gen, codifica la metionina no formilada.
En las arqueobacterias y las células eucariotas AUG especifica metionina no formilada, tanto en la posición de iniciación como en
las posiciones internas.

• Codones de terminación
Tres codones (UAA, UAG y UGA) no codifican aminoácidos. Estos codones señalan la terminación de la proteína, tanto en las ba
cterias como en las células eucariotas y se llaman codones de stop, codones de terminación o codones sin sentido. Ninguna moléc
ula de tRNA tiene anticodones que se apareen con los codones de terminación. NO EXISTEN tRNA CON ANTICODONES QUE S
E APAREEN CON ESTOS CODONES

• La universalidad del código


El código genético es casi universal. Solamente es universal para el material genético nuclear. El mismo varia muy levemente en
mitocondrias y en menor medida en cloroplastos.
También existen ciertas excepciones en los codones, principalmente en los de terminación.
Los aminoácidos codificados también difieren en ciertos organismos. Un aminoácido se lo considera como tal cuando el mismo pr
esenta un tRNA. Esto permite diferenciarlo de un aminoácido modificado covalentemente o intermediario.
Entre estos nuevos aminoácidos están:
• selenocisteina
• pirrolisina

INTERACCIÓN tRNA - mRNA

El mRNA por convención se escribe 5’  3’, por lo que interactúa con el tRNA de forma complementaria
La enzima encargada de cargar aminoácido al tRNA de manera especifica es la aminoacil tRNA sintetasa. Existe una sintetasa par
a cada aminoácido. Su especificidad esta dado porque reconoce al anticodón y/o al brazo aceptor de todos los tRNA que aceptan d
eterminado aminoácido.
La carga de aminoácidos al tRNA es el paso de regulación mas importante de la traducción, siendo considerado el segundo código
genético, debido a que es el único paso que garantiza que la traducción ocurra de manera fiel. Luego de esto, el proceso avanza p
or interacción codón – anticodón, de ahí su importancia.
Las tRNA sintetasas tienen actividad correctora de errores. Tiene varias formas de hacerlo:
• por hidrolisis del enlace éster de un aminoácidos que puede entrar al sitio activo pero que no es el correcto.
• por exclusión de tamaño, en el caso de que el aminoácido sea mas grande que el sitio activo.
• por características fisicoquímicas, como carga eléctrica o hidrofobicidad. Si el aminoácido no presenta las características correct
as será expulsado del sitio activo.

Finalmente, las proteinas se sintetizan alargando su extremo Ct, es decir, que el primer aminoácido que se codifica lo hace en dire
cción Nt – Ct, y la cadena se alarga a partir de su extremo Ct. De esta manera, un tripéptido es:
Nt-Ct  Nt-Ct  Nt-Ct

La reacción ocurre entre el grupo amino del aminoácido del sitio A y el grupo carboxilo del aminoácido del sitio P.

PROCESO GLOBAL DE LAS VIAS DE LA INFORMACIÓN GÉNICA

TRADUCCION DEL RNA EN PROCARIOTAS


El proceso de traducción
La traducción en las bacterias es similar, aunque existen algunas diferencias significativas, que la traducción en eucariotas.
La traducción ocurre en los ribosomas; de hecho, los ribosomas pueden pensarse como maquinarias en movimiento para la síntesis
de proteínas. Un ribosoma se une cerca del extremo 5’ de una cadena de mRNA y se mueve hacia el extremo 3’, y traduce los cod
ones a medida que avanza. La síntesis se inicia en el extremo amino (Nt) de la proteína, y la proteína se elonga por la adición de
nuevos aminoácidos al extremo carboxilo (Ct). La síntesis proteica puede dividirse, convenientemente, en cuatro etapas:
1) la unión de los aminoácidos a los tRNA.
2) la iniciación, en la que, los componentes requeridos para la traducción se ensamblan en el ribosoma.
- en procariotas: los ribosomas reconocen el inicio de la traducción cuando la subunidad menor interacciona con la secuencia SHI
NE-DELGARNO.
3) la elongación, en la cual se unen los aminoácidos, uno por vez, a la cadena polipeptídica creciente.
4) la terminación, en la que la síntesis proteica se detiene en el codón de terminación y los componentes de la traducción se liberan
del ribosoma.
ETAPA I: La unión de los aminoácidos a los RNA de transferencia
La primera etapa de la traducción es la unión de las moléculas de tRNA a sus aminoácidos adecuados. Cuando se encuentra ligado
a su aminoácido, el tRNA entrega el aminoácido al ribosoma, donde el anticodón del tRNA se aparea con un codón presente en el
mRNA. Este proceso permite que los aminoácidos se unan en el orden especificado por el mRNA. Entonces, la traducción adecu
ada requiere, en primer lugar, la unión correcta del tRNA y el aminoácido.
Una célula posee típicamente entre 30 y 50 tRNA distintos, y colectivamente, estos tRNA se unen a los 20 aminoácidos distintos.
Cada tRNA es específico para un tipo particular de aminoácido. Todos los tRNA tienen la secuencia CCA en el extremo 3’, y el gr
upo carboxilo (COO-) del aminoácido se encuentra unido al grupo hidroxilo 2’- o 3’- del nucleótido adenina presente en el extre
mo del tRNA.

• ¿De qué manera un tRNA se liga al aminoácido adecuado?


Cada tRNA es específico para un aminoácido en particular, pero todos los aminoácidos se encuentran unidos a un mismo nucleóti
do (A) en el extremo 3’ del tRNA.
La clave para la especificidad entre el aminoácido y su tRNA está en un conjunto de enzimas llamadas aminoacil-tRNA sintetasas.
Una célula tiene 20 aminoacil-tRNA sintetasas distintas, una para cada uno de los 20 aminoácidos. Cada sintetasa reconoce a un a
minoácido en particular, así como todos los tRNA que aceptan ese aminoácido. El reconocimiento del aminoácido apropiado por l
a acción de una sintetasa se basa en los diferentes tamaños, cargas y grupos R de los aminoácidos. Sin embargo, los tRNA son tod
os reconocidos por las distintas secuencias de nucleótidos características de los tRNA: el anticodón y/o el brazo aceptor.
La unión de un tRNA a su aminoácido adecuado (denominada carga del tRNA) requiere energía, que es provista por el adenosín tr
ifosfato (ATP):
aminoácido + tRNA + ATP  aminoacil-tRNA + AMP + PPi
Se separan dos fosfatos del ATP, y se produce adenosín monofosfato (AMP) y pirofosfato (PPi), como también el tRNA aminoaci
lado (el tRNA que se encuentra unido al aminoácido).
Para identificar el tRNA aminoacilado resultante se lo denota en una abreviatura de tres letras para el aminoácido que se encuentra
delante del tRNA; por ejemplo, el aminoácido alanina (Ala) se une a su tRNA (tRNAAla), surgiendo su aminoacil-tRNA (Ala-tRN
AAla). Los errores en el proceso de carga del tRNA son raros; ocurren solo con una frecuencia de entre 1 en 10k a 1 en 100k reacci
ones. Esta fidelidad se debe a la presencia de la actividad de corrección durante la lectura de las sintetasas, que detecta y elimina l
os aminoácidos incorrectamente apareados de los tRNA con los que se encuentran unidos.

ETAPA II: Iniciación de la traducción


La segunda etapa en el proceso de síntesis proteica es la iniciación. Durante la iniciación se ensamblan todos los componentes req
ueridos para la síntesis proteica:
1) el mRNA.
2) la subunidad grande y pequeña del ribosoma.
3) un conjunto de tres proteínas llamadas factores de iniciación.
4) el tRNA iniciador con la N- formil-metionina unida (fMet-tRNAfMet).
5) la guanosina trifosfato (GTP).
La iniciación abarca tres pasos centrales:
• en primer lugar, el mRNA se une a la subunidad pequeña del ribosoma.
• en segundo lugar, el tRNA iniciador se une al mRNA mediante apareamiento de bases entre el codón y el anticodón.
• tercero, la subunidad grande del ribosoma se une al complejo de iniciación.
Un ribosoma funcional existe en la forma de dos subunidades; la subunidad 30S pequeña y la subunidad 50S grande (en las bacter
ias). Cuando no se encuentra en un proceso de traducción activa, las dos subunidades se encuentran unidas. Una molécula de mR
NA puede unirse a la subunidad pequeña del ribosoma, solo cuando las subunidades están separadas.
El factor de iniciación 3 (IF-3) se une a la subunidad pequeña del ribosoma y evita que la subunidad grande se una durante la etap
a de iniciación.
Un segundo factor de iniciación el factor de iniciación 1 (IF-1) aumenta la disociación de las subunidades ribosómicas grande y pe
queña.
La secuencia clave en el mRNA necesaria para la unión del ribosoma tiene entre 30 y 40 nucleótidos de longitud e incluye el codó
n de iniciación AUG. Dentro del sitio de unión al ribosoma es la secuencia consenso de Shine-Dalgarno, que es complementaria c
on una secuencia de nucleótidos presentes en el extremo 3’ del rRNA 16S (parte de la subunidad pequeña del ribosoma). Durante l
a iniciación los nucleótidos presentes en la secuencia de Shine-Dalgarno se aparean con sus nucleótidos complementarios en el rR
NA 16S, lo que permite que la subunidad pequeña del ribosoma se una al mRNA y posicione al ribosoma directamente encima del
codón de iniciación. A continuación el fMet-tRNAfMet iniciador se une al codón de iniciación.
El codón de inicio se ubica sobre el sitio P del ribosoma directamente.
Este paso requiere el factor de iniciación 2 (IF-2), que forma un complejo con el GTP.
En este punto el complejo de iniciación consiste en:
1) la subunidad pequeña del ribosoma.
2) el mRNA.
3) el tRNA iniciador con su aminoácido (fMet-tRNAfMet)
4) una molécula de GTP
5) IF-3, IF-2; eIF-1.
Estos componentes se conocen colectivamente como el complejo de iniciación 30S.
En el paso final de la iniciación IF-3 se disocia de la subunidad pequeña, lo que permite que la subunidad grande del ribosoma se
una al complejo de iniciación. La molécula de GTP (proporcionada por el IF-2) se hidroliza a guanosina disfosfato (GDP), y IF-1
e IF-2 salen del complejo. Cuando la subunidad grande se ha unido al complejo de iniciación, se denomina complejo de iniciación
70S.

ETAPA III: Elongación


La siguiente etapa en la síntesis proteica es la elongación, en la cual los aminoácidos se unen para crear una cadena polipeptídica.
La elongación requiere:
1) el complejo 70S.
2) tRNA cargados con sus aminoácidos.
3) varios factores de elongación (EF-Ts, EF-Tu y EF-G).
4) GTP
Un ribosoma tiene tres sitios que pueden estar ocupados por tRNA;
• el sitio amínoacilo, o sitio A.
• el sitio peptidilo, o sitio P.
• el sitio de salida, o sitio E (exit).

El tRNA iniciador inmediatamente ocupa el sitio P (en eucariotas el único sitio al cual es capaz de unirse el fMet-tRNAfMet o Met-
tRNAMet) si bien, todos los otros tRNA primero entran al sitio A. Después de la iniciación el ribosoma se une al mRNA y el fMet-t
RNAfMet se posiciona por encima del codón de iniciación AUG en el sitio P; el sitio A adyacente permanece libre.
La elongación ocurre en tres pasos.
• Primer paso: Es la entrega del tRNA cargado (tRNA con su aminoácido unido) al sitio A. Esto requiere la presencia del factor d
e elongación Tu (EF-Tu), el factor de elongación Ts (EF-Ts) y el GTP. El EF-Tu, en primer lugar se une con el GTP y luego se un
e a un tRNA cargado para formar un complejo tripartito. Este complejo tripartito entra en el sitio A del ribosoma, donde el anticod
ón del tRNA se aparea con el codón del mRNA. Después de que el tRNA cargado se encuentra en el sitio A, el GTP se corta y for
ma GDP, y se libera el complejo EF-Tu-GDP. El factor EF-Ts regenera EF-Tu-GDP a EF-Tu-GTP. En las células eucariotas un c
onjunto de reacciones similares entrega el tRNA cargado al sitio A.
• Segundo paso: Es la creación de un enlace peptídico entre los aminoácidos, que están unidos a los tRNA, en los sitios P y A. La
formación de este enlace peptídico libera al aminoácido en el sitio P desde su tRNA. La actividad que explica la formación del enl
ace peptídico en el ribosoma es la de la peptidil-transferasa. La actividad catalítica es una propiedad del rRNA de la subunidad gra
nde del ribosoma; este rRNA actúa como una ribozima.
• El tercer paso: Es la translocación, el movimiento del ribosoma, hacia abajo, sobre el mRNA en la dirección 5’- 3’. Esta etapa p
osiciona el ribosoma encima del siguiente codón y requiere el factor de elongación G (EF-G) y la hidrólisis de GTP a GDP. Dado
que los tRNA en los sitios P y A aún se encuentran unidos al mRNA mediante el apareamiento codón-anticodón no se mueven co
n el ribosoma a medida de que éste se transloca. En consecuencia, el ribosoma se desplaza de modo que el tRNA que previamente
ocupaba el sitio P ahora ocupe el sitio E, desde el cual se mueve al citoplasma, lugar en el que puede volver a cargarse con otro a
minoácido. La translocación también provoca que el tRNA que ocupaba el sitio A (que se encuentra unido a la cadena polipeptídic
a creciente) esté en el sitio P, dejando el sitio A abierto.
De este modo el avance de cada tRNA a través del ribosoma, durante la elongación, puede resumirse de la siguiente manera:
Citoplasma  sitio A  sitio P  sitio E  citoplasma.
El tRNA iniciador es una excepción: se une directamente al sitio P y nunca ocupa el sitio A. Después de la translocación el sitio A
del ribosoma se vacía y queda listo para recibir el tRNA especificado por el codón siguiente.
El ciclo de elongación se repite: un tRNA cargado y su aminoácido ocupan un sitio A, se forma un enlace peptídico entre los amin
oácidos de los sitios A y P, y el ribosoma se transloca al codón siguiente. Durante todo el ciclo, la cadena polipeptídica permanec
e unida al tRNA en el sitio P. El ribosoma avanza sobre el mRNA en dirección 5’  3’, añadiendo aminoácidos, de uno por vez, d
e acuerdo con el orden especificado por la secuencia de codones del mRNA. La elongación en las células eucariotas ocurre en for
ma similar.

ETAPA IV: Terminación


La síntesis proteica termina cuando el ribosoma se transloca a un codón de terminación. Dado que no hay tRNA con anticodones c
omplementarios a los codones de terminación, no entra ningún tRNA al sitio A del ribosoma cuando se encuentra un codón de ter
minación. En lugar de ello las proteínas conocidas como factores de liberación se unen al ribosoma. E. coli tiene tres factores de li
beración: RF1 RF2, y RF3:
• el factor de liberación 1 reconoce a los codones de terminación UAA y UAG.
• RF2 reconoce UGA y UAA.
• el factor de liberación 3 forma un complejo con GTP y se une al ribosoma.
Los factores de liberación promueven, luego, el corte del tRNA presente en el sitio P y su separación de la cadena polipeptídica; e
n este proceso el GTP que forma complejo con el RF3 se hidroliza a GDP. Existen factores complementarios que colaboran en la l
iberación del tRNA desde el sitio P, la liberación del mRNA desde el ribosoma y la disociación del ribosoma.
Los factores de liberación llevan a cabo la terminación de la traducción al completar un ciclo final de elongación de la síntesis prot
eica. En este modelo RF1 y RF2, son semejantes en forma y tamaño a los tRNA que ocupan el sitio A del ribosoma, del mismo m
odo que lo efectúa el complejo aminoácido-tRNA-EF-Tu y GTP durante el ciclo de elongación. El factor de liberación 3 posee un
a estructura similar al EF-G; luego transloca RF1 o RF2 al sitio P, así como lo realiza con el último tRNA al sitio E, de forma sem
ejante a la manera en que lleva a cabo la translocación en EF-G. Cuando tanto el sitio A como el sitio P del ribosoma están libres
de tRNA, el ribosoma puede disociarse.

Con respecto a las Archeas, poseen una mezcla de rasgos de las bacterias y de las células eucariotas.
Dado que las arqueobacterias carecen de membrana nuclear la transcripción y la traducción ocurren simultáneamente al igual que
en las bacterias. Las arqueobacterias utilizan metionina no formilada como aminoácido iniciador, una característica de la traducció
n eucariota. Con respecto a las secuencias de DNA que codifican factores de iniciación y elongación en las arqueobacterias, algun
os son semejantes a las que se encuentran en las bacterias, mientras que otras son similares a las que se encuentran en los eucariota
s. Por último, parte de los antibióticos que inhiben la traducción en las bacterias carecen de efecto en la traducción de las arqueoba
cterias.

Polisomas o Polirribosomas
Tanto en las células procariotas como eucariotas, las moléculas de mRNA se traducen simultáneamente por acción de múltiples ri
bosomas. La estructura resultante (un mRNA con varios ribosomas unidos) se denomina polirribosoma. Cada ribosoma se une suc
esivamente al sitio que une ribosomas en el extremo 5’ del mRNA y se mueve hacia el extremo 3’; el polipéptido asociado con ca
da ribosoma progresivamente se torna más largo a medida que el ribosoma se mueve sobre el mRNA. En las células procariotas, l
a transcripción y la traducción son simultáneas; por tanto, pueden unirse múltiples ribosomas al extremo 5’ terminal del mRNA, m
ientras que la transcripción aún está en proceso en el extremo 3’.
A pesar de que la transcripción y la traducción no son procesos simultáneos en los eucariotas porque la transcripción ocurre en el
núcleo y toda la traducción ocurre en el citoplasma, puede ocurrir que parte de la traducción ocurra dentro del núcleo eucariota.

ACCION DE ANTIBIOTICOS SOBRE LA TRADUCCIÓN


Los antibióticos son drogas que matan microorganismos. Para que un antibiótico sea efectivo, debe eliminar los microbios sin dañ
ar al paciente. Los antibióticos deben elegirse en forma cuidadosa de modo que destruyan las bacterias, pero no las células eucario
tas de su huésped. La traducción es, a menudo, el blanco de los antibióticos porque ésta es esencial para todos los organismos vivo
s y difiere, en forma significativa, entre las bacterias y los eucariotas.
Una diferencia son los ribosomas bacterianos y eucariotas. Estos difieren en tamaño y composición. Varios antibióticos se unen, e
n forma selectiva, a los ribosomas bacterianos e inhiben varios pasos de la traducción, pero no aceptan los ribosomas eucariotas.
• las tetraciclinas son un tipo de antibióticos que se unen en el sitio A de los ribosomas bacterianos, y bloquean la entrada de los t
RNA cargados, si bien no tienen efecto alguno en los ribosomas eucariotas.
• la neomicina se une al ribosoma cerca del sitio A e induce errores de traducción, probablemente provocando errores en la unión
de los tRNA cargados al sitio A.
• el cloranfenicol se une a la subunidad grande del ribosoma y bloquea la formación del enlace peptídico.
• la estreptomicina, se une a la subunidad pequeña del ribosoma e inhibe la iniciación.
• la eritromicina bloquea la translocación.
Si bien el cloranfenicol y la estreptomicina son inhibidores potentes de la traducción bacteriana, no inhiben la traducción en las ar
queobacterias.
• la puromicina, debido a su estructura tridimensional que se asemeja al extremo 3’ de un tRNA cargado, ingresa al sitio A de un r
ibosoma en forma eficiente e inhiba la entrada de los tRNA. Puede formarse un enlace peptídico entre la puromicina del sitio A y
el aminoácido presente en el tRNA, que se encuentra en el sitio P del ribosoma, pero la puromicina no puede unirse al sitio P y la t
ranslocación no ocurre, con lo que se bloquea la elongación adicional de la proteína.
Dado que la estructura de los tRNA es semejante en todos los organismos la puromicina inhibe la traducción, tanto en las células b
acterianas como eucariotas, y en consecuencia, esta molécula mata a las células eucariotas junto con las bacterias y en ocasiones s
e usa en la terapia oncológica para destruir las células malignas.
Muchos antibióticos actúan bloqueando pasos específicos de la traducción, y diferentes antibióticos afectan diferentes etapas de la
síntesis proteica.
Dada su especificidad, los antibióticos se emplean con frecuencia para estudiar el proceso de síntesis de proteínas.

DETERMINACION EXPERIMENTAL: ETAPA DE LA SINTESIS PROTEICA QUE AFECTA UN DETERMINADO A

NTIBIOTICO

• iniciación: implica antes de que se arme el ribosoma


• elongación: cualquier evento despues del armado del ribosoma

DETERMINACION EXPERIMENTAL: PERFIL RIBOSOMICO


• wild type/inhibición de la elongación
• inhibición de la iniciación

TRADUCCION DEL RNA EN EUCARIOTAS: 8 DIFERENCIAS


En la iniciación de la traducción de las células eucariotas, ocurren sucesos similares, pero existen algunas diferencias importantes.
• En las bacterias, las secuencias presentes en el rRNA 16S de la subunidad pequeña del ribosoma, se unen a la secuencia de Shine
-Dalgarno del mRNA; esta unión posiciona el ribosoma encima del codón de iniciación.
En el mRNA eucariota no existe una secuencia consenso análoga. En lugar de ello, los ribosomas (la subunidad menor) reconocen
al CAP y a la cola poliA a través del factor de iniciación de la traducción eF4G, generando una estructura cerrada. Este interactúa
con eIF3 el cual interactúa con la subunidad menor del ribosoma. Luego la subunidad menor ribosomal se desliza hasta la posició
n AUG en un entorno adecuado, es decir, en el contexto de la secuencia de KOZAK.
• el código genético en las bacterias y en las células eucariotas es virtualmente idéntico; la única diferencia existe en cuanto al ami
noácido especificado por el codón de iniciación. En las bacterias AUG codifica un tipo modificado de metionina, la N-formilmetio
nina, mientras que, en los eucariotas, AUG codifica una metionina no formilada. Una consecuencia del hecho de que las bacterias
y los eucariotas empleen el mismo código es que los genes eucariotas pueden traducirse en los sistemas bacterianos y viceversa.
• La iniciación en los eucariotas requiere más factores de iniciación. Entre sus funciones:
- mantener las subunidades ribosómicas separadas, como lo hace el IF-3 en las bacterias.
- reconocimiento del CAP 5’ y de la cola poliA sobre el mRNA y permite que la subunidad pequeña del ribosoma se una allí.
- actividad de RNA helicasa, la que se emplea para desenrollar estructuras secundarias que pueden estar presentes en la región 5’ n
o traducida del mRNA, lo que permite que la subunidad pequeña se deslice sobre el mRNA hasta que se alcance el codón de inicia
ción.
- ayudan a llevar al tRNA iniciador y a la metionina (Met-tRNAMet) al complejo de iniciación.
• la cola de poli (A) presente en el extremo 3’ del mRNA eucariota también desempeña un papel en la iniciación de la traducción.
Las proteínas que se unen a la cola de poli(A) interactúan con las proteínas que se unen al CAP 5’, e incrementan la unión de la su
bunidad pequeña del ribosoma al extremo 5’ del mRNA. Esta interacción entre el CAP 5’ y la cola 3’ sugiere que el mRNA se cur
va hacia atrás durante la iniciación de la traducción para formar una estructura circular. Unos pocos mRNA eucariotas contienen si
tios de entrada interna para los ribosomas, en los cuales los ribosomas pueden unirse en forma directa, sin necesidad de estar unid
os previamente, al CAP 5’.

Otras diferencias importantes:


• la traducción en las células eucariotas termina en forma semejante al de las células procariotas, excepto por el hecho de que exist
en dos factores de liberación; eRF1, que reconoce a los tres codones de terminación, y eRF2, que se une al GTP y estimula la liber
ación del polipéptido desde el ribosoma. Alguna de las secuencias del rRNA desempeñan un papel en el reconocimiento de los co
dones de terminación.
• la transcripción y la traducción ocurren simultáneamente en las bacterias, pero la envoltura nuclear puede separar estos procesos
en las células eucariotas. La separación física de la transcripción y la traducción tiene importantes consecuencias para el control de
la expresión genética y permite una extensa modificación de los mRNA eucariotas.
• el mRNA de las bacterias es de vida corta, típicamente dura solo unos pocos minutos, pero la longevidad del mRNA en las célul
as eucariotas es altamente variable y con frecuencia resulta de horas o días. Así, la síntesis de una proteína bacteriana en particular
cesa muy rápidamente después de que se detiene la transcripción del mRNA correspondiente, pero la síntesis proteica en los euca
riotas puede continuar mucho después de que la transcripción haya finalizado. Tanto en las bacterias como en las células eucariota
s las aminoacil-tRNA sintetasas unen aminoácidos a sus tRNA adecuados y la reacción química que se emplea es la misma.
• existen diferencias notables en cuanto a los tamaños y la composición de las subunidades ribosómicas de las bacterias y las célul
as eucariotas.

