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INTRODUCCION A LA GENÉTICA MOLECULAR
El descubrimiento de la estructura de la doble hebra, a partir de la difracción de rayos X, y la aparición de la genética y del concep
to gen, dio a origen a un mecanismo para su copia, de modo que la información en él contenida pudiera ser transmitida de generac
ión en generación. La comprensión de como la información del DNA se convierte en proteína funcionales vino con el descubrimie
nto del mRNA (RNA mensajero) y el tRNA (RNA de transferencia) y con la elucidación del código genético.
Junto con otros avances mas, llevaron a la formulación del dogma central de la biología molecular:
Este dogma abarca los tres principales procesos celulares en los que se utiliza la información genética.
1ro: Replicación: copia del DNA parental para formar moléculas de DNA hijas con idéntica secuencia de nucleótidos.
2do: Transcripción: proceso mediante el cual parte del mensaje genético codificado por el DNA es copiado.
3ro: Traducción: en la cual el mensaje genético codificado en el mRNA es traducido en los ribosomas para dar un polipéptido con
una secuencia especifica de aminoácidos.
La biosíntesis de estas macromoléculas (DNA y proteinas), difiere de la biosíntesis de lipidos y glúcidos en la complejidad añadid
a debido a que el ensamblaje de los ácidos nucleicos y de las proteinas con sus secuencia especificas de nucleótidos y aminoácidos
debe respetar estrictamente a las características de un molde en que esta basada la propia vida. La formación de los enlaces fosfod
iéster en el DNA o de los enlaces peptídicos en las proteinas son una tarea fácil para el arsenal de enzimas especializadas para la c
atálisis de estos enlaces. Sin embargo, lo complicado de estas biosíntesis es que los enlaces deben formarse entre subunidades dete
rminadas, evitando errores de secuencia o de propagación. Esto implica un desgaste energético muy grande para la célula: así por
ejemplo:
La formación de un enlace peptídico requiere unos 21 KJ/mol.
Pero la formación de un enlace peptídico entre dos aminoácidos específicos en un punto particular de una hebra polipeptídica, la c
élula invierte unos 125 KJ/mol de energía química y hace uso de mas de 200 enzimas, moléculas de RNA y proteinas especializad
as. La reacción de formación es la misma, lo que cambia es de forma se lleva a cabo. La célula necesita asegurarse que el enlace p
eptídico se forme entre los aminoácidos correctos.
Por lo que es lógico, estas síntesis presentan muchas regulaciones, y están constantemente siendo revisadas por enzimas para verif
icar si la secuencia que esta siendo sintetizada es la correcta.
-------------------------------Composición de los genomas-------------------------------
INTRODUCCIÓN:
• El genoma es el conjunto de los genes de un organismo. En última instancia se define por la secuencia completa de DNA, aunqu
e en la secuencia completa no todos sean genes.
• El transcriptoma es el conjunto es el conjunto completo de los genes expresados en determinadas condiciones. Se define en funci
ón del conjunto de molécula de RNA presente y puede referirse a un solo tipo de célula, a cualquier ensamble de célula mas compl
ejo o al organismo completo. Debido a que algunos genes generan múltiples moléculas de mRNA, es probable que el transcriptom
a sea mayor que el numero de genes definidos directamente en el genoma. El transcriptoma incluye a las moléculas de RNA con c
odificadoras, así como a las moléculas de mRNA.
• El proteoma es el conjunto de proteínas. Debe corresponder a las moléculas de mRNA del transcrito a, aunque puede haber difer
encias de detalle que reflejen cambios de la abundancia relativa o la estabilidad de las moléculas de mRNA y de las proteinas. Pue
de ser utilizado para referirse al conjunto de proteínas codificadas por todo el genoma o producidas en cualquier célula o tejido es
pecifico
El numero de genes del genoma puede ser identificado directamente al definir marcos de lectura abierto (ORF). El mapeo de esta
naturaleza a gran escala es complicado porque los genes interrumpidos pueden estar formados por numerosos ORF separados. No
necesariamente tenemos información acerca de las funciones de los productos proteínicos ni tenemos una prueba de que leguen a
expresarse, de modo que este abordaje se restringe a la definición del potencial del genoma. Sin embargo, se presume con relativa
certeza que cualquier marco de lectura abierto conservado probablemente llegue a expresarse.
También se puede definir el numero de genes directamente en funcion del transcriptoma (identificando directamente todas las mol
éculas de mRNA) o del proteoma (identificando directamente todas las proteinas. Esto proporciona a la seguridad de que se trata c
on genes auténticos que se expresan en circunstancias conocidas y permiten investigar cuántos genes son expresados en un tipo de
célula o un tejido particular, que variación existe en los niveles relativos de expresión y cuántos de los genes expresados en una c
élula particular son únicos de esa célula o también son expresados en alguna otra parte.
Las repeticiones invertidas tienen una longitud entre 100 y 1000 pb. Se desconoce su funcion, sin embargo se esta estudiando com
o intervienen estas estructuras cruciformes en la formación de la cromatina.
2- En el mecanismo de conversión génico, un miembro de un grupo de genes repetidos "corrige", una variante próxima mediante u
n proceso parecido a la reparación mediante recombinación.
Dado que las mutaciones puntuales son acontecimientos raros comparados con los entrecruzamientos, cualquiera de los dos mecan
ismos dará como resultado una nueva copia de la secuencia repetida, ya sea eliminando la secuencia mutada o extendiendo su pred
ominio sobre la agrupación entera. Si una mutación que ha sido concentrada de esta forma es perjudicial, será eliminada por selecc
ión natural. Por el contrario, las variantes de los espaciadores, que no son objetos de un presión selectiva, serán eliminadas a una v
elocidad menor. La existencia de grupos repetidos de genes idénticos separados por espaciadores son objetos de una presión select
iva, serán eliminadas a una velocidad menor. La existencia de grupo repetidos de genes idénticos separados por espaciadores algo
heterogéneos puede, por lo tanto, ser explicada razonadamente por cualquiera de los dos modelos de homogenización.
POLIMORFISMOS
En la perspectiva mendeliana, solo podían haber dos tipos de alelos para un mismo locus, como máximo tres en ciertos patrones d
e herencia.
En alelos múltiples, se manifiestan mas de tres alelos por locus. La coexistencia de alelos múltiples en un locus se denomina poli
morfismo. Por definición, cualquier sitio en el cual existen alelos múltiples como componentes estables de la población es polimór
fico. Un alelo suele ser definido como polimórfico si su frecuencia en la población es de > 1 %
La explicación mas razonable del polimorfismo es que un gen haya sufrido diferentes mutaciones que modifiquen la función prote
ínica, produciendo cambios en el fenotipo.
El polimorfismo molecular consiste la variación que se presenta en individuos de una misma especie, bien sea al nivel genético o
al nivel de las proteínas. En otras palabras, describe el concepto de alelismo, es la existencia en una población de múltiples alelos
de un gen (mayor a tres). Los polimorfismos no son consideradas mutaciones.
Aunque probablemente, los polimorfismos hayan surgido de mutaciones de un gen, existe una gran diferencia:
• Mutaciones son cambios poco frecuentes en la secuencia de bases en el DNA.
• Polimorfismo son variaciones que debe aparecer necesariamente en al menos el 1% de la población.
Se describe tres tipos de polimorfismos:
A- Polimorfismo de nucleótido único (SNP, del inglés Single Nucleotide Polymorphism).
B- Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism).
C- Polimorfismos en el número de repetición en tándem (VNTR, del inglés Variable Number Tandem Repetition).
SNP:
Por definición, es una variación en la secuencia de DNA que afecta a una sola base de una secuencia del genoma.
Esta definición se vio modificada, siendo un tipo mas abarcativo que incluye:
- Variaciones de unos pocos nucleótidos.
- Inserciones y deleciones de un/unos pocos nucleótidos.
RFLP:
Se refiere a secuencias especificas de nucleótidos en el DNA que son reconocidas y cortadas por las enzimas restricción y que varí
an entre individuos.
VNTR:
Son repeticiones de secuencias de 9 a 100 pb. El numero de repeticiones es variable pero en general ronda entre 100 y 1000 pb.
DEFINICION DE GEN:
Según la biología clásica, "un gen es una parte de un cromosoma que determina o afecta un solo carácter o fenotipo"
Según la biología molecular, "un gen es un segmento de material genético que determina o codifica una proteína"
Según la bioquímica, "un gen es una secuencia de DNA que codifica un producto final con funcion estructural o catalítica"
TAMAÑO DE UN GEN:
El tamaño mínimo global de los genes que codifican proteinas puede calcularse de forma directa sabiendo que por cada aminoácid
os de una hebra polipeptídica, intervino tres nucleótidos consecutivos en una de las hebras del DNA.
El conjunto de tres nucleótidos se lo conoce como codón. Estos están dispuestos en una secuencia que corresponde a la secuencia
de aminoácidos del polipéptido codificado por el gen. A una hebra polipeptídica de tamaño medio de 350 aminoácidos le correspo
nderían 1050 pares de bases. Muchos genes de organismos eucariotas y unos pocos de bacterias y arqueas se encuentran interrump
idos por segmentos de DNA no codificante y son, por lo tanto, considerablemente mas largos que el tamaño sugerido mediante est
e calculo sencillo.
CARACTERISRICAS:
- La mayoría de los genes eucariotas contienen exones e intrones.
- Todo gen comienza con el exón 1.
- El transcrito primario, el mRNA sin procesar, se extiende desde el nucleótido +1 hasta el nucleótido final del gen.
- El promotor es una región ubicada "upstream" (no se transcribe) que es necesaria para que la enzima RNA polimerasa (RNApol)
pueda sintetizar el transcrito primario.
- El mRNA maduro o procesado contiene solo los exones mas el CAP (5') y Poli A (3').
- Los ribosomas comienzan a traducir la proteína a partir del codón de inicio del mRNA, generalmente AUG, y terminan en el cod
ón de STOP, por ejemplo UGA.
CARACTERISTICAS
-La mayoría de los genes procariotas no tiene intrones.
- La transcripción de los genes procariotas requiere de un promotor al igual que los genes eucariotas.
- En la mayoría de los genes procariotas el mRNA no sufre procesamiento.
- Los genes procariotas poseen regiones 5' y 3' UTR al igual que los genes eucariotas.
- La región 5' UTR de los genes procariotas contiene un RBS (Ribosome Binding Site, o sitio de unión al ribosoma) próximo al co
dón de inicio de la traducción AUG.
- Para expresar un gen eucariota en una célula procariota se requiere un vector de expresión que contenga un promotor, un RBS y
una secuencia terminadora de la transcripción que sean reconocidos por la maquinaria de la célula huésped.
EN RESUMEN =
• Un gen es una secuencia de DNA que codifica un producto final con funcion estructural o catalítica. Empieza por el exón +1. La
transcripción de un gen es promovida por un promotor: La región promotora está compuesta por una secuencia específica de DNA
localizada justo donde se encuentra el punto de inicio de la transcripción del DNA y contiene la información necesaria para activa
r o desactivar el gen que regula. Existen secuencias promotoras tanto en procariotas como eucariotas.
• El ORF o el marco de lectura abierto es la porción de material genético del gen que se transcribe. A pesar de que se transcribe to
dos los exones e intrones del gen, hay un segmento del exón 1 y del ultimo exón que no se lo considera parte de la ORF porque est
os son segmentos de donde se agarra la RNApol para sintetizar el transcrito primario.
• El transcrito primario es la secuencia complementaria de RNA del gen incluyendo los anticodones de iniciación y de stop, que so
n las secuencias complementarias de los codones de los mismo.
• El RNA maduro es el transcrito primario luego de sufrir un proceso de maduración. Este proceso (splicing) consiste en:
- Desaparición de los intrones
- Solapamiento de los exones
- Adición de la GAP y de una cola poli-A.
• Finalmente, el RNA maduro, mas comúnmente llamado RNA mensajero (mRNA) es traducido. El segmento de mRNA es menor
que lo que realmente mide el mRNA. Lógicamente, y esto se debe a los codones de iniciación y de finalización, que son posicion
es en donde se agarra el ribosoma para la traducción.
En células procariotas: El codón de inicio es: ATG
En células eucariotas: El codón de inicio es: AUG
A- CENTROMERO: consiste en una secuencia de DNA que actúa de punto de unión de las proteinas que fijan el cromosoma al h
uso mitótico. Esta unión resulta esencial para que se produzca la segregación igual y ordenada de los conjuntos de cromosomas en
tre las células hijas durante la división celular.
Las secuencias esenciales para la funcion de los centrómero en eucariotas son largos que generalmente contienen SSR, que 9consi
ste en miles de copias den tándem de una o unas pocas secuencias cortas de 5 a 10 pb en la misma orientación. Todavía no se cono
ce el papel exacto del DNA de secuencia simple en la funcion del centrómero.
B- TELOMEROS: son secuencias con funcion estabilizadora del cromosoma situadas en los extremos de los cromosomas eucariót
icos. Los telómeros terminan con secuencias del tipo:
donde:
x e y suelen oscilar entre 1 y 4. El numero de repeticiones en el telómero, n, esta entre 20 y 200 en la mayoría de eucariotas unicel
ulares y es generalmente superior a 1500 en mamíferos. Los extremos de una molécula lineal de DNA no pueden ser replicados de
manera rutinaria por la maquinaria de replicación celular (ello puede ser una de las causas de la circularidad del DNA bacteriano).
Las secuencias repetidas de los telómeros se añaden a los extremos de los cromosomas eucarióticos principalmente por la enzima
telomerasa.
EVOLUCIÓN DE GENOMAS
Existen principalmente cinco cambios a nivel genético que contribuyen a la evolución:
• Las mutaciones (mutation within a gene)
• La duplicación de genes (gene duplication)
• La deleción de genes (gene deletion)
• Reordenamientos de exones (exon shuffling)
GENE DELETION
La deleción de genes ocurre por procesos de transposición seguidos de recombinación homologa:
* las líneas representan dsDNA
EXON SHUFFLING
Existen dos mecanismos de exon shuffling:
• Por recombinación homologa entre secuencias repetitivas dispersas:
• Por transposición:
-----------------------------------Replicación del DNA------------------------------------
La necesidad de la transmisión de la información genética a las siguientes generaciones suficientemente fidelidad, pero con capaci
dad para admitir las mutaciones beneficiosas, ha llevado a la evolución de complejos mecanismos para la replicación, reparación y
recombinación del DNA.
El modelo de la doble hebra del DNA planteado por Watson & Crick, sugiere un posible mecanismo de reproducción del material
genético. Mas tarde, postulan dicho mecanismo: "Una hebra de DNA puede actuar como molde para dirigir la síntesis de su hebra
complementaria".
La replicación es semiconservativa
Las primeras pruebas sobre el mecanismo de replicación de los cromosomas se obtuvo mediante autorradiografías de DNA en repl
icación. Estas autorradiografías de cromosomas circulares creciendo en un medio que contenía [3H]timidina mostraban la existenc
ia de "burbujas" de replicación. Estas estructuras, denominadas estructuras theta indican que el DNA dúplex se replica por una pro
gresiva separación de las dos hebras paternas, acompañado de una síntesis de sus hebras complementarias, dando lugar, de forma s
emiconservadora, a dos dobles hebras hijas.
El punto de separación de las dos hebras en el ojo de replicación, donde la síntesis tiene lugar, se denomina horquilla de replicació
n. Una burbuja de replicación puede contener una o dos horquillas de replicación (replicación unidireccional o bidireccional), sien
do la replicación en la mayoría de las veces bidireccional.
El DNA procariótico y el de los bacteriófagos solo poseen un único origen de replicación (punto donde se originan las burbujas de
replicación).
La replicación es semidiscontínua
Las dos hebras antiparalelas del DNA dúplex se replican simultáneamente a medida que avanza la horquilla de replicación. Pero, t
odas las DNApol conocidas tan solo pueden extender las hebras en la dirección 5' → 3', lo que implica que para la hebra complem
entaria del molde (la hebra molde que va en 5' → 3') se debe replicar mediante otro mecanismo de replicación.
Okazaki, basándose en sus experimentos, planteo un modelo de replicación, que además de ser semiconservativa, es semicontínua,
lo que implica que las dos hebras paternas se replican de modo diferente:
- La hebra de DNA sintetizada de nuevo, que crece en dirección 5' → 3', al igual que el avance de la horquilla de replicación, es la
denominada hebra conductora y es sintetizada de manera continua.
- La otra hebra de DNA sintetizada de nuevo, que crece también en dirección 5' → 3', pero en contra al avance de la horquilla de r
eplicación, es la denominada hebra retrasa y es sintetizada de forma discontinua, mediante fragmentos de DNA, llamados fragmen
tos de Okazaki. Estos fragmentos se unen covalentemente, despues de su síntesis, en una reacción catalizada por la enzima DNA li
gasa.
Ahora bien, todas las DNApol necesitan, para extender la hebra de DNA, un extremo 3'-OH libre. La síntesis de la hebra retrasada
parten de extremos 5' que consisten en segmentos de RNA de 1 a 60 nucleótidos, que son complementarios a la hebra de DNA m
olde.
Las procariotas posee dos enzimas que catalizan la formación de estos cebadores de RNA: la RNA polimerasa (RNApol), y otra d
e menor tamaño, la primasa. La primasa es resistente a la acción de la rifampicina (antibiótico), mientras que la RNApol no.
La observación de que la rifampicina inhibe únicamente la síntesis de la hebra conductora esta indicando que la primasa es la enca
rgada de sintetizar los cebadores de los fragmentos de Okazaki.
Con respecto a la hebra conductora, in vitro puede ser sinterizada tanto por la RNApol como la primasa. Pero el proceso es altame
nte estimulado cuando las dos enzimas están presentes. Es por ello, que estas dos enzimas deben actuar sinérgicamente in vivo en
el inicio de la síntesis de la hebra conductora.
El DNA replicado, ya maduro, no contiene ningún fragmento de RNA. Los cebadores de RNA se eliminan durante el proceso de l
a replicación y los huecos monohebra que dejan son llenados con DNA.
B- NUCLEASAS
Las nucleasas son enzimas que degradan a los A.N. Mas específicamente, se llaman ADNsas a aquellas que degradan al DNA, y
ARNasas a las que degradan al RNA.