TRAFICO DE PROTEINAS PROCARIOTAS


La pared celular que rodea a las bacterias Gram negativas comprende una membrana interna, que es la barrera de permeabilidad pr
incipal para el citoplasma, un espacio periplasmático que contiene diversas proteínas, y una capa de peptidoglicano y una membra
na externa permeable a las moléculas pequeñas pero no a las proteínas. La capa de peptidoglicano confiere rigidez a la pared celul
ar, mientras las proteínas periplasmáticas detectan e incorporan moléculas extracelulares y participan en el ensamblaje y el manten
imiento de la integridad estructural de la pared celular. Estas proteínas (como todas las proteínas bacterianas) se sintetizan en los ri
bosomas citosólicos y luego son translocadas desplegadas a través de la membrana interna (también llamada membrana citoplasm
ática). La mayoría de las proteínas translocadas a través de la membrana interna permanecen asociadas con la célula bacteriana, ya
sea como proteínas de membrana insertadas en la membrana externa o interna o atrapadas dentro del espacio periplasmático. Alg
unas especies bacterianas también poseen sistemas especializados de translocación que permiten a las proteínas pasar a través de a
mbas membranas de la pared celular al espacio extracelular.

La ATPasa citosólica SecA empuja los polipéptidos bacterianos a través de los translocones hacia el espacio periplasmático
El mecanismo de translocación de las proteínas bacterianas a través de la membrana interna comparte varias características import
antes con la translocación de proteínas en el RE de las células eucariotas.
• Primero, las proteínas translocadas poseen casi siempre una secuencia de señalización hidrófoba en el N-terminal que es elimina
da por una peptidasa de señal.
• Segundo, las proteínas bacterianas atraviesan la membrana interna por un canal, o translocón, compuesto de proteínas estructural
mente similares al complejo Sec6 1 de los eucariotas.
• Tercero, las células bacterianas expresan dos proteínas, Ffh y su receptor (FtsY), que son las homólogas de la SRP y del receptor
de SRP, respectivamente.
Sin embargo, en las bacterias, estas últimas proteínas parecen funcionar principalmente en la inserción de proteínas de membrana
hidrófobas en la membrana interna. De hecho, todas las proteínas bacterianas que son translocadas a través de la membrana intern
a sólo lo hacen después de terminada su síntesis en el citosol, pero antes de que se plieguen para adoptar su estructura final.

TRANSLOCACIÓN POST-TRADUCCIONAL
SecA impulsa la translocación postraduccional de las proteínas bacterianas
La energía que dirige la translocación de proteínas bacterianas es generada por SecA, que se une aliado citosólico del translocón e
hidroliza el ATP citosólico.
SecA se une al polipéptido desplegado que se está translocando y luego un cambio de conformación del SecA, impulsado por la e
nergía liberada de la hidrólisis del ATP, empuja el segmento de polipéptido unido a través del poro del translocón hacia el lado pe
riplasmático de la membrana. La repetición de este ciclo empuja finalmente toda la cadena polipeptídica a través del translocón ha
cia el espacio periplasmático, donde se forman los puentes disulfuro y el polipéptido se pliega para adoptar su estructura apropiada
.
Varios mecanismos translocan las proteínas bacterianas hacia el espacio extracelular.
Para translocar las proteínas bacterianas desde el citosol a través de las membranas bacterianas interna y externa al espacio extrace
lular se usan mecanismos bastante diferentes. Estos mecanismos de secreción son muy importantes en las bacterias patógenas, que
suelen utilizar la secreción de proteínas extracelulares para colonizar tejidos específicos dentro del huésped y evadir los mecanis
mos de defensa. Los sistemas especializados de secreción bacteriana pueden clasificarse en cuatro tipos generales, de acuerdo con
su mecanismo de acción.
Los sistemas de secreción tipo 1 y tipo II constan de dos pasos:
• Primero, las proteínas sustrato son translocadas a través de la membrana interna hacia el espacio periplasmático, donde se pliega
n y a menudo adquieren puentes disulfuro.
• Segundo, las proteínas plegadas son translocadas desde el espacio periplasmático a través de la membrana externa por complejos
de proteínas periplasmáticas que atraviesan las membranas interna y externa. La energía necesaria para esta translocación provien
e de la hidrólisis del ATP en el citosol, pero los mecanismos que acoplan la hidrólisis del ATP y la translocación a través de la me
mbrana externa no se conocen bien.
Por otro lado, la translocación por los sistemas de secreción tipos III y IV tiene lugar en un solo paso:
Estos sistemas consisten en grandes complejos de proteína que atraviesan ambas membranas que permiten la translocación directa
de las proteínas desde el citosol al ambiente extracelular. El sistema tipo III no sólo está adaptado para secretar proteínas, sino ta
mbién para inyectarlas en las células diana, una propiedad muy útil para las bacterias patógenas.

TRAFICO DE PROTEINAS EUCARIOTAS


La inmensa mayoría de las proteínas eucariotas es sintetizada por los ribosomas del citosol y muchas permanecen dentro de él. Sin
embargo, casi la mitad de los diferentes tipos de proteínas producidos en una célula típica son enviadas a una membrana celular e
n particular, a un compartimiento acuoso distinto del citosol o a la superficie celular para su secreción.
Todas las proteínas producidas por una célula deben alcanzar sus localizaciones correctas para que la célula funcione adecuadame
nte. El envío de las proteínas recién sintetizadas a sus destinos celulares adecuados, denominado direccionamiento o clasificación
de proteínas, abarca dos tipos muy diferentes de procesos generales.
• el primero comprende el envío de una proteína a la membrana de un organela intracelular y puede ocurrir durante la síntesis de la
proteína por traducción en los ribosomas (co-traduccional) o poco después (post-traduccional). En el caso de las proteínas de me
mbrana, el direccionamiento lleva a la inserción de la proteína dentro de la bicapa lipídica de la membrana, en tanto que en las pro
teínas hidrosolubles se produce la translocación de toda la proteína a través de la membrana hacia el interior acuoso del organela.
Mediante este proceso general se distribuyen proteínas a:
- el retículo endoplasmático (RE), generalmente co-traduccional.
- las mitocondrias, a los cloroplastos, a los peroxisomas y al núcleo, generalmente post-traduccional.
• las proteínas que inicialmente están destinadas a la membrana del RE sufren un segundo proceso general de distribución por el c
ual ingresan en la vía secretoria. Estas proteínas incluyen:
- proteínas solubles y de membrana que forman parte del propio RE.
- proteínas que se secretan de la célula.
- las enzimas y otras proteínas residentes en la luz del complejo de Golgi y de los lisosomas.
- las proteínas que forman parte integral de las membranas de estas organelas y de la membrana plasmática.
El direccionamiento al RE suele involucrar proteínas nacientes, todavía en proceso de síntesis (co-traduccional).
La vía secretoria distribuye, mediante vesículas, proteinas a:
- aparato de Golgi
- lisosomas
- superficie celular
A lo largo de la vía secretoria, brotan vesículas pequeñas de la membrana de una organela y luego se fusionan con la membrana de
la siguiente organela de la vía.
La distribución de proteínas mediada por vesículas difiere significativamente del direccionamiento de proteínas a las membranas d
e las organelas intracelulares.

Las proteínas son dirigidas a la membrana de las organelas intracelulares y se insertan en la membrana de la organela o se desplaz
an hacia su interior. Los mecanismos básicos que gobiernan la distribución de proteínas a todos las organelas intracelulares son id
énticos.
La información para dirigir una proteína a un destino u organela en particular está codificada dentro de la secuencia de aminoác
idos de la propia proteína, casi siempre en secuencias de 20 a 50 aminoácidos conocidas genéricamente como secuencias de seña
lización, o secuencias de captación-direccionamiento, mas comúnmente conocido como péptido-señal.
Cada organela posee un conjunto de proteínas receptoras que sólo se unen a tipos específicos de secuencias de señalización, lo que
asegura así que la información codificada en una secuencia de señalización determina la especificidad del direccionamiento. Una
vez que una proteína que contiene una secuencia de señalización ha interactuado con el receptor correspondiente, la cadena de pro
teína es transferida a algún tipo de canal de translocación o translocón que le permite a la proteína atravesar la bicapa de la membr
ana. La transferencia en una sola dirección de una proteína hacia el interior de un organela, sin reflujo hacia el citoplasma, se logra
acoplando la translocación a un proceso energéticamente favorable, como la hidrólisis del ATP. Algunas proteínas son luego dirig
idas para alcanzar un subcompartimiento dentro de la organela diana; este direccionamiento depende de otras secuencias de señali
zación y de otras proteínas receptoras.
Por último, las secuencias de señalización a menudo son eliminadas de la proteína madura por proteasas específicas una vez que s
e completa la translocación a través de la membrana.
En resumen, un polipéptido se libera en el citosol. Sin embargo, no todas las proteinas tienen funcionalidad allí. Existe una señal
en la secuencia de aminoácidos que dice donde debe dirigirse.
• Hay proteinas que terminan en el lumen del RE, el cual son translocadas co-traduccionalmente.
• Hay proteinas que terminan en las mitocondrias, cloroplastos, peroxisomas y en el núcleo, que son translocadas post-traduccio
nalmente.
• Hay proteinas que terminan en el citosol las cuales se sintetizan allí mismo y no presentan señal de direccionamiento.

TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
Translocación de proteínas secretorias a través de la membrana del RE
Todas las células eucariotas usan en esencia la misma vía secretoria para sintetizar y distribuir las proteínas secretadas y las proteí
nas luminales solubles en el RE, el complejo de Golgi y los lisosomas, llamadas en conjunto proteínas secretorias. Aunque todas l
as células secretan diversas proteínas, ciertos tipos de células están especializadas en la secreción de grandes cantidades de proteín
as específicas.
Las células del ácino pancreáticos sintetizan cantidades grandes de varias enzimas digestivas que desembocan en el intestino. Debi
do a que este tipo de células secretorias contienen los organelas de la vía secretoria en gran abundancia, son usados como modelo
para el estudio de esta vía.
En experimentos de pulso y lavado en estas células, se observo que los aminoácidos marcados radiactivamente se incorporan fund
amentalmente en las proteínas secretorias recién sintetizadas. Los ribosomas que sintetizan estas proteínas están realmente unidos
a la superficie del RE. Como consecuencia, la parte del RE que recibe las proteínas que ingresan en la vía secretoria se conoce co
mo RE rugoso (RER) porque estas membranas están densamente asociadas con ribosomas. Cuando las células se homogeneizan, e
l RER se fragmenta en pequeñas vesículas cerradas, denominadas microsomas rugosos, con la misma estructura (ribosomas por fu
era) que se encuentra en la célula intacta. Aunque las proteínas secretorias se sintetizan en los ribosomas unidos a la superficie cito
sólica de la membrana del RE, se encuentran en la luz de las vesículas del RE durante su síntesis.

Una secuencia de señalización N-terminal hidrófoba dirige las proteínas secretorias nacientes hacia el RE
Después de que la síntesis de una proteína secretoria empieza en los ribosomas libres en el citosol, una secuencia de señalización d
e 16 a 30 residuos de aminoácidos en la proteína naciente dirige el ribosoma hacia la membrana del RE y comienza la translocació
n del polipéptido en desarrollo a través de ella. La secuencia de señalización para el RE se localiza en el N-terminal de la proteín
a, que es la primera parte de la proteína que se sintetiza. Las secuencias de señalización de diferentes proteínas secretorias contie
nen uno o más aminoácidos con carga positiva adyacentes a una cadena continua de 6 a 12 residuos hidrófobos (núcleo). En la ma
yor parte de las proteínas secretorias, la secuencia de señalización se separa de la proteína mientras todavía está creciendo en el rib
osoma; por consiguiente, las secuencias de señalización no están casi nunca presentes en las proteínas "maduras" de las células. El
núcleo hidrófobo de las secuencias de señalización hacia el RE es esencial para su función.
Deleciones específicas de varios aminoácidos hidrófobos de una secuencia de señalización, o la introducción por mutación de ami
noácidos cargados en el núcleo hidrófobo pueden abolir la capacidad del N-terminal de una proteína para funcionar como secuenci
a de señalización. Como consecuencia, la proteína modificada permanece en el citosol, incapaz de atravesar la membrana del RE h
acia su luz. Mediante técnicas de DNA recombinante, se han producido proteínas citosólicas con secuencias de aminoácidos agreg
adas al N-terminal. Si la secuencia agregada es suficientemente larga e hidrófoba, esta proteína citosólica modificada es translocad
a a la luz del RE. Por lo tanto, los residuos hidrófobos del núcleo de las secuencias de señalización hacia el RE representan un siti
o de unión que es crítico para la interacción de las secuencias de señalización con las proteínas receptoras de la membrana del RE.
En sistemas de síntesis de proteínas libre de células, con mRNA que codifica una proteína secretoria y microsomas despojados d
e sus propios ribosomas unidos, han comprobado que una proteína secretoria típica es incorporada a los microsomas y su secuen
cia de señalización es eliminada sólo si hay microsomas presentes durante la síntesis de la proteína.
Los microsomas deben agregarse antes de que se unan los primeros 70 aminoácidos aproximadamente, para que la proteína secret
oria completa se localice en la luz del microsoma. En ese momento, han surgido del ribosoma aproximadamente los primeros 40 a
minoácidos, incluida la secuencia de señalización que después será eliminada, y los siguientes 30 aminoácidos todavía se encuentr
an ocultos dentro del canal del ribosoma. Por consiguiente, el transporte de la mayoría de las proteínas secretorias hacia la luz del
RE ocurre mientras la proteína naciente todavía está unida al ribosoma y está sufriendo su elongación, proceso denominado transl
ocación cotraduccional.

La translocación cotraduccional es iniciada por dos proteínas que hidrolizan GTP


Dado que las proteínas secretorias se sintetizan en asociación con la membrana del RE, pero no con cualquier otra membrana celul
ar, debe existir un mecanismo de reconocimiento de la secuencia de señalización que las dirige hacia allí. Los dos componentes pr
incipales de este direccionamiento son la partícula de reconocimiento de la señal (signal-recognítion particle, SRP) y su receptor, l
ocalizado en la membrana del RE:
• la SRP es una partícula de ribonucleoproteína citosólica que se une de manera temporaria y simultánea a la secuencia de señaliza
ción hacia el RE de una proteína naciente, a la unidad grande del ribosoma y al receptor de SRP. La SRP está formada por seis pol
ipéptidos definidos y un RNA de 300 nucleótidos. La proteína P54 es la subunidad que se une a la secuencia de señalización en un
a proteína secretoria naciente. Dos de las proteínas SRP, la P9 y la P14, interactúan con el ribosoma, mientras la P68 y la P72 son
necesarias para la translocación de la proteína. En el sistema de traducción libre de células, la presencia de SRP retarda la elonga
ción de una proteína secretoria cuando no hay microsomas presentes, inhibiendo así la síntesis de la proteína completa.
La interacción del SRP con la cadena naciente de una proteína secretoria y con el ribosoma libre impide que la cadena naciente se
a demasiado larga para la translocación en el RE. Sólo después de que el complejo SRP/cadena naciente/ribosoma se ha unido al r
eceptor de SRP en la membrana del RE la SRP libera la cadena naciente y permite su elongación a la velocidad normal.
• el receptor de SRP es una proteína integral de la membrana compuesto de dos subunidades: una subunidad alfa y una subunidad
beta de menor tamaño. El tratamiento de los microsomas con cantidades muy pequeñas de proteasas corta la subunidad alfa muy c
erca de su sitio de unión a la membrana y libera una forma soluble del receptor SRP. Los microsomas tratados con proteasa son in
capaces de ligar el complejo SRP/cadena naciente/ribosoma o de soportar la translocación cotraduccional. Sin embargo, el frag
mento soluble del receptor SRP conserva su capacidad para interactuar con el complejo SRP/cadena naciente/ribosoma, lo que p
roduce la liberación de la SRP y permite la elongación de la cadena.
Por lo tanto, la SRP y el receptor de SRP no sólo facilitan la interacción de una proteína secretoria naciente con la membrana de
l RE, sino que también actúan en conjunto para permitir la elongación y la síntesis de proteínas completas sólo cuando hay memb
ranas de RE presentes.
La función de la SRP y del receptor de SRP es llevar los ribosomas que sintetizan proteínas secretorias hacia la membrana del RE.
El GTP presenta dos funciones:
• Por un lado, la asociación de la hidrólisis de GTP con este proceso de direccionamiento contribuye a la fidelidad con la que se
reconocen las secuencias de señalización.
La energía de la hidrólisis de GTP se usa para liberar proteínas que carecen de las secuencias de señalización apropiadas del comp
lejo SRP y del receptor de SRP, lo que impide su direccionamiento erróneo hacia la membrana del RE.
• Además, la interacción del complejo SRP/cadena naciente/ribosoma con el receptor de SRP es estimulada cuando el GTP se un
e a la subunidad P54 de la SRP y a la subunidad alfa del receptor de SRP.
En este caso, la energía de la hidrolisis de GTP se usa para la transferencia de la cadena naciente y del ribosoma a un sitio en la m
embrana del RE en el que puede tener lugar la translocación.
Después de disociarse, la SRP y su receptor liberan el GDP unido y se reciclan hacia el citosol para comenzar otra ronda de intera
cción entre ribosomas que sintetizan proteínas secretorias nacientes con la membrana del RE.

El pasaje de los polipéptidos nacientes a través del translación es impulsado por la energía liberada durante la traducción
Una vez que la SRP y su receptor han dirigido un ribosoma que está sintetizando una proteína secretoria a la membrana del RE, el
ribosoma y la cadena naciente son rápidamente transferidos al translocón, un canal revestido de proteínas que se encuentra dentro
de la membrana. A medida que continúa la traducción, la cadena naciente pasa directamente de la subunidad grande del ribosoma
al poro central del translocón. La subunidad 60S del ribosoma se alinea con el poro del translocón de tal manera que la cadena n
aciente nunca queda expuesta al citoplasma y no se pliega hasta que alcanza la luz del RE.
Cuando los microsomas presentes en el sistema de translocación libre de células se reemplaza por vesículas de fosfolípidos recons
tituidas que contenían sólo el receptor de SRP y el complejo Sec6 1 (monómero constituyente del translocón), la proteína secretori
a naciente fue translocada desde su complejo SRP/ribosoma hacia el interior de las vesículas. El receptor de SRP y el complejo Se
c6 1 son las únicas proteínas de la membrana del RE absolutamente necesarias para la translocación. Por lo tanto, la energía produ
cida por la elongación de la cadena en el ribosoma parece ser suficiente para empujar la cadena polipeptídica a través de la membr
ana en una sola dirección. Múltiples copias del complejo Sec6 1 se agrupan para formar un canal translocón, lo que puede visualiz
arse por microscopia electrónica.
Si los translocones siempre estuvieran abiertos en la membrana del RE, sobre todo en ausencia de ribosomas adheridos y de un pol
ipéptido en translocación, las moléculas pequeñas como el ATP y los aminoácidos podrían difundirse libremente a través del poro
central. Para mantener la barrera de permeabilidad de la membrana del RE, el translocón está regulado de tal forma que sólo está a
bierto cuando se le une un complejo cadena naciente/ribosoma. Por lo tanto, el translocón es un canal similar a los canales iónicos.
Cuando el translocón se abre por primera vez, un asa de la cadena naciente, que contiene la secuencia de señalización y aproxima
damente 30 aminoácidos adyacentes, puede introducirse en el poro del translocón.
El mecanismo por el que el canal del translocón se abre y se cierra pueden ser las siguientes:
• una proteína de la luz del RE bloquea el poro del translocón cuando no hay un ribosoma unido del lado citosólico del translocón.
• los complejos Sec6 1 pueden encontrarse normalmente en la membrana del RE en un estado no ensamblado y que el proceso de
compuerta involucra la formación de un canal de translocón en el sitio de la membrana al que son transportados el ribosoma y la c
adena naciente por la SRP y el receptor de SRP. A medida que la cadena polipeptídica creciente entra en la luz del RE, la secuenci
a de señalización es eliminada por la peptidasa de señal, una proteína transmembrana del RE asociada con el translocón. Esta prot
easa reconoce una secuencia en el Ct del núcleo hidrófobo del péptido señal y corta específicamente la cadena en esta secuencia u
na vez que emerge al espacio luminal del RE. Después de la separación de la secuencia de señalización, el polipéptido creciente p
asa a través del translocón hacia la luz del RE. El translocón permanece abierto hasta que la traducción se completa y toda la cade
na polipeptídica ha pasado a la luz del RE.

Receptores KDEL
Las proteinas que terminan en el RE son transportadas en vesículas hacia la membrana plasmática donde allí se fusionan con la mi
sma. Previo, las vesículas deben dirigirse hacia el cis-Golgi, la region interna y mas próxima al RE.
Las proteinas que se encuentran dentro de las vesículas, al fusionarse con la membrana plasmática son liberadas al exterior celular
(estas proteinas son las secretorias), mientras que si la proteinas se mantienen ancladas a la membrana vesicular, cuando la vesícu
la se fusione con la membrana plasmática, la proteina formara parte de las proteinas de transmembrana.
Para regular el flujo de vesículas, existe un sistema anterógrado, que regula el transporte de vesicular del RE al Golgi, y uno retrog
rado, donde las proteinas que hayan llegado al Golgi, y presenten una señal de retención, la KDEL, volverá hacia el RE.
El transporte anterógrado desde el RE al Golgi, el cuál es el primer paso en la vía secretoria está mediado por las vesículas COPII,
mientras que en el transporte retrógrado es inverso, es decir, desde el cis-Golgi al RE e intervienen las vesículas COPI.
Este transporte vesicular retrógrado sirve para que el RE recuperar proteínas y membrana para proveer el material necesario para c
iclos adicionales de gemación vesicular del RE.
El transporte retrógrado mediado por COPI también recupera proteínas residentes del RE desde el cis-Golgi para corregir errores d
e clasificación. Las proteínas que se entregaron correctamente al Golgi avanzan a través de sucesivos compartimientos del Golgi
mediante progresión cisternal.
Papel del receptor de KDEL en la recuperación desde el Golgi de las proteínas luminales residentes en el RE:
Las proteínas luminales del RE, sobre todo las presentes en altos niveles, pueden ser incorporadas en forma pasiva en las vesículas
COPII y transportadas hacia el Golgi. Muchas de tales proteínas portan una secuencia KDEL C-terminal que les permite retornar.
El receptor de KDEL, localizado principalmente en la red cis-Golgi y tanto en las vesículas COPII como en las COPI, une proteín
as que portan la señal de clasificación KDEL y las regresa hacia el RE. Este sistema de devolución evita el agotamiento de las prot
eínas luminales del RE como las que se necesitan para el plegamiento apropiado de las proteínas secretorias recién sintetizadas. La
afinidad de unión del receptor de KDEL es muy sensible al pH. La pequeña diferencia entre el pH del RE y el del Golgi favorece
la fijación de las proteínas que portan KDEL al receptor en las vesículas derivadas del Golgi y su liberación en el RE.

Inserción de proteínas en la membrana del RE


Las proteínas integrales localizadas en las membranas del RE, del Golgi y los lisosomas y en la membrana plasmática, que se sinte
tizan en el RER, permanecen incluidas en la membrana cuando se desplazan a sus destinos finales siguiendo la misma vía de las p
roteínas secretorias solubles. Durante este transporte, se conserva la orientación de las proteínas de membrana; es decir, los mismo
s segmentos de la proteína siempre enfrentan el citosol, mientras otros segmentos siempre están dirigidos en la dirección opuesta.
En el RE se sintetizan varias clases topológicas de proteínas integrales de membrana
La topología de una proteína de membrana se refiere al número de veces que su cadena polipeptídica atraviesa de lado a lado la m
embrana y la orientación de estos segmentos transmembrana dentro de la membrana. Los elementos clave de una proteína que det
erminan su topología son los propios segmentos transmembrana, que suelen contener de 20 a 25 aminoácidos hidrófobos. Cada un
o de estos segmentos forma una hélice que atraviesa totalmente la membrana, con sus residuos de aminoácidos hidrófobos fijos al
interior hidrófobo de la bicapa de fosfolípidos.
Las proteínas integrales de membrana se clasifican en cuatro clases topológicas:
• las clases topológicas I, II y III comprenden proteínas de un solo paso, que tienen un solo segmento helicoidal alfa que atraviesa
la membrana.
• proteínas tipo I: tienen una secuencia de señalización cortada en el N-terminal y están ancladas en la membrana, con su región
N hidrófila hacia la cara luminal (también conocida como cara exoplásmica) y su región C hidrófila hacia la cara citosólica.
• proteínas tipo II: no contienen una secuencia de señalización separable y se orientan con su región N hidrófila hacia el citosol y
su región e hidrófila hacia la cara exoplásmica (es decir, una orientación inversa a las proteínas tipo I).
• proteínas tipo III: tienen la misma orientación que las proteínas tipo I, pero no contienen una secuencia de señalización separab
le.
Estas diferentes topologías reflejan los distintos mecanismos usados por la célula para establecer la orientación dentro de la memb
rana de los segmentos transmembrana.
Las proteínas que forman la clase tipo IV contienen muchos segmentos transmembrana. Muchas de las proteínas de transporte de
membrana y los numerosos receptores unidos a la proteína G pertenecen a esta clase, llamadas a veces proteínas de pasaje múltipl
e.
Un tipo final de proteína de membrana carece totalmente de un segmento hidrófobo transmembrana; en cambio, estas proteínas se
unen a un ancla de fosfolípido anfipático incluida en la membrana.

Proteínas tipo I:
Una secuencia de aproximadamente 22 aminoácidos hidrófobos existente en el medio de la proteína tipo I detiene la transferencia
de la cadena naciente a través del translocón. Debido a sus características hidrófobas, esta secuencia interna puede desplazarse late
ralmente entre las subunidades de proteína que forman la pared del translocón y queda anclada en la bicapa de fosfolípidos de la m
embrana, donde permanece. Por su función dual, esta secuencia se denomina secuencia de detención de transferencia y anclado. U
na vez interrumpida la translocación, la traducción continúa en el ribosoma que todavía está fijo al ahora vacío y cerrado translocó
n. A medida que se sintetiza el C-terminal de la cadena de la proteína, forma un asa en el lado citosólico de la membrana. Cuando
termina la traducción, el ribosoma se separa del translocón y el C-terminal de la proteína tipo I recién sintetizada queda en el citos
ol.

Proteínas tipo II y tipo III:


Las proteínas tipo II y tipo III carecen de una secuencia de señalización hacia el RE separable en el N-terminal. En cambio, ambas
poseen una sola secuencia de señalización-anclaje interna hidrófoba que funciona al mismo tiempo como secuencia de señalizaci
ón al RE y secuencia de anclaje a la membrana. Las proteínas tipo II y tipo III tienen una orientación opuesta dentro de la membra
na; esta diferencia depende de la orientación que sus respectivas secuencias de señalización-anclaje asumen dentro del translocón.
La secuencia de señalización-anclaje interna en las proteínas tipo II dirigen la inserción de la cadena naciente en la membrana del
RE de tal forma que el N-terminal de la cadena enfrente al citosol. La secuencia de señalización-anclaje interna no es cortada y pe
rmanece dentro del translocón mientras la región del C-terminal de la cadena naciente es empujada hacia la luz del RE por translo
cación simultánea con la traducción. Durante la síntesis, la secuencia de señalización-anclaje se desplaza lateralmente entre las su
bunidades de proteína que forman la pared del translocón hacia la bicapa de fosfolípidos, donde funciona como un ancla de memb
rana.
En las proteínas tipo III, la secuencia de señalización-anclaje que se localiza cerca del N-terminal inserta la cadena naciente en la
membrana del RE con el N-terminal enfrentando la luz, exactamente al contrario que las proteínas tipo II. La secuencia de señaliz
ación-anclaje de las proteínas tipo III también previene la extrusión adicional de la cadena naciente hacia la luz del RE y funciona
como una secuencia de detención de transferencia. La elongación continua del C-terminal de la cadena hasta la secuencia de señali
zación-anclaje/detención de la transferencia tiene lugar como en las proteínas tipo I; la secuencia hidrófoba se desplaza lateralmen
te entre las subunidades del translocón para fijar el polipéptido a la membrana del RE. Una de las características de las secuencias
de señalización-anclaje que parecen determinar su orientación de inserción es la alta concentración de aminoácidos cargados positi
vamente adyacente a un extremo del segmento hidrófobo. Estos residuos cargados positivamente tienden a permanecer del lado cit
osólico de la membrana, lo que determina la orientación de la secuencia de señalización-anclaje dentro del translocón.
Por lo tanto, las proteínas tipo II tienden a tener residuos cargados positivamente en el lado del N-terminal de su secuencia de se
ñalización-anclaje, en tanto que las proteínas tipo III tienden a tenerlos en el lado del C-terminal.

Proteínas tipo IV:


Las proteínas de pasaje múltiple pertenecen a uno de dos tipos, según el N-terminal se encuentre en el citosol o en el espacio exopl
asmático (es decir, la luz del RE, el exterior de la célula). Esta topología del N-terminal suele estar determinada por el segmento hi
drófobo adyacente al N-terminal y por la carga de las secuencias que lo flanquean:
• si una proteína tipo IV tiene un número par de hélices alfa transmembrana, sus N-terminales y C-terminales quedan orientados h
acia el mismo lado de la membrana.
• si una proteína tipo IV tiene un número impar de hélices alfa, sus dos extremos tendrán orientaciones opuestas.

TRANSLOCACIÓN POST-TRADUCCIONAL
La hidrólisis del ATP impulsa la translocación postraduccional de algunas proteínas secretorias en las levaduras
En la mayoría de las eucariotas, las proteínas secretorias entran en el RE por translocación simultánea con la traducción, usando la
energía derivada de la traducción para atravesar la membrana. Sin embargo, en las levaduras, algunas proteínas secretorias ingres
an en la luz del RE después de que se completa la traducción. En este tipo de translocación postraduccional, la proteína translocad
a atraviesa el mismo translocón de Sec6 1 que se usa en la translocación simultánea a la traducción. Sin embargo, la SRP y el rece
ptor de SRP no participan en la translocación postraduccional y en estos casos la interacción directa entre el translocón y la secu
encia de señalización de la proteína completada parece ser suficiente para el direccionamiento hacia la membrana del RE. Adem
ás, la fuerza necesaria para la translocación unidireccional a través de la membrana del RE es proporcionada por un complejo de p
roteínas adicional, conocido como complejo Sec6 3 y un miembro de la familia de chaperonas conocido como BiP. El complejo te
tramérico Sec6 3 está incluido en la membrana del RE en la vecindad del translocón, mientras que BiP se encuentra en la luz del R
E. BiP tiene un dominio ligador de péptidos y un dominio ATPasa. Estas chaperonas se unen y estabilizan proteínas desplegadas o
parcialmente plegadas.
El modelo actual para la translocación postraduccional de una proteína hacia el RE es el siguiente:
• una vez que el segmento del N-terminal de la proteína ingresa en la luz del RE, la peptidasa de señal corta la secuencia de señaliz
ación de la misma forma que en la translocación cotraduccional.
• la interacción BiP-ATP con la porción luminal del complejo Sec6 3 produce la hidrólisis del ATP unido a él, lo que determina u
n cambio de conformación en el BiP que promueve su unión a la cadena polipeptídica expuesta.
• dado que el complejo Sec6 3 está localizado cerca del translocón, el BiP se activa en los sitios en los que los polipéptidos nacient
es pueden entrar en el RE.
• en ausencia de unión al BiP, un polipéptido desplegado se desliza de un lado a otro dentro del canal del translocón. Estos movim
ientos de deslizamiento al azar rara vez hacen que todo el polipéptido atraviese la membrana del RE. La unión de una molécula de
BiP-ADP a la porción luminal del polipéptido impide que el polipéptido se deslice fuera del RE.
• a medida que los movimientos de deslizamiento adicionales al azar exponen una mayor porción del polipéptido en el lado lumin
al de la membrana del RE, la unión sucesiva de moléculas de BiP-ADP a la cadena polipeptídica actúa como retén y tracciona fina
lmente todo el polipéptido dentro del RE. Las moléculas de BiP intercambian espontáneamente su ADP por ATP, lo que produce l
a liberación del polipéptido, que puede plegarse para adoptar su estructura nativa.
• el BiP-ATP reciclado está entonces disponible para otra interacción con Sec6 3.

Translocación postraduccional en mitocondrias, cloroplastos, peroxisomas y núcleo.


Las mitocondrias y los cloroplastos están rodeados por una membrana doble y tienen subcompartimientos internos, en tanto que lo
s peroxisomas están rodeados por una sola membrana y tienen un solo compartimiento luminal conocido como matriz.
El núcleo esta delimitado por una doble membrana.

• MITOCONDRIAS & CLOROPLASTOS


Las mitocondrias y los cloroplastos contienen su propio DNA, que codifica rRNA, tRNA y algunas proteínas de los organelas.
El crecimiento y la división de las mitocondrias y los cloroplastos no se asocian con la división nuclear, sino que crecen por la inc
orporación de proteínas y lípidos celulares y las nuevas organelas se forman por la división de otros preexistentes; ambos procesos
ocurren continuamente durante el período de interfase del ciclo celular.
Las proteínas codificadas por el DNA de las mitocondrias o de los cloroplastos se sintetizan en ribosomas dentro de las organelas
y se direccionan al subcompartimiento correcto inmediatamente después de la síntesis. Sin embargo, la mayor parte de las proteína
s localizadas en las mitocondrias y en los cloroplastos son codificadas por genes del núcleo y se incorporan en los organelas despu
és de su síntesis en el citosol.
Las proteínas precursoras sintetizadas en el citosol que están destinadas a la matriz mitocondrial o al espacio equivalente de los cl
oroplastos, la estroma, suelen contener secuencias de captación-direccionamiento específicas en el N-terminal que determinan la u
nión a proteínas receptoras presentes en la superficie de los organelas. En general, esta secuencia es eliminada una vez que alcanza
la matriz o el estroma. Estas secuencias de captación-direccionamiento son similares en lo que respecta a su localización y funció
n general a las secuencias de señalización que dirigen las proteínas nacientes a la luz del RE.
Tanto en las mitocondrias como en los cloroplastos, la incorporación de proteínas requiere energía y tiene lugar en puntos en los q
ue las membranas externa e interna de las organelas están en contacto íntimo. Debido a que las mitocondrias y los cloroplastos con
tienen varias membranas y espacios limitados por membranas, la redistribución de muchas proteínas a su localización correcta req
uiere la acción secuencial de dos secuencias de señalización y dos sistemas de translocación ligados a membranas: uno para dirigir
la proteína hacia el organela y el otro para direccionarla al compartimiento correcto o membrana de éste.

• PEROXISOMAS
Los peroxisomas son orgánulos pequeños limitados por una sola membrana. A diferencia de las mitocondrias y los cloroplastos, lo
s peroxisomas carecen de DNA y ribosomas. Por lo tanto, todas las proteínas peroxisómicas son codificadas por los genes nuclear
es, se sintetizan en los ribosomas libres del citosol y luego se incorporan a peroxisomas preexistentes o recién formados. A medida
que los peroxisomas se agrandan por el agregado de proteínas (y lípidos) pueden finalmente dividirse y formar nuevos peroxisom
as, como sucede con las mitocondrias y los cloroplastos. El tamaño y la composición enzimática de los peroxisomas varían consid
erablemente según los diferentes tipos de célula. Sin embargo, todos los peroxisomas contienen enzimas que usan oxígeno molecu
lar para oxidar diversos sustratos y forman agua oxigenada (H2O2). La catalasa, una enzima del peroxisoma, descompone eficazm
ente el H2O2 a H2O. Los peroxisomas son muy abundantes en las células del hígado, donde constituyen del 1 al 2% del volumen
celular.

• NÚCLEO
La membrana nuclear es una doble membrana lipídica que delimita al núcleo. La misma presenta poros nucleares, por donde pasa
n moleculas pequeñas pero no proteinas plegadas. Las proteinas nucleares entran debido a que se encuentran orientadas por acción
del péptido señal. Este péptido señal no es eliminado luego de haber sido translocado. La ubicación del péptido señal es variable,
pero suele encontrarse a aproximadamente a la mitad de la proteina.
En la división celular se degrada la membrana nuclear, de manera que todas las proteinas nucleares se dispersan en el citoplasma.
Luego de la citocinesis, en las células hijas se vuelven a formar las membranas nucleares. Las proteinas nucleares, debido a que no
perdieron dicha secuencia pueden retornar al núcleo.
Por otro lado, el sitio de armado de los ribosomas se da en el nucléolo, donde se sintetiza los rRNA, que formará parte de las subu
nidades ribosómicas.

----------------------------Regulación de la expresión génica----------------------------


INTRODUCCIÓN
La regulación de la expresión génica es el conjunto de procesos que mantienen estable la concentración celular de una proteína da
da.
La misma viene determinada por un delicado equilibrio de al menos, siete procesos, de los cuales cada uno tiene varios puntos pot
enciales de regulación:
1 – Síntesis del transcrito primario de RNA (transcripción)
2 – Modificación postranscripcional del mRNA.
3 – Degradación del mRNA.
4 – Síntesis proteica (traducción)
5 – Modificaciones postraducción de las proteinas
6 – Tráfico de las proteinas
7 – Degradación de las proteinas.
En otras palabras, el conjunto de mecanismos hacen que los niveles celulares de los productos génicos aumenten o disminuyan en
respuesta a señales moleculares se lo conoce como regulación de expresión génica o expresión génica regulada.
Existen dos tipos:
• Los productos génicos que aumentan la concentración bajo circunstancias moleculares particulares se designan como inducibles;
el proceso de aumento de su expresión se denomina inducción.
• Por el contrario, los productos génicos que disminuyen de concentración en respuesta a una señal molecular se designan como re
primibles y el proceso se denomina represión.
La transcripción esta facilitada y regulada por interacciones proteina – DNA, especialmente por aquellas en las que intervienen los
componentes proteicos de la RNApol.
Regulación (+) Regulación (-)
Proteina Activador Represor
Molécula Inductor Correpresor

Al menos tres tipos de proteinas regulan el inicio de la transcripción por la RNApol:


• los factores de especificidad, que modifican la especificidad de la RNApol por un promotor determinado o un conjunto de promo
tores (factores sigma y factores de transcripción generales);
• los represores, que impiden el acceso de la RNApol al promotor;
• los activadores que potencian la interacción RNApol – promotor.
La subunidad sigma de la holoenzima de la RNApol es un factor de especificidad que interviene en el reconocimiento y la unión
al promotor. La mayoría de los promotores son reconocidos por una única subunidad sigma (en E. coli, sigma70). En ciertas condic
iones, algunas subunidades sigma pueden ser reemplazadas por otras subunidades sigma. Sigma70 es sustituida por sigma32 cuando
las bacterias están sometidas a estrés por calor. Cuando esta unida a sigma 32, la RNApol se dirige hacia una serie de promotores e
specializados con una secuencia consenso diferente. Estos promotores controlan la expresión de un conjunto de genes que codifica
n proteinas entre ellas algunas chaperonas de proteinas que son parte de la respuesta al choque térmico. Por lo tanto, la coordinaci
ón de la regulación de un conjunto de genes relacionados es el resultado de los cambios de afinidad de unión de la polimerasa, qu
e la dirigen hacia diferentes promotores.
En las células eucariotas, algunos de los factores de transcripción generales, en particular la proteina de unión a TATA (TBP), pue
de considerarse factores de especificidad.
Los represores se unen a sitios específicos del DNA. En células bacterianas, esos sitios de union, denominados operadores, se enc
uentran generalmente cerca de un promotor. La union de la RNApol, o su movimiento a lo largo del DNA despues de la union, se
bloquea cuando el represor esta presente. La regulacion mediante una proteina represora que bloquea la transcripciom se denomi
na regulacion negativa. La union del represor al DNA se regula por una señal molecular (efector), normalmente una pequeña mol
ecula o una proteina, que se une al represor y provoca un cambio de conformación. La interaccion entre el represor y la molecula s
eñal tanto puede aumentar como disminuir la transcripcion.
En algunos casos, el cambio de conformacion provoca la disociacion de un represor que se encuentra unido al DNA del operador.
El inicio de la transcripcion puede entonces proceder libremente. En cambio, en otros casos la interacción entre un represor inactiv
o y la molecula señal hace que el represor se una al operador. En las celulas eucarioticas, el sitio de union de un represor puede en
contrarse a cierta distancia del promotor; la union tiene el mismo efecto que en las celulas bacterianas: la inhibicion del ensamblaj
e o de la actividad de un complejo de transcripción en el promotor.
Los activadores se unen y potencian la actividad de la RNApol en un promotor; es la regulación positiva. Los sitios de unió
n de los activadores se encuentran a menudo adyacentes a promotores a los que la RNApol o bien no se une por si sola o lo hace d
ébilmente, de manera que en ausencia de activador la transcripción es escasa. Algunos activadores eucarióticos se unen a sitios de
l DNA denominados potenciadores, que se encuentran lejos del promotor. Los potenciadores influyen en la tasa de transcripción e
n un promotor que puede estar situado a miles de pares de bases de distancia. Algunos activadores están normalmente unidos al D
NA potenciando la transcripción hasta que la unión de una molécula señal provoca la disociación del activador. En otros casos, el
activador se une al DNA solo después de la interacción con una molécula señal. Las moleculas señal pueden, por lo tanto, aument
ar o disminuir la transcripción según como afecten al activador.

REGULACION DE LA EXPRESION GÉNICA EN PROCARIOTAS


CONTROL TRANSCRIPCIONAL
OPERONES
El mecanismo general de las bacterias para coordinar la regulación de los genes que codifican productos implicados en una serie d
e procesos relacionados consiste en agrupar estos genes en el cromosoma y transcribirlos de manera conjunta. Muchos mRNA pro
cariotas son policistrónicos (múltiples genes en un único transcrito) y el promotor único que inicia la transcripción del grupo es el
sitio de regulación para la expresión de todos los genes del grupo. El grupo de genes y el promotor, mas secuencias adicionales qu
e funcionan conjuntamente en la regulación, se denomina operón. Es habitual que los operones incluyan de dos a seis genes transc
ritos como una unidad, muy pocos operones contienen 20 genes o mas.

OPERON LACTOSA
El operón de la lactosa (lac) incluye los genes de:
• la beta-galactosidasa (Z)
• la galactósido permeasa (Y)
• la tiogalactósido transacetilasa (A)
La ultima de estas enzimas parece modificar los galactósidos tóxicos para facilitar su eliminación por la célula. Cada uno de los tr
es genes está precedido por un sitio de unión a ribosoma (RBS), que dirige independientemente la traducción de cada gen.
La regulación negativa del operón lac sigue el mecanismo siguiente:
En ausencia de lactosa, los genes del operón lac están reprimidos. Mutaciones en el operador o el gen I, provocan la síntesis const
itutiva de los productos génicos.
El gen I codifica para el represor del sistema. Cuando el gen I es defectuoso, la represión puede restablecerse mediante la introduc
ción de un gen I funcional dentro de la célula como otra molécula de DNA (plásmido) denominada represor Lac de DNA, lo que
demuestra que el gen I codifica una molécula que difunde causando la represión génica. Esta molécula es una proteina denominad
a represor Lac.
El operador al que se une mas fuertemente (O1) es contiguo al sitio de inicio de la transcripción. El gen I se transcribe a partir de s
u propio promotor (PL), independientemente de los genes del operón lac. El operón lac tiene dos sitios de unión secundarios para e
l represor Lac. Uno, llamado (O2) esta ubicado dentro del gen que codifica la beta-galactosidasa (Z); el otro (O3) esta dentro del ge
n I. Para reprimir el operón, el represor Lac parece que se une tanto al operador principal como a uno de los dos sitios secundarios,
con el DNA interpuesto formando un lazo. Cualquiera de las dos formas de unión bloquea el inicio de la transcripción.
A pesar de la complejidad del complejo de unión, la represión no es absoluta. La unión del represor Lac reduce la tasa de inicio de
la transcripción en un factor de 103. Si se eliminan los sitios O2 y O3 la unión del represor solamente a O1 reduce la transcripción
en un factor alrededor de 102. Incluso en el estado reprimido, las células tienen unas pocas moleculas beta-galactosidasa y de galac
tósido permeasa, probablemente sintetizadas en las raras ocasiones en que el represor se disocia transitoriamente de los operadores
. Este nivel basal de transcripción, no obstante, es esencial para la regulación del operón.
Cuando se suministra lactosa a las células, se induce el operón lac. Una molécula inductora (señal) se une a un sitio especifico del
represor Lac, causando un cambio de conformación, que provoca la disociación del represor del operador. El inductor en el sistem
a del operón lac no es la propia lactosa sino la alolactosa, un isómero de la lactosa. Una vez en el interior de la célula (mediante la
s pocas moleculas de permeasa existentes), la lactosa se convierte en alolactosa por una de las pocas moleculas de beta-galactosida
sa presentes. La liberación del represor Lac del operador, provocado por la unión de la alolactosa al represor, permite que los gene
s del operón se expresen y provoca un incremento de 103 veces en la concentración de beta-galactosidasa.
Varios beta-galactósidos estructuralmente relacionados con la alolactosa son inductores del operón lac, pero no son sustratos de la
beta-galactosidasa; otros son sustratos pero no inductores. Un inductor muy efectivo y no metabolizable del operón lac, que a men
udo se utiliza experimentalmente, es el isopropiltiogalactósido (IPTG).
Un inductor que no se pueda metabolizar permite estudiar la funcion fisiológica de la lactosa como fuente de carbono para el creci
miento, con independencia de su funcion en la regulación de la expresión génica.
La regulación positiva del operón lac sigue el mecanismo siguiente:
La glucosa metabolizada directamente por la glucolisis, es la fuente de energía preferida de los organismos procariotas. Otros azuc
ares pueden servir como principal o único nutriente, pero se necesitan etapas adicionales para preparar su entrada en la glucolisis.
La síntesis de enzimas adicionales que metabolicen azucares tales como la lactosa o la arabinosa es un derroche energético si la gl
ucosa es abundante.
Cuando hay tanto glucosa como lactosa en el medio, se activa otro mecanismo de regulación llamado represión por catabolito, que
impide la expresión de los genes para el catabolismo de la lactosa, la arabinosa y otros azucares en presencia de glucosa, incluso c
uando estos azucares secundarios también están presentes. El efecto de la glucosa esta facilitado por el cAMP, como inductor, y la
proteina receptor de cAMP (CRP) como activador.
La CRP presenta sitios de unión al DNA y al cAMP. En ausencia de glucosa, la CRP – cAMP se une a un sitio cerca del promotor
lac y estimula 50 veces la transcripción del RNA.
La CRP se une al DNA con mayor afinidad cuando las concentraciones de cAMP son altas. En presencia de glucosa, la síntesis de
cAMP esta inhibida y se estimula la salida de cAMP de la célula. A medida que la [cAMP] desciende, la unión de la CRP al DNA
disminuye y en consecuencia también disminuye la expresión del operón lac.
De esta manera, la CRP – cAMP es un elemento de regulación positiva sensible a los niveles de glucosa, mientras que el represor
Lac es un elemento de regulación negativa sensible a la lactosa.
Los dos actúan conjuntamente:
• La CRP-cAMP tiene poco efecto sobre el operón lac cuando el represor Lac esta bloqueando la transcripción. Esto es lógico ya q
ue no hay lactosa, entonces por mas que no haya glucosa, no tienen ningún sentido que haya transcripción del operón lac.
• La disociación del represor del operador Lac tiene poco efecto en la transcripción del operón lac a menos que la CRP – cAMP es
te presente para facilitar la transcripción. Esto se a que la glucosa es preferentemente metabolizable con respecto a la lactosa, de es
ta manera aun en presencia de lactosa si hay glucosa no se activa el operón lac. Esto se debe a que cuando la CRP no esta unida, el
promotor lac wt es un promotor relativamente debil, de manera que el complejo abierto de la RNApol y el promotor no se forma f
ácilmente a menos que la CRP – cAMP este presente. La CRP interacciona directamente con la RNApol a través de la subunidad
alfa.
Por ende, una fuerte inducción del operón lac requiere tanto lactosa (para inactivar el represor lac) como una baja concentració
n de glucosa (para provocar un aumento de la [cAMP], así como de la unión del cAMP a la CRP).

Mutaciones en el operón lac


Para el estudio de la estructura y función del operón lac se trabajo con cepas que eran diploides parciales de E. coli. Un organismo
merodiploide o diploide parcial es aquel que incorporó un fragmento de ADN del exterior. Ahora el organismo contiene una varia
nte de un gen propio, de manera que ahora posee dos alelos de un mismo locus.
Como generalmente se utiliza este término en genética bacteriana, los cuales son organismos haploide, se dice que la bacteria es d
iploide parcial o merodiploide.
Estas cepas merodiploides se crearon por conjugación entre dos bacterias. El plásmido contenía el operón lac; por tanto, la bacteri
a receptora se transformó en una diploide parcial, al poseer dos copias del operón lac.
Esto ayudo a determinar que había partes del operón lac que actuaban en forma cis (eran capaces de controlar la expresión de g
enes, solo en la misma porción de DNA) o trans (eran capaces de controlar la expresión de genes en otras moléculas de DNA).

Mutaciones de los genes estructurales


Mutantes incapaces de sintetizar la beta-gal o la permeasa.
Estas mutaciones se mapearon en los genes estructurales lacZ o lacY y alteraban las secuencias de aminoácidos de las enzimas co
dificadas por los genes. Ellas afectaban claramente la estructura de las enzimas y no la regulación de su síntesis.
Mediante el empleo de diploides parciales, se determino que los genes lacZ y lacY eran independientes y habitualmente se veía af
ectado solo el producto del gen en el cual ocurrían. Los diploides parciales con lacZ+ y lacY- en el cromosoma bacteriano, pero la
cZ- lacY+ en el plásmido, funcionaban normalmente y producían beta-galactosidasa y permeasa en presencia de lactosa.
En este diploide parcial es suficiente un único gen de beta-galactosidasa funcional (lacZ+) para producir la beta-galactosidasa, no
hay diferencia entre el hecho de que el gen funcional para beta-galactosidasa esté acoplado con un gen para permeasa funcional (la
cY+) o un gen defectuoso (lacY-). Lo mismo es válido para el gen lacY+.