Todas las células contienen varias nucleasas diferentes, que pueden clasificarse en dos grandes grupos:
- las exonucleasas degradan los A.N. desde un extremo de la molécula. Muchas actúan solo en dirección 5' → 3' o bien en direcció
n 3' → 5' eliminando nucleótidos solo de los extremos 5' o del 3' respectivamente, de una hebra de acido nucleico de doble hebra.
- las endonucleasas pueden empezar a degradar en sitios interno específicos de una hebra o molécula de A.N., reduciéndolo a frag
mentos cada vez mas pequeños. Unas pocas exonucleasas y endonucleasa degradas exclusivamente DNA de hebra sencilla. Hay u
nas pocas clases de endonucleasas de gran importancia que degradan secuencias de nucleótidos especificas, las mas importantes s
on las endonucleasas de restricción.
C- ENZIMAS DE REPLICACION
La replicación del DNA es un proceso complejo en el que intervienen gran variedad de enzimas y otras proteinas. Las principales
son:
1- DNA girasa
2- Maquinaria proteica que opera en la horquilla de replicación
3- Una DNApol
4- Una exonucleasa
5- Una DNA ligasa
1- DNA girasa
La separación de las hebras de un DNA dúplex circular tiene diferentes problemas topológicos. La separación de las hebras de la d
oble hebra sufre un proceso de desenrollamiento de la estructura.
La separación de las dos hebras de una molécula de DNA circular (o una molécula lineal que no puede girar con libertad, como oc
urre en un gran cromosoma eucariota) genera un aumento de la tensión a medida que se desenrolla que no puede liberarse por rota
ción de la molécula.
Una molécula de DNA sobrenrollada adquiere un superenrollamiento positivo. Por lo tanto, el movimiento de la horquilla de repli
cación genera un superenrollamiento positivo en la porción no replicada del DNA por delante de la horquilla. Cuando se considera
que un cromosoma circular completo de procariotas contiene alrededor de 400000 vueltas y lo duplican dos horquillas de replicac
ión en 40 min, se planteo que había un mecanismo que debía alivianar la tensión.
Las células contienen enzimas, llamadas topoisomerasas, capaces de cambiar el estado de superenrollamiento de la molécula de D
NA. Una enzima de este tipo, denominada DNA girasa, una topoisomerasa de tipo II, libera la tensión mecánica que se crea durant
e la replicación en procariotas. Las moléculas de la DNA girasa se desplazan a lo largo del DNA por delante de la horquilla de rep
licación y eliminan los superenrollamiento positivos. La DNA girasa realiza esta tarea al cortar las dos hebras del DNA dúplex; un
segmento del DNA pasa a través de la rotura de la doble hebra hacia el otro lado y entonces se ligan los cortes de nueva cuenta, u
n proceso que se lleva a cabo por liberación de energía durante la hidrolisis de ATP. Las células eucariotas poseen enzimas similar
es que realizan esta funcion.
3- DNA polimerasas
En la procariotas existen al menos 5 DNA polimerasas. En todas, comparten 2 características en común:
1- Todas las DNApol requieren un molde. La reacción de polimerización esta dirigida por una hebra molde de DNA según las regl
as de apareamiento de bases predichas por Watson & Crick.
Este proceso es el primero en descubrirse en donde se aprecio que la información genética se transmite empleando moldes de mate
rial genético existente.
2- Las polimerasas requieren un cebador. Un cebador es un segmento de hebra (complementario del molde) con un grupo 3'-OH li
bre al cual pueden añadirse nucleótidos. El extremo 3' del cebador se denomina extremo terminal del cebador. Parte de la nueva he
bra ya tiene que encontrarse en su lugar; todas las DNApol, sin excepción, únicamente son capaces de añadir nucleótidos a una he
bra preexistente.
Despues de añadir un nucleótido a una hebra de DNA en crecimiento, la DNApol se disocia o bien se traslada a lo largo del molde
y añade otro nucleótido. La disociación y la reasociación de la polimerasa pueden limitar la velocidad global de polimerización. E
l proceso es generalmente mas rápido si la polimerasa añade mas nucleótidos sin disociarse del molde. El numero medio es el núm
ero de nucleótidos añadidos antes de que una polimerasa se disocie.
La DNApol I fue la primera en descubrirse. Esta cataliza la transferencia de un grupo fosforilo. El nucleófilo es el grupo 3'-OH del
nucleótido en el extremo 3' de la hebra en crecimiento. El ataque nucleofílico se produce sobre el fosforo alfa del desoxinucleósid
o 5'-trifosfato entrante. En la reacción se libera pirofosfato inorgánico. La ecuación general:
(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
donde dNMP y dNTP son desoxinucleósidos 5'-monofosfato y 5'-trifosfato, respectivamente. La reacción aparentemente tiene lug
ar con solo un cambio mínimo de energía libre, puesto que se forma un enlace fosfodiéster a expensas de un anhídrido fosfórico al
go menos estable. Sin embargo, las interacciones no covalentes de apilamiento y de apareamiento de bases estabilizan el DNA ala
rgado en relación con el nucleótido libre. Además, en la célula la formación de productos esta favorecida por los 19 kJ/mol genera
dos por la subsiguiente hidrolisis del producto pirofosfato por la enzima pirofosfatasa.
Poco tiempo despues, se determino experimentalmente que la DNApol I no podía actuar en solitario. Estos resultados arrojaron qu
e:
A- Su velocidad es demasiado lenta para explicar la velocidad del movimiento de la horquilla de replicación en las células bacteria
nas.
B- El DNApol I tiene una procesividad relativamente baja.
C- Estudios genéticos han demostrado que en la replicación intervienen muchos genes y, por lo tanto, muchas proteinas, lo cual da
un indicio de que la DNApol I no actúa aisladamente.
D- Al estudiar una cepa bacteriana con el gen de la DNApol I alterada, y ver que dicha enzima estaba inactiva, pero que al emplea
r agentes que dañaban al DNA, las bacterias eran viables, confirmo dicho hipótesis.
La búsqueda de otras polimerasa llevo al descubrimiento de la DNApol II y de la DNApol III en procariotas. La DNApol II es una
enzima implicada en un tipo de reparación del DNA. La DNApol III es la enzima principal de replicación en procariotas.
Las DNApol IV y V están implicadas en un tipo de reparación del DNA poco habitual.
La DNApol I no es la enzima principal de la replicación; en cambio realiza una multitud de funciones de limpieza durante la replic
ación, la recombinación y la reparación. Estas funciones especiales están potenciadas por su actividad exonucleotílica 5' → 3'. Est
a actividad esta localizada en un dominio estructural que puede ser separado de la enzima mediante un tratamiento proteolítico sua
ve. Cuando se elimina el dominio exonucleotílico 5' → 3', el fragmento grande o de Klenow, retiene las actividades de polimeriza
ción y de corrección de pruebas. La actividad exonucleasa 5' → 3' de la DNApol I intacta puede reemplazar un segmento de DNA
(o RNA) apareado a la hebra molde, en un proceso llamado proceso llamado translación de la mella. La mayoría de DNApol resta
ntes carecen de actividad exonucleasa 5' → 3'.
La DNApol III, con diez tipo de subunidades, es mucho mas compl3ja que la DNApol I. Sus actividades de polimerización y de c
orrección de pruebas reside en las subunidades alfa y épsilon, respectivamente. La subunidad theta se asocia con las subunidades a
lfa y épsilon para formar la polimerasa núcleo, capaz de polimerizar el DNA, pero de procesividad limitada. Dos polimerasas núcl
eo se pueden unir mediante otro conjunto de subunidades, un complejo de carga de la abrazadera, o complejo gamma, consistente
en cinco subunidades de cuatro subtipos diferentes. Las polimerasas núcleo se unen a través de las subunidades tau. Dos subunida
des adicionales chi y psi, están unidas al complejo de la abrazadera.
El conjunto completo de 13 subunidades proteicas (de nueve tipos diferentes) se denomina DNApol III*.
Las DNApol III* puede polimerizar DNA, pero con una procesividad mucho menor que la necesaria para la replicación organizad
a del cromosoma completo. El necesario aumento de procesividad resulta de la unión de las subunidades beta, cuatro de las cuales
completan la holoenzima de la DNApol III. Las subunidades beta se asocian por pares para formar una estructura toroidal que rod
ea el DNA y que actúa como una abrazadera. Cada dímero se asocia con un subconjunto núcleo de la polimerasa III* (una abrazad
era dimérica por subconjunto núcleo) y se desliza a lo largo a medida que avanza la replicación. La abrazadera beta deslizante imp
ide la disociación de la DNApol III del DNA, lo cual aumenta de forma espectacular la procesividad.
*Todas las DNApol presentan actividad polimerizadora 5’ – 3’, sin embargo, solo la DNApol I presenta actividad exonucleasa
en la misma dirección 5’ – 3’. La DNApol III es la enzima principal en el proceso de replicación, por su alta procesividad.
4- Exonucleasa
La DNApol I presenta diferentes propiedades que son desconcertantes, entre ellas, que la misma presenta actividad de exonucleas
a, lo cual es contradictorio para una enzima que aparentemente cataliza la síntesis de DNA y no su degradación.
Se demostró que todas las polimerasas bacterianas poseen la actividad de exonucleasa, por lo que la DNApol I tiene tres actividad
es:
- actividad de exonucleasa 5' → 3'
- actividad de exonucleasa 3' → 5' (corrección de pruebas)
- actividad de polimerización 5’ – 3’
Estas tres actividades se localizaron en diferentes dominios de un solo polipéptido. De esta forma, la DNApol I posee tres enzimas
en una. Las dos actividades de exonucleasa tienen funciones por completo diferentes en la replicación.
Además, casi todas las nucleasas son especificas para DNA o RNA pero la exonucleasa 5' → 3' de la DNApol I puede degradar lo
s dos tipos de A.N. El inicio de los fragmentos de Okazaki por medio de la primasa deja un segmento de RNA en el extremo 5' de
cada fragmento, el cual se remueve por la actividad de exonucleasa 5' → 3' de la DNApol I. A medida que la enzima remueve los
ribonucleótidos del iniciador su actividad de polimerasa rellena de manera simultanea el espacio resultante con desoxirribonucleót
idos. El ultimo desoxirribonucleótido incorporado se liga de manera covalente al extremo 5' terminal del fragmento de DNA antes
sinterizado por medio de una DNA ligasa.
5- DNA ligasa
En el contexto de la replicación, la DNA ligasa se encarga de unir los fragmentos de DNA que reemplazan los cebadores de RNA
con los fragmentos de Okazaki.
Su función es catalizar un enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-hidroxilo extremo de una de las hebras de DNA y el grupo 5'-difosf
ato del extremo de la otra hebra de DNA. Para llevar a cabo esta reacción, la célula necesita energía:
- En las células eucariotas y en las arqueas, la fuente de energía es el ATP.
- En las bacterias obtienen la energía del NAD+.
MECANISMO DE REPLICACION
- MODELO DEL CIRCULO RODANTE (BACTERIÓFAGOS)
La replicación por medio de círculos rodantes es común entre bacteriófagos. Los genomas unitarios pueden ser separados de la col
a desplazada y generar monómeros que es posible empacar en partículas de fagos o utilizar para ciclos de replicación posteriores.
El destino de la cola desplazada determina el tipo de productos generados por los círculos rodantes. La división de una uni
dad genera monómeros, que pueden ser convertidos en estructuras dúplex o circulares. La división de los multímeros gene
ra una serie de copias repetidas en tándem de la unidad original. La conversión a hebra doble podría ocurrir antes de que
la hebra se desprenda del circulo rodante.
En general, un fago esta formado por un DNA circular de hebra individual conocido como hebra positiva (+); por otra parte, se sin
tetiza una hebra complementaria denominada hebra negativa (-). Por esta acción se genera el circulo dúplex que es replicado poste
riormente por un mecanismo de circulo rodante.
El circulo dúplex se transforma en una estructura cerrada de manera covalente, la cual se superenrrolla. Una proteína codificada p
or el genoma del fago, la proteína A, hace una hendidura en la hebra (+) del DNA dúplex en un sitio especifico que define el orige
n de la replicación. Despues de que se forma la hendidura en el origen, la proteína A se mantiene conectada con el extremo 5' que
genera, mientras que el extremo 3' es extendido por la DNApol.
La estructura del DNA tiene una funcion importante en esta reacción, pues solo puede ser hendido cuando este superenrrollado ne
gativamente. La proteína A es susceptible de unirse a un fragmento decámero de hebra individual de DNA que rodea al sitio de he
ndidura, lo cual sugiere que el superenrrollamiento es necesario para facilitar la formación de una región de hebra individual que p
roporciona a la proteína A su sitio de unión. La hendidura genera un extremo 3'-OH y uno 5'-P (adherido de manera covalentemen
te a la proteína A), los cuales tienen un papel que desempeñar en la replicación de fagos.
Utilizando el circulo rodante, el extremo 3'-OH de la hendidura se extiende en una nueva hebra que se alarga en torno a la hebra m
olde (-) circular hasta que llega al punto de inicio y desplaza al origen, cuando la proteína A vuelve a funcionar.
Permanece conectada al circulo rodante y también al extremo 5' de la cola desplazada, de modo que se mantiene cerca, mientras q
ue el punto creciente regresa y rebasa al origen. Por consiguiente, la misma proteína A vuelve a estar disponible para reconocer el
origen y hendirlo, adhiriéndose ahora al extremo generado por la nueva hendidura. El ciclo puede repetirse indefinidamente. Desp
ues de este evento de formación de la hendidura, la hebra individual (+) desplazada es liberada en forma circular. La proteína A pa
rticipa en la formación del circulo, de hecho, la unión de los extremos 3' y 5' de la hebra (+) producida se logra a través de ella co
mo parte de la reacción por la cual es liberada al final de un ciclo de replicaci6n para que empiece otro. La proteína A tiene una pr
opiedad inusual posiblemente relacionada con estas actividades. In vivo actúa en configuración cis. (No es posible reproducir este
comportamiento in vitro, como puede observarse a partir de su actividad en cualquier molde de DNA de un sistema sin células.) L
a implicación es que, in vivo, la proteína A sintetizada por un genoma en particular puede adherirse solo al DNA de dicho genoma
, pero se desconoce como. Sin embargo, su actividad in vitro muestra como se mantiene asociada a la misma hebra molde (-) prog
enitora. La proteína A tiene dos sitios activos, lo cual le permite dividir el origen "nuevo" mientras aun conserva el "antiguo"; des
pues se liga a la hebra desplazada en un circulo. Una vez formada la estructura circular, la hebra (+) desplazada puede tener dos de
stinos. Durante la fase de replicación de la infección vírica puede ser utilizada como molde para sintetizar la: hebra (-) complemen
taria; el circulo dúplex puede ser utilizado despues como circulo rodante para generar mas progenie. Por otra parte, durante la mor
fogénesis del fago, la hebra (+) desplazada se empaqueta en el virión fágico.
ENZIMA TELOMERASA
La secuencia de los telómeros de múltiples organismos, ha mostrado que la mayoría son oligómeros repetitivos con un alto conten
ido de G en la hebra con su extremo 3’ al final del cromosoma. La secuencia repetitiva telomérica en los vertebrados es TTAGGG
. El extremo 3’ de las hebras ricas en G se extienden 12 – 16 nucleótidos mas allá del extremo 5’ de la hebra complementaria rica
en C. Esta region esta unida por proteinas especificas que protegen los extremos de los cromosomas lineales del ataque por parte d
e las nucleasas.
La necesidad de una region especializada en los extremos de los cromosomas eucariotas es evidente cuando se considera que toda
s las DNApol conocidas alargan las hebras de DNA en el extremo 3’, y todas requieren un cebador de RNA o DNA. A medida qu
e la horquilla de replicación se aproxima al final de un cromosoma lineal, la síntesis de la hebra conductora continua hasta el final
de la hebra molde de DNA, completando una doble hebra de DNA hija.
Sin embargo, debido a que el molde de la hebra retardada se copia de manera discontinua, no se puede replicar en su totalidad.
Cuando se elimina el cebador de RNA final, no existe hebra en dirección 5’ sobre la cual la DNApol pueda trabajar para llenar los
huecos resultantes. Sin algún tipo de mecanismo especial, la hebra de DNA hija, resultante de la síntesis de la hebra rezagada, se
acortaría en cada división celular.
El problema del acortamiento de los telómeros se resuelve mediante una enzima que añade las secuencias repetidas teloméricas (T
EL) al extremo de cada cromosoma. La enzima es un complejo de RNA-proteina llamada transferasa terminal telomérica o telome
rasa. Debido a que la secuencia de RNA asociada a la telomerasa, sirve como molde para la adición de desoxirribonucleótidos a lo
s extremos de los telómeros, la fuente de enzima y no la fuente del cebador de DNA telomérico determina la secuencia añadida.
La telomerasa es una forma especializada de una transcriptasa reversa que transporta su propio molde de RNA interno para dirigi
r la síntesis de DNA.
El extremo 3’ de una hélice final de un telómero extendido por la telomerasa, contrarrestando la incapacidad del mecanismo de re
plicación del DNA para sintetizar el extremo final de DNA lineal.
Principales Características:
La telomerasa alarga este extremo de una hélice mediante un mecanismo de transcripción inversa reiterativo.
La telomerasa añade una unidad de repetición T2G4; otras telomerasas añaden secuencias levemente diferentes.
La telomerasa contiene un molde de RNA que forma apareamiento de bases con el extremo 3’ del molde de la hebra retrasada.
MECANISMO
1- La enzima contiene RNA telomerásico con un sector complementario a la secuencia de los telómeros.
2- La unión del DNA telomérico con al RNA telomerásico se produce por apareamiento de bases complementarias.
3- La enzima alarga el telómero usando como molde el RNA.
4- Al completar un alargamiento la enzima se desplaza y comienza un nuevo ciclo de alargamiento y así sucesivamente.
5 – La replicación de la hebra rezagada termina cuando un cebador de RNA sintetizado por la DNApol alfa se utiliza como extrem
o 3’ libre para la DNApol delta.
Resultados esperados en este tipo de experimento para cada uno de los tres posibles esquemas de replicación.
El tubo único de la izquierda indica la posición del DNA parental y las posiciones en las cuales los fragmentos de DNA ligeros o h
íbridos deberían generar las banda.