Mutaciones de los genes reguladores


Mutantes que afectaban la regulación de la producción enzimática.
Estas mutaciones afectaron la producción tanto de la beta-galactosidasa como de la permeasa porque los genes para ambas enzima
s se encuentran en el mismo operón y se regulan en forma coordinada. Parte de estas mutaciones eran constitutivas y causaban que
las enzimas lac se produjeran todo el tiempo, independientemente de la presencia o la ausencia de lactosa. Estas mutaciones ocurr
ían en el gen regulador y se designaron lacI-. La construcción de diploides parciales reveló que el gen lacI+ era dominante con res
pecto al gen lacI-; una única copia de lacI+ era suficiente para llevar a cabo la regulación normal de la producción enzimática.
Más aún, lacI+ restableció el control normal a un operón, aun cuando éste se localizaba en una molécula de DNA distinta, lo que
mostró que lacI+ era capaz de actuar, en trans. El hecho de que el gen lacI+ pudiera regular al gen lacZ+ localizado en una molécu
la de DNA diferente indicó que el producto del gen lacI+ era capaz de difundirse ya fuera al plásmido o al cromosoma.
Algunas mutaciones lacI aisladas evitaron la transcripción aun en presencia de lactosa y de otros inductores como el IPTG. Estas
mutaciones se denominaron superrepresoras (lacIS) porque producían represores que no podían ser inactivados por un inductor.
El represor tiene dos sitios de unión, uno para el inductor y uno para el DNA. Las mutaciones en lacIS produjeron un represor con
un sitio de unión al inductor alterado, lo que determinaba que el inductor fuera incapaz de unirse al represor; en consecuencia, el r
epresor siempre era capaz de unirse al sitio operador y evitar la transcripción de los genes lac. Las mutaciones superrepresoras fue
ron dominantes sobre lacI+; los diploides parciales con el genotipo lacIS lacZ+/lacI+ lacZ+ fueron incapaces de sintetizar beta-gala
ctosidasa o permeasa, hubiese o no lactosa.

Mutaciones del operador.


Mutantes en el sitio del operador, lacO constitutivo (lacOC)
Las mutaciones lacOC alteraron la secuencia del DNA en el operador, de modo que la proteína represora ya no era capaz de unirse.
Un diploide parcial exhibió síntesis constitutiva de beta-galactosidasa, lo que indicó que lacOC era dominante sobre lacO+. El aná
lisis de otros diploides parciales mostró que el gen lacO actuaba en cis, al afectar solo a los genes de la misma molécula de DNA.
Por ejemplo, un diploide parcial con genotipo lacI+ lacO+ lacZ-/lacI+ lacOC lacZ+ era constitutivo y producía beta-galactosidasa
en presencia o ausencia de lactosa, pero un diploide parcial con genotipo lacI+ lacO+ lacZ+/lacI+ lacOC lacZ- producía beta-galac
tosidasa solo en presencia de lactosa. En el diploide parcial constitutivo (lacI+ lacO+ lacZ-/lacI+ lacOC lacZ+), la mutación lacO
C y el gen funcional lacZ+ están presentes en la misma molécula de DNA, pero en lacI+ lacO+ lacZ+/lacI+ lacOC lacZ- la mutaci
ón lacOC y el gen funcional lacZ+ están en moléculas diferentes.
La mutación lacO afecta solo a los genes a los que está conectada físicamente, como resulta cierto para todas las mutaciones de op
erador. Evitan la unión de una proteína represora al operador, y por tanto permiten que la RNA polimerasa transcriba genes de la
misma molécula de DNA. Sin embargo, no pueden evitar que un represor se una a los operadores normales de otras moléculas de
DNA.

Mutaciones del promotor.


Las mutaciones que afectan el metabolismo de la lactosa también han sido aisladas en el sitio promotor; estas mutaciones se desig
nan lacP- e interfieren en la unión de la RNA polimerasa al promotor. Dado que esta unión es esencial para la transcripción de los
genes estructurales las cepas de E. coli con las mutaciones lacP- no producen enzimas lac, sea en presencia de lactosa o en ausenci
a de ella. Al igual que las mutaciones del operador, las mutaciones lacP- actúan en cis y afectan solo a los genes de la misma molé
cula de DNA.

EJEMPLO:
Se ensayo la actividad beta-galactosidasa (Z) y transacetilasa (A) en dos cepas de E. coli (1 y 2) y en el heterocigota merodiploide.
Los ensayos se realizaron en presencia y en ausencia de inductor:

Determinar el genotipo de cada una de las cepas considerando además de la beta-gal y la transacetilasa, a los genes que codifica p
ara el inductor (lacI), y la secuencia del operador (lacO).
• Cepa I: lacZ- lacY+ lacI+ lacO+
lacZ- porque tanto en presencia de inductor como en su ausencia, no hay cambios en la actividad de la beta-gal.
lacY+ porque existe una notable diferencia en la actividad de la transacetilasa en presencia del inductor con respecto al que no tien
e inductor.
lacI+ es evidente debido a que en la transacetilasa se ve represión en ausencia de un inductor.
lacO+ es evidente por lo mismo que lo anterior, al haber una represión implica que el operador (el sitio de unión del represor) esta
intacto.

• Cepa II: lacZ+ lacY- lacI? LacO?


lacZ+ porque hay expresión. Si fuera lacZ- no habría expresión en ninguna condición.
lacY- porque no hay expresión en ninguna condición.
Ahora bien:
el operador puede ser lacO+/lacI-, lacOC/lacI+ o lacOC/lacI-. Estos genotipos explican la sobreexpresión de lacZ.

• Cepa III: lacZ+ lacY+ lacI+ lacO+


lacZ+ y lacY+ porque hay expresión.
lacI+ y lacO+ porque responden correctamente a los estímulos (presencia o ausencia de inductor)

De esta manera, en la cepa II si o si el genotipo debe ser lacO+/lacI- debido a que si fuese constitutivo, el merodiploide también lo
seria, porque es dominante frente a lacO+. De manera que la sobreproducción de lacZ se debe a una falla en el represor.

OPERON TRIPTOFANO
El operón del triptófano contiene cinco genes, los cuales son las que requiere para convertir el corismato en triptófano. El mRNA
del operón trp tiene vida media corta, lo que permite que la célula responda rápidamente a las necesidades cambiantes de este ami
noácido.
La regulación negativa del operón trp sigue el mecanismo siguiente:
Cuando el triptófano es abundante, se une al represor trp, provocando un cambio de conformación que permite al represor unirse a
l operador trp e inhibir la expresión del operón trp. El sitio del operador trp se solapa con el promotor, por lo que la unión del repr
esor puede bloquear la unión de la RNApol.
La regulación por atenuación del operón trp sigue el mecanismo siguiente:
Acabada la represión y restablecida la transcripción, la velocidad de transcripción se ajusta mediante un segundo proceso de regul
ación denominado atenuación de la transcripción, en el que la transcripción se inicia normalmente pero se interrumpe bruscamente
antes de que los genes del operón se transcriban. La frecuencia de atenuación de la transcripción esta regulada por la disponibil
idad del triptófano y depende del rígido acoplamiento de la transcripción y la traducción en las bacterias.
El mecanismo de atenuación del operón trp utiliza cuatro secuencias dentro de una region llamada guía de aprox 160 nucleótidos e
n el extremo 5’ del mRNA. Esta region guía precede al codón de inicio del primer gen.
Las secuencias 3 y 4 constituyen una región denominada atenuador de la transcripción. Estas secuencias se aparean para formar un
a estructura en horquilla rica en GC, seguida inmediatamente por una serie de residuos U. La estructura del atenuador actúa (es an
áloga) a la secuencia terminadora de la transcripción.
Las secuencias 2 y 3 constituyen la region conocida como continuador de la transcripción. Si se aparean las secuencias 2 y 3, la es
tructura atenuadora no se puede formar y la transcripción continua en los genes biosintéticos trp; el lazo formado por el apareamie
nto de las secuencias 2 y 3 no obstaculiza la transcripción.

Mecanismo:
Partiendo de que a medida que se va sintetizando el operón trp, va ocurriendo su traducción, se puede afirmar que el mecanismo
consistencia en una competencia por cual de las dos regio es se forma primera, si la region atenuadora o si la region continuador
a.
El hecho de que ocurra uno u otro apareamiento depende exclusivamente de la velocidad con la que este traduciendo el ribosoma
la secuencia 1.
La secuencia 1 se traduce inmediatamente despues de su transcripción por un ribosoma que sigue de cerca a la RNApol a medida
que avanza la transcripción. Dicha secuencia codifica un péptido llamado guía el cual presenta dos residuos de Trp. La única funci
ón del péptido guía es sensar la concentración de trp intracelular.
• Cuando las concentraciones de triptófano son elevadas, las concentraciones de tRNA cargados con triptófano (Trp – tRNATrp) ta
mbién son elevadas. Esto permite que la traducción proceda rápidamente, pasando por los dos codones Trp de la secuencia 1 haci
a la secuencia 2. En esta situación la secuencia 2 quede cubierta por el ribosoma, lo que la inhabilita para aparearse con la secuenc
ia 3 cuando esta es sintetizada; se forma la estructura atenuadora (secuencias 3 y 4) y se interrumpe .a transcripción.
• En cambio, cuando las concentraciones de triptófano son bajas, el ribosoma queda parado en los dos codones de Trp de la secuen
cia 1 porque hay menos tRNATrp cargados. La secuencia 2 permanece libre mientras se sintetiza la secuencia 3, permitiendo que es
tas dos secuencias se apareen y que se produzca la transcripción. De esta manera la proporción de transcritos que se atenúa descie
nde a medida que disminuye la concentración de triptófano.

CONTROL TRADUCCIONAL
En las bacterias, un incremento en la demanda celular de síntesis proteica se satisface mediante el incremento del numero de ribos
omas en lugar de alterar la actividad de los ribosomas individuales. En general, el numero de ribosomas aumenta a medida que au
menta la tasa de crecimiento celular. A tasas altas de crecimiento, los ribosomas constituyen aproximadamente el 45% del peso se
co celular. La proporción de recursos celulares dedicados a la producción de ribosomas es tan grande y la funcion de los ribosoma
s tan importante que las células tienen que coordinar la síntesis de los componentes ribosómicos: proteinas ribosómicas (proteinas
r) y RNA (rRNA). Esta regulación es diferente debido a que tiene lugar a la altura de la traducción.
Las diferentes proteinas r se encuentran distribuidos en mas de 20 operones de 1 a 11 cistrones.
Algunos de estos operones también contienen los genes para las subunidades de la DNA primasa, la RNApol y los factores de elo
ngación de la síntesis proteica, lo que explica el estrecho acoplamiento de la replicación, la transcripción y la traducción durante el
crecimiento celular.
Los operones de proteinas r se regulan principalmente mediante un mecanismo de retroalimentación tradicional. Una proteina r co
dificada por un operón también actúa de represor de la traducción, uniéndose al mRNA de su propio operón y bloqueando así la tr
aducción de todos los genes codificados por el mensajero. En general, la proteina r que desempeña el papel de represor también se
une directamente a un rRNA. Cada proteina r represora de la traducción se une con mayor afinidad al rRNA apropiado que a su m
RNA.
De esta manera, la proteína r cuando se une al mRNA reprime la traducción solo si el nivel de la proteina r excede al de rRNA. Ell
o asegura que la traducción de los mRNA que codifican proteinas r se reprima solo cuando el nivel de proteinas r exceda lo necesa
rio para producir ribosomas funcionales. De esta forma la velocidad de síntesis de proteinas r se mantiene en equilibrio con la disp
onibilidad de rRNA.
El sitio de unión del mRNA para el represor de la traducción esta cerca del sitio de inicio de la traducción de uno de los genes del
operón, generalmente el primer gen. En otros operones se vería afectado solo ese gen en particular, ya que en los mRNA policistró
nicos bacterianos la mayoría de genes tienen señales de traducción independientes. Sin embargo, en los operones de proteinas r, l
a traducción de un gen depende de la traducción de todos los demás. El mecanismo de este acoplamiento de la traducción aun no s
e conoce en detalle. No obstante, en algunos casos la traducción de múltiples genes parece que se bloquea mediante el plegamient
o del mRNA en una estructura tridimensional compleja que se estabiliza tanto por apareamiento interno como por la unión de la pr
oteina represora de la traducción. Cuando el represor de la traducción esta ausente, la unión del ribosoma y la traducción de uno o
mas genes elimina la estructura plegada del mRNA, permitiendo que se traduzcan todos los genes.
Debido a que la síntesis de proteinas r esta coordinada con la disponibilidad de los rRNA, la regulación de la producción de riboso
mas refleja la regulación de la síntesis de rRNA. En E. coli, la síntesis de rRNA a partir de los siete operones de rRNA refleja la ta
sa de crecimiento celular y los cambios en la disponibilidad de nutrientes cruciales, especialmente aminoácidos. La regulación coo
rdinada con las concentraciones de aminoácidos se denomina respuesta grave. Cuando las concentraciones de aminoácidos son baj
as, la síntesis de rRNA se detiene. La deficiencia de aminoácidos provoca la unión de tRNA descargados al sitio A de los ribosom
as; ello desencadena una secuencia de acontecimientos que empieza con la unión de una enzima llamada factor de respuesta grave
(proteina RelA) al ribosoma. Cuando esta unido al ribosoma, el factor de respuesta grave cataliza la formación del nucleótido poc
o común guanosina tetrafosfato (ppGpp), que añade pirofosfato a la posición 3’ del GTP, en la reacción:
GTP + ATP  pppGpp + AMP
A continuación una fosfohidrolasa elimina un fosfato para formar ppGpp. El aumento brusco del nivel, de ppGpp en respuesta a la
carencia de aminoácidos produce una gran reducción de la síntesis de rRNA, debida al menos en parte, a la unión de ppGpp a la
RNApol.
El nucleótido ppGpp, junto al AMPc, pertenece a una clase de nucleótidos modificados que actúan como segundos mensajeros cel
ulares. En E. coli, estos dos nucleótidos sirven como señal de carencia de nutrientes, y causan grandes cambios en el metabolismo
celular, aumentando o disminuyendo la transcripción de centenares de genes. En las células eucarióticas, nucleótidos similares que
actúan de segundos mensajeros también tienen funciones de regulación múltiples. La coordinación del metabolismo células con el
crecimiento celular es muy compleja y sin duda existen otros mecanismos de regulación por descubrir.

REGULACION POR PEQUEÑOS RNA EN CIS O EN TRANS


Además de las proteinas, el RNA también juega un papel crucial en la regulación de la expresión génica. Una vez sintetizado un m
NA, sus funciones pueden ser controladas por proteinas de unión a RNA, o por un RNA. Una molécula distinta de RNA puede uni
rse al mRNA “en trans” y afectar su actividad. Alternativamente, una parte del mismo mRNA puede regular su propia funcion. Cu
ando una parte de una molécula afecta la funcion de otra parte de la misma molécula, se dice que actúa “en cis”.
La regulación en cis pone en juego una clase de estructuras de RNA conocidas como ribointerruptores. Los apatámeros son molec
ulas de RNA generadas in vitro, que son capaces de unirse específicamente a un ligando particular. Tales dominios de RNA de uni
ón a ligandos también se encuentran en la naturaleza, en los ribointerruptores, en un numero significativo de mRNA bacterianos (e
incluso en algunos mRNA eucarióticos). Estos aptámeros naturales consisten en dominios estructurados localizados en la region 5
’ no traducida de ciertos mRNA bacterianos. La unión de un mRNA ribointerruptor al ligando apropiado provoca un cambio de co
nformación en el mRNA, que inhibe la transcripción mediante la estabilización de una estructura de terminación de la transcripció
n prematura, o bien se inhibe (en cis) la traducción a consecuencia de la oclusión del sitio de unión al ribosoma.
En general, los ribointerruptores actúan como parte de un bucle de retroalimentación. La mayor parte de los genes regulados de est
a forma están implicados en la síntesis o el transporte del ligando que se une el ribointerruptor; por lo tanto, cuando el ligando esta
presente en elevadas concentraciones, el ribointerruptor inhibe la expresión de los genes necesarios para reponerlo.
Cada ribointerruptor une un solo ligando. Se han encontrado diferentes ribointerruptores que responden a mas de una docena de li
gandos diferentes, entre los que se encuentran la tiamina pirofosfato (TPP, vitamina B1), la cobalamina (vitamina B12), la flavina
mononucleótido, la lisina, la S-adenosilmetionina (adoMet), las purinas, la N-acetilglucosamina 6P y la glicina.
El ribointerruptor que responde a TTP parece ser el mas difundido; se encuentran en muchas bacterias, hongos y algunas plantas.
El ribointerruptor para el TTP bacteriano inhibe la traducción en algunas especies e induce la terminación prematura de la transcri
pción en otras. El ribointerruptor para el TTP eucariótico se encuentra en los intrones de ciertos genes y modula el corte y empalm
e alternativo de estos genes.

REGULACION POR RECOMBINACIÓN GENÉTICA


Existe otro tipo de regulación genética bacteriana, a nivel del reordenamiento del DNA por recombinación. Salmonella typhimuni
um, que vive en los intestinos de los mamíferos, se mueve haciendo girar los flagelos de su superficie celular. Las muchas copias
de la proteina flagelina que forman los flagelos son dianas preferentes de los sistemas inmunitarios de los mamíferos.
Pero las células de Salmonella poseen un mecanismo que elude las respuestas inmune: alternan entre dos proteinas flagelina distin
tas (FljB y FliC) aproximadamente una vez cada 1k generaciones, utilizando un proceso denominado variación de fase.
El cambio se produce mediante la inversión periódica de un segmento de DNA que contiene el promotor de un gen de la flagelina.
La inversión es una reacción de recombinación especifica de sitio en la que actúa la recombinasa denominada Hin sobre secuenci
as especificas de 14 pb (secuencias hix) en cada extremo del segmento de DNA. Cuando el segmento de DNA se encuentra en una
orientación, se expresan el gen de la flagelina FljB y el gen que codifica un represor (FljA); el represor anula la expresión del gen
de la flagelina FliC. Cuando se invierte el segmento de DNA, los genes fljA y fljB dejan de transcribirse y el gen fliC se induce a
medida que desaparece el represor. La recombinasa Hin, codificada por el gen hin en el segmento de DNA que sufre la inversión,
se expresa cuando el segmento de DNA esta en cualquier orientación; por lo tanto, la célula siempre puede cambiar de un estado a
otro.

REGULACION DE LA EXPRESION GÉNICA EN EUCARIOTAS


Los promotores eucarióticos fuertes se encuentran por lo general inactivos in vivo en ausencia de proteinas reguladoras; es decir, e
l estado de transcripción basal es restrictivo. Esta diferencia fundamental con respecto a las procariotas (en donde la RNApol pued
e unirse a los promotores sin necesidad de otras proteinas con un cierto grado de afinidad dando una transcripción basal) da lugar
al ciertas características importantes que distinguen la regulación de la expresión génica en eucariotas de la de las bacterias.
• acceso a los promotores eucarióticos esta restringido por la estructura de la cromatina y la activación de la transcripción esta aso
ciada con múltiples cambios en la estructura de la cromatina en la region transcrita.
• a pesar de que en las células eucarióticas se encuentran tanto elementos de regulación positiva como negativa, los mecanismos p
ositivos predominan en todos los sistemas caracterizados hasta la fechas. Dado que el estado de transcripción basal es restrictivo, c
asi todos los genes eucarióticos requieren activación para ser transcritos.
• las células eucarióticas tienen proteinas reguladoras multiméricas mas grandes y complejas que las bacterias.
• la transcripción en el núcleo eucariótico esta separada tanto en el espacio como en el tiempo de la traducción en el citoplasma (n
o existe el mecanismo de atenuación). Existen otros mecanismos de regulación en la traducción.

CONTROL TRANSCRIPCIONAL
ACCESO A LOS PROMOTORES EUCARIOTICOS ESTA RESTRINGIDO POR LA ESTRUCTURA DE LA CROMATINA
La cromatina se puede clasificar en dos tipos dependiendo de su estado de condensación:
• Heterocromatina: es la cromatina que se encuentra condensada. Existen dos tipos: constitutiva, como por ejemplo los telómeros
y los centrómeros, cuya función es exclusivamente estructural sin funciones codificantes; y la facultativa que su estado de condens
ación depende de la diferenciación celular.
• Eucromatina: es la cromatina descondensada, transcripcionalmente activa.
Heterocromatina  Eucromatina
La heterocromatina implica que los genes que se encuentran dentro de ella se encuentran inactivos transcripcionalmente, y que req
uieren un proceso de activación para activarse.
• La eucromatina implica que los genes que se encuentran dentro de ella se encuentran activos transcripcionalmente, y que requier
en un proceso de represión para que se inactiven.
El DNA que se encuentra siempre condensada se llama heterocromatina constitutiva (y no sufre procesos de activación).
El DNA que se encuentra siempre condensada se llama eucromatina (y no sufre procesos de represión).
El DNA que sufre procesos de activación/represión se lo conoce como heterocromatina facultativa.

En una célula eucariótica típica, alrededor del 10 % de la cromatina se encuentra en un estado mas condensado que el resto de la c
romatina. Esta forma, la heterocromatina, es transcripcionalmente inactiva. La heterocromatina, esta asociada generalmente a estr
ucturas cromosómicas definidas. La cromatina restante, menos condensada, se denomina eucromatina.
La transcripción de un gen eucariótico esta fuertemente reprimida cuando su DNA esta condensado en la heterocromatina. Una pa
rte de la eucromatina, pero no toda, es transcripcionalmente activa. Las regiones cromosómicas transcripcionalmente activas se ca
racterizan no solo por un estructura de la cromatina mas abierta sino también por la presencia de nucleosomas con modificación y
composición especifica.
• Tanto la activación como la desactivación comparten dos mecanismos en común:
- La unión de activadores o represores produciendo la activación o inhibición directa de los elementos espacialmente próximos (es
to implica que una secuencia regulatoria puede estar cerca o lejos de la secuencia codificadora; los bucles generados por las histon
as permiten que dos secuencias que se encuentran alejadas en la estructura primaria puedan influirse entre si).
La activación y la represión dada por el sitio de unión de DNA a la proteina puede solaparse, de manera que le llegada de un repre
sor impide la interacción con el activador y viceversa.
- Sitios reclutadores de enzimas (ya sea para la activación o inactivación).
También puede ocurrir que el represor interactúa con el sitio de reclutamiento del complejo enzimático activador.
La activación abarca los siguientes procesos:
- reclutamiento de la HAT, la cual acetila los residuos de Lys de las colas Nt de las histonas). Al ser acetilado pierde sus cargas po
sitivas y produce la descondensación en la cromatina circundante.
- reclutamiento del complejo remodelador de la cromatina, el cual modifica la estructura del nucleosoma, produciendo la apertura
del mismo
- también existen procesos de sustitución de histonas que permiten que la cromatina sea mas laxa, o directamente se eliminan las h
istonas, ambos procesos están mediados por chaperonas.
Existe un mecanismo de metilación de histonas que produce tanto la activación como la represión de la transcripción dependiend
o de qué residuos de lisina en qué histonas son metilados.
• La metilación puede hacer mas resistente al pasaje del DNA de la cromatina condensada a la descondensada. Las histonas que
se encuentran metiladas son capaces de unirse con mayor afinidad al ADN, de manera que hace a dicha region transcripcionalm
ente inactiva.
• También la metilación puede favorecer la descondensación. La histona es metilada (por metilasas especificas de histonas) en lo
s nucleosomas en la Lys (cerca del extremo 5’ de la region codificante y a lo largo de toda la region codificante), facilitando la u
nión de histona acetiltransferasa (HAT), enzimas que acetilan residuos Lys específicos.

Las modificaciones asociadas con la activación transcripcional, principalmente metilación y acetilación, serian reconocidas por en
zimas que hacen que la cromatina sea mas accesible a la maquinaria de la transcripción. En efecto, algunas de las modificaciones s
on esenciales para la interacción con proteinas que juegan un papel clave en la transcripción.
El conjunto de cambios estructurales de la cromatina asociados a la transcripción se generan mediante un proceso denominado re
modelación de la cromatina. Algunas enzimas modifican covalentemente las histonas del nucleosomas. Otros utilizan la energía q
uímica del ATP para reposicionar los nucleosomas en el DNA. Otros, finalmente, alteran la composición en histonas de los nucleo
somas.
La acetilación y la metilación de las histonas juegan un papel destacado en los procesos de activación de la cromatina para la trans
cripción. Los dominios Nt de las histonas internas son generalmente ricos en residuos Lys y Arg, puntos de metilación y acetilació
n.
Las HAT citosólicas (tipo B) acetilan histonas recién sintetizadas antes que sean importadas por el núcleo. El posterior ensamblaj
e de las histonas en cromatina esta facilitado por chaperonas de histonas.
Allí donde la cromatina esta siendo activada para la transcripción, las histonas del nucleosoma se acetilan aun mas por HAT nucle
ares (tipo A). La acetilación de múltiples residuos Lys en los dominios Nt de las histonas H3 y H4 puede reducir la afinidad del nu
cleosoma completo hacia el DNA. La acetilación de residuos Lys concretos es critica para la interacción del nucleosoma con otras
proteinas. Cuando la transcripción de un gen ya no es necesaria., la acetilación de los nucleosomas en la region donde se encuentr
a disminuye por acción de las histonas desacetilasas (HDAC), como parte del proceso general de silenciamiento de genes que rest
ablece el estado transcripcionalmente inactivo de la cromatina. Además de la eliminación de determinados grupos acetilo, nuevas
modificaciones covalentes de las histonas marcan la cromatina como transcripcionalmente inactiva.

MODIFICACIONES INTRACELULARES QUE ACTIVAN LA FUNCIONALIDAD DE LOS REGULADORES


Esto implica que el regulador, previo a la modificación, se encontraba inactivo, o ni siquiera fue sintetizado. Entre estas modificac
iones se encuentran:
• estimulación de la síntesis proteica del regulador
• unión de algún ligando al regulador
• modificación covalente
• adición de una subunidad
• desinhibición por la liberación de alguna subunidad o ligando
• impedimento pro proteinas que regulan la entrada al núcleo
• escisión de una proteina de membrana inactiva a una forma mas activa

EPIGENÉTICA
La metilación en posición 5’ de los residuos citosina de las secuencias CpG es frecuente en el DNA eucariótico, pero el DNA de l
a cromatina transcripcionalmente activa tiende a estar poco metilado. Además, los sitios CpG de genes particulares están a menud
o metilados en las células de los tejidos donde esos genes se expresan que en aquellos en que no se expresan.
La metilación se la considera como un mecanismo de mantenimiento de la expresión génica, en donde se requiere que la expresió
n génica de un determinado gen sea constante en un lapso de tiempo indefinido. De esta manera, la metilación permite un libre acc
eso a la expresión sin necesitar de otra forma regulatoria.
La epigenética se basa en la metilación de las citosinas. Estas metilasas son metilasas de mantenimiento, distinta a las que metilan
a las histonas. La epigenética es un mecanismo de regulación único debido a que son los cambios ambientales lo que desencadena
n la metilación o no de un determinado gen, que a su vez garantiza que la progenie celular, en esa secuencia metilada, también se
va a encontrar metilada. Por lo general, ocurre en células que están a punto de diferenciarse.

LOS MECANISMOS DE REGULACIÓN PREDOMINANTES DE LOS PROMOTORES SON POSITIVOS


Las RNApol eucarióticas tienen poca o ninguna afinidad intrínseca por sus promotores; el inicio de la transcripción es casi siempr
e dependiente de la acción de múltiples proteinas activadoras.
Se estima dos razones posibles por las cual en las células eucariotas predomina la regulación positiva:
• el empaquetamiento del DNA en la cromatina hace que la mayoría de promotores sean inaccesibles; por lo tanto, los genes n
ormalmente permanecen silenciosos en ausencia de regulación de otro tipo.
La estructura de la cromatina afecta el acceso a algunos promotores mas que a otros, pero la presencia de represores que se unen al
DNA para imposibilitar el acceso de la RNApol (regulación negativa) seria a menudo simplemente redundante. Otros factores pu
eden favorecer la utilización de la regulación positiva; dos de ellos se consideran generalmente como mas importantes: el gran tam
año de los genomas eucarióticos y la mayor eficiencia de la regulación positiva.
Primero, la unión no especifica de proteinas reguladoras al DNA se convierte en un problema mas importante en los grandes geno
mas de los eucariotas superiores, pues la posibilidad de que una determinada secuencia de unión especifica se encuentre al azar en
un sitio inapropiado también aumenta con el tamaño del genoma. Se puede mejorar la especificidad de la activación de la transcri
pción si diversas proteinas reguladoras positivas se tienen que unir a secuencias especificas de DNA y formar un complejo para vo
lverse activas. El numero promedio de sitios de regulación de los genes de un organismo multicelular es de probablemente cinco c
omo mínimo. El requisito que múltiples proteinas reguladoras, positivas tengan que unirse a secuencias especificas de DNA reduc
e enormemente la probabilidad de que se produzca al azar la yuxtaposición funcional de todos los sitios de unión necesarios.
• la regulación positiva es mas eficiente que la regulación negativa
Una regulación negativa implica que la célula debería sintetizar en todo momento el mismo numero de represores diferentes (o mu
chas veces ese numero si se utilizasen en cada promotor múltiples elementos de regulación) en concentraciones suficientes que per
mitiesen la unión especifica a cada uno de los genes no deseados”. En la regulación positiva, la mayoría de los genes están normal
mente inactivos (es decir, las RNApol no se unen a los promotores) y las células tienen que sintetizar solamente las proteinas activ
adoras necesarias para promover la transcripción del subconjunto de genes necesarios para esa célula en un determinado momento
. No obstante, a pesar de que no predomina como sistema de regulación, en eucariotas también existen casos de regulación negat
iva. La regulación negativa es predominante en sistemas vegetales, el cual es una gran diferencia desde el punto de vista de la gen
ética molecular, con los sistemas animales.

PROTEINAS REGULADORAS MULTIMERICAS GRANDES Y COMPLEJAS


Aunque la mayoría de promotores (pero no todos) de la RNApol II incluyen la secuencia TATA y las secuencias Inr (iniciador) co
n sus espaciados estándar, estos varían mucho en el numero y en la localización de secuencias adicionales necesarias para la regul
ación de la transcripción. Estas secuencias reguladoras adicionales se denominan a menudo intensificadores en las eucariotas supe
riores y secuencias activadoras corriente arriba (UAS) en levaduras. Un intensificador típico se puede encontrar a centenares o inc
luso a miles de pb del sitio de inicio de la transcripción o incluso puede encontrarse mas abajo, dentro del propio gen. Cuando esta
unido a las proteinas reguladoras apropiadas, un potenciador aumenta la transcripción de los promotores cercanos, independiente
mente de su orientación en el DNA. Las UAS de las levaduras funcionan de manera similar, aunque generalmente tienen que estar
situados corriente arriba y a no mas de unos pocos centenares de pares de bases del sitios de inicio de la transcripción. Un promot
or de RNApol II puede estar afectado por media docena de estas secuencias reguladoras como promedio, pero son comunes los pr
omotores todavía mas complejos.
La unión eficaz de la holoenzima activa de la RNApol II a uno de sus promotores necesita normalmente la participación de otras p
roteinas de cuatro tipos distintos:
• activadores de la transcripción, que se unen a los potenciadores o a UAS y facilitan.
• proteinas de modificación y remodelación de la cromatina.
• coactivadores
• factores de transcripción basal, necesarios en todos los promotores de RNApol II.
Los coactivadores actúan indirectamente, no mediante la unión al DNA, y son necesarios para la comunicación entre los activador
es y el complejo formado por la Pol II y los factores de transcripción basales (o generales).
Además, diversas proteinas represoras pueden interferir en la comunicación entre la RNApol y los activadores, con el resultado de
la represión de la transcripción.

RNA DE INTERFERENCIA
En los eucariotas superiores, se ha descubierto una clase de pequeños RNA, denominados microRNA (miRNA), que participa en e
l silenciamiento de muchos genes. Estos RNA actúan interaccionando con el mRNA, a menudo en el 3’UTR, provocando su degra
dación o la inhibición de la traducción. En ambos casos, el mRNA, y por lo tanto el gen que lo produce, es silenciado. Esta forma
de regulación génica controla el desarrollo temporal en al menos algunos organismos. También se utiliza como un mecanismo de
proteccion frente a virus RNA invasores (de especial importancia en las plantas que carecen de sistema inmune) y para controlar l
a actividad de los transposones. Además, estas pequeñas moleculas de RNA juegan un papel fundamental (aunque aun no esta bie
n definido) en la formación de la heterocromatina.
Muchos miRNA están presentes solamente de manera transitoria durante el desarrollo, y a veces se denominan pequeños RNA te
mporales (stRNA). En las eucariotas superiores se han identificado múltiples miRNA diferentes, que pueden influir en la regulaci
ón de algunos genes de los mamíferos. Se transcriben en forma de RNA precursor de unos 70 nucleótidos, con secuencias comple
mentarias internas que forman estructuras en horquilla. Los precursores se cortan con endonucleasas (como Drosha o Dicer) para f
ormar dúplex corto de 20 a 25 nucleótidos de longitud.
Una de las hebras del miRNA maduro se asocia con el mRNA diana (o con el RNA de un virus o de un transposon), provocando l
a inhibición de la traducción o de la degradación del RNA. Algunos miRNA se unen y afectan un único mRNA, con lo que así infl
uyen en la expresión de un solo gen. Otros interactúan con múltiples mRNA y, por lo tanto, constituyen el núcleo del mecanismo
de los regulones que coordinan la expresión de una multiplicidad de genes.
Este mecanismo de regulación génica tiene un aspecto interesante y practico lo que hace sumamente útil. Si se introduce en un org
anismo una molécula de RNA dúplex, correspondiente a la secuencia de prácticamente cualquier mRNA, la endonucleasa Dicer c
orta el dúplex en cortos fragmentos denominados pequeños RNA de interferencia (siRNA). Estos fragmentos se unen al mRNA y
lo silencian. El proceso se conoce como interferencia por RNA (iRNA).
En las plantas, prácticamente cualquier gen puede ser silenciado de esta manera.
Esta técnica se ha convertido rápidamente en una herramienta muy eficaz para estudiar la función génica, porque puede suprimirla
sin necesidad de crear un organismo mutante. Este procedimiento también se puede aplicar en humanos. Se han usado siRNA sint
etizados en el laboratorio para bloquear el VIH y las infecciones por polivirus en células humanas en cultivo durante una semana a
proximadamente. Los rápidos progresos de los estudios sobre el RNA de interferencia presiden un claro uso medico de esta tecnol
ogía.

RNA NO CODIFICANTE
Los RNA de función especializada de los eucariotas incluyen los miRNA, los snRNA (implicados en el splicing), y los snoRNA (i
mplicados en la modificación del rRNA).
Todos los RNA que no codifica para proteinas (incluyendo los rRNA y los tRNA), se lo agrupa bajo el nombre de ncRNA (RNA
no codificante).
Los genomas de los mamíferos parecen codificar mas ncRNA que mRNA codificantes.
La mayoría de los ncRNA interaccionan con proteinas en lugar de con RNA, y afectan la funcion de las proteinas unidas, y/o afec
tan la transcripción de diversas maneras.

CONTROL TRADUCCIONAL
MUCHOS mRNA EUCARIÓTICOS ESTAN SOMERIDOS A REPRESION TRADUCCIONAL
La regulación a nivel de traducción supone un papel mucho mas destacado en los eucariotas que en las procariotas y se observa en
una variedad de situaciones celulares. En contraste con el estrecho acoplamiento entre la transcripción y la traducción en las bacte
rias, los transcritos generados en un núcleo eucariótico tienen que ser modificados y transportados hacia el citoplasma antes de la t
raducción. Ello puede implicar un retraso significativo en la aparición de una proteina.
Cuando se requiere un incremento rápido de la producción de una proteina, un mRNA reprimido traduccionalmente presente en el
citoplasma puede ser activado para que sea traducido sin retraso. La regulación de la traducción puede desempeñar un papel espec
ialmente importante en la regulación de ciertos genes eucarióticos muy largos, para los que la transcripción y la maduración del m
RNA puede requerir muchas horas. Algunos genes se regulan tanto en las etapas de transcripción como de traducción, estando im
plicada esta ultima en el ajuste preciso de los niveles de proteinas celulares. En algunas células anucleadas, tales como los reticulo
citos (eritrocitos inmaduros), el control de la transcripción es totalmente inasequible y el control de la traducción de los mRNA al
macenados se convierte en esencial.
Los controles de la traducción pueden tener también un significado espacial durante el desarrollo, donde la traducción regulada de
mRNA pre posicionados crea un gradiente local del producto proteico.
Los eucariotas tienen al menos cuatro mecanismos principales de regulación de la traducción:
• Los factores de inicio de la traducción están sujetos a fosforilación por proteinas quinasas. Las formas fosforiladas son menudo
menos activas y causan una depresión general de la traducción en la célula.
• Algunas proteinas se unen directamente al mRNA y actúan como represores de la traducción y muchas se unen a sitios específic
os de la region 39 no traducida (39UTR).
Una vez posicionadas, interaccionan con otros factores de inicio de la traducción unidos al mRNA o con la subunidad ribosómica
40S para impedir el inicio de la traducción.
• Proteinas de unión, presentes en las eucariotas desde las levaduras hasta los mamíferos, impiden la interacción entre eIF4E y el e
IF4G. Las proteinas de los mamíferos se denominan 4E-BP (proteinas de unión eIF4E). Cuando el crecimiento celular es lento, est
as proteinas limitan la traducción uniéndose al sitios de eIF/E que normalmente interacciona con eIF4G. Cuando se reanuda o aum
enta el crecimiento celular en respuesta a factores de crecimiento u otros estímulos, las proteinas de unión se inactivan mediante f
osforilación dependiente de proteinas quinasas.
La regulación de la expresión génica dirigida por RNA, a menudo se produce a nivel de la represión de la traducción.

CONTROL POSTRADUCCIONAL
Modificaciones, plegado y control de calidad de las proteínas en el RE
Las proteínas de membrana y secretorias solubles sintetizadas en el RER son sometidas a cuatro modificaciones principales antes
de alcanzar sus destinos finales:
1) agregado y procesado de hidratos de carbono (glucosilación) en el RE y el Golgi.
2) formación de puentes disulfuro en el RE.
3) plegado apropiado de las cadenas de polipéptidos y ensamblaje de proteínas compuestas de subunidades múltiples en el RE.
4) cortes proteolíticos específicos en el RE, el Golgi y las vesículas secretorias.
A la inmensa mayoría de las proteínas que se sintetizan en el RER se le agregan una o más cadenas de hidratos de carbono; de hec
ho, la glucosilación es la principal modificación química que sufre la mayor parte de estas proteínas. La cadena de hidrato de carb
ono de las glucoproteínas puede unirse al grupo hidroxilo de la serina y treonina o al nitrógeno de la amida de la asparagina. Estas
cadenas son llamadas oligosacáridos O-ligados y N-ligados, respectivamente.
• los oligosacáridos O-ligados a menudo contienen sólo uno a cuatro residuos de azúcar.
• los oligosacáridos N-ligados son más frecuentes, más grandes y más complejos, y contienen varias ramas en las células de mamí
fero.
Después de la glucosilación inicial de una proteína en el RE, la cadena del oligosacáridos es modificada en el RE y normalmente t
ambién en el Golgi.
La formación de puentes disulfuro, el plegado de proteínas y el ensamblaje de proteínas multiméricas, que tienen lugar exclusivam
ente en el RER, es de vital importancia: sólo las proteínas plegadas y ensambladas adecuadamente son transportadas del RER al
complejo de Golgi y por último a la superficie celular u otro destino final. Las proteínas desplegadas, mal plegadas o parcialmente
plegadas y ensambladas son retenidas selectivamente en el RER.
Las secuencias de señalización hacia el RE del N-terminal son escindidas de las proteínas secretorias y de las proteínas de membra
na tipo I en el RE. Algunas proteínas también son sometidas a otros cortes proteolíticos específicos en el complejo de Golgi o en l
as vesículas secretorias en formación.

Un oligosacárido N-ligado preformado se agrega a muchas proteínas en el RER


La biosíntesis de todos los oligosacáridos N-ligados empieza en el RER con el agregado de un precursor oligosacárido preformado
. La estructura de este precursor es la misma en las plantas, los animales y los eucariotas unicelulares: un oligosacárido ramificado
, que contiene:
• tres moléculas de glucosa (Glu)
• nueve de manosa (Man)
• dos de N-acetilglucosamina (Glu-NAc)
Estructuralmente se lo puede denotar como: (Glu) 3(Man)9(Glu-NAc)2
Esta estructura de hidrato de carbono ramificado es modificada en el RE y el complejo de Golgi, pero en las proteínas secretorias
y de membrana se conservan 5 de los 14 residuos en las estructuras de todos los oligosacáridos N-ligados.

Los puentes disulfuro son formados y reordenados por proteínas de la luz del RE
Los enlaces disulfuro (-S-S-) intramoleculares e intermoleculares ayudan a estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria de much
as proteínas. Estos enlaces covalentes se forman por el enlace oxidativo de grupos sulfhidrilo (-SH), también conocidos como gru
pos tiol, existentes en dos residuos de cisteína de la misma o diferentes cadenas polipeptídicas. Esta reacción puede tener lugar esp
ontáneamente sólo cuando hay un agente oxidante adecuado. En las células eucariotas, los puentes disulfuro se forman sólo en la l
uz del RER; en las células bacterianas, se forman en el espacio periplasmático entre la membrana interna y externa. Por lo tanto, l
os enlaces disulfuro sólo se encuentran en las proteínas secretorias y en los dominios exoplasmáticos de las proteínas de membran
a. Las proteínas citosólicas y las proteínas de los organelas sintetizados en los ribosomas libres carecen de enlaces disulfuro y dep
enden de otras interacciones para estabilizar sus estructuras. La formación eficiente de enlaces disulfuro en la luz del RE depende
de la enzima disulfuro isomerasa de proteínas (PDI) presente en todas las células eucariotas. Esta enzima es especialmente abunda
nte en el RE de las células secretorias de órganos como el hígado y el páncreas, donde se producen grandes cantidades de proteína
s que contienen puentes disulfuro. El puente disulfuro en el sitio activo de la PDI puede transferirse con facilidad a una proteína p
or dos reacciones secuenciales de transferencia de tiol-disulfuro. La PDI reducida generada por esta reacción vuelve a su forma ox
idada por la acción de una proteína residente en el RE, denominada Ero 1, que lleva un puente disulfuro que puede transferirse a la
PDI.
En las proteínas que contienen más de un puente disulfuro, el apareamiento apropiado de los residuos de cisteína es esencial para a
segurar una estructura y actividad normales. Por lo general, los puentes disulfuro se forman entre cisteínas que se encuentran segui
das en la secuencia de aminoácidos mientras un polipéptido todavía está creciendo en el ribosoma. Sin embargo, esta formación se
cuencial algunas veces produce puentes disulfuro entre cisteínas que no corresponden.
En las células, la redisposición de los enlaces disulfuro también es acelerada por la PDI, que actúa sobre un amplio rango de sustra
tos proteicos, permitiéndoles alcanzar su estructura termodinámicamente más estable. Los puentes disulfuro suelen formarse en un
orden específico, estabilizando primero dominios pequeños de un polipéptido y luego las interacciones de segmentos más distante
s.

Las chaperonas y otras proteínas del RE facilitan el plegado y el ensamblaje de las proteínas
Aunque algunas proteínas reducidas desnaturalizadas pueden plegarse espontáneamente a su estado nativo in vitro, este plegado s
uele requerir horas para completarse. En cambio, las nuevas proteinas solubles y de membrana producidas en el RE se pliegan hast
a alcanzar su estructura adecuada minutos después de su síntesis. El plegado rápido de estas proteínas recién sintetizadas en las cél
ulas depende del efecto secuencial de varias proteínas presentes dentro de la luz del RE.
• La chaperona BiP puede manejar la translocación postraduccional en las levaduras, uniéndose a los polipéptidos totalmente sinte
tizados a medida que ingresan en el RE. La BiP también puede unirse tempranamente a las cadenas nacientes; cuando ingresan en
el RE durante la translocación cotraduccional. BiP unida impide que segmentos de una cadena naciente se plieguen mal o formen
agregados, promoviendo así el plegado de todo el polipéptido en su estructura apropiada.
• La disulfuro isomerasa de proteínas (PDI) también contribuye al plegado apropiado, que en muchas proteínas se estabiliza por lo
s puentes disulfuro.
• Otras dos proteínas del RE, los homólogos de lectinas (proteínas ligadoras de h1dratos de carbono) calnexina y calrreticulina, se
unen selectivamente a ciertos oligosacáridos N-ligados en las cadenas nacientes en crecimiento. El ligando para estas dos lectinas,
que contienen un solo residuo de glucosa, se genera por una glucosiltransferasa específica presente en la luz del RE. Esta enzima s
olo actúa sobre cadenas polipeptídica que están desplegadas o mal plegadas. La unión de la calnexina y la calrreticulina a las cade
nas nacientes desplegadas impide la agregación de segmentos adyacentes de una proteina mientras se esta sintetizando en el RE. A
sí, la calnexina y la calrreticulina, como el BiP, previenen el plegado prematuro incorrecto de segmentos de una proteína recién si
ntetizada.
• Otras enzimas importantes del plegado de las proteínas en la luz del RE son las peptidil-prolil isomerasas, una familia de enzima
s que aceleran la rotación alrededor de los puentes peptidil-prolil en los segmentos del plegado de un polipéptido:
Estas isomerizaciones a veces son el paso que limita la velocidad de plegado de los dominios de las proteínas
Muchas peptidil-prolil isomerasas pueden catalizar indiscriminadamente la rotación de los puentes peptidil-prolil isomerasas expu
estos en numerosas proteínas, pero algunas tienen sustratos proteicos muy específicos.
Las proteínas tipo silvestre (wild type) que se sintetizan en el RER no pueden abandonar este compartimiento hasta que alcanzan s
u estructura completamente plegada. En forma similar, casi cualquier mutación que impide el plegado apropiado de una proteína e
n el RE también bloquea el desplazamiento del polipéptido de la luz del RE o de la membrana al complejo de Golgi. Es probable q
ue los mecanismos para retener las proteínas desplegadas o plegadas incompletamente dentro del RE aumenten la eficacia global d
el plegado manteniendo las formas intermedias en proximidad de los enzimas de plegado, que son muy abundantes en el RE. Por l
o general, las proteínas plegadas inadecuadamente retenidas dentro del RE se unen en forma permanente a las chaperonas del RE
BiP y calnexina. Así, estas enzimas luminales de plegado tienen dos funciones relacionadas: ayudan al plegado de las proteínas no
rmales impidiendo su agregación y se unen a proteínas irreversiblemente mal plegadas. Las células de mamíferos y las levaduras r
esponden a la presencia de proteínas desplegadas dentro del RER aumentando la transcripción de varios genes que codifican chap
eronas del RE y otros enzimas de plegado.

A menudo las proteínas no ensambladas o mal plegadas presentes en el RE son transportadas al citosol para su degradación
Las proteínas secretorias y de membrana mal plegadas, así como las subunidades de proteínas multiméricas no ensambladas, a me
nudo se degradan una hora o dos después de su síntesis en el RER.
Las proteínas secretorias y de membrana mal plegadas son transportadas fuera de la luz del RE, siguiendo un camino "al revés" a t
ravés del translocón, hacia el citosol, donde son degradadas por la vía proteolítica mediada por la ubiquitina.. La enzimas ubiquiti
nilantes localizadas en la superficie citosólica del RE agregan ubiquitina a las proteínas mal plegadas del RE cuando salen de éste.
Esta reacción, que se acompaña por hidrólisis de ATP, puede proporcionar parte de la energía necesaria para llevar estas proteínas
nuevamente al citosol. Los polipéptidos poliubiquitinilados resultantes son rápidamente degradados en los proteosomas.
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TECNICAS RELACIONADAS CON EXPRESIÓN GÉNICA
• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA BETA G
ALACTOSIDASA
Se hace uso de una medida indirecta. Se utiliza como un sustrato que sea reconocido por la enzima (el X-gal) para dar un producto
coloreado (X, azul). La intensidad del color será proporcional a la actividad de la enzima. Esto solo se cumple en condiciones de s
ustrato saturantes. Se utiliza como unidad enzimática a las unidades Miller.
UM = 1000 × DO480/ t v DO600
donde:
t = tiempo de reacción (en min)
v = volumen del cultivo usado en el ensayo (en mL)

La fracción DO480/DO600 representa indirectamente al numero de mRNA del operón lac generados con respecto al numero de bac
terias. Esto es necesario ya que permite estandarizar el numero de mRNA generados, en promedio, por bacteria.
De no ser así, se podría cometer un error al suponer que una muestra genera mayor numero de mRNA que otra muestra a una dete
rminada condición cuando en realidad, no es que haya mas inducción del operón lac sino que el numero de bacterias es mayor y p
or ende va haber mayor coloración.
Por lo general se utiliza como inductor al IPTG y como sustrato colorimétrico al ONPG, el cual genera una coloración amarillenta.
Se utiliza la propiedad de que el ONPG en medio básico se desprotona aumentando su absorbancia en una longitud de onda de 42
0. El medio básico, a su vez, desestabiliza a la beta-galactosidasa de manera que también se detiene la reacción. Se utiliza al Na2C
O3 como medio para alcalinizar.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA LA CUANTIFICACIÓN DEL mRNA DEL OPERON LAC


• Antes del tiempo t = 0, el LacI reprime la transcripción del operón.
• El complejo LacI – IPTG “activa” la transcripción de lac por inhibición del represor.
• Como el RNAm tiene una vida media corta, llega un momento que hay un equilibrio entre su síntesis y degradación.
Esto permite evitar derroche energético. Al tener un tmedio corto inmediatamente despues de que se corta el estimulo cae la mRNA
debido a que se degradan rápidamente. Si estos fueron estables aun cuando se corta la señal seguiría habiendo transcripción a lo l
argo del tiempo.
Al sacar el IPTG, la curva rápidamente caerá (pendiente negativa).