EXPERIMENTO DE OKAZAKI
El experimento de Okazaki permitió determinar como es que se sintetiza la hebra rezagada. El experimento es del tipo pulso y lav
ado, el cual consiste en dos ensayos:
A- Por un lado, durante el crecimiento de un cultivo se realizo marcajes con pulsos de 30 seg de [3H]timidina, de manera tal que l
a mayor parte de la radiactividad, proviene del nuevo DNA sintetizado. El mismo tiene un coeficiente de sedimentación en medio
alcalino de 7 a 11 S. Estos fragmentos, llamados fragmentos de Okazaki, son de 1 a 2 kb.
B- Luego se transfiere el cultivo a un medio no radiactivo. El DNA resultante, marcado radiactivamente, sedimenta a una velocida
d que se incrementa con el tiempo que las células han crecido en el medio no radiactivo.
Se tomaron las bandas que se formaron en el gradiente a partir de seis tubos (que representan los diferentes tiempos).
Tomando alícuotas desde la parte superior, siendo el X = 0 el tope, se midió la radiactividad en función de la distancia X hacia el t
ope del tubo, obteniendo el siguiente gráfico:
A partir de este experimento se deduce que: los fragmentos de Okazaki deben haber sido incorporados covalentemente a molécul
as de DNA de mayor tamaño.
Esto se ve al analizar que:
• A tiempos cortos despues del pulso, solo se ve radiactividad en la parte superior del tubo, lo que implica que son fragmentos peq
ueños. A su vez, a medida que pasa el tiempo (hasta aprox los 30 s), el numero de los fragmentos cortos marcados aumenta.
• Después de periodos de 60 a 120 s, la altura de los picos a tiempos cortos disminuye. Sin embargo, fragmentos ubicados al final
del tubo presentan radiactividad, el cual también aumenta a medida que transcurre el tiempo.
Debido a que la radiactividad solo proviene de una única fuente, y que primeramente fue asimilado por fragmentos pequeños de D
NA, se concluye que estos fragmentos marcados a tiempos largos son incorporados a una molécula de DNA de mayor tamaño.
Una vez encontrado, el texp o [MUT] adecuado, se procede a un segundo ensayo de réplica, pero esta vez, empleando como factor
limitante a la T. Utilizando las condiciones recién obtenidas, con este ensayo se trata de aislar a letales condicionales sensibles a l
a T.
Esto se logra utilizando placas con distintas T de incubación, pero con las mismas propiedades nutritivas y [MUT]. Las T se las c
onocen como T restrictiva y permisiva debido a que en la primera el microorganismo no crece y en la segunda si.
A su vez, para detectar a bacterias que tengan mutaciones implicadas en la replicación del DNA se utilizara timina tritiada para se
guir la síntesis de DNA, y de esta manera evaluar que enzima puede estar afectada:
• En el caso I: se trata de una proteina que esta involucrada en el origen de replicación. Se requiere solo en el reconocimiento del o
rigen, por lo que solo aparecerá su efecto cuando se produzca un nuevo ciclo de replicación. A eso se debe que aun haya síntesis.
• En el caso II: se trata de una proteina que esta involucrada en todo el proceso de replicación, de manera que inmediatamente des
pues de que se produce el cambio de T, la replicación se detiene.
----------------------------------Reparación del DNA--------------------------------------
Una célula generalmente solo tiene una o dos copias de gDNA (DNA genómico). Las proteinas y las moléculas de RNA pueden s
er reemplazadas rápidamente en caso de resultar dañadas utilizando información codificada en el DNA; en cambio, las propias mo
léculas de DNA son irremplazables. El mantenimiento de la integridad de la información contenida en el DNA es, por lo tanto, un
a orden celular, al que responde un elaborado conjunto de sistemas de reparación de DNA. El DNA puede resultar dañado por div
ersos procesos, algunos espontáneos, otros catalizados por agentes ambientales. La propia replicación puede ocasionalmente dañar
la información genética contenida al dejar bases mal apareadas.
La química de las lesiones del DNA es compleja y diversa. La respuesta celular a las lesiones consiste en una amplia gama de siste
mas enzimáticos que catalizan algunas de las transformaciones químicas mas importantes del metabolismo del DNA.
MUTAGENESIS
Las mutaciones surgen en las células a causa de cambios en la secuencia de bases del material genético. En muchos casos, las mut
aciones conducen a cambios fenotípicos en el organismo; en la mayoría de las ocasiones estos cambios son perjudiciales o neutros
, pero a veces ocurren también cambios que son beneficiosos.
Las mutaciones pueden ser espontaneas o inducidas. Las mutaciones espontaneas pueden surgir como consecuencia de la acción d
e la radiación natural que alteran la estructura de las bases del DNA. También pueden ocurrir durante la replicación, como resultad
o de errores en el apareamiento de las bases, originando cambios en el DNA replicado.
Las mutaciones que implican un par de bases (o unos pocos pares) se conocen generalmente como puntuales. Las mutaciones punt
uales pueden ser resultado de sustituciones de pares de bases en el DNA o de la inserción o delación de un par de bases (microinse
rciones o microdeleciones). Como en toda mutación, el cambio fenotípico derivado de una mutación puntual depende de donde oc
urra exactamente la mutación en el gen, que cambio de nucleótido tuvo lugar, y que producto codifica dicho gen.
A- DESAMINACION
Varias bases nucleotídicas sufren la perdida espontanea de sus grupos amino exocíclicos. La lenta reacción de desaminación de la
citosina es la causa por la que el DNA contenga timina en lugar de uracilo. Esto es básicamente por dos cosas:
- El producto de la desaminación de la citosina se lo puede reconocer rápidamente como extraño, y se elimina por un sistema de re
paración del DNA.
- Si el DNA contuviera normalmente uracilo, el reconocimiento de los uracilos procedentes de la desaminación de la citosina prov
ocaría entonces una disminución gradual en la cantidad de pb de G - C y un aumento en los A - U en el DNA de todas las células.
B- DEPURINACION
Es la hidrolisis del enlace N-beta-glucosídico entre la base y la pentosa. Esta reacción produce una lesión denominada sitio AP (ap
urínico, apirimidínico) o abásico. Esta reacción ocurre con mayor facilidad con las purinas que con las pirimidínas. La despurinac
ión de los ribonucleótidos y del RNA es mucho mas lenta y normalmente no se considera fisiológicamente significativa, a compar
ación de la despurinación del DNA. El proceso puede acelerarse empleando acido diluido: la incubación del DNA a pH 3 provoca
la eliminación selectiva de las bases purínicas, y produce un derivado denominado acido apurínico.
Estos productos pueden no ser peligrosos en sí mismos pero su metabolización por las células puede convertirlos en productos que
si lo sean. Hay dos clases principales de este tipo de agentes:
1- Agentes Dasaminantes: en particular el acido nitroso, o compuestos que generen acido nitroso o nitritos.
El acido nitroso, formado a partir de precursores orgánicos tales como nitrosaminas y sales de nitritos y nitrato, es un reactivo que
acelera poderosamente la desaminación de las bases.
El bisulfito tiene efectos similares. Ambos compuestos se usan como conservantes en alimentos preparados para evitar el crecimie
nto de bacterias toxicas. Parece ser que su utilización no aumenta significativamente el riesgo de cáncer, probablemente porque las
cantidades empleadas son pequeñas y su efecto sobre el DNA resulta despreciable.
Los riesgos potenciales para la salud a causa del deterioro que se produciría en los alimentos en el caso de que no se usaran esto
s conservantes son mucho mayores.
2- Agentes Alquilantes: Los agentes alquilantes pueden alterar ciertas bases del DNA. Muchas reacciones son producidas por age
ntes alquilantes normalmente presentes en las células, como la S-adenosilmetionina, que están reguladas y se producen por fin. Pe
ro, por ejemplo, el dimetilsulfato, puede metilar la guanina y dar lugar a O 6-metilguanina, que no puede aparearse con la citosina,
además que la reacción es irreversible:
MUTÁGENOS
Mientras que la frecuencia de mutación espontanea es muy baja, hay una variedad de agentes químicos, físicos y biológicos que p
ueden incrementar la velocidad de mutación, y se dice que inducen a mutaciones. Estos agentes se conocen como mutágenos.
=> RADIACION
Varias formas de radiación son altamente mutagénicas. Podemos dividir la radiación mutagénica en dos categorías principales, ion
izantes y no ionizantes (electromagnéticas). Aunque ambos tipos de radiación se usan en genética microbiana, las radiaciones no i
onizantes se usan mas.
No ionizantes
Las bases púricas y pirimidínas de los ácidos nucleicos absorben intensamente radiación UV, y con un máximo de absorción para
el DNA y el RNA es de 260 nm. Las proteinas también absorben radiación UV, pero presentan un máximo a 280 nm debido a la a
bsorción de los aminoácidos aromáticos.
La muerte de células por radiación UV se debe principalmente a su acción sobre el DNA, de manera que la radiación de 260 nm e
s la mas efectiva y la mas letal. Aunque se conocen varios efectos, el mas importante es la inducción de dímeros de pirimidína en
el DNA, un estado en el que dos bases pirimídicas adyacentes (citosina o timina) se unen covalentemente, de manera que se incre
menta en gran medida la probabilidad de que durante la replicación del DNA, la DNApol inserte un nucleótido incorrecto en posic
ión.
El tipo mas frecuente de fuente de radiación UV que se usa en mutagénesis es la lámpara microbicida, la cual emite grandes dosis
de radiación UV en la región de 260 nm. Suele utilizarse una dosis de radiación UV que produce un 90-95% de muerte en la pobla
ción, y se buscan luego mutantes entre los supervivientes. Si se usan dosis mucho mas altas de radiación, el numero de células via
bles será demasiado bajo, mientras que si se usan dosis menores, se inducirán daños insuficientes en el DNA.
Su acción es mas superficial, es decir, no tiene mucho poder de penetración.
Ionizantes
La radiación ionizante es una forma de radiación mas potente e incluye los radiación de longitud corta, como los rayos X y los ray
os gamma. Estas radiaciones causan la ionización del agua y otras sustancias, y los efectos mutagénicos se producen indirectament
e a causa de esta ionización. Entre las potentes especies químicas formadas por la radiación ionizante están los radicales libre, de l
os cuales el mas importante es el radical hidroxilo OH•. Los radicales libres reaccionan e inactivan macromoléculas celulares, sien
do la mas importante el DNA. Con toda probabilidad, el DNA no es mas sensible que otras moléculas a la radiación ionizante, per
o dado que el DNA es el material genético, los cambios inducidos en el tienen un efecto permanente. A bajas dosis de radiación, s
olo ocurren unos pocos impactos en el DNA, pero a altas dosis ocurren tantos impactos que conducen a la muerte de las células. A
l contrario que la radiación UV, la radiación ionizante penetra fácilmente el vidrio y otros materiales. Por esta razón, la radiación i
onizante se usa con frecuencia para inducir mutaciones en plantas y animales (donde su poder de penetración hace posible alcanz
ar con facilidad las células germinales de estos organismos), pero debido a que es mas peligrosa de usar y esta menos disponible, s
e emplea poco en microorganismos ( donde la penetración de la radiación UV no es problema y alcanza).
Sensible al frio Alteración de una proteína esencial de ma Incapacidad de crecer a una T (15/30 °C)
nera que se inactiva a bajas T. en la que normalmente crece.
Resistente a drogas Alteración en la permeabilidad a la droga, Crecimiento en el medio que contiene una
modificación de su diana, o capacidad de CIM del compuesto.
detoxificación.
Colonia rugosa Perdida o cambio en el LPS en lugar mem Colonias agranulares e irregulares.
brana externa.
Fermentación de azucares Perdida de una enzima de una vía degrada Perdida de cambio de color en medio cont
tiva. eniendo el azúcar y un indicador de pH.
Alteración de una proteína esencial que no Incapacidad para crecer a una T (36/45 °C
Sensible a la temperatura rmalmente permite el crecimiento a T mo ) pero aun capaz de crecer a T mas bajas (
deradas. 25/35°C), de modo que se hace sensible a
la T.
Resistencia a virus Perdida del receptor del virus. Crecimiento en presencia de grandes
cantidades de virus.
=> REVERSIONES
Un revertante se define operativamente como una cepa en la que se ha restaurado el fenotipo silvestre. Los revertantes pueden ser
de dos tipos. En los revertantes de un mismo sitio, la mutación que restaura la actividad ocurre en el mismo sitio en el que ocurrió
la mutación original. (Si la mutación hacia atrás no solo es en el mismo sitio sino que, además, conduce a la secuencia silvestre, se
denomina verdadero revertante). En los revertantes de segundo sitio, la mutación ocurre en un sitio diferente en el DNA.
Las mutaciones en un segundo sitio puede restaurar un fenotipo silvestre debido a varios tipos de mutaciones supresoras que resta
uran el fenotipo original. Las mutaciones supresoras son nuevas mutaciones que compensan el efecto de la mutación original. Se c
onocen varios tipos de mutaciones supresoras:
1- una mutación en otra parte del mismo gen puede restaurar la funcion génica.
2- una mutación en otro gen puede restaurar la funcion del gen mutado original y la del fenotipo silvestre.
3- una mutación en otro gen puede originar la producción de otra enzima capaz de reemplazar a la mutada, usando una vía metabó
lica diferente a la usada por la enzima mutante. En este caso no existe producción de la enzima original, pero en los otros dos si.
● PROTOCOLO
TEST DE AMES
Se ha descubierto que muchos mutágenos conocidos son carcinógenos, sustancias que causan cáncer en los animales, incluidos los
seres humanos. En los últimos años diversas sustancias químicas presentes en el ambiente, en el lugar de trabajo y en la dieta han
sido implicadas como causas de cáncer en los seres humanos. Por lo general se utilizan animales para las pruebas destinadas a dete
rminar carcinógenos potenciales y los procedimientos de comprobación son prolongados y costosos. En la actualidad se dispone d
e procedimientos más rápidos y menos costosos para la selección preliminar de carcinógenos potenciales. Uno de ellos, denomina
do prueba de Ames, utiliza bacterias como indicadores de carcinógenos.
La prueba de Ames se basa en la observación de que la exposición de las bacterias mutantes a las sustancias mutagénicas puede ca
usar nuevas mutaciones que reviertan el efecto (el cambio del fenotipo) de la mutación original. Básicamente, permite determinar
si un compuesto es mutagénico al poder revertir la mutación. Estas mutaciones se denominan reversiones, y a las células capaces d
e revertir se llaman revertantes. Específicamente, la prueba mide la inversión de los auxótrofos para histidina de Salmonella (las c
élulas his-, es decir, las células mutantes que han perdido la capacidad de sintetizar histidina) a células que sintetizan histidina (his
+) después del tratamiento con un mutágeno.
Las bacterias se incuban en presencia y en ausencia de la sustancia que se quiere probar. Además, muchas sustancias químicas deb
en ser activadas (transformadas por medios químicos en las formas químicamente reactivas), por enzimas de origen animal para q
ue aparezca la actividad mutagénica o carcinogénica, la sustancia que se quiere probar y las baterías mutantes se incuban juntas co
n extracto de hígado de rata, una fuente rica en las enzimas necesarias para la activación. Si la sustancia que se va a evaluar es mut
agénica, producirá la inversión de las bacterias his- a bacterias his+ con una tasa mayor que la tasa de inversión espontánea. La ca
ntidad de bacterias que sufren inversiones proporciona una indicación del grado de mutagenicidad de esa sustancia y por consiguie
nte de su posible efecto carcinogénico.
Existen formas alternativas de este ensayo:
Pueden utilizarse mezclas como vino, sangre, humo condensado y extractos de alimentos para comprobar si contienen mutágenos
.
Cerca del 90% de las sustancias que resultan mutagénicas por la prueba de Ames también mostraron ser carcinogénicas en animal
es. Además, cuanto más mutagénica sea una sustancia mayor será su poder carcinogénico.
El ensayo de Ames en bacterias ha introducido un elemento mas (además del uso del hígado de rata) que lo hacen mucho mas efic
iente. Este es el uso de cepas bacteriana que usan casi exclusivamente vías de reparación propensos a error, para evitar de esta ma
nera que mutaciones espontaneas den lugar, asegurándonos que la restauración sea debido al mutágeno y no la replicación errónea
.
● PROTOCOLO
Test de Ames cualitativo:
El test de Ames se usa para evaluar la mutagenicidad de un compuesto. En el cultivo se inoculo Salmonella entérica que requiere
de histidina. El medio no contiene histidina, de modo que solo podrán crecer las células que reviertan al wt. En la placa aparecerán
revertantes espontáneos, representados en la región mas lejana al disco de papel de filtro de la placa. Se dice que son espontáneos
porque la concentración de mutágeno es mínima o no llega a esa distancia, de manera que estas reversiones no surgen por acción d
el mutágeno . Existen una región intermedia mas cercana al disco de papel de filtro que ha aumentado la frecuencia de mutación, l
o cual se refleja en el aumento de números de colonia en torno al disco. En la región mas cercana al disco, no se ven colonias, y po
r lo tanto, no se ven revertantes, debido a que la concentración de mutágeno es letal.
REPARACION DIRECTA
Varios tipos de lesiones se reparan sin eliminar la base o el nucleótido.
Dímeros de pirimidína, una reacción revertida por las DNA fotoliasas.
Los dímeros de pirimidína son producto de una reacción inducida por la luz UV. Las fotoliasas utilizan energía proveniente de la l
uz absorbida para invertir la lesión.
Las fotoliasas generalmente contienen dos cofactores que actúan de agentes de absorción de la luz o cromóforos. Uno de los crom
óforos es siempre el FADH-. En procariotas y en levadura, el otro cromóforo es un folato. El mecanismo de reacción conlleva la g
eneración de radicales libre. Las DNA fotoliasas no se encuentran en mamíferos placentarios (incluyendo mamíferos).
Lesiones por agentes alquilantes.
El nucleótido modificado O6-metilguanina se forma en presencia de agentes alquilantes, y es una lesión común altamente mutagén
ica, pues tiende a aparearse con timina en lugar de citosina durante la replicación y, por lo tanto, genera mutaciones de G - C a A -
T. La reparación directa de la O6-metilguanina la lleva a cabo la O6-metilguanina-DNA metiltransferasas, que cataliza la transfere
ncia del grupo metilo de la O6-metilguanina a uno de sus propios residuos de Cys. Esta metiltransferasas no es propiamente una e
nzima, porque una única transferencia de metilo la metila permanentemente, inactivándola.
Un mecanismo completamente diferente, pero también directo, se utiliza para reparar la 1-metiladenina y la 3-metilcitosina. Los g
rupos amino de los residuos de A y C se metilan ocasionalmente en el DNA de hebra sencilla y la metilación afecta directamente
el correcto apareamiento de las bases. En procariotas, la proteína AlkB, participa en la desmetilación oxidativa de estos nucleótido
s alquilados.
Proteinas MutH, MutL y MutS - La proteína MutL forma un complejo con la proteína MutS y el complejo se une a todos los
pares de bases mal apareados. Esto da aviso que hay mal apareamientos a la proteína MutH,
esta se une al complejo MutL - MutH, empieza a desplazarse hasta encontrar la secuencia G
ATC mas cercana a la región del apareamiento incorrecto.
- MutH tiene una actividad endonucleasa con especificidad de secuencia, que se mantiene ina
ctiva hasta que el complejo encuentra una secuencia GATC semimetilada.
- MutH cataliza el corte de la hebra no metilada por el lado 5' de la G en GATC, que de este
modo marca la hebra que ha de reparase.
DNA helicasa II, SSB, Exonuclea - Cuando el desapareamiento se encuentra en el lado 5' del sitio de corte, la hebra sin metilar
sa I, Exonucleasa X, es desenrrollada y degradada en dirección 3' → 5', a partir del sitio de corte hasta mas allá de
l desapareamiento, siendo despues reemplazada por nuevo DNA. Este proceso requiere la ac
ción de DNA helicasa II, SSB, exonucleasa I o bien exonucleasa X (ambas degradan las hebr
as del DNA en dirección 3' → 5').
Exonucleasa VII & RecJ La ruta para la reparación de apareamientos incorrectos en el lado 3' del sitio de corte es simi
lar, excepto que la exonucleasa es reemplazada por la exonucleasa VII (que degrada ssDNA
en dirección 3' → 5', o en 5' → 3') o por la nucleasa RecJ (una exonucleasa que degrada DN
A monohebra en dirección 5' → 3').
DNApol III & DNA ligasa Finalmente, se elonga y se unen las mellas, reconstituyendo nuevamente el DNA.
DNA glucosilasas Reconocen lesiones del DNA muy frecuentes y eliminan la base afectada rompiendo el enlac
e N-glucosilo. El corte crea sitios apurínicos o apirimidínicos en el DNA, normalmente cono
cidos como sitios AP o abásicos.
Endonucleasas AP Una vez formado un sitio AP por acción de la DNA glucosilasa, la endonucleasa AP, cortan
do la hebra de DNA que contiene el sitio AP. Luego realiza otro corte en dirección 5' o 3' del
sitio AP. Luego se elimina el segmento de DNA que contiene el sitio AP.
ABC excinucleasa La enzima excinucleasa hidroliza dos enlaces fosfodiéster, uno a cada lado de la distorsión p
rovocada por la lesión. Los oligonucleótidos limitados por las dos incisiones es liberado del
dúplex.
Además de estas tres clases bien caracterizadas, hay una amplia gama de reordenamientos genéticos poco frecuentes para los que
aun no se ha propuesto ni mecanismos ni finalidad.
Las funciones de los sistemas de recombinación genética, entre los mas relevantes, son:
- participar en sistemas de reparación de DNA especializados.
- actividades especializadas en la replicación del DNA.
- la regulación de la expresión de ciertos genes.
- contribuyen a la segregación correcta de los cromosomas durante la división celular en las eucariotas.
- contribuyen al mantenimiento de la diversidad genética
- contribuyen a los reordenamientos genéticos programados durante el desarrollo embrionario.
En general, la recombinación genética esta íntimamente integrada con otros procesos del metabolismo.
Este intercambio, denominado también entrecruzamiento, une las dos pares de cromátides hermanas en puntos denominados quias
mas
El entrecruzamiento une efectivamente las cuatro cromátides homologas, siendo esta unión esencial para la correcta segregación d
e los cromosomas en las posteriores divisiones meióticas. El entrecruzamiento no es un proceso enteramente al azar, pues se han d
etectado lugares con alta probabilidad de entrecruzamiento en muchos cromosomas eucarióticos. Sin embargo, la suposición de qu
e el entrecruzamiento ocurre con igual probabilidad en casi cualquier punto a lo largo de la longitud de dos cromosomas homólog
os sigue siendo una aprox razonable en muchos casos. En esta suposición se basa el cartografiado de los genes. La frecuencia de r
ecombinación homologa en cualquier región que separe dos puntos de un cromosoma es aproximadamente proporcional a la dista
ncia entre los puntos, lo cual permite determinar las posiciones relativas y las distancias entre diferentes genes.
MECANISMO:
La recombinación genética homologa es un mecanismo de reparación a la rotura de doble hebra (DSB). A diferencias de los meca
nismos de reparación de única hebra, este mecanismo presenta mayor importancia porque una sola rotura de la doble hebra puede
causar anormalidades cromosómicas serias y, al final, son letales para las células. Las DSB pueden repararse por medio de diferen
tes vías alternativas, dependiendo del tipo y del estadio celular.
1- Ocurre una ruptura de la doble hebra en uno de los dos homólogos. Los extremos con 3' se degradan menos que aquello con 5' f
inales, produciendo extensiones 3' simple hebra.
2- Uno de los extremos 3' del final se exponen con su homologo intacto. La otra hebra se desplaza.
3- La invasión del extremo 3' es ampliado por la DNApol y se da la migración de la otra hebra, generando una molécula de DNA c
on dos transiciones llamadas intermedios de Holliday.
4- La invasión de la otra hebra del extremo 3' también es ampliado por la DNApol.
5- El corte de los intermediarios de Holliday por nucleasas especializadas genera cualquiera de los dos productos de la nueva com
binación:
Se han aislado nucleasas de bacterias y levaduras que cortan específicamente los intermedios de Holliday, a menudo denominada r
esolvasas. La proteína RuvC es una de las, mínimo, dos nucleasas de este tipo procariotas.
La enzima RecBCD se une al DNA lineal en un extremo roto y se mueve hacia adentro a lo largo de la doble hebra, desenrronllad
o y degradando el DNA, en una reacción acoplada a la hidrolisis del ATP. Las subunidades RecB y RecD son motores helicasa, co
n RecB moviéndose en dirección 3' → 5' a lo largo de la otra hebra. La actividad RecC degrada a ambas hebras por igual, hasta qu
e, RecB interacciona con una secuencia denominada chi.
A partir de este punto, la degradación de la hebra con un extremo 3' disminuye considerablemente (formando un bucle simple hebr
a debido al desplazamiento del complejo y a la interacción de la secuencia chi con el sitio de barrido de la RecB).
Sin embargo, la degradación de la hebra con el extremo 5' continua. Este proceso genera un DNA de hebra sencilla con un extrem
o 3', estructura que se utiliza en las etapas posteriores de la recombinación.
La proteína RecA destaca entre las proteinas que intervienen en el metabolismo del DNA, pues su forma activa es un filamento he
licoidal ordenado formado por varios millares de monómeros unidos cooperativamente al DNA.
Este filamento normalmente se forma sobre DNA monohebra, tal como el generado por la enzima RecBCD. El filamento también
se forma sobre un dúplex de DNA con un hueco de hebra sencilla. En este caso, los primeros monómeros de RecA se fijan al DN
A monohebra en el hueco y a continuación el filamento se extiende rápidamente al dúplex vecino.
Varias proteinas regulan el ensamblaje y el desensamblaje de los filamentos de RecA.
Un modelo útil para ilustrar las actividades de recombinación del filamento de RecA es la reacción in vitro de intercambio de hebr
a.
La unión de ATP (pero no su hidrolisis) es necesaria para lo formación de un filamento de RecA activo que pueda alinear dos mol
éculas de DNA.
Una vez formado el intermedio de Holliday, hacen falta una multitud de enzimas, para completar la recombinación . La proteína R
uvC de procariotas corta los intermedios de Holliday para generar productos cromosómicos completos no ramificados
C- TODOS LOS MECANISMOS DEL METABOLISMO DEL DNA PARTICIPAN EN LA REPARACION DE LAS HORQUI
LLAS DE REPLICACION BLOQUEDAS
Como todas la células, las bacterias deben afrontar elevados niveles de daño en el DNA, incluso en condiciones normales de creci
miento. La mayoría de las lesiones del DNA son reparadas rápidamente por reparación. No obstante, casi todas las horquillas de re
plicación bacterianas topan con una lesión o rotura no reparada en su trayecto desde el origen al termino de su recorrido.
La DNApol III no puede superar muchos tipos de lesiones; en estos casos, la DNApol III no puede avanzar y la lesión suele queda
r en un hueco de hebra sencilla. El encuentro con una rotura de la hebra de DNA crea una rotura de doble hebra. Ambas situacion
es requieren la reparación por recombinación del DNA. En condiciones de crecimiento normal, las horquillas de replicación bloqu
eadas se reactivan mediante un elaborado sistema de reparación que incluye la reparación por recombinación del DNA, la reanuda
ción de la replicación y la reparación de cualquier lesión que haya quedado atrás. En este proceso participan todos los componente
s del metabolismo del DNA.
Una vez la horquilla de replicación se ha detenido, puede ser reactivada a través de al menos dos vías principales; ambas requieren
la proteína RecA. La reparación de lesiones que se encuentran en huecos requiere además de otras proteinas. La reparación de rot
uras de doble hebra requiere la enzima RecBCD. Otras etapas adicionales de recombinación son seguidas por el proceso conocido
por reinicio de la replicación independiente de origen, en el que la horquilla de replicación se reorganiza con ayuda de un complej
o de siete proteinas. Este complejo se denomina actualmente primisoma de reinicio de la replicación. La reactivación de las horqui
llas de replicación también requiere DNApol II, con un papel aun no definido, pues acto seguido cede su lugar a la DNApol III par
a la replicación extensiva generalmente necesaria para completar el cromosoma. En algunos casos el reinicio de la replicación pue
de ocurrir mas allá de una lesión bloqueante del DNA antes de que la lesión sea reparada.
La reparación de horquillas de replicación bloqueadas supone transiciones coordinadas entre replicación y recombinación. Las eta
pas de recombinación sirven para rellenar el hueco del DNA o para unir la rama del DNA rota con el fin de recrear la estructura ra
mificada del DNA en la horquilla de replicación. Las lesiones dejada atrás, en lo que ya es DNA dúplex, son reparadas por rutas c
omo la reparación por escisión de base o por escisión de nucleótido. Por lo tanto, una amplia variedad de enzimas implicadas en c
ada uno de los aspectos del metabolismo del DNA desempeñan en ultimo termino un papel en la reparación de las horquillas de re
plicación bloqueadas. Este tipo de proceso de reparaciones una de las funciones principales del sistema de recombinación homolo
ga en cualquier célula y los defectos en la reparación del DNA por recombinación tienen un importante papel en patologías human
as.
Incorporación de DNA
Una diferencia importante en la incorporación de DNA entre Gram negativas y Gram positivas es la producción del factor de com
petencia.
- En Gram positivas, es preciso que las bacterias se encuentren en una determinada fase de crecimiento. Cuando la población alcan
za una determinada densidad poblacional, es ahí cuando la población se vuelve competente. En ese momento, comienzan a segreg
ar una pequeña proteína denominada factor de competencia que estimula la producción de 8 a 9 nuevas proteinas necesarias para e
l proceso de transformación.
- En Gram negativas, no produce un factor de competencia para estimular el desarrollo de competencia, y sólo capta el DNA proc
edente de especies estrechamente relacionadas. El DNA bicentenario forma complejos con proteínas y es captado por vesículas de
membrana. La especificidad de la transformación se debe a una secuencia especial de pares de bases que se repite mas de mil vec
es en el DNA de la Gram negativa. El DNA debe contener esta secuencia para que una célula competente se una a él.
Esto implica que, mientras que las Gram negativas solo son competentes con determinadas moléculas de DNA. Las Gram negativ
as son menos exigentes en cuanto a la fuente de su DNA.
Las bacterias también difieren en la forma en que incorporan el DNA aunque en todos los casos solo entra en el citoplasma ssDN
A.
- En Gram positivas, las células toman ssDNA. En la bacteria se incorpora dsDNA a la vez que una de las hebras es degradada.
- En Gram negativos, la célula solo toma dsDNA, a pesar de que solo se incorporan en el genoma mediante recombinación segme
ntos monocatenarios. Parece que el dsDNA es degradado a hebra sencilla en el espacio periplásmico y solo penetra en el citoplas
ma una hebra sencilla.
Competencia inducida
La transformación natural de alta eficacia ocurre solo en un grupo muy reducido de procariotas. Muchas procariotas se transforma
n muy pobremente o nada en absoluto bajo condiciones naturales.
=> Shock térmico/solución de calcio
La determinación de como inducir competencia en tales bacteria fue cuando se pudo inducir artificialmente a Escherichia coli cua
ndo se la trataba a altas concentraciones de iones de calcio, y luego se la somete a un shock térmico, cambiando drásticamente de
T muy bajas a T muy elevadas. procariotas de esta manera toma dsDNA, y así la transformación por pDNA (DNA plasmídico) es
relativamente eficiente.
Este tratamiento funciona para un gran numero de bacterias Gram negativas.
=> Electroporación
Otra forma de hacer a las bacterias competente consiste en exponer a laces células a campos eléctricos pulsados para abrir pequeñ
os poros en sus membranas. Cuando existen moléculas de DNA fuera de las células durante el pulso eléctrico, pueden entrar en las
células a través de estos poros. La electroporación requiere un suministro de potencia sofisticado, ya que los pulsos deben ser con
trolados cuidadosamente y duran solo milisegundos. Esta técnica se ha usado para introducir DNA en un gran numero de especies
diferentes, tanto arqueas como bacterias, y también en muchas células eucariotas. Además, la electroporación permite transferir un
plásmido de una célula a otra si ambos están presentes durante la electroporación. Por lo tanto, la electroporación permite tanto la
salida como la entrada en la célula de pequeñas moléculas de DNA. Este tipo de "transformación" elimina las etapas requeridas pa
ra aislar el plásmido de la primera cepa antes de introducirlo en la segunda.
=> TRANSDUCCION
En la transducción, el DNA se transfiere de una célula a otra mediante un virus. La transferencia genética de genes del huésped po
r virus puede ocurrir de dos maneras. En ambos casos, la partícula viral es defectiva, ya que algunos genes virales han sido reempl
azados por genes bacterianos.
• En la primera, llamada transducción generalizada, el DNA del huésped, que puede proceder de cualquier parte del genoma, pasa
a formar parte del DNA de la partícula madura del virus en lugar del genoma del virus. En la transducción generalizada, si los gen
es del donor no sufren recombinación homologa con el cromosoma de la bacteria receptora se perderán. No pueden replicarse inde
pendientemente y no son parte de un genoma viral.
• En la segunda, llamada transducción especializada, ocurre solo en algunos virus atemperados (virus provenientes de cepas lisogé
nicas); el DNA de una región especifico del cromosoma bacteriano se integra directamente en el genoma del virus, generalmente r
eemplazado algunos de los genes del virus. En la transducción especializada también puede ocurrir recombinación homologa. Sin
embargo, puesto que el DNA de la bacteria donora es ahora parte del genoma de un fago temperado, hay dos posibilidades:
1- el DNA puede integrarse en el cromosoma del huésped durante la lisogenización
2- el DNA puede replicarse en el receptor como parte de una infección lítica.
No todos los fagos pueden transducir, y no todas las bacterias son transducibles; pero el fenómeno esta lo suficientemente extendi
do para suponer que desempeña un importante papel en la transferencia genética en la naturaleza.
Transducción generalizada
En la transducción generalizada se puede transferir prácticamente cualquier marcador genético desde el donor al receptor. Este pro
ceso requiere fagos líticos.
Cuando la población de bacterias sensibles se infecta con un fago, pueden iniciarse las etapas del ciclo lítico del fago. Durante una
infección lítica, las enzimas responsables del empaquetamiento del DNA vírico en el fago, a veces introducen DNA del hospedad
or de forma accidental, debido a que el genoma bacteriano se rompe en fragmentos pequeños. La partícula resultante es una part
ícula transductora, la misma solo presenta DNA bacteriano. Cuando la célula se lisa, estas partículas se liberan junto con los virus
normales, de manera que el lisado contiene una mezcla de viriones y partículas transductantes. Puesto que las partículas transduct
antes no pueden iniciar una infección viral normal (no contienen DNA vírico, o le falta en parte), se les llama defectivas. Cuando
este lisado se usa para infectar una población de células receptivas, la mayoría de las células resultan infectadas por un virus norm
al. Sin embargo, una pequeña proporción de la población recibe partículas transductantes que inyectan el DNA que recibieron de
la anterior bacteria hospedadora. Aunque este DNA no puede replicarse (no puede formar virus maduros, ya sea por falta de pro
teinas estructurales o por falta de enzimas involucradas en la replicación codificadas en su genoma,, puede sufrir recombinación
genética con el DNA del nuevo hospedador.
Puesto que solo una pequeña proporción de las partículas del lisado son del tipo transductor defectivo, y cada uno contiene solo un
pequeño fragmento de DNA donor, la probabilidad de que una partícula transductora contenga un determinado gen es muy baja, y
normalmente alrededor de una célula de cada 106-108 resulta transducida con un marcador genético dado.
Los fagos capaces de formar partículas transductantes pueden ser atemperados o virulentos, y los principales requisitos son que po
sean un mecanismo de empaquetamiento del DNA que permita el reconocimiento accidental del DNA del hospedador y que el em
paquetamiento ocurra antes de que el genoma del hospedador sea completamente degradado. La detección de la transducción es m
as segura cuando la multiplicidad de infección del fago con respecto al hospedador es baja, de manera que una célula huésped es i
nfectada por solo una partícula fágica; a alta multiplicidad de infección, los viriones del lisado pueden matar células.