DISEÑO DE SONDAS:
Las sondas se arman con transcriptasa reversa empleando ramdom primers, que son oligonucleótidos sintetizados químicamente d
e 6 nucleótidos ordenados al azar, de manera que son fragmentos inespecíficos que se aparea con cualquier RNA.
Los nucleótidos deben estar marcados, generalmente de forma radiactiva.
Otra forma de marcar sondas es empleando nucleótidos que tienen biotina el cual interactúa con la estreptavidina, el cual está unid
a a una enzima cuya reacción que cataliza genera un producto fluorescente o coloreado.

NORTHERN BLOT:
• Se toma alícuotas a distintos tiempos.
• Se centrifuga
• Buffer de lisis
• Extracción de RNA
• Corrida electroforética: desnaturalizante, agregado de agente renaturalizante y un agente intercalante para revelar (corrida por ta
maño). Habrá una chorreado de RNA con algunas bandas mas prominentes. Estos son los mas estables o con mas t medios mas gr
andes. Se observara bandas mas prominentes correspondientes al rRNA debido a que son mas estables.
• Empleando un papel de nitrocelulosa se realiza una impresión del patrón. Se hace una pre-hibridación para evitar interacciones i
nespecíficas. Se agrega la sonda marcada y se revela.
CONTROL INTERNO
Permite normalizar el gen de interés. Esto es, permite saber las proporciones que se transcriben en determinadas condiciones por e
jemplo en presencia de hormonas.

La cuantificación exacta de los niveles de ARNm requiere la normalización del gen de interés para un gen con niveles transcripcio
nales que no varían a través del ciclo celular o con un tratamiento particular.
Los cambios en la expresión bajo determinadas condiciones debe ser normalizado empleando housekeeping genes. Estos son gene
s que se expresan en todos los tejidos, aproximadamente en la misma proporción (genes constitutivos). Estos no presentan una reg
ulación extra (ni represores ni activadores) de manera que su la concentración de mRNA es independiente de las condiciones celul
ares.
Los genes que se utilizan como estándar son: la actina, G3PD, albúmina, entre otros.
El aumento de veces corregido es igual es igual a la razón entre lo incremento el gen target y lo que incremento el gen housekeepi
ng, en unidades arbitrarias (absorbancia, fluorescencia, radiactividad, etc).

DOT BLOT
Se prepara un cultivo de bacterias con un medio que tiene uridina tritiada.
• Se toma alícuotas a distintos tiempos.
• Se centrifuga
• Buffer de lisis
• Extracción de RNA
• Se usa DNA no marcado ligado al soporte solido, luego se lava todo el RNA no marcado.
Se apreciada en las placas un aumento de la marca proveniente del mRNA radiactivo a medida que aumenta el tiempo, hasta que s
e mantiene constante.

RT-qPCR
La PCR a tiempo real o PCR cuantitativa es una variación de la PCR estándar utilizada para la cuantificación de DNA o de RNA
mensajero (mRNA) de una muestra. Utilizando primers específicos de secuencia, es posible determinar el número de copias o la c
antidad relativa de una determinada secuencia de DNA o RNA. Cuando la PCR a tiempo real se combina con una reacción de retr
o-transcripción o RT (RT-PCR), puede determinarse la cantidad de mRNA de una muestra mediante una cuantificación relativa.
Dicha cuantificación se denomina relativa ya que se compara entre diferentes muestras (tejidos, tratamientos, etc) la cantidad relat
iva o relación del mRNA de un gen específico respecto a la cantidad de mRNA de un gen constitutivo (control endógeno).
Para la cuantificación, se mide en cada ciclo de PCR la cantidad de amplicón producido. La cuantificación del producto se produc
e mediante la adición de fluoróforos que se unen al amplicón de forma cuantitativa, de forma que a mayor producto mayor fluores
cencia se emitirá. Los sistemas de PCR a tiempo real detectan la cantidad de fluorescencia producida en cada ciclo de PCR y los
softwares de análisis representan dicha fluorescencia gráficamente respecto al número de ciclos. La cantidad de amplicón produci
do es proporcional al número de moléculas de RNA/DNA iniciales, de forma que en aquellas muestras con mayor expresión del
gen el amplicón fluorescente aparecerá en ciclos anteriores.
Tipos de fluoróforos
Se utilizan principalmente dos tipos de fluoróforos.
• SYBR Green o Eva Green: se unen al DNA de doble cadena de manera inespecífica.
El SYBR Green o el Eva Green se unen inespecíficamente al DNA de doble cadena y producen fluorescencia. Estos fluoróforos n
o son específicos ya que se unen a toda molécula de DNA de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer. El uso de
SYBR Green o Eva Green implica un diseño muy cuidadoso de los primers con el fin de evitar dímeros de primer, y e
vitar la amplificación de DNA genómico contaminante en la muestra de cDNA, para ello, deben diseñarse los primers de
forma que el amplicón contenga secuencias de diferentes exones.
• Sondas de hidrólisis TaqMan-MGB o UPLs: se unen al DNA doble cadena de manera especifica.
Esta técnica permite la cuantificación específica del cDNA de interés incluso en la presencia de amplificación inespecífic
a (dímeros de primer, DNAg).
Controles endógenos
La medida de la expresión génica por medio de RT-PCR es una cuantificación relativa, en la que se compara entre las diferentes
muestras la expresión del gen objeto de estudio respecto a la expresión de un gen constitutivo cuya expresión no varía en las condi
ciones del experimento (control endógeno). Es lo que se denomina como normalización de la expresión del gen específico, o norm
alizar respecto a la diferente concentración de RNA total de las muestras, ya que si la cantidad de control endógeno varía es debid
o a cambios en la cantidad de RNA total empleada en la síntesis de cDNA, no a cambios en su expresión. Es el mismo control qu
e se hace en Northern blot.

• MACROARRAYS (CHIPS DE DNA)


Permite el análisis de varios mRNA en simultáneo de distintos tejidos o en distintas condiciones.
- se extrae RNA de los tejidos (por ejemplo, hepático y muscular).
- se convierte en cDNA empleando transcripción reversa. Se utiliza primers marcados con nucleótidos fluorescentes (de distinto c
olor por ejemplo rojo para el hepático y verde para el muscular) para cada tejido.
- si se hace una mezcla de ambos cDNA, se puede saber la proporción del RNA en cada tejido. En los pocillo se vera rojo si el mR
NA es abundante en el tejido hepático, verde si el mRNA es abundante en tejido muscular, o amarillo si la proporción es mas o me
nos igual.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA LA DETERMINACIÓN DE LA INTERACCION DNA – PROTEINA

EMSA

En el EMSA se hacen correr dos muestras:


• por un lado el fragmento de DNA que contiene la posible secuencia de unión a la proteina. (tubo I)
• por otro lado, el fragmento de DNA incubada con la proteína, de manera que se forme el complejo. (tubo II)
El tubo II se filtra con filtro de nitrocelulosa (retención por filtro). En él se retienen el complejo y la proteina libre que no haya hib
ridado.
Al hacerlas correr electroforéticamente, estas dos especies migran a distintas velocidades.
Para verificar la secuencia de unión de la proteína se utiliza técnicas de hibridación por sonda marcada.
Para verificar si la proteina de interés es la que interactúa realmente, se pueden utilizar anticuerpos específicos para dicha proteina
.

ENSAYO DE FOOTPRINTING
Se utiliza para identificar las secuencias de DNA a las que se une una proteina determinada. Se aísla un fragmento de DNA que su
puestamente contiene secuencias reconocidas por un proteina de unión al ADN y se marca radiactivamente un extremo de una de l
as secuencias.
Por lo general, esto se logra tratando un conjunto de fragmentos de restricción mas largos con una enzima que fija marcadores en
ambos extremos y, despues, se cortan estas moleculas marcadas con una segunda enzima de restricción y se purifica uno de los co
njuntos de fragmentos terminales.
A fragmentos continuación se utilizan reactivos químicos o enzimáticos para introducir roturas al azar en el fragmento de DNA (d
ebe estar a punto para que haya de promedio, un corte por molécula). La separación de los productos de corte radiactivos (fragmen
tos rotos de distintas longitudes) mediante electroforesis de alta resolución produce una “escalera” de bandas radiactivas. En un tu
bo aparte se repite el procedimiento de corte con el fragmento de DNA original al que se ha unido la proteina. Los dos conjuntos d
e productos de corte se analizan y comparan por electroforesis. En la “escalera” de bandas radiactivas obtenidas de la muestra que
contiene la proteina se observa un agujero (huella), atribuible al DNA protegido por la proteina unida, que identifica las secuencia
s reconocidas pro la proteina.
Se puede determinar la localización precisa del sitio de unión de la proteina por secuenciación directa del mismo fragmento de DN
A, incluyendo los carriles de secuenciación en el mismo gel que la huella.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROMOTORA


Permite determinar que secuencias son fundamentales para que un promotor sea funcional.
El procedimiento es el siguiente:
• Se clona un fragmento de DNA (promotor) con un sitio de inicio de la transcripción en un vector plasmídico.
• El plásmido se torna lineal por digestión con una enzima de restricción que corta en el extremo hacia 5’ del fragmento que se est
a analizando
• El DNA linealizado se digiere entonces con una exonucleasa durante periodos diferentes, de manera que de cada extremo se elim
inen segmentos de longitudes cada vez mayores.
• Tras la adición de un ligador de oligonucleótidos sintético y la digestión con las enzimas de restricción (diferentes), los fragment
os eliminados se clonan en un vector plasmídico con un gen reportero. Un gen reportero es aquel que es fácilmente detectable (col
oración: beta-galactosidasa; fluorescencia: GFP; luminiscencia: lux)
• Los plásmidos con deleciones de diversas longitudes hacia 5’ del sitio de inicio de la transcripción se transfectan luego a células
de cultivo y se analiza la expresión del gen reportero.

Se liga el promotor de estudio con un gen reportero:


• Las flechas representan al gen reportero.
• Las líneas mas oscuras son las secuencias que se van quitando.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL DEL PUNTO DE INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN


PRIMER EXTENSION + SECUANCIACIÓN
Permite ubicar la region reguladora, además de poder mapear los extremos 5’ del RNA.
El procedimiento de primer extensión se puede separar en dos etapas:
- Se agrega un primer marcado al transcrito y se sintetiza DNA. El primer debe ser complementario a una región cerca del extrem
o 3’ del mRNA. Se utiliza la transcriptasa reversa para sintetizar cDNA desde el mRNA hasta que alcanza el extremo 5’ del RNA.
- Se secuencia el DNA molde (igual cDNA porque es complementario al mRNA que es igual al DNA codificante que es complem
entario al molde). Se amplifica el DNA por PCR, empleando el mismo primer que en la RT-PCR. Se utiliza el método del dideoxi
(método de Sanger). Se hace en una electroforesis desnaturalizante.
El método permite determinar el +1 de la transcripción debido a que el mRNA comienza a sintetizar a partir de este punto, de man
era que la síntesis de cDNA determinara en ese punto.
Si se comparan las bandas de la corrida electroforética del DNA y del patrón de la secuenciación, se puede decir que la calle que t
enga una banda con el mismo tamaño que el del DNA molde es el nucleótido +1 de la transcripción. Esto es porque, si suponemos
que tienen el mismo tamaño, deben recorrer una misma distancia en el gel.
Los nucleótidos que estén por encima de este nucleótido (en la corrida) estarán upstream, de manera que se pueden estudiar region
es regulatorias, y por debajo (en la corrida) de este nucleótido estamos downstream del +1.

Se lee de arriba abajo como 3’ – 5’:


3’ AGTCAGCTT 5’ cDNA
5’ UCAGUCGAA 3’ mRNA
3’ AGTCAGCT T5’ dsDNA
3’ TCAGTCGAA 3’

• DISEÑO DE PLÁSMIDOS
TRANSCRIPCION IN VITRO
No se puede obtener RNA in vitro porque el mismo es muy inestable. Solo puedo hacerlo en un plásmido, empleando la polimeras

a de T7 (un bacteriófago)
Se puede realizar un ensayo para saber si el RNA es autocatalíticos:
En dos muestras de RNA obtenidas de bacterias transformadas con este plásmido, se agregan NTPs. Si sufren procesamiento son
del tipo autocatalíticos, para saber si son del tipo I o II se sigue el siguiente razonamiento:
Si en el tubo I (sin NTP): no hubo procesamiento

TUBO I (con nucleótidos) TUBO II (sin nucleótidos) INTRON


RESULTADO I SI SI Tipo I o Tipo II
RESULTADO II NO NO Tipo III
RESULTADO III SI NO Tipo I
RESULTADO IV NO SI Tipo II

VECTOR PLASMIDICO DE EXPRESIÓN


• DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DE LA SECUENCIA DE EVENTOS DEL SPLICING
Se aísla el núcleo para eliminar rápido los RNA y evaluar solo la síntesis y el procesamiento del ismo.
Se hace un pulso con nucleótidos radiactivos. Los núcleos incorporan NTP a través del poro nuclear. Se incuba con ribonucleósid
os radiactivos. Se ajusta el t del pulso. Se diluye con un exceso de ribonucleósidos radiactivos.
Se toman alícuotas de distintos tiempos, viendo como ,a radiactividad viaja a los distintas formas de la molécula de origen.
Para estudiar los productos de transcripción de una determinada polimerasa se usa alfa-amanitina (inhibidor).

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: DETECCION DE LA CROMATINA ACETILADA, DESCONDENSADA Y TRANS


CRIPCIONALMENTE ACTIVA
CHIP: DETECCION POR INMUNOPRECIPOTACION DE LA CROMATINA
Permite detectar la acetilación de las histonas y evaluar su relacion con el nivel transcripcional de un ges de interés.
- Se preparan anticuerpos contra extremos de Lys Nt acetiladas. Esto permite detectar los tramos en donde la Lys no esta acetilada
en la muestra de DNA debido a que solo reconoce las Lys acetiladas.
- se desarma los nucleosomas, y se usa primers para detectar si el gen esta bajo la forma de cromatina condensada.

ACCESIBILIDAD DE LA DNAasa I
Permite evaluar que genes dejan de ser transcripcionalmente activos o al revés (genes que eran inactivos y pasan a ser activos ) en
células que se diferenciaron o en diferentes tejidos celulares.
- Se prepara cromatina descondensada de eritroblastos , y se prepara cromatina condensada de eritrocitos.
El gen de la beta-globina se encuentra en el mismo tramo de DNA, por lo que se puede cortar el gen de interés con enzimas de rest
ricción.
Se agregan [DNAasa I] en concentraciones ascendentes en ambas muestras.
A medida que aumenta la concentración de DNAasa I una de las dos bandas ira desapareciendo como producto de su degradación
(es el caso del DNA descondensado), mientras que la banda del DNA que esta condensado se mantendrá aprox igual en todas las c
oncentraciones empleadas.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRES Y SU DIFERENCIACION A DISTINTAS C


ÉLULAS
Se han encontrado los genes y factores de transcripción que produce la desdiferenciación de determinadas células, llamadas en co
njunto genes de Yamanaka.
Estos genes son incorporados a virus recombinantes, el cual aprovechando su mecanismo de infección (transfección), se puede obt
ener células madres de distintos tejidos eucariotas de mamíferos.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: IDENTIFICACION DE SECUENCIAS METILADAS


La secuencia metilada es CCGC.
Las enzimas HPaII no digieren esta secuencia cuando esta metilada.
Las enzimas MSPI digiere esta secuencia cuando esta metilada

• DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL: LINKER SCANNING MUTATIONS


Las mutaciones rastreadoras de ligadores identifican los elementos de control transcripcional.
• Una región de DNA eucariota que sustenta un alto nivel de expresión de un gen indicador (o reportero) se clona en un vector pla
smídico.
• Desde un extremo de la región bajo análisis al otro se introducen mutaciones rastreadoras de ligadores que se superponen. Estas
mutaciones son el resultado de la mezcla irregular de la secuencia nucleotídica en un segmento corto de DNA.
• Después que los plásmidos mutantes se transfectaron por separado a células cultivadas, se analiza la actividad del producto del g
en reportero.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: IN VIVO TRANSFECTION


El ensayo de transfección in vivo mide la actividad transcripcional para evaluar proteínas que se creen que son factores de transcri
pción.
• el sistema de ensayo requiere dos plásmidos.
- Un plásmido contiene el gen codificante del supuesto factor de transcripción (proteína X).
- Un segundo plásmido contiene un gen reportero y uno o más sitios de unión para la proteína X.
Ambos plásmidos se introducen simultáneamente en las células que carecen del gen codificante de la proteína X (knock out para e
l gen x). Se mide la producción de transcriptos de RNA del gen reportero; alternativamente se puede analizar la actividad de la pro
teína codificada. Si la transcripción del gen indicador es mayor en presencia del plásmido codificante de X, entonces la proteína es
un activador; si la transcripción es menor, entonces es un represor. Mediante el uso de plásmidos que codifican un factor de transc
ripción mutado o reordenado, es posible identificar dominios importantes de la proteína.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: DISEÑO DE MUTANTES POR DELECION CON UNA CONSTRUCCION REPOR
TERA PARA LA DETECCION DE DOMINIOS FUNCIONALES
La construcción deberá contener un gen reportero como lacZ y una caja TATA ligada a un elemento regulador (R) que contiene v
arios sitios de unión para un factor de transcripción (FT) (generalmente activador, pero también sirve para represores transcripcion
ales).
Las construcciones del gen reportero y el DNA que codifica al factor de transcripción de tipo silvestre o mutante (eliminado) fuero
n introducidas simultáneamente en células eucariotas mutantes para FT y se analiza la actividad de la beta-galactosidasa expresada
a partir de lacZ. La actividad será más alta si el DNA de R introducido codifica una proteína funcional.
Las deleciones (eliminaciones) de los aminoácidos N-terminales en un dado punto anulan la capacidad de FT para unirse a la R y
para de estimular la expresión de la beta-gal a partir del gen indicador.
También se hacen deleciones en el extremo C-terminal.
De esta manera se puede localizar el dominio de unión al DNA en el N-terminal de la region R. La capacidad para activar la expre
sión de la beta-galactosidasa no se elimina totalmente a menos que se suprima alguna región comprometida funcionalmente.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: IMPORTACIÓN CO-TRADUCCIONAL DE LAS PROTEINAS DEL RE


En el caso de que la translocación de una determinada proteina sea co-transcripcional:
• en el primer ensayo se vera que las proteinas serán susceptibles a la proteólisis.
• en el segundo ensayo no se vera afectada.
El péptido señal se pierde durante la translocación.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: IMPORTACIÓN POST-TRADUCCIONAL DE LAS PROTEINAS DE MITOCOND


RIAS, CLOROPLASTOS, PEROXISOMAS O NUCLEOS
En primer lugar se debe aislar la organela en cuestión, en la que se cree que la proteina transloca.
Se realiza una traducción in vitro y se agrega la organela.
Si la proteina se transloca no debería de haber proteólisis.

Diseño: se realiza una RT-PCR para obtener cDNA doble cadena. Se prepara de manera tal que contenga todos los elementos de
un gen, es decir, un ORF, las regiones no traducibles 5’ y 3’ UTR, el promotor y el ter.
Tanto el promotor como el ter pueden ser pertenecientes a la de la RNApol T7, que mediante por transcripción in vitro, se obtiene
una gran cantidad de mRNA. En primer lugar se incorpora el fragmento de cDNA en un plásmido con todas sus elementos, y por t
ransformación, se emplea la maquinaria enzimática para la amplificación.

Una vez obtenido el plásmido, mediante traducción in vivo empleando aminoácidos marcados, y finalmente se agregan las mitoco
ndrias.

Un ensayo similar se lo puede hacer in vivo:


Por ejemplo, se quiere evaluar la translocación del receptor de glucocorticoide en el núcleo.
Se utilizara la expresión de beta-gal revelado con anticuerpo.
• se transfectan la beta-gal a las células. Tiene que haber un promotor adecuado que indique la presencia del GR.
Diseño:

Este plásmido debe ser clonado por transfección.


• Se pone el anticuerpo anti beta-gal. Se vera presencia del mismo tanto en presencia del glucocorticoide como en ausencia, y se v
era solo en el citosol.
• Se arma quimeras que tenga fragmentos del gen del receptor del glucocorticoide. Se vera que en presencia de hormona, la protei
na se transloca al núcleo. De esta manera, se puede saber que porción del polipéptido es el responsable de la translocación del gluc
ocorticoide.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: DETERMINAR SI UNA PROTEINA ES DE MEMBRANA


Se realiza dos ensayos de traducción in vivo, en presencia de microsomas.
• en uno se realiza sin agregar proteasas.
• en el otro se agrega proteasas.
Se aísla la proteina en ambos casos y se realiza una corrida electroforética. Se marca con anticuerpos, en el caso de que la proteina
con la proteasa de una banda mucho inferior a la banda de sin proteasa es porque parte de su secuencia fue removida.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: DETERMINACION DEL EXTREMO Nt o Ct EN LA CARA EXTRACELULAR


Una vez tratada la proteina con la proteasa, se puede verificar a través de un mapa peptídico, si el extremo es Nt o Ct.
El mapa peptídico es una técnica analítica que permite determinar con mas facilidad diferencias entre proteinas relacionadas, ya se
a por modificaciones covalentes, proteinas homologas de dos especies, alguna mutación puntual, etc.
Esto se hace realizando digeridos parciales de una proteina. La base consiste en emplear las mismas condiciones de hidrolisis en a
mbas muestras, de manera que teóricamente se tendrán los mismo cortes y por ende los mismos fragmentos. De esta manera, cual
quier variación en alguna de las proteina afectara a un fragmento en particular. Se puede analizar este fragmento para determinar l
as variantes que ocasionan ese corrimiento en el comportamiento.
La forma de analizar los fragmentos son variados entre ellos:
• movilidad electroforética, por electroforesis bidimensional
• tiempo de elución, HPLC
• movilidad electroforética, SDS-PAGE
Todos estas técnicas, a su vez tienen la ventaja que permiten aislar el péptido, para su posterior secuenciación, y comparación.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: SI LA PROTEINA SUFRIO PROCESOS DE GLUCOSILACIÓN


En un tercer ensayo se puede determinar si la proteina transmembrana se encuentra glucosilada. Las proteinas se glucosilan durant
e la translocación, de manera que se puede saber, si se emplean glucosilasas que hidrolicen el azúcar.
En una tercera calle se siembra la proteina tratada glucosilasa, y si hay diferencias con la proteina de membrana sin tratamiento de
proteasa es porque se encontraba glucosilada.

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: SI LA PROTEINA PRESENTA PASOS A TRAVES DE LA MEMBRANA.


Esto se le puede determinar de mi misma manera de como se procedió para saber si la proteina es transmembrana. Si se lo trata co
n proteasas, se puede saber incluso cuantos pasos tiene por la membrana. De esta manera si por ejemplo tiene dos pasos, se verán
dos fragmentos

• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: PUENTES DISULFURO


Las proteinas con mas de un monómero se comporta como una única proteina
. Si se realiza un SDS-PAGE desnaturalizante, en donde las proteinas corran por peso molecular, y además, se eliminen las diferen
tes interacciones intra e intercatenarios, se puede saber el numero de subunidades.
Sabiendo el PM de la proteina intacta, se hace correr en condiciones reductoras y desnaturalizantes, si ahora el PM de la proteina d
a que es la mitad que la proteina intacta implica que tiene mas de una única subunidad.
------------------------------Elementos del DNA recombinante--------------------------
La clonación del DNA consiste en la separación de un gen especifico o de un fragmento de DNA de un cromosoma mucho mayor
y su unión a una pequeña molécula de DNA portador, para despues replicar este DNA miles o millones de veces, como efecto a la
vez del aumento del numero de células del huésped y de la creación de múltiples copias del DNA clonado en cada célula. El result
ado es la amplificación selectiva de un gen o de un segmento de DNA particular. Esto se realiza utilizando vectores de clonación.
Finalmente, ese gen amplificado puede ser utilizado para obtener en cantidades considerables su producto de expresión. Esto se re
aliza empleando vectores de clonación.
La tecnología del DNA como metodología para generar múltiples copias de un gen presenta las siguientes ventajas:
- La capacidad de crecimiento bacteriano.
- Maquinaria enzimática para la replicación.
- Se emplean plásmidos pequeños con capacidad de autorreplicarse.
La técnica toma su relevancia en el ultimo punto. El plásmido es material genético extracromosomal circular con capacidad de aut
orreplicarse. Los plásmidos de alguna manera, se podrían clasificar en dos tipos:
- los que presentan el mismo origen de replicación que el gDNA.
Si ambos presentan el mismo origen de replicación, la enzima DNApol bacteriana puede replicar tanto el gDNA como el pDNA.
- y lo que no tienen el mismo origen de replicación.
En este caso, cada uno se replica con un mecanismo diferente y de forma independiente. Por lo general, los mecanismos de replica
ción en este tipo de pDNA es mucho mas eficiente porque realiza muchísimas mas copias por cada moléculas de pDNA, debido a
que no depende del estadio celular de la bacteria.
Se usa pDNA y no gDNA debido a las diferencias de tamaños. El gDNA es mucho mas grande lo cual hace que sea difícil de man
ipularlo, además de haber mucho menos probabilidad de transformar a la bacteria, por el tamaño del vector.