Transducción especializada
Como la transducción generalizada, la transducción especializada requiere la transferencia de genes de una bacteria a otra por med
io de fagos, pero aquí solo se transfieren los genes cercanos a determinados sitios del cromosoma bacteriano. Este proceso requier
e fagos lisogénicos. Los profagos pueden escindirse del cromosoma bacteriano de manera imperfecta y transportar con ellos una p
orción pequeña del DNA bacteriano adyacente al sitio de la integración del profago. El fago que transporta este DNA lo inyectara
luego en otra célula bacteriana en el siguiente ciclo de infección. Este proceso es comparable a lo que sucede en las células F', en l
as que el plásmido F transporta genes de una bacteria a otra.
EJEMPLO: transducción de los genes de la gal por el fago atemperado lambda de procariotas:
Cuando la célula lisogénica es inducida, el DNA del fago se escinde como una unidad. Sin embargo, bajo ciertas condiciones raras
, el genoma del fago puede escindirse de forma incorrecta. Alguno de los genes bacterianos adyacentes se escinde junto con el DN
A del fago. Al mismo tiempo, algunos genes fágicos se quedan allí. Un tipo de partícula fágica alterada, dgal (defectivo de galacto
sa), es defectiva a causa de los genes fágicos perdidos y no forma virus maduros. Sin embargo, un fago auxiliar, puede suministrar
las funciones que faltan en las partículas defectivas. Este fago "auxiliar" es idéntico al fago original. Así, el lisado del cultivo obte
nido contiene algunas partículas de dgal mezcladas con un gran numero de viriones del fago normales.
Para que el fago sea viable, existe un limite máximo en la cantidad de DNA del fago que puede ser reemplazado por DNA del hos
pedador, ya que se debe conservar suficiente DNA del fago para suministrar información para la producción de las proteinas de la
cubierta del fago, así como para otras proteinas necesarias para la lisis y la lisogenización.
Sin embargo, si se usa un fago auxiliar junto al defectivo en una infección mixta, entonces se necesita incluso menos información
en el fago defectivo para la transducción. En estas condiciones, la producción de una partícula transductante solo necesita:
- La región att: sitio de fijación al cromosoma del hospedador.
- El sitio cos: extremos cohesivos para el empaquetamiento
- El origen de replicación.
Una diferencia importante entre transducción generalizada y especializada radica en la forma en que se puede formar el lisado tran
sductor. En la transducción especializada debe ocurrir por inducción de un lisógeno, mientras que en la transducción generalizada
puede ocurrir de este modo o por infección de una bacteria no lisogénica, con posterior replicación del fago y lisis de la célula.
Cabe destacar que la transducción especializada no solo se utiliza para la galactosa, se pueden utilizar muchas regiones especificas
del genoma de la bacteria, o incluso que contengan genes de cualquier otro organismo.
=> CONJUGACION
Es el principal mecanismo de transmisión célula a célula y es una funcion codificada por algunos plásmidos. La conjugación es un
proceso replicativo y ambas células terminan con copias del plásmido.
Los plásmidos que gobiernan su propia transferencia de una célula a otra por contacto se llaman conjugativos, pero no todos los pl
ásmidos son conjugativos.
Algunos plásmidos conjugativos pueden transferir información genética entre organismos muy distantes filogenéticamente. Así, d
entro de las bacterias, se ha demostrado transferencia entre Gram negativas y Gram positivas, entre bacterias y células vegetales, y
entre bacterias y hongos. Incluso si el plásmido no puede replicarse en el nuevo hospedador, la transferencia del mismo, puede te
ner importantes consecuencias evolutivas, así como estar relacionada con procesos. patogénicos, si se puede recombinar con el g
enoma del nuevo hospedador.
Los mecanismos de transferencia por conjugación pueden ser diferentes dependiendo del plásmido concreto, pero la mayoría de lo
s plásmidos Gram negativas parecen emplear un mecanismo similar al usado por el plásmido F.
Los plásmidos conjugativos deben la transmisibilidad por conjugación a un conjunto de genes dentro del plásmido que constituye
la región tra.
La region tra contiene genes que codifican proteinas que funcionan en la transferencia del DNA y en su replicación, y otras que fu
ncionan en la formación de parejas conjugativas. Muchos genes de la region tra están relacionados con la síntesis de una estructur
a superficial, el pelo sexual.
El plásmido F y otros relacionados codifican pelos F.
La presencia de una region tra en un plásmido puede tener otra importante consecuencia si el plásmido se integra en el cromosoma
. En este caso, el plásmido puede movilizar la transferencia del gDNA de una célula a otra. Las cepas de bacterias que transfieren
grandes cantidades de gDNA durante la conjugación se llaman, Hfr (siglas en ingles de alta frecuencia de recombinación).
Todos los plásmidos, inclusive los conjugativos, deben llevar genes que aseguren si propia replicación.
EJEMPLO:
Se realiza una conjugación entre una cepa:
• Hfr: estreptomicina sensible (StrS); Treo+ y Leu+; Gal+
• F-: estreptomicina resistente (StrR); Treo- y Leu-; Gal-
Se mezclan 0,2 ml de Hfr con 1,8 ml de F-, ambos provenientes de cultivos en caldos en fase logarítmica que contienen 2×109 UF
C/ml.
La mezcla de conjugación se incuba a 32°C durante 100 minutos y se seleccionan los transconjugantes Treo+- Gal+ en una caja de
Petri conteniendo el medio selectivo A.
En dicha caja se sembraron 0,1 ml de la dilución 1/10 de la mezcla de conjugación. Después de incubar a 37°C una noche se cont
aron 170 colonias.
También se pudo determinar el mapa génetico para estos genes, obteniendo:
A- Como se determina la frecuencia que aparecen los transconjugantes Treo +- Gal+?
Frecuencia = [Transconjugantes]/[Aceptoras finales]
Las transconjugantes se calculan viendo el número de colonias que crecen en el medio de cultivo A, luego eso se lo multiplica por
el factor de dilución. Finalmente, se determina la concentración, en la mezcla de reacción:
MECANISMOS DE CONJUGACION
F+ × F -
HFr × F-
F' × F -
COMPLEMENTACION
Los métodos de transferencia de genes en bacterias implican la transferencia se solo una porción del cromosoma donor, por lo tan
to, a memos que ocurra recombinación con el cromosoma receptor, el DNA del donor que entra en la célula se perderá ya que no p
uede replicarse independientemente. Tan solo en dos casos puede mantenerse un estado de diploidia parcial:
- en la transducción especializada, en la que los genes del donor se mantienen como parte del genoma viral.
- en el uso de plásmidos F', en donde los genes del donor se han incorporado al genoma del plásmido F.
Puesto que es posible crear un fago transductor especializado o plásmidos recombinantes mediante técnicas de DNA recombinante
, resulta ahora posible pones esencialmente cualquier porción del cromosoma bacteriano en un fago o plásmido.
Esto es útil en el test de complementación.
Cuando se cruzan genéticamente dos cepas mutantes (se conjugan), la recombinación homologa puede generar recombinantes del
tipo silvestre a menos que ambas mutaciones incluyan cambios en los mismo pares de bases. Así, si dos cepas Trp- se cruzan y se
obtienen recombinantes Trp+, resulta claro que las mutaciones no afectan a los mismos pares de bases. Sin embargo, este experim
ento no puede detectar si las mutaciones están en el mismo gen. Esto puede determinarse mediante un test, llamado test de comple
mentación.
La complementación se uso inicialmente en organismos eucarióticos diploides. En los organismos diploides la célula tiene pares d
e cromosomas, cada miembro procedente de un padre. Cuando dos mutaciones están presentes en miembros separados de un par (
es decir, una mutación de cada padre), se dice que están en configuración trans. Por otro lado, si las dos mutaciones están en el mi
smo cromosoma se dice que están en configuración cis.
En procariotas no existen verdaderos diploides, pero se puede conseguir un estado diploide para una region del cromosoma por tra
nsferencia de un fragmento cromosómico de un donor. Sin embargo, el principio de la prueba y la nomenclatura (cis y trans) es la
misma.
Si uno de los genes del Trp se inactiva en una célula por una mutación, originando un fenotipo Trp-, la introducción de una copia
del gen silvestre de otra cepa en dicha célula debería restaurar el fenotipo silvestres de la misma; es decir, el diploide parcial result
ante debe ser Trp+, valido en el caso de que la mutación sea dominante. Entonces, se puede decir que el gen silvestre complement
a la mutación.
Incluso aunque en procariotas solo transfiere un fragmento cromosómico, este fragmento es por lo general suficientemente grande
como para contener varios genes. Los genes para la biosíntesis del Trp forman un operón, y por lo tanto, se puede transferir el ope
rón entero desde la célula donora. Incluso si el operón del donor también tiene una mutación, complementara al gen mutado en el r
eceptor si las dos mutaciones están en genes diferentes. Se dice que las dos mutaciones se complementan. Las mutaciones pueden
complementar porque los genes codifican proteinas que pueden difundir dentro del citoplasma de la célula.
No se puede complementar mutaciones en sitios regulatorios tales como los promotores, ya que estos funcionan a nivel de DNA. S
i cada molécula homologa de DNA proporciona un gen diferente de los requerido, entonces la célula tendrá todas las enzimas requ
eridas para sintetizar Trp.
La complementación no implica recombinación. Para hacer el test, las mutaciones deben estar en trans, si una molécula lleva amb
as mutaciones, la otra será del tipo wt y debería ser capaz por si misma de conferir el fenotipo silvestre, a menos que una de las m
utaciones sea dominante. Por lo tanto, dispones de las mutaciones en cis sirve de control.
CISTRÓN
Este tipo de prueba de recombinación, llamada test cis-trans se usa para definir si dos mutaciones están en la misma unidad genéti
ca (funcional). La unidad genética definida por el test cis-trans se denomina a veces un cistrón (no siempre es equivalente a gen).
Dos mutaciones en el mismo cistrón no pueden complementar, de modo que cuando se produce la complementación implica que l
as dos mutaciones se localizan en diferentes cistrones (esto es, en diferentes genes). El termino cistrón se usa ahora raramente, sol
o para describir si un mRNA tiene la información genética de un gen (mRNA monocistrónico) o de mas de un gen (policistrónico)
.
PROTOCOLO CONJUGACION
Supongamos el siguiente caso hipotético en el que se quiere transferir el gen marcador de resistencia al antibiótico Tetraciclina y e
l gen que codifica para la expresión de la proteína verde fluorescente entre dos cepas de procariotas.
Las cepas utilizadas son las siguientes:
- Donora: procariotas S17-1: portador del plásmido pMP 6 que contiene el gen para la expresión de la proteína verde fluorescente
(GFP+) y es tetraciclina resistente, kanamicina sensible (tetR, kmS)
- Aceptora: procariotas SM10: GFP-, tetS, kmR
La recombinación homóloga con construcciones interruptoras transfectadas puede inactivar genes diana específicos en la levadu
ra.
• Se puede preparar una construcción adecuada para interrumpir un gen diana mediante PCR.
Los dos cebadores diseñados para este propósito contienen cada uno una secuencia de alrededor de 20 nucleótidos (nt) que es ho
móloga a un extremo del gen diana de levadura al igual que las secuencias necesarias para amplificar un segmento de DNA que l
leva un gen marcador de selección como kanMX. el cual confiere resistencia al G-418.
• Cuando las células diploides receptoras de Saccharomyces son transformadas con la construcción interruptora de genes.
La recombinación homóloga entre los extremos de la construcción y las secuencias cromosómicas correspondientes integrarán el
gen kanMX al cromosoma, reemplazando la secuencia del gen diana. Las células diploides recombinantes crecerán en un medio
que contenga G-418. mientras que las células no transformadas no lo harán. Si el gen diana es esencial para la viabilidad. la mit
ad de las esporas haploides que se formen luego de la esporulación de células diploides recombinantes serán no viables.
Células ES heterocigóticas para un gen interrumpido son usadas para producir ratones knockout con respecto a un gen.
Paso I: Las células madre embrionarias (ES) heterocigóticas para una mutación knockout en un gen de interés (X) y homocigótica
para un alelo dominante de un gen marcador (aquí, pelaje de color pardo. A) se trasplantan a la cavidad del blastocele de embrione
s de 4-5 días que son homocigóticos para un alelo recesivo del marcador (aquí pelaje de color negro.
Paso II: Los embriones tempranos se implantan luego en una hembra pseudopreñada. La progenie que contiene células derivadas
de las ES son quimeras, lo que se evidencia por su pelaje mezclado negro y pardo.
Paso III: Luego se hacen cruzamientos retrógrados de los ratones quiméricos con ratones negros; la progenie parda de esta cruza ti
ene células derivadas de ES en su línea germinal.
Pasos 4 - 6: Los análisis de DNA aislado de una pequeña cantidad de tejido de la cola pueden identificar a los ratones pardos heter
ocigóticos para el alelo knockout.
El entrecruzamiento de estos ratones produce algunos individuos homocigóticos para el alelo alterado es decir, ratones knockout.
El aislamiento de células ES murinas con una interrupción dirigida a un gen es el primer paso en la producción de ratones
knockout.
• Cuando se introduce el DNA exógeno en células madre embrionarias (ES), la inserción aleatoria a través de la recombinació
n no homóloga sucede mucho más frecuentemente que la inserción dirigida a genes a través de una recombinación homóloga.
Las células recombinantes en las cuales un alelo del gen X (naranja y blanco) está interrumpido pueden obtenerse mediante el us
o de un vector recombinante que lleva el gen X interrumpido con neo (verde), el cual confiere resistencia al G-418, y, fuera de la
región de homología, el t05v (amarillo). el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple. La timidina quinasa viral. a dif
erencia de la enzima endógena del ratón, puede convertir el análogo de nucleótido ganciclovir a la forma monofosfato; ésta es lu
ego modificada a la forma trifosfato, la cual inhibe la replicación del DNA celular en las células ES. De este modo. el ganciclovir
es citotóxico para las células recombinantes ES que llevan el gen t05v. La inserción no homóloga incluye el gen t0sv. mientras q
ue la inserción homóloga no lo incluye; por ende. sólo las células con inserción no homóloga son sensibles al ganciclovir.
• Las células recombinantes son seleccionadas por tratamiento con G-418, puesto que las células que fallan en tomar el DNA o
integrarlo en su genoma son sensibles a este compuesto citotóxico.
Las células recombinantes sobrevivientes se tratan con ganciclovir. Sólo las células con una interrupción dirigida en el gen X. y q
ue por lo tanto carecen del gen t05v, sobrevivirán.
TIPOS DE TRANSPOSONES
Existen dos clases principales de elementos móviles autónomos:
• Aquellos que codifican proteínas que mueven al DNA directamente a una nueva posición o duplican el DNA para producir un el
emento nuevo que se integra en otro lugar. Estos se encuentran tanto en procariotas como en eucariotas (transposones clase II).
• Los que codifican una transcriptasa reversa con la que sintetizan DNA a partir de un RNA molde. Dicho DNA se integra luego e
n nuevos sitios del genoma (transposones clase I, retrotransposones, retroposones, etc.).
Transposición
La transposición es el movimiento de un elemento transponible de un sitio a otro. Este proceso es mediado por varios mecanismos
diferentes que funcionan tanto en las células procariotas como en las eucariotas. Sin embargo, todos los tipos de transposición tie
nen algunas características comunes:
1) en el DNA en el que se produce la inserción se generan cortes escalonados.
2) el elemento transponible se une a los extremos de hebra simple del DNA elegido.
3) el DNA presente en las brechas de hebra simple se replica.
Mecanismos de transposición
Algunos elementos transponibles se movilizan en forma de DNA (en lugar de transcribirse primero a RNA como transposones) y
se denominan transposones de DNA (conocidos también como elementos transponibles de clase I). Otros elementos transponibles
se movilizan en forma de un RNA intermediario. En este caso el elemento transponible (DNA) se transcribe a RNA y luego se vue
lve a copiar a DNA usando una enzima especial denominada transcriptasa inversa. Los elementos que se transponen a través de un
RNA intermediario se denominan retrotransposones (o transposones de clase II). La mayoría de los elementos transponibles halla
dos en las bacterias son transposones de DNA.
En los eucariotas se detectan tanto transposones de DNA como retrotransposones, aunque estos últimos son más frecuentes.
Los transposones de DNA pueden sufrir una transposición replicativa o no replicativa.
• La transposición replicativa consiste en la introducción de una copia nueva del elemento transponible en un sitio nuevo mientras
que la copia vieja permanece en el sitio original, lo que determina el aumento del número de copias del elemento transponible com
o consecuencia de la transposición.
• La transposición no replicativa consiste en la escisión del elemento transponible del sitio donde se hallaba y su inserción en un si
tio nuevo sin aumentar la cantidad de copias. La transposición no replicativa requiere la replicación de los pocos nucleótidos que c
onstituyen las repeticiones directas.
Los retrotransposones emplean solo la transposición replicativa.
Transposición replicativa
La transposición replicativa, a menudo denominada transposición de copia y pegado, puede involucrar dos moléculas de DNA dif
erentes o dos partes de la misma molécula de DNA.
En la figura se resumen los pasos de la transposición entre dos moléculas de DNA circular. Antes de la transposición hay una sola
copia del elemento transponible sobre una molécula.
• En el primer paso se unen las dos moléculas de DNA y se replica el elemento transponible para producir la estructura de cointegr
ación compuesta por las moléculas A y B fusionadas con dos copias del elemento transponible.
• A continuación veremos cómo se produce la copia, pero primero analizaremos el segundo paso del proceso de transposición repl
icativa. Después de la formación de la estructura de cointegración el entrecruzamiento de regiones dentro de las copias del elemen
to transponible produce dos moléculas, cada una con una sola copia del elemento transponible. Este segundo paso se denomina res
olución de la cointegración.
¿Cómo se desarrollan los pasos de la transposición replicativa (formación y resolución de la cointegración?
La formación requiere que se produzcan cuatro fenómenos. En primer lugar una enzima transposasa (con frecuencia codificada po
r el elemento transponible) produce rupturas de una sola hebra en cada extremo del elemento transponible y a cada lado de la secu
encia donde se desea insertar este elemento. En segundo lugar los extremos libres del elemento transponible se unen a los extremo
s libres de la secuencia en cuestión.
• En tercer lugar se produce la replicación sobre los moldes de hebra simple a partir de los extremos 3’ de las hebras simples y a tr
avés de los elementos transponibles. Esta replicación genera la estructura de cointegración, con sus dos copias del elemento transp
onible y de la secuencia donde se va a realizar la inserción, que en este momento se ubican al lado de cada copia. Las enzimas que
desempeñan las funciones de replicación y de ligadura son enzimas celulares que actúan en la replicación y la reparación del DN
A.
• En cuarto lugar, después de la formación de la estructura de cointegración ésta es sometida al proceso de resolución, que requier
e el entrecruzamiento de sitios localizados dentro del transposón. La resolución origina las dos copias del elemento transponible. E
l paso de resolución depende de las enzimas resolvasas (en algunos casos codificadas por el elemento transponible y en otros por u
n gen celular) que actúan en la recombinación homologa.
Transposición no replicativa
En la transposición no replicativa el elemento transponible se mueve de un sitio a otro sin replicarse en su totalidad, aunque sí se r
eplican secuencias cortas en el DNA en el que se produce la inserción que determinan la producción de repeticiones directas flanq
ueantes. A menudo denominada transposición de corte y pegado, la transposición no replicativa solo requiere el corte y la readhesi
ón del elemento transponible en el DNA en el que se producirá la inserción. La escisión requiere una enzima transposasa producid
a por el elemento transponible. Es probable que las enzimas que en condiciones normales intervienen en la replicación y la reparac
ión desarrollen la unión del elemento transponible y el DNA específico.
Si un elemento transponible se mueve a través de un mecanismo de transposición no replicativa,
¿Cómo aumenta la cantidad de copias de ese elemento en el genoma?
La respuesta proviene de la investigación del destino de la localización original del elemento. Después de la escisión queda un cor
te en el sitio de inserción original. Estos cortes son nocivos para la célula por lo que se reparan de manera eficiente. Un método ha
bitual para reparar estas rupturas es eliminar y luego replicar el segmento de DNA roto a partir del empleo del molde homólogo pr
esente en la cromátida hermana. Antes de la transposición ambas cromátidas tenían una copia del elemento transponible. Después
de la transposición (en la que el elemento transponible se trasladó a otro sitio) y de la reparación de la ruptura (que restablece la co
pia original) la cantidad de copias del elemento transponible habrá aumentado en una unidad. Por ende, el número de copias de los
elementos transponibles no aumenta durante la transposición pero tiende a incrementarse dentro del genoma debido al mecanismo
de reparación.
Transposones compuestos
Cualquier segmento de DNA que posea dos copias de una IS (una a cada lado) puede trasladarse y pasar a denominarse transposó
n compuesto. Cada tipo de transposón compuesto recibe un nombre formado por la abreviatura Tn seguida por un número. Tn10 e
s un transposón compuesto que tiene alrededor de 9 300 pb y porta un gen (de alrededor de 6 500 pb) que codifica la resistencia a l
a tetraciclina entre dos IS IS10.
Las IS tienen repeticiones terminales invertidas; esto significa que el transposón compuesto también finaliza con repeticiones inve
rtidas. Los transposones compuestos también producen repeticiones directas flanqueantes en los sitios en los que se insertan. Las I
S presentes en los extremos de un transposón compuesto pueden tener la misma orientación o estar invertidas una con respecto a l
a otra (como en Tn10). Las IS halladas en los extremos de un transposón compuesto son responsables de la transposición. El DNA
entre las IS no es necesario para el movimiento y puede ser portador de información adicional (como por ejemplo relacionada con
la resistencia a los antibióticos). Es probable que los transposones compuestos se formen cuando una IS se traslada a una localiza
ción cercana a la de otro transposón del mismo tipo. La transposasa producida por una de las IS cataliza la transposición de ambas
IS, lo que permite que ambas se muevan en forma conjunta y transporten el DNA ubicado entre ellas. En algunos transposones co
mpuestos (como por ejemplo en Tn10) una de las IS puede ser defectuosa; esto implica que su movimiento dependerá de la transp
osasa producida por la otra secuencia.
Transposones no compuestos
Las IS solo poseen información para su propio movimiento, mientras que los transposones bacterianos son más complejos. Algun
os elementos transponibles presentes en las bacterias carecen de IS y se denominan transposones no compuestos. Por ejemplo, Tn
3 es un transposón no compuesto que mide alrededor de 5 000 pb, posee repeticiones invertidas terminales de 38 pb y produce rep
eticiones directas flanqueantes que miden 5 pb. Tn3 está compuesto por genes para la transposasa y la resolvasa, junto con un gen
que codifica la enzima P-lactamasa que le aporta resistencia a la ampicilina. Algunos genomas de bacteriófagos se reproducen por
transposición y usan este proceso para insertarse en un cromosoma bacteriano durante su ciclo lisogénico; el bacteriófago mejor es
tudiado entre los que emplean la transposición es Mu.
Aunque Mu no posee repeticiones invertidas terminales, produce repeticiones directas flanqueantes cortas (5 pb) cuando se inserta
en el DNA al azar. Mu se replica por transposición y determina el desarrollo de mutaciones en el sitio de inserción, propiedades q
ue son características de los elementos transponibles.
En cada extremo de un elemento Ty hay repeticiones directas denominadas secuencias delta que miden 334 pb de longitud. Las se
cuencias delta son análogas a las repeticiones terminales largas halladas en los retrovirus. Estas secuencias delta contienen promot
ores necesarios para la transcripción de los genes Ty y los promotores también pueden estimular la transcripción de genes localiza
dos en dirección 3’ con respecto al elemento Ty. Entre las secuencias delta presentes en cada extremo de un elemento Ty hay dos
genes {TyA y TyB, que codifican varias enzimas) relacionados con los genes gag y pol hallados en los retrovirus. Muchos elemen
tos Ty son defectuosos y esta alteración anula su capacidad de transposición.
UNIDADES TRANSCRIPCIONALES
Una unidad de transcripción se extiende desde el promotor hasta el terminador. La característica determinante de la unidad de tran
scripción, es que constituye un fragmento de DNA expresado por medio de la producción de una sola molécula de RNA. Una unid
ad de transcripción puede incluir a mas de un cistrón.
Básicamente, un cistrón implica a los ORF. De esta manera se pueden distinguir dos tipos de unidades transcripcionales:
Los policistrónicos los cuales presentan mas de un ORF, y los monocistrónicos los cuales presentan un único ORF.
• Procariotas:
Los genes que están involucrados en una misma ruta sintética están agrupados, es decir, se transcriben todos juntos. De esta maner
a, las unidades transcripcionales contienen varios ORF, es decir, son unidades policistrónicas.
• Eucariotas:
Los genes que están involucrados en un misma ruta generalmente se encuentran dispersos en distintos cromosomas ubicándose en
distintas unidades transcripcionales, por lo que son generalmente monocistrónicos.
MODELO DEL OPERÓN
Cada uno de los cuadros celestes son ORFs. Los cuatros ORFs se transcriben de una única vez. Sin embargo, al tener sitios de uni
ón a ribosomas y secuencias terminadoras de traducción independientes entre si, de la misma unidad transcripcional se generaran
en este caso cuatro proteinas distintas.
• UNIÓN A MOLDE
La síntesis de RNA se inicia, por lo general, únicamente en sitios específicos del molde de DNA. La RNApol se une a sus sitios d
e iniciación a través de secuencias de bases conocidas como promotores, que son reconocidas por el correspondiente factor sigma.
El promotor esta formado por una secuencia de aprox 40 pb que esta situada en el lado 5’ del sitio de inicio de la transcripción. Po
r convención se representa la secuencia de la hebra antisentido (codificante o no molde) del DNA molde, de forma que tenga la mi
sma dirección que el RNA que se transcribe. Un par de bases de una región promotora recibe una numeración que puede ser positi
va o negativa, según se encuentre respectivamente hacia 3’ o hacia 5’ del sitio de inicio de transcripción. Este sitio de inicio de la t
ranscripción recibe el número +1, y no existe ningún par de bases “0”. El RNA se sintetiza en la dirección 5’ – 3’. En consecuenci
a, el promotor queda en la 5’ (flujo ascendente, corriente arriba o upstream) del nucleótido inicial del RNA.
La holoenzima forma complejos muy fuertes con los promotores. Existen dos regiones en el promotor que une la RNApol.
• La caja de Pribnow es una región de 6 bp centrada alrededor de la posición -10. Su secuencia consenso es TATAAT, donde las
TA iniciales y la T final son altamente conservadas.
• Una secuencia de 8 a 12 bp situada sobre la region de – 35. También contienen una región conservada TCTTGACAT la cual, es
mas evidente en promotores eficientes.
• Los sitios de iniciación de la transcripción, que en muchos promotores están representados por único nucleótido de purina. El nu
cleótido iniciador, el cual casi siempre es A o G, esta en el centro de una secuencia CAT o CGT no muy conservada, situada entre
5 y 8 bases hacia 3’ de la caja de Pribnow.
UP ELEMENT: aumenta la fuerza del promotor (numero de veces que una unidad transcripcional es transcripta). Esto puede gr
acias a que aumenta la afinidad del elemento sigma por el promotor.
La mayoría de las secuencias promotoras varían considerablemente respecto de la secuencia consenso. No obstante, variaciones
en una de las regiones parcialmente conservadas puede incrementar o disminuir enormemente la eficiencia de iniciación del pro
motor afectado. Las velocidades de transcripción de los genes, que cubren un rango de tres órdenes de magnitud, varían directam
ente con la velocidad de formación de complejos de iniciación estables de sus promotores con la holoenzima.
El núcleo de la enzima, que no se une al promotor de manera especifica, se une estrechamente al dsDNA. Contrariamente, la holo
enzima, se une al DNA no promotor comparativamente con menor afinidad. Aparentemente, la subunidad sigma permite que la h
oloenzima se desplace rápidamente a lo largo de una hebra de DNA buscando el promotor correspondiente a la subunidad sigma
de que se trate. Una vez que se ha iniciado la transcripción y la subunidad sigma ha sido desechada, la fuerte unión entre el núcle
o de la enzima y el DNA estabiliza aparentemente el complejo enzima-DNA-RNA.
Hay horquillas de transcripción de manera que debe haber enzimas topoisomerasas que enrollen y desenrollen el DNA.
En la región que esta siendo transcripta, la hélice de DNA es desenrrollada en aproximadamente una vuelta, para posibilitar que la
hebra con sentido del DNA forme un corto segmento de RNA en dirección 5’ – 3’ dando una doble hélice hibrido DNA-RNA.
Este fragmento inicial de DNA-RNA presenta entre 8 – 10 nucleótidos. A partir de allí, a medida que agregan mas nucleótidos se
produce la liberación de la cadena, de manera que siempre haya un fragmento de 8 a 10 nucleótidos apareados.
Por otro lado, luego de incorporar el 10mo – 12vo nucleótido, el factor sigma ya no cumple mas su funcion de reconocimiento y s
e desprende del resto del complejo. La RNApol libre de sigma puede continuar transcribiendo hasta llegar a las secuencias de fin d
e transcripción.
La secuencia promotora libre ahora es diana para que otra RNApol con factor sigma pueda comenzar una nueva ronda de transcrip
ción. Por lo general ocurren sucesivas transcripciones de un mismo gen a la vez.
A medida que la RNApol avanza sobre el DNA molde, el DNA se desenrrolla por delante del extremo 3’ en crecimiento de RNA,
y se vuelve a enrollar por detrás, donde desplaza al RNA recién sintetizado de la hebra con sentido.
• Una forma de realizar este proceso podría ser que la RNApol siguiera la ruta marcada por la hebra con sentido a lo largo de la do
ble hélice de DNA, con lo que el transcrito acabaría envolviendo al DNA una vez por cada vuelta de dúplex.
• Una segunda posibilidad, mas probable, es que el RNA se desplace en línea recta al tiempo que el DNA gira por debajo. En este
caso, el RNA no se enrollaría alrededor del DNA, sino que el DNA situado por delante de la burbuja de transcripción se sobreenr
ollaría a medida que esta va avanzando, y se iría desenrollando por detrás.
La velocidad de transcripción in vivo es de entre 20 a 50 nucleótidos / segundo a 37 °C. Una vez que una molécula de RNApol ha
iniciado la transcripción y se ha desplazado del promotor, otra RNApol puede ocupar su lugar. La síntesis de RNA que son neces
arios en grandes cantidades, por ejemplo los rRNA, se inicia tantas veces como las restricciones estéricas lo permiten, aproximada
mente una vez cada segundo.
La frecuencia de errores en la síntesis de RNA, estimada a partir del análisis de transcritos de moldes sencillos, es de una incorpor
ación de base errónea por cada aprox 104 transcritos.
Esta tasa es tolerable debido a que la transcripción repetida de la mayoría de los genes, porque el código genético contiene número
s “sinónimos”, al ser degenerado.
La RNApol eucariotas presentan una alta procesividad de manera que pueden transcribir de una única vez una unidad transcripc
ional. La RNApol presentan baja fidelidad y no tienen actividad corrección de errores.
PROMOTORES DE LA RNApol II
El Core o núcleo del promotor es la zona mas pequeña que presenta funcionalidad promotora. Esta fragmento es suficiente para qu
e ocurra la transcripción por la RNApol II in vitro.
Los elementos que habitualmente forman parte del Core promoter son:
• TATA box: secuencia consenso localizado a aprox 30 bp upstream del sitio de inicio de la transcripción.
• Initiator element (Inr): localizado usualmente en el sitio de inicio de transcripción. Es una secuencia de 17 bp no conservada.
• Islas CpG: localizado dentro de las 100 bp upstream del inicio de transcripción. Es una zona rica en CG (de entre 20 – 50 nucleót
idos).
• BRE: elemento reconocedor de TFIIB (BRE). Se localiza entre -32 y -38 pb en dirección 5’ con respecto al sitio de iniciación (T
FIIB es la sigla en inglés de un factor de transcripción que se une a este elemento).
• DPE: promotor mínimo en dirección 3’ (downstream Core promoter element o DPE). Se encuentra aproximadamente 4-30 pb co
rriente abajo del sitio de iniciación en muchos promotores que también tienen Inr.
Todas estas secuencias consenso del promotor mínimo son reconocidas por factores de transcripción que se unen a ellas y sirven
como plataforma para el ensamblaje del aparato de transcripción basal (llamado también complejo pre-iniciación).
Los promotores reconocidos por la RNApol II son considerablemente mas largos y diversos que los de los genes procarióticos.
Los genes estructurales que se expresan en todos los tejidos también denominados constitutivos, son transcritos de forma constitut
iva, gracias a que poseen una o mas copias de la secuencia GGGCGG o de su complementaria (la caja GC) situadas hacia 5’ de su
s inicios de transcripción.
Los genes estructurales que se expresan de manera selectiva en uno o pocos tipos de células carecen a menudo de estas secuencias
ricas GC. En lugar de ello, contienen una secuencia rica en AT situada entre 25 y 30 bp hacia 5’ de sus sitios de inicio de transcri
pción. Esta secuencia recibe la denominación de caja de Goldberg-Hogness (TATA box).
Las funciones de estos dos elementos promotores no son estrictamente análogas, dado que la deleción de la TATA box no elimin
a necesariamente la transcripción. En lugar de ello, la deleción o mutación de la caja TATA genera heterogeneidades en el sitio de
iniciación de la transcripción, lo cual indica que la caja TATA participa en la selección de este sitio.
La región génica que se extiende entre -50 y -110 también contienen elementos promotores. Evidentemente, las secuencias promot
oras situadas hacia 5’ de la caja TATA constituyen los sitios iniciales de unión al DNA de la RNApol II y de las otras proteinas im
plicadas en la iniciación de la transcripción.
• Cis-Splicing
El otro tipo principal de modificación que se produce en el pre-mRNA eucariota es la eliminación de los intrones por el corte y em
palme de los exones. Esto ocurre en el núcleo habitualmente después de la transcripción y de la adición de la cola de poli(A), pero
antes de que el RNA se mueva hacia el citoplasma.
El uso de un sitio de corte alternativo puede producir una proteína diferente o no producirla, según si el sitio se localiza antes o d
espués del codón de terminación. Tanto el corte y empalme alternativo como la existencia de múltiples sitios de corte 3’ pueden c
oexistir en el mismo transcrito de pre-mRNA.
La mayor parte de los mRNA se producen a partir de una sola molécula de pre-mRNA a partir de la cual los exones se escinde
n en conjunto. Sin embargo, en algunos organismos, los mRNA pueden ser producidos por el empalme de exones provenientes
de dos o más pre-mRNA; a este proceso se lo conoce como corte y empalme trans.
• Trans-Splicing
Es una forma especial de procesamiento de ARN en eucariotas donde exones de dos pre-RNA diferentes se unen de extremo a ext
remo y luego son ligados.
Trans-splicing genera un solo ARN transcripción de múltiples pre-mRNAs separados. Por lo tanto, el trans-splicing consiste en el
procesamiento de dos RNA diferentes. Una particularidad es que como producto se obtiene intrones con estructura de Y (Y – shap
ed) en lugar de lazo. Es muy raro en eucariotas superiores. El SL RNA es el que se encuentra involucrado en el trans-splicing, cuy
a secuencia presenta un leader que será adquirido por el pre-mRNA al finalizar el trans-splicing.
• Edición mRNA
La información genética reside en la secuencia de nucleótidos del DNA, a excepción del RNA en los virus. Esta información se tr
anscribe a mRNA y el mRNA luego se traduce a una proteína.
La suposición de que toda la información acerca de la secuencia de aminoácidos de una proteína reside en el DNA está violada po
r un proceso llamado edición del RNA. En este proceso, la secuencia codificante de una molécula de mRNA se altera después de l
a transcripción, de modo que la proteína tiene una secuencia de aminoácidos distinta de la codificada por el gen.
La edición del RNA se detectó al comparar secuencias codificantes de mRNA con las secuencias codificantes de DNA y encontrar
discrepancias para algunos genes nucleares de las células de mamíferos y para los genes de las mitocondrias de las células vegetal
es.
En estos casos hubo sustituciones en algunos de los nucleótidos del mRNA.
Una edición más extensa del mRNA ocurre de algunos genes mitocondriales de los tripanosomas. En algunos mRNA de estos org
anismos, más del 60% de la secuencia está determinada por la edición del RNA.
Actualmente, se conocen diferentes tipos de edición del RNA en los mRNA, tRNA y rRNA de un amplio espectro de organismos
que incluyen la inserción y la deleción de nucleótidos, y la conversión de una base en otra.