La tecnología del DNA de cualquier organismo consta de las siguientes etapas:


1- Evaluar la estrategia para la obtención del DNA recombinante.
2- Selección del vector de clonado (o de expresión)
3- Ligación del fragmento al vector de clonado (o de expresión)
4- Transformación de la bacteria (transfección en eucariotas)
5- Identificación y selección de las células huésped que contienen el DNA recombinante.
6- Selección del gen insertado en el vector de clonación/expresión.
7- Caracterización y expresión de los fragmentos de DNA clonados.

1 – EVALUACIÓN DE LA ESTRATEGIA PARA LA OBTENCIÓN DEL DNA RECOMBINANTE


Existen básicamente dos estrategias posibles:
A- Cuando conozco la secuencia del genoma, o en su defecto, se conoce la secuencia de un gen homologo en otra especie.
• Si se quiere clonar genes procarióticos, el mismo se puede directamente por diseño de primers y amplificación por PCR. Si se qu
iere clonar genes eucarióticos, la estrategia es la misma.
• Si se quiere expresar genes procarióticos, el gen puede ser incorporado directamente al vector de expresión, empleando técnicas
de PCR para la amplificación del gen. Si se quiere expresar genes eucarióticos, debe usarse el cDNA para que el mismo puede pro
ducir la proteina eucariota funcional (esto se debe a que el gen contiene tanto exones como intrones, cosa que no ocurre en genes p
rocariotas).
B- Cuando no conozco la secuencia del genoma.
• Si se quiere clonar fragmentos de DNA procarióticos, debe armarse una biblioteca genómica. Si se quiere clonar fragmentos de
DNA eucarióticos, debe armarse también una biblioteca genómica.
• Si se quieren expresar fragmentos de DNA procarióticos, también se requiere al uso de bibliotecas genómicas, incorporando el fr
agmento de interés al vector de expresión. La expresión de fragmentos de DNA eucarióticos requieren del armado de una bibliotec
a de cDNA.

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Una de las enzimas base para producir y propagar una molécula de DNA recombinante son las enzimas de restricción.
Las endonucleasas de restricción (o enzimas de restricción) reconocen y cortan el DNA en secuencias especificas (sitios de restric
ción), generando una serie de fragmentos mas pequeños.
Las endonucleasas de restricción se encuentran en muchas especies bacterianas, y su funcion es reconocer y cortar DNA foráneo (
procedente de otro lugar), como puede ser el caso de DNA de un virus infeccioso. En el DNA de la célula huésped, la secuencia re
conocida por la propia endonucleasa de restricción esta protegida de la digestión (el corte por parte de la endonucleasa) por metila
ción del DNA, catalizada por una metilasa de DNA especifica (la metilación evita que las endonucleasas corten el DNA propio de
la bacteria). El conjunto formado por la endonucleasa de restricción y la metilasa correspondiente se conoce a veces como sistema
de modificación-restricción.
Hay tres tipos de endonucleasas de restricción, designados como I, II, y III. Los tipos I y III son grandes complejos formados por
múltiples subunidades que contienen, simultáneamente, las actividades endonucleasa y metilasa.
• Las endonucleasas de restricción tipo I (ERI) cortan el DNA al azar, en lugares que pueden encontrarse a 1000 pb o mas de la se
cuencia de reconocimiento.
• Las endonucleasas de restricción tipo III (ERIII) cortan el DNA a unos 25 pares de bases de la secuencia de reconocimiento.
Ambos tipos de enzimas se mueven a lo largo del DNA mediante un mecanismo que necesita ATP.
• Las ERII son mas sencillas no necesitan ATP y cortan el DNA en la misma secuencia de reconocimiento.
Las secuencias reconocidas tienen normalmente de 4 a 6 pares de bases y son palindrómicas.
Una secuencia palindrómica es una secuencia de ácido nucleico (DNA o RNA) que es lo mismo si se lee de 5' (cinco-prima) a 3' (t
res prima) en un filamento o de 5' a 3' en el filamento complementario, con el cual se forma una doble hebra.

Algunas endonucleasas de restricción realizan cortes indentados en las dos hebras del DNA, que dejan de dos a cuatro nucleótidos
desapareados en cada extremo resultante. Se denominan extremos cohesivos, ya que pueden aparearse entre si o con extremos co
hesivos complementarios de otros fragmentos de DNA. Otras endonucleasas de restricción cortan ambas hebras del DNA en los e
nlaces fosfodiéster opuestos, y no dejan bases desapareadas en ningún extremo; estos extremos se denominan extremos romos.

El tamaño medio de los fragmentos producidos al cortar DNA genómico con una determinada endonucleasa de restricción en la m
olécula de DNA, que a su vez, depende en buena medida del tamaño de la secuencia de reconocimiento.
OBTENCION DE GENES POR ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Se extrae gDNA de cualquier tejido, ya que el genoma es el mismo en todos los tejidos. Considerar que las células de ese tejido de
be tener núcleo. Al conocer la secuencia del gen y la secuencia de sus partes flanqueantes, se puede aislar, empleando cortes con e
nzimas de restricción de manera que el gen no se vea afectado. De esta manera, se realiza una digestión parcial, obteniendo fragm
entos de dsDNA.
Una vez obtenido el gen, el numero de copias de este segmento de DNA puede amplificarse enormemente con la PCR.
Uno de los problemas que tiene la obtención de genes por PCR, es que luego de obtener el gen amplificado, se necesita emplear e
nzimas de restricción para acoplarlo a un pDNA, lo cual es critico, ya que si se emplea una enzima de restricción hay que asegurar
se que la secuencia de restricción no se encuentre en el gen de interés.
Se tienen que cumplir tres requisitos para que funcione luego el vector:
1- En primer lugar tiene que haber una secuencia que pueda ser reconocida por la enzima de restricción.
2- En segundo lugar la secuencia de restricción no debe estar incluida en el gen, ya que de ser así, la enzima rompería el gen.
3- En tercer lugar, que el DNA se aparee de manera correcta al plásmido. Esto es importante cuando se quiere expresar el gen, de
manera que el gen sea codificante a una proteina funcional. Da lo mismo la orientación de como se inserta el gen, si solamente se
quiere clonar.
Una forma muy utilizada que solucionan estos problemas, consiste en el diseño y síntesis de primers de manera que contengan el s
itio de corte de una endonucleasa de restricción (como extremos cohesivos).
Esto se utiliza debido a que los productos de PCR presenta en su secuencia los primers, de tal forma que en la secuencia también v
a a estar incorporado la secuencia de restricción.
Si por ejemplo, estamos en el tercer ciclo de la PCR, donde tenemos 8 moléculas de DNA, se ve que los primers se encuentran inc
orporados en el gen de interés. Luego del 30 ciclos, habrán 1 × 109 de estos fragmentos, mientras que solo 6 × 102 fragmentos de l
ongitud variable.
Los extremos cohesivos para mayor seguridad deben hacerse para dos enzimas de restricción diferentes, de manera que solo una d
irección sea la que se pueda aparear con el vector. Es por este motivo que los vectores actualmente poseen secuencias con sitios d
e reconocimiento para varias enzimas de restricción (sitio múltiple de clonado o polylinker).
Por otro lado, emplear dos enzimas de restricción ahorra un paso siguiente: el empleo de la fosfatasa alcalina. Si se emplea una úni
ca enzima de restricción, la probabilidad de que haya recircularización de la enzima sin haber ligado el DNA amplificación es mu
y alta, principalmente por la cercanía de los extremo, y por tratarse de una reacción unimolecular.
La fosfatasa alcalina elimina los grupos fosfatos del plásmido de manera que no hay productos de religación, y la inserción ocurre
porque los fosfatos son aportados por el inserto, lo cual permite la formación del enlace fosfodiéster catalizado por la ligasa. El pr
oblema de la fosfatasa alcalina es que luego hay que inactivar la enzima.
Por ello, para evitar recircularización se debe emplear una [DNA]amplificado >> [DNA]plásmido en una proporción 3 : 1.
El vector de clonación ya tiene el polylinker que viene con varias secuencia de restricción. Por ejemplo:
5' AGGGAAAAGGCCATAACGAT CTA CT TAGCTA …(450 pb)… CTCAGCCGTATCGTTATCAC TCC CGTATGGA 3'
3' TCC CT TTT CCGGTATTGCTAGATGAATCGAT …(450 pb)… GAGTCGG CATAGCAATTG TG AGGGCATACCT 5'
Si se tiene el fragmento de interés dentro de 450 pb, se podrían plantear los primers como secuencias complementarias a las secue
ncias que están en negrita para hacer la PCR, siendo las bases marcadas con negro las regiones que no se van a aparear y van a co
ntener en su lugar los sitios de restricción. De esta manera, el producto de PCR contiene la secuencia de restricción. Los primers p
or lo general son oligonucleótidos de no mas de 20 nucleótidos.
El diseño de primers consiste en hacer complementario los nucleótidos que se apareen por su lado 3’, de manera que pueda trabaja
r la DNApol (un % elevado de GC ayuda en la estabilidad del apareamiento primer-gen). El extremo 5’ va a contener la secuencia
de restricción que no va a ser complementario (es muy poco probable encontrar una secuencia de restricción en particular flanquea
ndo al gen de interés). El extremo 5’ no es necesario que se encuentre apareado porque la DNApol empieza a sintetizar del extrem
o 3’.
Primer directo: 5' AAGTCGGATCTACTTAGCTA 3'
Primer inverso: 5' AAGTAAACGATACGGCTGAG 3'
Los segmentos en cursiva son los sitios de restricción
Una vez obtenidos los fragmentos se procede a la purificación:
Se emplean geles de agarosa. Como las fragmentos a replicar son de unos 450 pb, y los primer a usar son de 20 pb cada, se esperar
ían bandas de 470 pb aprox. En el caso de dar, positivo, para aislarlo:
- Se puede eluir el fragmento de la agarosa.
- Emplear directamente el tubo de PCR.
Este depende de la cantidad de muestra que se necesite, y del grado de purificación.
En el caso de haber muchas bandas en el gel, para usar directamente del tubo de PCR se debe purificar.

OBTENCIÓN DE cDNA POR TRANSCRIPTASA INVERSA


El primer paso para preparar cDNA es aislar todo el mRNA del tipo celular o del tejido de interés. En este caso, como no todos los
tejidos expresan todas las proteinas, hay que elegir aquel que presente mayor expresión del mismo.
Gracias a sus colas de poli A, es muy sencillo separar los mRNA de los rRNA y tRNA presentes en un numero mucho mayor en u
n extracto celular mediante el uso de una columna cuya matriz se adhirieron hebras cortas de timidilato (poli T o poli U).
Se convierte el mRNA a DNA por la transcriptasa inversa. Se trata con base para degradar el mRNA, quedándonos solo con el cD
NA. El cDNA simple hebra se lo hace doble hebra empleando ramdom primers, que son primers de 6 nucleótidos de orden aleator
io, capaces de aparearse fácilmente, es decir, la probabilidad de que uno de los primers se aparee es alta. Se emplea DNApol y liga
sas para terminar la secuencia, y formar la doble hebra. Otra forma es agregando un lynker de poli G ligado al cDNA por la ligasa,
de manera que con utilizar un primer de poli C se puede obtener la doble hebra.
Para volver compatibles los extremos de DNA es a través de la utilización de adaptadores o linkers. Éstos son oligonucleótidos sin
téticos de doble hebra con extremos romos y que presentan un sitio de corte específico para un enzima de restricción. Esto permit
e que una vez que actúe la enzima de restricción se generen extremos cohesivos complementarios a los del vector. Además estos
adaptadores nos permiten que una vez que tengamos el clon podremos recuperar nuestro fragmento y también que al insertar nuest
ro cDNA éste lo haga en la orientación adecuada.

CONSTRUCCION DE BIBIOTECAS GENÓMICAS (BIBLIOTECAS O GENOTECAS)


Se digiere todo el gDNA por degradación parcial. Esto se logra a través del empleo de distintos tiempos de corte de manera que lo
s fragmentos luego en su análisis puedan solaparse. Luego, los fragmentos deben ser incorporados y almacenados en bacterias. De
esta manera, se tendrá todos los fragmentos de un genoma en plásmidos incorporados en una bacteria.
Luego procede al análisis individual de cada uno de los fragmentos.

CONSTRUCCION DE BIBIOTECAS DE cDNA


Es una biblioteca del cual se extrae mucha información redundante porque los mRNA se extraen de tejidos que presentan una alta
expresión génica. De esta manera, un gran % del mRNA va a pertenecer a algunas pocas proteinas.

ANALISIS DE GENOTECAS
Tanto las bibliotecas como las bibliotecas de cDNA de diversos organismos contienen cientos de miles a mas de un millón de clon
es individuales en el caso de las eucariotas superiores. Se dispone de dos metodologías generales para realizar búsquedas en biblio
tecas a fin de identificar clones específicos que porten un gen u otra region de DNA de interés:
1- la detección con sondas de oligonucleótidos que se unen al clon de interés.
2- la detección basada en la expresión de la proteina codificada.
=> HIBRIDACION:
La base para la detección con sondas de oligonucleótidos es la hibridación, la capacidad de moléculas de DNA o RNA de hebra si
mple complementarias de asociarse (hibridar) específicamente entre si mediante el apareamiento de bases. El DNA de hebra doble
(dsADN) puede ser desnaturalizado para obtener DNA simple hebra (ssADN) por calentamiento en una solución salina diluida. S
i luego la T se baja y se eleva la concentración de iones, el ssADN se reasociarán para formar el ssADN.
En una mezcla de ácidos nucleicos, solo las hebras de cDNA se reasociarán; mas aun, la extensión de su reasociación no se ve casi
afectada por la presencia de hebras no complementarias.
En esta técnica se utiliza una sonda de ssADN para detectar los fragmentos de DNA en una mezcla que son complementarios a la
sonda.
Primero se desnaturaliza la muestra de DNA y se adhieren las hebras simples a un soporte solido, por lo común un filtro de nitroce
lulosa o una membrana de nailon tratada. Luego se incuba la membrana en una solución que contiene una sonda marcada radiactiv
amente. En condiciones de hibridación (cerca del pH neutro, 40-65 °C; 0,3-0,6 M NaCl), esta sonda marcada se hibrida a cualquie
r hebra de acido nucleico complementaria fijada a la membrana. Cualquier exceso de sonda no hibridada se elimina por lavado y l
os híbridos marcados se detectan mediante autorradiografía del filtro.

2 – SELECCIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN (O DE EXPRESIÓN)


Los tres vectores de clonación mas comúnmente usados son:
- Plásmidos: los plásmidos son moléculas de DNA circulares que se replican con independencia del cromosoma del huésped. Ron
dan entre los 5 - 400 mil pb.
Independientemente del método utilizado, solo unas pocas células captan el pDNA; se necesita, pues un método para seleccionar l
as que lo hayan hecho. La estrategia mas común consiste en incluir en el plásmido un gen que permita que la célula huésped crezc
a en determinadas condiciones, tal como un gen de resistencia a un antibiótico. Solo aquellas células que hayan sido transformada
s por el plásmido recombinante podrán crecer en presencia del antibiótico. Cualquier célula que contenga el plásmido será "selecci
onable" en estas condiciones de cultivo. Esos genes se denominan marcadores seleccionables.
EJEMPLO: plásmido de procariotas pBR322
Entre las características importantes del plásmido pBR322 destacan:
1- Un origen de replicación, ori, en el cual las enzimas celulares inician la replicación. Esta secuencia es necesaria para propagar e
l plásmido y mantenerlo en un nivel de 10 a 20 copias por célula.
2- Dos genes que confieren resistencia a diferentes antibióticos (tetR, ampR), que permiten la selección de las células que conteng
an el plásmido intacto o una versión recombinante del mismo.
3- Varias secuencias únicas de reconocimiento para diferentes endonucleasas de restricción, que suministran los sitios por los cual
es cortar el plásmido para insertar las secuencias de DNA foráneo.
4- El pequeño tamaño (4361 pb), que facilita la entrada en la célula y la manipulación bioquímica del DNA.
La transformación de células bacterianas típicas con DNA purificado (proceso nunca muy eficiente) decrece al aumentar el tamañ
o del plásmido, siendo difícil la clonación de segmentos de DNA mayores de unos 15 mil pb cuando se utiliza un plásmido como
vector.
- Bacteriófagos: el bacteriófago lambda tiene un mecanismo muy eficiente para introducir sus 48.502 pb de bases de DNA en la b
acteria, y puede ser usado como vector para clonar fragmentos de DNA algo mayores. Su utilidad se basa en dos características pri
ncipales:
1- Alrededor de un tercio del genoma de lambda no es esencial y puede ser reemplazado por DNA foráneo.
2- El DNA se empaqueta en partículas de fago infecciosas solo si su tamaño se encuentra entre 40 - 53 pb, limitación aprovechabl
e para lograr que solamente se empaquete el DNA recombinante.
Se han desarrollado vectores derivados del bacteriófago lambda que se pueden cortar fácilmente en tres trozos, dos de los cuales c
ontienen genes esenciales, que totalizan solo unos 30 mil pb. El tercer trozo, o DNA "de relleno", es descartado cuando el vector s
e usa para la clonación. Por lo tanto, debe introducirse DNA adicional entre los dos segmentos esenciales para generar moléculas l
igadas de DNA suficientemente largas para producir partículas de fago viables. En efecto, el mecanismo de empaquetamiento sele
cciona eficazmente los DNA víricos recombinantes.
Los vectores del bacteriófago lambda permiten la clonación de fragmentos de DNA de hasta 23 mil pb.
- Cromosomas Bacterianos Artificiales (BAC): los cromosomas bacterianos artificiales son simplemente plásmidos diseñados par
a la clonación de fragmentos de DNA muy largos (habitualmente entre 100-300 mil pb). Generalmente incluyen marcadores selec
cionables, tales como la resistencia al cloranfenicol (CmR), así como un origen de replicación muy estable (ori), que mantiene una
o dos copias del plásmidos por célula. Los fragmentos de DNA de varios centenares de miles de pares de bases se clonan en vecto
res BAC.

VECTOR DE EXPRESIÓN
Los vectores de expresión son vectores de clonación que poseen toda la información necesaria para expresar una secuencia amino
acídica.
Las moléculas de cDNA son las que se va a insertar en vectores que favorezcan su expresión eficiente en hospedadores. Para cons
eguir un grado máximo de transcripción, el cDNA se inserta en el vector con la pauta de lectura correcta y cerca de un promotor b
acteriano muy activo. Además, estos vectores aseguran una traducción eficiente porque codifican en el mRNA, cerca del codón de
iniciación, una secuencia de unión de ribosomas. Los clones que contienen cDNA se pueden analizan en base a su capacidad para
sinterizar una proteina ajena a las bacterias.

CONSTRUCCION DE VECTORES DE EXPRESION & VECTORES DE CLONADO


Diferencias: vectores de expresión vs vectores de clonado
A- Vector de Clonado:
Elementos:
- Un origen de replicación (ori), en el cual las enzimas inician la replicación. Esta secuencia es necesaria para propagar el plásmid
o y mantenerlo en un nivel de 10 a 20 copias por célula.
- El gen que confiere resistencia a la ampicilina (ampR), que permite la selección de las células que contengan el plásmido intacto
o una versión recombinante del mismo.
- Varias secuencias de reconocimiento para diferentes endonucleasas de restricción (polylinker), suministra los sitios por los cuale
s se corta el plásmido para insertar las secuencias de DNA foráneo. En su secuencia, esta el gen de la beta-galactosidasa.

B- Vector de expresión

Elementos:
- Los mismos que los que tiene un vector de clonación
- Promotor: sitio de unión de la RNApol
- Terminador: sitio de terminación de la transcripción
- Sitio de unión a ribosomas (RBS): se une la subunidad menor del ribosoma en el momento de iniciarse la traducción.
- En algunos casos, hay primers universales.

3 – LIGACIÓN DEL FRAGMENTO AL VECTOR DE CLONADO (O DE EXPRESIÓN)


Una vez aislado el fragmento de DNA deseado, la DNA ligasa permite unirlo a un vector de clonación digerido de forma similar ,
es decir, un vector digerido con la misma endonucleasa de restricción.
La DNA ligasa cataliza la formación de nuevos enlaces fosfodiéster en una reacción que usa ATP u otro cofactor similar. El apare
amiento de los extremos cohesivos complementario facilita la reacción de ligación. Los extremos romos también se pueden ligar,
aunque con menor eficiencia. Se pueden crear nuevas secuencias de DNA insertando fragmentos de DNA sintéticos (denominados
conectores o lynkers) entre los extremos que tienen que ligarse. Los fragmentos de DNA insertados que contienen secuencias múl
tiples de reconocimiento para endonucleasa de restricción (útiles como puntos de inserción de otros DNA por corte y ligación) se
denominan polylinker.
Los cuatro productos principales de ligación son los siguientes:
- El DNA recombinante (pDNA + inserto)
- El DNA recombinante con orientación errónea (en el caso de no haber utilizado dos enzimas)
- El pDNA recircularizado (en el caso de no haber utilizado BAP)
- El pDNA dimerizado (también en el caso de no haber utilizado BAP)
4 – TRANSFORMACIÓN DE LA BACTERIA (TRANSFECCIÓN EN EUCARIOTAS)
• Los plásmidos pueden introducirse en las células bacterianas mediante un proceso denominado transformación. Esta forma es la
mas utilizada en ingeniería genética.
Las células competentes son aquellas células que son mas ávidas a la incorporación de DNA foráneo. Este proceso de hacer comp
etente a la célula implica hacer que la membrana de las mismas sea proclive a la incorporación de DNA.
Puede llevarse a cabo por:
- Métodos químicos: se le agrega a las bacterias una solución de CaCl2 fría (aprox 4 °C) y luego se da un shock térmico de unos
minutos (aprox 42 °C) y se repite el proceso varias veces. Por razones no bien comprendidas, algunas de las células tratadas de est
e modo incorporan el DNA plasmídico. Algunas especies bacterianas son competentes por naturaleza para la incorporación de DN
A y no requieren el tratamiento con cloruro de calcio.
- Métodos eléctricos: se aplica a las bacterias pulsos pequeños de corriente de alta intensidad. Es un método alternativo consiste en
aplicar un pulso de alto voltaje a las células incubadas con el plásmido, permeabilizando transitoriamente la membrana a las gran
des moléculas.
La eficiencia de transformación es el número de células transformadas por 1microgramo de DNA. La eficiencia permite saber que
bacterias son aptas para determinados procedimientos, por ejemplo, en bibliotecas la eficiencia debe ser alta, mientras que en clon
ación, con que haya algunas pocas bacterias alcanza.
La eficiencia de transformación, matemáticamente, es la pendiente del sector final de la grafica:

Se define como:
ET = N° de colonias transformantes/ug de DNA dador.
FT = (N° de colonias transformantes/N° de colonias viables) × 100
El numero de colonias viables se calcula como UFC × D × F, siendo D el factor de dilución de las diluciones seriadas 1/10 y F es l
a fracción de siembra, es decir, el cociente entre lo que se sembró y el volumen total de la mezcla.

• Para el caso de los fagos, el sistema es otro. Una vez los fragmentos del bacteriófago lambda han sido ligados con fragmentos de
DNA foráneo de tamaño adecuado, los DNA recombinantes resultantes se empaquetan en partículas de fago añadiendo un extract
o crudo de células bacterianas que contenga todas aquellas proteinas necesarias para ensamblar un fago completo. Esta operación r
ecibe el nombre de empaquetamiento in vitro. Todas las partículas de fago viables contendrán un fragmento de DNA foráneo. La t
ransmisión ulterior del DNA recombinante a células de procariotas es muy eficiente.
• Los BAC son introducidas en las bacterias huésped por electroporación. Las bacterias huésped usadas con los BAC recombinant
es tienen mutaciones que afectan la estructura de la pared bacteriana que facilitan la incorporación de estas grandes moléculas de
DNA.