Con respecto a como se especifica la secuencia del RNA editado, las moléculas conocidas como RNA guías (gRNA) desempeñan
un papel central. Los gRNA contienen secuencias que son parcialmente complementarias con segmentos del RNA preeditado, y la
s dos moléculas aparean las bases de esta secuencia. Después de que el mRNA se ha anclado al gRNA, el mRNA sufre cortes y se
añaden nucleótidos, se delecionan, o bien se alteran, de acuerdo con el molde provisto por la gRNA. Luego se unen los extremos d
el mRNA.
En otros casos, la conversión de bases es llevada a cabo por las enzimas. En los seres humanos, por ejemplo, un gen se transcribe
a un mRNA que codifica un polipéptido transportador de lípidos (apolipoproteina) sintetizado en los hepatocitos. Una forma trunc
ada de la proteína (otra apolipoproteina) se sintetiza en las células intestinales. La proteína truncada se produce a partir de una vers
ión editada del mismo mRNA, que codifica la hepática. Durante el proceso de edición, una enzima desamina una citosina y la con
vierte en uracilo. Esta conversión cambia un codón que especifica el aminoácido glutamina a un codón de terminación, que termin
a en forma prematura la traducción, y deja como resultado la proteína acortada.
• Transporte mRNA
Una vez procesado por completo (con CAP, sin intrones y poliadenilado), el mRNA se transporta desde el núcleo hacia el citosol,
donde se lo traduce para que sé su producto proteico. El movimiento desde el núcleo hacia el citoplasma no es un proceso pasivo.
El mismo se encuentra regulado debido a que el mRNA recién sintetizado no es el único RNA presente en el núcleo.
Desde el momento en que comienza su transcripción, una molécula de RNA se asocia con proteinas de varias clases: al principio, l
as proteinas que participan en la adición del CAP; luego, factores de empalme, y, por ultimo, las proteinas que median la poliadeni
lación. Algunas de estas proteinas se reemplazan en diversos pasos a lo largo del mecanismo de procesamiento, pero otras no, e in
cluso hay proteinas que se unen a otras proteinas adicionales.
Como consecuencia, un mRNA maduro típico porta una colección importante de proteinas asociadas que lo identifican como un
mRNA destinado a la exportación.
Los RNA que no son de exportación, pueden ser que no estén marcados con estas proteinas, o que presenten un conjunto propio d
e proteinas que bloqueen su exportación.
La exportacion se produce por una estructura especial en la envoltura nuclear llamada poro nuclear. Las moleculas pequeñas pued
en pasar por estos poros. Sin embargo, moleculas mas grandes o complejos riboproteicos, son transportados de forma activa. El m
ecanismo basico conskste en que algunas de las proteinas asociadas con el RNA es reconocida por receptores de exportacion en la
envoltura que guian al RNA en su salida a traves del poro. El transporte de proteinas desde el cktoplasma al nucleo funciona de la
misma manera, como por ejemplo, proteinas que asocian al rRNA que formara los ribosomas.
Una vez en el citoplasma, las proteinas se separan del mRNA y luego se las reconoce para su reimportacion hacia el nucleo, donde
se asocian con otro mRNA y asi se repite el ciclo.
• rRNA: en las eucariotas, un transcrito de pre-rRNA de 45S es sintetizado por la RNApol I y modificado en el nucléolo para dar l
os rRNA 18S, 28S y 5,8S, característicos de los ribosomas eucarióticos. La maduración consiste en reacciones de corte por endo y
exorribonucleasas y en reacciones de modificación de nucleósidos. Algunos pre-rRNA también contienen intrones que se han de
cortar y empalmar.
El proceso comienza en el nucléolo, en grandes complejos que se forman sobre el precursor de rRNA a medida que es sintetizado
por la Pol I. La transcripción del rRNA, la maduración del rRNA y el ensamblaje de los ribosomas en el nucléolo están perfectame
nte coordinados. Cada complejo contiene las ribonucleasas que cortan el precursor de rRNA, las enzimas que modifican determina
das bases, numerosas RNA nucleolares pequeñas o snoRNA, que guían las modificaciones de los nucleósidos, y algunas reaccione
s de corte y proteinas ribosómicas.
La composición de los complejos puede varias a medida que los ribosomas son ensamblados y muchos de los complejos intermedi
os pueden rivalizar en complejidad con los propios ribosomas y snRNP. El rRNA 5S de la mayoría de eucariotas es sintetizado co
mo un transcrito totalmente independiente por una polimerasa diferente (Pol III).
Las modificaciones mas comunes de los nucleósidos en los rRNA eucarióticos son de nuevo la conversión de la uridina en pseudo
uridina y la metilación de los nucleósidos dependiente de adoMet (a menudo en los grupos 2’-OH). Estas reacciones son realizada
s por complejos de proteinas y snoRNA, o snoRNP, formados por un snoRNA y cuatro o cinco proteinas, entre las que se encuentr
a la enzima que lleva a cabo la modificación.
Los snoRNA tienen de 60 a 300 nucleótidos de longitud. Muchos están codificados en los intrones de otros genes y son cotranscrit
os con estos genes. Cada snoRNA contiene una secuencia de 10 a 21 nucleótidos perfectamente complementaria de algún sitio de
rRNA. Los elementos de secuencia conservados del resto del snoRNA se pliegan en estructuras a las que se unen las proteinas de l
as snoRNP.
• tRNA: la mayoría de célula tienen entre 40 y 50 tRNA diferentes y en las células eucarióticas hay múltiples copias de muchos de
los genes de tRNA. Los RNA de transferencia proceden de precursores mas largos por eliminación enzimática de nucleótidos de l
os extremos 5’ y 3’. En los transcritos de tRNA de los eucariotas, ocasionalmente se encuentran intrones que deben ser eliminados
. Cuando dos o mas tRNA diferentes se encuentran en el mismo transcrito primario, son separados por corte enzimático. La endon
ucleasa RNAasa P, presente en todos los organismos, elimina RNA del extremo 5’ de los tRNA. La enzima contiene proteína y R
NA. El componente de RNA es esencial para la actividad y en las bacterias puede realizar su función con precisión aun en ausenci
a del componente proteico.
La RNAasa P es, por lo tanto, otro ejemplo de RNA catalítico. El extremo 3’ de los tRNA es modificado por una o mas nucleasas,
entre las que se encuentra la exonucleasa RNAasa D.
Los precursores del tRNA pueden ser sometidos a una ulterior modificación postranscripcional. El trinucleótido 3’-terminal CCA(
3’), al que se unirá un aminoácido durante la síntesis proteica, no se encuentra en algunos precursores de tRNA bacterianos y en to
dos los eucarióticos y es añadido durante la maduración. La adición corre a cargo de la tRNA nucleotidiltransferasa, enzima peculi
ar que une los tres ribonucleósidos trifosfato precursores en sitios activos separados y cataliza la formación de los enlaces fosfodié
ster para producir la secuencia CCA (3’). La creación de esta secuencia definida de nucleótidos es, por lo tanto, independiente de l
a presencia de un molde de DNA o de RNA; el molde es el sitio de unión de la enzima.
La etapa final de la maduración del tRNA consiste en la modificación de algunas bases por metilación, desaminación o reducción.
En el caso de la pseudouridina, la base (uracilo) es separada y vuelta a unir al azúcar en C5. Algunas de estas bases modificadas se
encuentran en posiciones características en todos los tRNA.
POLINUCLEOTIDO FOSFORILASA
In vitro, dicha enzima cataliza la reacción:
(NMP)n + NDP <-- (NMP)n+1 + Pi
La polinucleótido fosforilasa fue la primera enzima sintetizadora de A.N descubierta. La reacción catalizada por la polinucleótido
fosforilasa difiere fundamentalmente de las otras actividades polimerizantes debido a que es independiente de un molde. La enzim
a utiliza los ribonucleótidos 5’-difosfato y no puede actuar sobre los 5’-trifosfato homólogos o sobre los desoxirribonucleósidos 5’
-difosfato. El polímero de RNA formado por la polinucleótido fosforilasa contiene enlaces 3’,5’-fosfodiéster normales, que puede
n ser hidrolizados por la ribonucleasa. La reacción es fácilmente reversible y puede ser impulsada en la dirección de la degradació
n del polinucleótido incrementando la concentración de fosfato. La función probable de esta enzima en la célula es la degradación
de los mRNA hasta nucleósidos difosfato.
Debido a que la reacción de la polinucleótidos fosforilasa no utiliza molde, no forma un polímero con una secuencia de bases espe
cifica. La reacción transcurre con idéntica facilidad con cualquiera de los cuatro nucleósidos difosfato y la composición de bases d
el polímero resultante refleja solamente las concentraciones relativas de los sustratos 5’- difosfato presentes en el medio.
La polinucleótido fosforilasa se puede utilizar en el laboratorio para la preparación de muchos tipo diferentes de polímeros de RN
A con diferentes secuencias y frecuencias de bases. Los polímeros de RNA sintético con estas características hicieron posible ded
ucir el código genético de los aminoácidos.
------------------------------------------Traducción-----------------------------------------
CODIGO GENÉTICO
La forma en la cual la secuencia de bases de DNA especifica la secuencia de aminoácidos de su proteína esta dado por el código g
enético:
La unidad básica en el código genético (el conjunto de bases que codifica un aminoácido único) fue denominado codón. Los codo
nes debían contener un mínimo de tres nucleótidos. Cada posición de nucleótidos en el mRNA puede ser ocupada por una de cuatr
o bases: A, G, C o U.
- Si un codón consistía en un nucleótido único, entonces, serían posibles solo cuatro codones diferentes (A, G, C y U), lo que no e
s suficiente para codificar los veinte aminoácidos distintos que se encuentran por lo común en las proteínas.
- Si los codones estuvieran hechos por dos nucleótidos cada uno (p. ej., GU, AC, etc.) habría 4 x 4 = 16 codones posibles; aún no r
esulta suficiente para codificar para los veinte aminoácidos.
- Con tres nucleótidos por cada codón, hay 4 x 4 x 4 = 64 codones posibles, lo que es más que suficiente para especificar los veint
e aminoácidos.
Por tanto, un código de tripletes que requiriera tres nucleótidos por codón sería la forma más eficiente de codificar la totalidad d
e los veinte aminoácidos.
Cuando se estableció que el código genético es un conjunto de codones que tienen tres nucleótidos de longitud, el siguiente paso c
onsistió en determinar cuáles grupos de tres nucleótidos especifican cuáles aminoácidos. Lógicamente, la forma más sencilla de de
scifrar el código hubiera sido determinar la secuencia de bases de un trozo de RNA, añadirlo a un sistema de síntesis proteica libre
de células y permitir que dirigiera la síntesis de una proteína. La secuencia de aminoácidos de la proteína recién sintetizada se det
erminaría, y esta secuencia se compararía con la presente en el RNA.
Sin embargo, no existía en ese momento la posibilidad de determinar la secuencia de nucleótidos de un trozo de RNA, de modo qu
e debieron emplearse métodos indirectos para descifrar el código.
TRADUCCIÓN IN VITRO
Existen diferentes métodos para la traducción in vitro: en todos los casos se requiere de un sistema acelular (por lisis celular). La
mezcla de lisis tienen todos los componentes necesarios:
• ribosomas
• tRNA
• mRNA sintético
• solo se debe agregar de manera exógena ATP, y los aminoácidos marcados
• aminoacil tRNA sintetasa
Para ello, se crearon RNA sintético empleando una enzima llamada polinucleótido fosforilasa. A diferencia de la RNA polimeras
a, la polinucleótido fosforilasa no requiere un molde; une al azar cualquier nucleótido de RNA que esté disponible. Los primeros
RNA sintéticos fueron homopolímeros, moléculas de RNA que consistían de un único tipo de nucleótido.
Al añadir la polinucleótido fosforilasa a una solución de nucleótidos de uracilo se generaban moléculas de RNA que consistían co
mpletamente en nucleótidos de uracilo, de esta manera solo contenían codones del tipo UUU. Estos RNA poli(U) se añadieron lue
go a veinte tubos, cada uno de los cuales contenía un sistema de síntesis proteica libre de células y los veinte aminoácidos distinto
s, uno de los cuales estaba marcado radioactivamente. La traducción procedió en los veinte tubos pero la proteína radioactiva apar
eció solo en uno de ellos (el que contenía fenilalanina marcada). Ese resultado mostró que el codón UUU especifica el aminoácido
fenilalanina.
Los resultados de experimentos similares en los que se empleó RNA poli(C) y poli(A) mostraron que CCC codifica para prolina y
AAA codifica para Lisina; por razones técnicas, los resultados para poli(G) fueron imposibles de interpretar.
Para obtener información acerca de codones adicionales, crearon RNA sintéticos que contenían dos o tres bases diferentes. Dado q
ue la polinucleótido fosforilasa incorpora nucleótidos al azar estos RNA contenían mezclas al azar de las bases y por tanto se los ll
amó copolímeros al azar.
Por ejemplo, cuando los nucleótidos adenina y citosina se mezclaran con la polinucleótido fosforilasa, las moléculas de RNA prod
ucidas tuvieron ocho codones diferentes: AAA, AAC, ACA, ACC, CAA, CAC y CCC. En los sistemas de síntesis de proteínas lib
re de células estos RNA poli(AC) produjeron proteínas que contenían seis aminoácidos distintos: asparagina, glutamina, histidina,
lisina, prolina y treonina.
Las proporciones de los distintos aminoácidos en las proteínas dependían del cociente de los dos nucleótidos empleados en crear e
l mRNA sintético, y la probabilidad teórica de encontrar un codón particular se calcularía a partir de los cocientes de las bases.
Si se hubiera empleado un cociente 4:1 de C con respecto a A al elaborar el RNA, entonces:
• la probabilidad de que C apareciera en cualquier posición dada de un codón sería de 4/5.
• la probabilidad de que A estuviera en él sería de 1/5.
Esta técnica fue útil hasta acá. Esto se debe a que los cálculos teóricos dependían de la incorporación al azar de las bases, lo que n
o siempre ocurre, y dado que el código genético es redundante, en algunas ocasiones varios codones distintos especifican el mism
o aminoácido.
Para determinar los aminoácidos que codificaban los codones mas complejos se diseño otra metodología. Se lo conoció como unió
n de tRNA a los ribosomas.
La tercera metodología permitió obtener información adicional acerca del código genético. Se emplearon técnicas químicas para si
ntetizar moléculas de RNA que contenían secuencias repetidas conocidas. La hipótesis consistía en que un mRNA que contenía, p
or ejemplo, nucleótidos alternantes uracilo y guanina (UGUGUGUGUGUG) se leería, durante la traducción, como dos codones al
ternantes, UGU GUG UGU GUG, produciendo una proteína compuesta por dos aminoácidos alternantes. Cuando se ubicaron este
mRNA sintético en un sistema de síntesis proteica libre de células, se produjo una proteína constituida por residuos alternantes de
cisteína y valina.
Esta técnica no permite determinar cuál de los dos codones (UGU o GUG) especificaba para cisteína o la valina (debido a que el c
ódigo genético es degenerado), pero en combinación con otros métodos constituyó una contribución crucial para desentrañar el có
digo genético.
tRNA isoaceptores
Los tRNA sirven como moléculas adaptadoras, que llevan aminoácidos particulares unidos y los entregan a un ribosoma, donde lo
s aminoácidos luego se ensamblan en cadenas de polipéptidos. Cada tipo de tRNA une un único tipo de aminoácido, es decir, son
específicos para cada aminoácido.
Las células de la mayor parte de los organismos poseen entre 30 y 50 tRNA distintos, los cuales, son bastante menos de lo que se
predice por los 64 codones existentes.
Aun así solo existen 20 aminoácidos distintos en las proteínas. Esto implica que un aminoácido puede ser transportado por más de
un tRNA.
Los diferentes tRNA que aceptan al mismo aminoácido pero tienen anticodones distintos se llaman tRNA isoaceptores. Algunos co
dones sinónimos codifican para diferentes isoaceptores.
Tambaleo o Balanceo
Muchos codones sinónimos difieren solo en la tercera posición.
Por ejemplo, la alanina es codificada por los codones GCU, GCC, GCA y GCG, todos los cuales comienzan con GC. Cuando el c
odón en el mRNA y el anticodón del tRNA se unen, la primera base (5’) del codón se aparea con la tercera base (3’) del anticodón
, estrictamente de acuerdo con las reglas de Watson y Crick: A con U; C con G.
Luego, las bases del medio del codón y del anticodón se aparean, también estrictamente de acuerdo con las reglas de Watson y Cri
ck. Después de que estos pares han formado puentes de hidrógeno, las terceras bases se aparean débilmente, esto implica que pued
e haber cierta flexibilidad o tambaleo en su apareamiento.
La hipótesis del balanceo propone que algunos pares de bases no convencionales podrían producirse en la tercera posición de un c
odón.
Las reglas del tambaleo indican cuáles bases en la tercera posición (extremo 3') del codón del mRNA pueden aparearse con bases
que se encuentran en el primer lugar (extremo 5') del anticodón del tRNA:
Por ejemplo, una G en el anticodón podría aparearse con una C o una U en la tercera posición del codón. El tambaleo permite que
algunos tRNA se apareen con más de un codón de un mRNA; de esta forma, entre 30 y 50 tRNA pueden aparearse con los 61 cod
ones con sentido. Algunos codones son sinónimos por tambaleo.
• Codones de terminación
Tres codones (UAA, UAG y UGA) no codifican aminoácidos. Estos codones señalan la terminación de la proteína, tanto en las ba
cterias como en las células eucariotas y se llaman codones de stop, codones de terminación o codones sin sentido. Ninguna moléc
ula de tRNA tiene anticodones que se apareen con los codones de terminación. NO EXISTEN tRNA CON ANTICODONES QUE S
E APAREEN CON ESTOS CODONES
El mRNA por convención se escribe 5’ 3’, por lo que interactúa con el tRNA de forma complementaria
La enzima encargada de cargar aminoácido al tRNA de manera especifica es la aminoacil tRNA sintetasa. Existe una sintetasa par
a cada aminoácido. Su especificidad esta dado porque reconoce al anticodón y/o al brazo aceptor de todos los tRNA que aceptan d
eterminado aminoácido.