EJEMPLO: una posible resolución de la transformación podría ser la siguiente:


El tubo 1: se circulariza el plásmido porque al no tener el BAP, el plásmido puede formar el enlace fosfodiéster por la ADN ligasa
.
El tubo 2 es el mas eficiente: el mismo contiene BAP, solo va haber inserción del fragmento. No habrá recircularización.
El tubo 3: no hay ATP, entonces la ligasa no puede formar el enlace fosfodiéster, el plásmido no se circulariza. Entonces, la bacter
ia no puede sobrevivir a la presión de selección.
El tubo 4: predominan las bacterias que tienen el gen lacZ intacto debido a que no hay inserto. Existe una probabilidad de que se a
coplen dos plásmidos de manera que restauran las actividades de lacZ.
El tubo 5: la mayoría se muere porque no hay reincorporación de plásmido. El BAP impide esto. Hay bacterias sobrevivientes que
pueden ser por la recircularización o el acoplamiento de dos vectores. (control BAB).
El tubo 6: no hay ligasa, no se logra formar el plásmido. En el caso de que fallara este control, se verían colonias. (control DIGES
TIÓN).
El tubo 7: Ingresa el vector como tal. (control TRANSFORMACIÓN)

5 – IDENTIFICACIÓN Y SELECCIÓN DE LAS CÉLULAL HUESPED QUE CONTIENEN EL DNA RECOMBINANTE


Se tiene que tomar en cuenta que en la reacción de ligación genera cuatro productos, de manera que las bacterias que han sido tran
sformadas, pudieron haber incorporado cualquiera de estos productos.
- El DNA recombinante (pDNA + inserto)
- El DNA recombinante con orientación errónea.
- pDNA recircularizado
- pDNA dimerizado
Como la probabilidad de recircularización es mayor con respecto a la probabilidad de unir al inserto, se emplea un [inserto] >> [ve
ctor] en una proporción 3 : 1. Esto se debe a que la reacción unimolecular de recircularización tiene mayor probabilidad de ocurrir
que una reacción bimolecular. De esta manera, se esta aumentando la eficiencia de la [DNA recombinante] obtenido. El mismo se
ve aun mas favorecido si se emplea BAP para evitar religaciones y dimerizaciones, y si se emplean extremos cohesivos cortados c
on distintas enzimas de restricciones, de manera que se eviten incorporaciones erróneas (además de inhibir aun mas la religación y
la dimerización)
Sin embargo, como la reacción de ligación no es 100 % eficaz, siempre va a haber productos otros productos. En todos los casos,
el vector expresara el gen que hace a la bacteria resistente a un determinado antibiótico, por ejemplo, la tetraciclina. De esta maner
a, se selecciona a las bacterias que hayan incorporado el plásmido.
Para distinguir a las bacterias que hayan incorporado al DNA recombinante, en general se toman ciertas medidas a la hora de arma
r vector:
Los plásmido, y todos los vectores en general, presentan en su secuencia información que permite discernir aquellos vectores que
han incorporado el inserto de los que no lo tienen.
Por lo general, una pDNA presenta una sección llamada polylinker que es una sección que tiene la información para el corte de va
rias enzimas de restricción. Estas secuencia, sin embargo, están dispuesta de manera tal, que contiene al gen lacZ, la cual codifica
a la enzima beta-galactosidasa.
Las bacterias que no hayan incorporado el inserto, pueden hidrolizar el X-gal presente en el agar del medio, tornándose sus coloni
as de color azul, debido a que se hidroliza el colorante X-gal por la β-galactosidasa a galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol.
Este último es oxidado dando un compuesto azul insoluble. Además de su color característico, la volatilización del grupo indol pr
oduce un mal olor característico.
En cambio, las bacterias que portan el plásmido recombinante no son capaces de producir la enzima β-galactosidasa debido a que l
a región que sintetiza a la enzima se rompe por la inserción del fragmento a clonar.
Por lo tanto, las bacterias que han sido transformadas con el DNA recombinante no pueden procesar X-gal y permanecen con su c
oloración blanca natural.

6 – SELECCIÓN DEL GEN INSERTADO EN EL VECTOR DE CLONACIÓN (O DE EXPRESIÓN)


Para encontrar el gen se procede a realizar colony blot:
1 - Transferir a las colonias microbianas a una membrana.
2 - Las células se lisan en su lugar para liberar los ácidos nucleicos.
3 - Luego, el acido nucleico, se fija al filtro.
4 - Se emplea material genético foráneo para evitar uniones inespecíficas. De esta manera, el gen se puede hibridar con una sonda
marcada.
5 - El exceso de la sonda se elimina por lavado y la membrana se visualiza por autorradiografía o UV.
La ventaja de la misma, es que al emplear bacterias, el vector esta a "a salvo indefinidamente", ya que se pueden obtener muchas r
eplicas en poco tiempo. Además que permite guardar información de genes enteros.

Para encontrar el gen de un vector de expresión se proceso a un inmunoensayo:


Para identificar las colonias de bacterias que albergan el vector con el cDNA correspondiente a la proteina que nos interesa, se pue
den utilizar anticuerpos específicos para la proteina en cuestión. Se lisan las manchas obtenidas sobre una replica de la placa de Pe
tri para liberar las proteinas y se aplica un filtro de nitrocelulosa para que se unan a el. Añadiendo un anticuerpo marcado radiactiv
amente que sea especifico para la proteina de interés, se puede averiguar por autorradiografía la posición de las colonias deseadas
en la placa original.

7 – CARACTERIZACIÓN & USO DE FRAGMENTOS CLONADOS DE DNA


=> ELECTROFORESIS EN GEL
Para manipular o secuenciar un fragmento de DNA clonado, este primero debe separarse del DNA del vector. Esto se puede lograr
cortando el clon de DNA recombinante con la misma enzima de restricción utilizada para producir originalmente los vectores de r
ecombinación. El DNA clonado y el DNA del vector son sometidos luego a electroforesis en gel.
Dependiendo del tamaño:
- Las moléculas de DNA compuestas por hasta ~ 2000 nucleótidos suelen separarse electroforéticamente en geles de poliacrilamid
a.
- Las moléculas de DNA compuestas desde 200 a 20 kb, se separan en geles de agarosa.
Se prepara un gel volcando un liquido que contiene agarosa fundida o acrilamida no polimerizada entre dos placas vidrio separada
s unos pocos mm. A medida que la agarosa se solidifica o la acrilamida se polimeriza en acrilamida, se forma una matriz de gel co
mpuesta de largas hebras enredadas de polímeros. Las dimensiones de los canales interconectantes, o poros, dependen de la conce
ntración de la agarosa o de la acrilamida utilizada para formar el gel. Las bandas generadas pueden visualizarse por autorradiograf
ía (si los fragmentos están marcados radiactivamente) o por adición de un marcador fluorescente (bromuro de etidio) que se une al
DNA.
Una vez que un fragmento de DNA clonado, sobre todo uno largo, se separo del DNA del vector, se trata con diversas enzimas de
restricción para producir fragmentos mas pequeños. Despues de la separación mediante electroforesis en gel, todos o algunos de es
tos fragmentos mas pequeños pueden ser ligados individualmente a un vector plasmídico y clonados en procariotas por el procedi
miento convencional. Este proceso, conocido como subclonación, es un paso importante en el reordenamiento de las partes de gen
es en nuevas configuraciones útiles.

=> SECUENCIACION DE DNA CLONADO


La caracterización de cualquier fragmento de DNA requiere la determinación de su secuencia de nucleótidos. Para ello se emplea l
a secuenciación de Sanger, que permite determinar la estructura primaria de un oligonucleótido de hasta ~ 500 nucleótidos de long
itud. También existe equipos automáticos de secuenciación.
Para secuenciar una region continua larga del gDNA, se comienza con una colección de fragmentos de DNA clonados cuyas secue
ncias se superponen. Una vez que se determina la secuencia de uno de estos fragmentos, se pueden sinterizar químicamente los oli
gonucleótidos basados en esa secuencia para utilizarse como cebadores en la secuenciación de los fragmentos superpuestos.
De esta forma, la secuencia de una extensión larga de DNA se determina experimentalmente al secuenciar los fragmentos superpu
estos de DNA clonados que la componen.

=> AMPLIFICACION DEL DNA CLONADO


Si las secuencias de nucleótidos en los extremos de una region de DNA en particular se conocen, el fragmento intermedio puede a
mplificarse directamente por la reacción en hebra de la polimerasa (PCR).

=> IDENTIFICACION DE GENES CLONADOS


Existen dos métodos muy sensibles para detectar una secuencia particular de DNA o RNA, llamado Southern blot y Northern blot
respectivamente. Estas técnicas de inmunotransferencia combinan la separación mediante electroforesis en gel y la hibridación co
n una sonda de DNA complementaria marcada radiactivamente.

=> LOCALIZACION DE PROTEINAS


Además de su empleo en la producción de proteínas que son modificadas después de la traducción, los vectores de expresión euca
riotas proveen una forma fácil de estudiar la localización intracelular de las proteínas eucariotas. En este método, un cDNA clonad
o es modificado al fusionarlo a una secuencia corta de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos reconocida por un anticue
rpo monoclonal conocido. Este péptido corto que es unido por un anticuerpo se denomina epítope; en consecuencia este método se
conoce como marcación con epítopos. Después de la transfección con un vector de expresión plasmídico que contiene el cDNA f
usionado, la expresión de la forma de la proteína marcada con epítope puede detectarse por marcación con inmunofluorescencia d
e las células con el anticuerpo monoclonal específico para el antiepítope.
La marcación con epítope de una proteína para que sea detectable con un anticuerpo monoclonal disponible evita la lenta tarea de
producir un nuevo anticuerpo monoclonal específico para la proteína natural.

=> TRANSFECCIÓN
Una desventaja de los sistemas de expresión bacterianos es que muchas proteínas eucariotas sufren diversas modificaciones despu
és de su síntesis sobre los ribosomas. Estas modificaciones postraduccionales suelen ser necesarias para el funcionamiento celular
normal, pero no pueden ser introducidas por las células de procariotas, que carecen de las enzimas necesarias. Para superar esta li
mitación, los genes clonados son introducidos en células animales cultivadas, un proceso llamado transfección (la transfección es l
a transformación no viral de células animales).
Dos métodos comunes para transfectar células animales difieren en si el DNA vector recombinante está integrado o no al gDNA d
e la célula huésped. En ambos métodos, las células animales cultivadas deben ser tratadas para facilitar la incorporación inicial de
un vector plasmídico recombinante. Esto puede hacerse al exponer células a una preparación de lípidos que penetran en la membra
na plasmática, incrementando su permeabilidad al DNA. En forma alternativa, puede aplicarse a las células un pulso eléctrico brev
e de varios miles de voltios, una técnica conocida como electroporación, que las hace transitoriamente permeables al DNA. El pD
NA suele añadirse en una concentración suficiente como para asegurar que una gran proporción de las células cultivadas reciba al
menos una copia.
=> Transfección transitoria
El más simple de los dos métodos de expresión, llamado transfección transitoria, emplea un vector similar a los vectores lanzadera
s de levadura. Para usarlos en las células de los mamíferos, los plásmidos son también diseñados para tener un origen de replicació
n derivado de un virus que infecta esas células, un promotor fuerte reconocido por la RNApol de mamíferos y el cDNA clonado, q
ue codifica la proteína por ser expresada, adyacente al promotor.
Una vez que ese plásmido penetra en una célula de mamífero, el origen de replicación viral le permite replicarse con eficiencia, lo
que genera numerosos plásmidos a partir de los cuales se expresa la proteína. Sin embargo, durante la división célula esos plásmid
os no son segregados fielmente en ambas células hijas y con el tiempo, una fracción sustancial de las
células en un cultivo no contendrán el plásmido, de ahí el nombre de transfección transitoria.

=> Transfección estable (transformación).


Si un vector introducido se integra en el genoma de la célula huésped, el genoma se altera de manera permanente y se dice que la c
élula está transformada. La integración la logran más probablemente las enzimas de mamíferos que suelen funcionar en la reparaci
ón y recombinación del DNA. Debido a que la integración es un suceso raro, los vectores de expresión plasmídicos diseñados para
transformar células animales deben tener un marcador de selección para identificar las fracciones
pequeñas de células que integran el DNA plasmídico. Un marcador de selección utilizado con frecuencia es el gen de la neomicina
fosfotransferasa (designada neo'), que confiere resistencia a un compuesto tóxico químicamente relacionado con la neomicina con
ocido como G-418.
Sólo las células que han integrado el vector de expresión en el cromosoma huésped sobrevivirán y darán origen a un clon en prese
ncia de una alta concentración de G-418. Como la integración ocurre en sitios aleatorios en el genoma, los clones individuales tran
sformados, resistentes al G-418, diferirán en las velocidades de transcripción del cDNA insertado. Por lo tanto, los transfectantes e
stables suelen ser rastreados para identificar a los que producen la proteína de interés en los niveles más altos.

AUTOEVALUACION METABOLISMO GENÉTICO GENERAL


COMPOSICION DEL GENOMA
1- ¿Que son los VNTR?
2- Explique como puede determinar experimentalmente los distintos alelos de un VNTR con una estrategia basada en PCR. ¿Que t
ipo de muestra podría utilizar para obtener DNA de los individuos a estudiar?
3- Explique como podría identificar un polimorfismo de único nucleótido (SNP)
4- Indique los elementos mínimos de un gen procariota.
5- Indique los elementos mínimos de un gen eucariota.
6- Suponiendo que desconoce del genoma humano, ¿De que manera se podría identificar la secuencia responsable de una enferme
dad dominante dentro de una región de 1mb del cromosoma sexual X? ¿

REPLICACION DEL DNA


1- ¿En que se diferencian las hebras adelantada y retrasada?
2- ¿Que enzimas participan en la elongación y cuales son sus actividades?
3- Dibuje claramente un esquema de una horquilla de replicación en el que se puedan apreciar (y diferenciar) las hebras parentales
e hijas, el origen de replicación y el carácter bidireccional y semi-discontinua de la replicación. Marque las polaridades tanto de la
s hebras parentales como la de las hijas.
4- Explicar el experimento de Meselson y Stahl.
5- Explicar el experimento de Okazaki.
6- Realizar los tres posibles mecanismos de la replicación con respecto a si es conservativa, semiconservativa o dispersiva.
7- Explique cual es el problema que se presenta durante la replicación de los cromosomas lineales de los organismos eucariotas qu
e es compensado por la acción de la telomerasa.
8- ¿Cual es la composición de la telomerasa y cual es el mecanismo que utiliza para llevar a cabo su funcion? Aclare su respuesta
en esquemas.
9- Dos cepas de procariotas, mutantes ts en los genes polA (gen de la subunidad alfa de la DNApol III) y lig (gen de la DNA ligas
a), se cultivaron respectivamente a 30 °C (T° permisiva) y despues de 30 min, la T se subió a 42 °C (T° restrictiva). En paralelo, s
e cultivo una procariotas salvaje que se sometió al mismo tratamiento.
Dibuje un grafico que permita observar la síntesis de DNA en funcion del tiempo (durante 90 min) para cada uno de los mutantes
(use como control un grafico que obtendría de la wt), indicando los cambios producidos al subir la T y razonando su respuesta. Di
buje en el mismo grafico la curva control que corresponde a un cultivo en paralelo a 30 °C.
10. ¿Cómo influye en la replicación el knockout del gen de la ligasa?

REPARACION DEL DNA


1- ¿En que consiste el mecanismos de reparación conocido como mismatch repair? ¿Qué mecanismos están implicados en la repar
ación del DNA por daños producidos por la radiación UV?
2- Un cultivo de 1x108 UFC/ml de una cepa mutante de Pseudomonas aeruginosa se plaquea en distintos medios, y luego de 2 día
s de incubación se obtienen los siguientes resultados:

En base a los resultados obtenidos:


A- ¿Qué mutaciones sugiere Usted que posee esta cepa?
B- ¿De qué clase cree que son?
C- Explique estos resultados, y relacione con las frecuencias de mutación.
D- ¿Cómo cambiaría su respuesta si los datos a 30°C en el medio mínimo no mostraran crecimiento.
3- Explique que mecanismos podrían estar involucrados en la aparición de los revertantes.
4- Plantear un ensayo que permita ver la acción mutagénica del glifosato.
5- Usted plaquea 0,1 mL de cultivos con 1 × 10 8 UFC/mL de tres mutantes de procariotas His-, denominadas Ec1, Ec2 y Ec3, en u
n medio mínimo sin histidina, con la intención de evaluar el efecto de los mutágenos naranja de acridina y acido nitroso. Para ello,
se determino el numero de revertantes de las cepas expuestas a diferentes sustancias.
La siguiente tabla muestra los resultados obtenidos despues de la incubación de varios días a 37 °C
Naranja de acridina Acido nitroso Espontáneos
Ec1 4 2 3
Ec2 266 6 8
Ec3 3 298 10
A- Interprete los resultados de la tabla.
B- Explique que mecanismos podrían estar involucrados en la aparición de los revertantes.
C- Calcule la frecuencia de mutación de cada mutágeno
6- ¿Cómo influye a los mecanismos de reparación un knockout de los genes uvrA, uvrB, uvrC y recA? ¿En que consiste el mecani
smo de SOS?

RECOMBINACION DEL DNA


1- Describir la transformación genética.
2- Explicar experimentalmente como se procede en una conjugación bacteriana.
3- ¿Que diferencias hay entre la transducción especializada y la transducción generalizada.
4- Describa brevemente los pasos a seguir para construir un mutante de ratón de la enzima telomerasa.
5- ¿Como seleccionarías aquellos microorganismos que presenten la mutación?
6- ¿Como se aseguraría que los embriones que se selecciono tienen efectivamente interrumpido el gen de la telomerasa?
7- ¿Varia el experimento si se requiere knockear a la telomerasa de un organismo procariota como por ejemplo procariotas?
8- Dar los productos de recombinación de una recombinación genética homologa.
9-Dibuje los productos de recombinación entre las regiones homologas de las moléculas
10- Se realiza una conjugación entre una cepa
• F- que es Bio--Gal--His--Leu--Trp--SpR
• Hfr que es Bio+-Gal+- His+-Leu+-Trp+-SpS.
Se mezclan 0,1 ml de Hfr con 1,9 ml de F-, ambos provenientes de cultivos en caldos en fase logarítmica que contienen 5×10 8 UF
C/ml.
La mezcla de conjugación se incuba a 32°C durante 100 minutos y se seleccionan los transconjugantes Bio -- His+ en una caja de P
etri conteniendo el medio selectivo A.
En dicha caja se sembraron 0,1 ml de la dilución 1/10 de la mezcla de conjugación. Después de incubar a 37°C una noche se cont
aron 170 colonias.
Los transconjugantes Bio-- His+ se estudiaron para determinar además cuantos eran gal+- leu+ -trp+. Para ello se replicaron con ma
nguito de terciopelo las 170 colonias en las siguientes condiciones:

A- Con qué frecuencia aparecen los transconjugantes bio+- his+?


B- Indique la composición de los medios selectivos A, B, C y D.
C- Cuál es el orden relativo de los marcadores en el cromosoma?
11- ¿Qué es la recombinación homologa? ¿Qué importancia tiene en eucariotas y en procariotas? ¿Qué diferencia hay con la reco
mbinación sitio especifica?

TRANSCRIPCION
1 – Realice un esquema del proceso de transcripción señalando:
• ¿Qué es una unidad transcripcional?
• ¿Cuáles son los elementos necesarios para la transcripción?
• Los productos de transcripción en un procariota y su diferencia con un eucariota.
• Indicar cual es la hebra molde y cual la hebra codificante. Incluir sus polaridades durante la transcripción.
• Incluir también la RNApol y señalar la dirección de avance de la misma.

TRADUCCION
1 - Realice un esquema del proceso de traducción señalando:
• Sobre el mRNA, los polipéptidos que se obtienen por acción de dos ribosomas traduciendo simultáneamente.
• Incluir la polaridad de la cadena polipeptídica.
• Incluir la dirección de avance del ribosoma.
• Señalar la polaridad de mRNA y su interacción con el tRNA.
• Marcar la unión del aminoácido al tRNA.

REGULACION DE LA EXPRESION GÉNICA


1 - Se aislaron bacterias que pueden proliferar usando al polisacárido inulina como única fuente de carbono. Los genes unuA, unu
B y unuD codifican para enzimas del metabolismo de la inulina, mientras que el gen inuC codifica para una proteina regulatoria q
ue se une al DNA en una zona cercana al promotor del operón.
Nivel de la mRNA
Genotipo Sin inulina Con inulina
InuC+ Bajo Alto
InuC- Bajo Bajo
A – Interpretar los resultados. Proponer un modelo donde se le asigne un rol a inuC.
B - ¿Cómo determinaría una curva que esquematice la [mRNA de inulina] en funcion del tiempo luego de haber agregado inulina.
C- Estudios posteriores demostraron la existencia una proteina análoga a CPR. ¿Cómo cree que este involucrada en la regulación
del operón inu.

ELEMENTOS DEL DNA RECOMBINANTE


1- Realiza un esquema de un vector de clonado.
A- Explique que funcion cumple cada uno de ellos.
B- Indique aquellos elementos que deberían ser incluidos en el vector si se deseara expresarse la ubiquitina de ratón con procariota
s.
C- Enumere los pasos que realizaría para obtener la construcción del vector de clonación.
2- Describa brevemente dos métodos que ayuden a confirmar que ha clonado el fragmento de DNA que se deseaba.
A- ¿Que son las células competentes y como se preparan?
B- ¿Como se calcula la eficiencia de transformación?
C- Explicar paso a paso, los dos procedimientos para clonar.
D- Las bacterias competentes se controlan de la siguiente manera:
50 uL de bacterias competentes (103 bacterias/mL) se transformaron con 1 uL de una solución de un plásmido control (50 ug/mL).
Se agregaron 450 uL de medio de cultivo sin antibiótico, se incubo durante 1 hs a 30 °C en agitador rotatorio y luego se plaqueo e
n medio LB-agar con antibiótico, sembrando 150 uL en cada una de tres placas por cada dilución analizada. En las placas en las q
ue se sembró la dilución 1/50 se contaron 178, 198 y 137 colonias respectivamente. Con estos datos calcule la eficiencia de las cél
ulas competentes.
3 – Una enfermedad dominante se debe a la presencia de un gen solo cuando la misma presenta mas de 40 repeticiones del trinucl
eótido CGG. Asimismo, presenta secuencias conservadas que flanquean la region de las repeticiones tal como se indica en la figur
a:
CTAGGTCAACAGTATGCACAATGAA --- (CGG)42 --- ATGCGTAATTAGCCGATGCCATTCG
Escribir las secuencias de los primers directo e inverso que permiten amplificar por PCR la región que incluye las repeticiones CG
G.
Indique los tamaños de el/los productos de PCR esperados. Justificar en función del sitio de hibridación de los primers.

APLICACIONES BIOTÉCNOLOGICAS

1 - Una enfermedad dominante se debe a la presencia de un gen solo cuando la misma presenta mas de 40 repeticiones del trinucle
ótido CGG. Asimismo, presenta secuencias conservadas que flanquean la region de las repeticiones tal como se indica:
CTAGGTCAACAGTATGCACAATGAA --- (CGG)42 --- ATGCGTAATTAGCCGATGCCATTCG
A – Se decidió clonar el fragmento empleando la transformación:
• Realizar un esquema de un vector de clonado.
• ¿De que manera obtendría los fragmentos clonados en bacterias?
• ¿Qué precauciones se requiere a la hora del aislamiento?
• ¿Qué controles se debe tomar para realizar la transformación?
B – Se requiere amplificar el segmento de DNA a partir de PCR:
• Escribir las secuencias de los primers directo e inverso que permiten amplificarlo.
• Indique los tamaños de el/los productos de PCR esperados. Justificar en función del sitio de hibridación de los primers.

2 – Tres cepas de procariotas (CI y CI) se cultivaron a 30 °C (T° permisiva), y despues de 30 min se subió la T a 42 °C (T° restric
tiva). CI es ligasa- y CII es primasa-
• Dibuje claramente un esquema de una horquilla de replicación en el que se puedan apreciar (y diferenciar) las hebras parentales
e hijas, el origen de replicación y el carácter bidireccional y semi-discontinua de la replicación. Marque las polaridades tanto de la
s hebras parentales como la de las hijas.
• Esquematizar un procedimiento que permita determinar que la replicación es semidiscontínua y semiconservativa.
• Esquematizar de que manera influye estas alteraciones en las enzimas en la replicación, explicando su importancia en dicho proc
eso.

3 – Se quiere preparar levaduras KO en la telomerasa:


• Explique cual es el problema que se presenta durante la replicación de los cromosomas lineales de los organismos eucariotas que
es compensado por la acción de la telomerasa.
• ¿Cual es la composición de la telomerasa y cual es el mecanismo que utiliza para llevar a cabo su funcion? Aclare su respuesta e
n esquemas
• ¿Cuál es el efecto de knockear a la telomerasa en el proceso de replicación?

4 – Se esta estudiando la capacidad mutagénica de la radiación UV:


• ¿Cómo influye a los mecanismos de reparación a la luz UV, un knockout de los genes uvrA, uvrB, uvrC y recA?
• ¿Qué otros mecanismos están implicados en la reparación del DNA por daños producidos por la radiación UV?
• Dar los productos de recombinación

5 – Con respecto a las vías de la información genética


• Esquematizar un gen eucariota y diferenciarlo de un gen procariota.
• ¿Qué elementos presenta un transposon que lo hace autorreplicativo? Realizar un esquema.

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