La carga de aminoácidos al tRNA es el paso de regulación mas importante de la traducción, siendo considerado el segundo código
genético, debido a que es el único paso que garantiza que la traducción ocurra de manera fiel. Luego de esto, el proceso avanza p
or interacción codón – anticodón, de ahí su importancia.
Las tRNA sintetasas tienen actividad correctora de errores. Tiene varias formas de hacerlo:
• por hidrolisis del enlace éster de un aminoácidos que puede entrar al sitio activo pero que no es el correcto.
• por exclusión de tamaño, en el caso de que el aminoácido sea mas grande que el sitio activo.
• por características fisicoquímicas, como carga eléctrica o hidrofobicidad. Si el aminoácido no presenta las características correct
as será expulsado del sitio activo.
Finalmente, las proteinas se sintetizan alargando su extremo Ct, es decir, que el primer aminoácido que se codifica lo hace en dire
cción Nt – Ct, y la cadena se alarga a partir de su extremo Ct. De esta manera, un tripéptido es:
Nt-Ct Nt-Ct Nt-Ct
La reacción ocurre entre el grupo amino del aminoácido del sitio A y el grupo carboxilo del aminoácido del sitio P.
El tRNA iniciador inmediatamente ocupa el sitio P (en eucariotas el único sitio al cual es capaz de unirse el fMet-tRNAfMet o Met-
tRNAMet) si bien, todos los otros tRNA primero entran al sitio A. Después de la iniciación el ribosoma se une al mRNA y el fMet-t
RNAfMet se posiciona por encima del codón de iniciación AUG en el sitio P; el sitio A adyacente permanece libre.
La elongación ocurre en tres pasos.
• Primer paso: Es la entrega del tRNA cargado (tRNA con su aminoácido unido) al sitio A. Esto requiere la presencia del factor d
e elongación Tu (EF-Tu), el factor de elongación Ts (EF-Ts) y el GTP. El EF-Tu, en primer lugar se une con el GTP y luego se un
e a un tRNA cargado para formar un complejo tripartito. Este complejo tripartito entra en el sitio A del ribosoma, donde el anticod
ón del tRNA se aparea con el codón del mRNA. Después de que el tRNA cargado se encuentra en el sitio A, el GTP se corta y for
ma GDP, y se libera el complejo EF-Tu-GDP. El factor EF-Ts regenera EF-Tu-GDP a EF-Tu-GTP. En las células eucariotas un c
onjunto de reacciones similares entrega el tRNA cargado al sitio A.
• Segundo paso: Es la creación de un enlace peptídico entre los aminoácidos, que están unidos a los tRNA, en los sitios P y A. La
formación de este enlace peptídico libera al aminoácido en el sitio P desde su tRNA. La actividad que explica la formación del enl
ace peptídico en el ribosoma es la de la peptidil-transferasa. La actividad catalítica es una propiedad del rRNA de la subunidad gra
nde del ribosoma; este rRNA actúa como una ribozima.
• El tercer paso: Es la translocación, el movimiento del ribosoma, hacia abajo, sobre el mRNA en la dirección 5’- 3’. Esta etapa p
osiciona el ribosoma encima del siguiente codón y requiere el factor de elongación G (EF-G) y la hidrólisis de GTP a GDP. Dado
que los tRNA en los sitios P y A aún se encuentran unidos al mRNA mediante el apareamiento codón-anticodón no se mueven co
n el ribosoma a medida de que éste se transloca. En consecuencia, el ribosoma se desplaza de modo que el tRNA que previamente
ocupaba el sitio P ahora ocupe el sitio E, desde el cual se mueve al citoplasma, lugar en el que puede volver a cargarse con otro a
minoácido. La translocación también provoca que el tRNA que ocupaba el sitio A (que se encuentra unido a la cadena polipeptídic
a creciente) esté en el sitio P, dejando el sitio A abierto.
De este modo el avance de cada tRNA a través del ribosoma, durante la elongación, puede resumirse de la siguiente manera:
Citoplasma sitio A sitio P sitio E citoplasma.
El tRNA iniciador es una excepción: se une directamente al sitio P y nunca ocupa el sitio A. Después de la translocación el sitio A
del ribosoma se vacía y queda listo para recibir el tRNA especificado por el codón siguiente.
El ciclo de elongación se repite: un tRNA cargado y su aminoácido ocupan un sitio A, se forma un enlace peptídico entre los amin
oácidos de los sitios A y P, y el ribosoma se transloca al codón siguiente. Durante todo el ciclo, la cadena polipeptídica permanec
e unida al tRNA en el sitio P. El ribosoma avanza sobre el mRNA en dirección 5’ 3’, añadiendo aminoácidos, de uno por vez, d
e acuerdo con el orden especificado por la secuencia de codones del mRNA. La elongación en las células eucariotas ocurre en for
ma similar.
Con respecto a las Archeas, poseen una mezcla de rasgos de las bacterias y de las células eucariotas.
Dado que las arqueobacterias carecen de membrana nuclear la transcripción y la traducción ocurren simultáneamente al igual que
en las bacterias. Las arqueobacterias utilizan metionina no formilada como aminoácido iniciador, una característica de la traducció
n eucariota. Con respecto a las secuencias de DNA que codifican factores de iniciación y elongación en las arqueobacterias, algun
os son semejantes a las que se encuentran en las bacterias, mientras que otras son similares a las que se encuentran en los eucariota
s. Por último, parte de los antibióticos que inhiben la traducción en las bacterias carecen de efecto en la traducción de las arqueoba
cterias.
Polisomas o Polirribosomas
Tanto en las células procariotas como eucariotas, las moléculas de mRNA se traducen simultáneamente por acción de múltiples ri
bosomas. La estructura resultante (un mRNA con varios ribosomas unidos) se denomina polirribosoma. Cada ribosoma se une suc
esivamente al sitio que une ribosomas en el extremo 5’ del mRNA y se mueve hacia el extremo 3’; el polipéptido asociado con ca
da ribosoma progresivamente se torna más largo a medida que el ribosoma se mueve sobre el mRNA. En las células procariotas, l
a transcripción y la traducción son simultáneas; por tanto, pueden unirse múltiples ribosomas al extremo 5’ terminal del mRNA, m
ientras que la transcripción aún está en proceso en el extremo 3’.
A pesar de que la transcripción y la traducción no son procesos simultáneos en los eucariotas porque la transcripción ocurre en el
núcleo y toda la traducción ocurre en el citoplasma, puede ocurrir que parte de la traducción ocurra dentro del núcleo eucariota.
NTIBIOTICO
La ATPasa citosólica SecA empuja los polipéptidos bacterianos a través de los translocones hacia el espacio periplasmático
El mecanismo de translocación de las proteínas bacterianas a través de la membrana interna comparte varias características import
antes con la translocación de proteínas en el RE de las células eucariotas.
• Primero, las proteínas translocadas poseen casi siempre una secuencia de señalización hidrófoba en el N-terminal que es elimina
da por una peptidasa de señal.
• Segundo, las proteínas bacterianas atraviesan la membrana interna por un canal, o translocón, compuesto de proteínas estructural
mente similares al complejo Sec6 1 de los eucariotas.
• Tercero, las células bacterianas expresan dos proteínas, Ffh y su receptor (FtsY), que son las homólogas de la SRP y del receptor
de SRP, respectivamente.
Sin embargo, en las bacterias, estas últimas proteínas parecen funcionar principalmente en la inserción de proteínas de membrana
hidrófobas en la membrana interna. De hecho, todas las proteínas bacterianas que son translocadas a través de la membrana intern
a sólo lo hacen después de terminada su síntesis en el citosol, pero antes de que se plieguen para adoptar su estructura final.
TRANSLOCACIÓN POST-TRADUCCIONAL
SecA impulsa la translocación postraduccional de las proteínas bacterianas
La energía que dirige la translocación de proteínas bacterianas es generada por SecA, que se une aliado citosólico del translocón e
hidroliza el ATP citosólico.
SecA se une al polipéptido desplegado que se está translocando y luego un cambio de conformación del SecA, impulsado por la e
nergía liberada de la hidrólisis del ATP, empuja el segmento de polipéptido unido a través del poro del translocón hacia el lado pe
riplasmático de la membrana. La repetición de este ciclo empuja finalmente toda la cadena polipeptídica a través del translocón ha
cia el espacio periplasmático, donde se forman los puentes disulfuro y el polipéptido se pliega para adoptar su estructura apropiada
.
Varios mecanismos translocan las proteínas bacterianas hacia el espacio extracelular.
Para translocar las proteínas bacterianas desde el citosol a través de las membranas bacterianas interna y externa al espacio extrace
lular se usan mecanismos bastante diferentes. Estos mecanismos de secreción son muy importantes en las bacterias patógenas, que
suelen utilizar la secreción de proteínas extracelulares para colonizar tejidos específicos dentro del huésped y evadir los mecanis
mos de defensa. Los sistemas especializados de secreción bacteriana pueden clasificarse en cuatro tipos generales, de acuerdo con
su mecanismo de acción.
Los sistemas de secreción tipo 1 y tipo II constan de dos pasos:
• Primero, las proteínas sustrato son translocadas a través de la membrana interna hacia el espacio periplasmático, donde se pliega
n y a menudo adquieren puentes disulfuro.
• Segundo, las proteínas plegadas son translocadas desde el espacio periplasmático a través de la membrana externa por complejos
de proteínas periplasmáticas que atraviesan las membranas interna y externa. La energía necesaria para esta translocación provien
e de la hidrólisis del ATP en el citosol, pero los mecanismos que acoplan la hidrólisis del ATP y la translocación a través de la me
mbrana externa no se conocen bien.
Por otro lado, la translocación por los sistemas de secreción tipos III y IV tiene lugar en un solo paso:
Estos sistemas consisten en grandes complejos de proteína que atraviesan ambas membranas que permiten la translocación directa
de las proteínas desde el citosol al ambiente extracelular. El sistema tipo III no sólo está adaptado para secretar proteínas, sino ta
mbién para inyectarlas en las células diana, una propiedad muy útil para las bacterias patógenas.
Las proteínas son dirigidas a la membrana de las organelas intracelulares y se insertan en la membrana de la organela o se desplaz
an hacia su interior. Los mecanismos básicos que gobiernan la distribución de proteínas a todos las organelas intracelulares son id
énticos.
La información para dirigir una proteína a un destino u organela en particular está codificada dentro de la secuencia de aminoác
idos de la propia proteína, casi siempre en secuencias de 20 a 50 aminoácidos conocidas genéricamente como secuencias de seña
lización, o secuencias de captación-direccionamiento, mas comúnmente conocido como péptido-señal.
Cada organela posee un conjunto de proteínas receptoras que sólo se unen a tipos específicos de secuencias de señalización, lo que
asegura así que la información codificada en una secuencia de señalización determina la especificidad del direccionamiento. Una
vez que una proteína que contiene una secuencia de señalización ha interactuado con el receptor correspondiente, la cadena de pro
teína es transferida a algún tipo de canal de translocación o translocón que le permite a la proteína atravesar la bicapa de la membr
ana. La transferencia en una sola dirección de una proteína hacia el interior de un organela, sin reflujo hacia el citoplasma, se logra
acoplando la translocación a un proceso energéticamente favorable, como la hidrólisis del ATP. Algunas proteínas son luego dirig
idas para alcanzar un subcompartimiento dentro de la organela diana; este direccionamiento depende de otras secuencias de señali
zación y de otras proteínas receptoras.
Por último, las secuencias de señalización a menudo son eliminadas de la proteína madura por proteasas específicas una vez que s
e completa la translocación a través de la membrana.
En resumen, un polipéptido se libera en el citosol. Sin embargo, no todas las proteinas tienen funcionalidad allí. Existe una señal
en la secuencia de aminoácidos que dice donde debe dirigirse.
• Hay proteinas que terminan en el lumen del RE, el cual son translocadas co-traduccionalmente.
• Hay proteinas que terminan en las mitocondrias, cloroplastos, peroxisomas y en el núcleo, que son translocadas post-traduccio
nalmente.
• Hay proteinas que terminan en el citosol las cuales se sintetizan allí mismo y no presentan señal de direccionamiento.
TRANSLOCACIÓN CO-TRADUCCIONAL
Translocación de proteínas secretorias a través de la membrana del RE
Todas las células eucariotas usan en esencia la misma vía secretoria para sintetizar y distribuir las proteínas secretadas y las proteí
nas luminales solubles en el RE, el complejo de Golgi y los lisosomas, llamadas en conjunto proteínas secretorias. Aunque todas l
as células secretan diversas proteínas, ciertos tipos de células están especializadas en la secreción de grandes cantidades de proteín
as específicas.
Las células del ácino pancreáticos sintetizan cantidades grandes de varias enzimas digestivas que desembocan en el intestino. Debi
do a que este tipo de células secretorias contienen los organelas de la vía secretoria en gran abundancia, son usados como modelo
para el estudio de esta vía.
En experimentos de pulso y lavado en estas células, se observo que los aminoácidos marcados radiactivamente se incorporan fund
amentalmente en las proteínas secretorias recién sintetizadas. Los ribosomas que sintetizan estas proteínas están realmente unidos
a la superficie del RE. Como consecuencia, la parte del RE que recibe las proteínas que ingresan en la vía secretoria se conoce co
mo RE rugoso (RER) porque estas membranas están densamente asociadas con ribosomas. Cuando las células se homogeneizan, e
l RER se fragmenta en pequeñas vesículas cerradas, denominadas microsomas rugosos, con la misma estructura (ribosomas por fu
era) que se encuentra en la célula intacta. Aunque las proteínas secretorias se sintetizan en los ribosomas unidos a la superficie cito
sólica de la membrana del RE, se encuentran en la luz de las vesículas del RE durante su síntesis.
Una secuencia de señalización N-terminal hidrófoba dirige las proteínas secretorias nacientes hacia el RE
Después de que la síntesis de una proteína secretoria empieza en los ribosomas libres en el citosol, una secuencia de señalización d
e 16 a 30 residuos de aminoácidos en la proteína naciente dirige el ribosoma hacia la membrana del RE y comienza la translocació
n del polipéptido en desarrollo a través de ella. La secuencia de señalización para el RE se localiza en el N-terminal de la proteín
a, que es la primera parte de la proteína que se sintetiza. Las secuencias de señalización de diferentes proteínas secretorias contie
nen uno o más aminoácidos con carga positiva adyacentes a una cadena continua de 6 a 12 residuos hidrófobos (núcleo). En la ma
yor parte de las proteínas secretorias, la secuencia de señalización se separa de la proteína mientras todavía está creciendo en el rib
osoma; por consiguiente, las secuencias de señalización no están casi nunca presentes en las proteínas "maduras" de las células. El
núcleo hidrófobo de las secuencias de señalización hacia el RE es esencial para su función.
Deleciones específicas de varios aminoácidos hidrófobos de una secuencia de señalización, o la introducción por mutación de ami
noácidos cargados en el núcleo hidrófobo pueden abolir la capacidad del N-terminal de una proteína para funcionar como secuenci
a de señalización. Como consecuencia, la proteína modificada permanece en el citosol, incapaz de atravesar la membrana del RE h
acia su luz. Mediante técnicas de DNA recombinante, se han producido proteínas citosólicas con secuencias de aminoácidos agreg
adas al N-terminal. Si la secuencia agregada es suficientemente larga e hidrófoba, esta proteína citosólica modificada es translocad
a a la luz del RE. Por lo tanto, los residuos hidrófobos del núcleo de las secuencias de señalización hacia el RE representan un siti
o de unión que es crítico para la interacción de las secuencias de señalización con las proteínas receptoras de la membrana del RE.
En sistemas de síntesis de proteínas libre de células, con mRNA que codifica una proteína secretoria y microsomas despojados d
e sus propios ribosomas unidos, han comprobado que una proteína secretoria típica es incorporada a los microsomas y su secuen
cia de señalización es eliminada sólo si hay microsomas presentes durante la síntesis de la proteína.
Los microsomas deben agregarse antes de que se unan los primeros 70 aminoácidos aproximadamente, para que la proteína secret
oria completa se localice en la luz del microsoma. En ese momento, han surgido del ribosoma aproximadamente los primeros 40 a
minoácidos, incluida la secuencia de señalización que después será eliminada, y los siguientes 30 aminoácidos todavía se encuentr
an ocultos dentro del canal del ribosoma. Por consiguiente, el transporte de la mayoría de las proteínas secretorias hacia la luz del
RE ocurre mientras la proteína naciente todavía está unida al ribosoma y está sufriendo su elongación, proceso denominado transl
ocación cotraduccional.
El pasaje de los polipéptidos nacientes a través del translación es impulsado por la energía liberada durante la traducción
Una vez que la SRP y su receptor han dirigido un ribosoma que está sintetizando una proteína secretoria a la membrana del RE, el
ribosoma y la cadena naciente son rápidamente transferidos al translocón, un canal revestido de proteínas que se encuentra dentro
de la membrana. A medida que continúa la traducción, la cadena naciente pasa directamente de la subunidad grande del ribosoma
al poro central del translocón. La subunidad 60S del ribosoma se alinea con el poro del translocón de tal manera que la cadena n
aciente nunca queda expuesta al citoplasma y no se pliega hasta que alcanza la luz del RE.
Cuando los microsomas presentes en el sistema de translocación libre de células se reemplaza por vesículas de fosfolípidos recons
tituidas que contenían sólo el receptor de SRP y el complejo Sec6 1 (monómero constituyente del translocón), la proteína secretori
a naciente fue translocada desde su complejo SRP/ribosoma hacia el interior de las vesículas. El receptor de SRP y el complejo Se
c6 1 son las únicas proteínas de la membrana del RE absolutamente necesarias para la translocación. Por lo tanto, la energía produ
cida por la elongación de la cadena en el ribosoma parece ser suficiente para empujar la cadena polipeptídica a través de la membr
ana en una sola dirección. Múltiples copias del complejo Sec6 1 se agrupan para formar un canal translocón, lo que puede visualiz
arse por microscopia electrónica.
Si los translocones siempre estuvieran abiertos en la membrana del RE, sobre todo en ausencia de ribosomas adheridos y de un pol
ipéptido en translocación, las moléculas pequeñas como el ATP y los aminoácidos podrían difundirse libremente a través del poro
central. Para mantener la barrera de permeabilidad de la membrana del RE, el translocón está regulado de tal forma que sólo está a
bierto cuando se le une un complejo cadena naciente/ribosoma. Por lo tanto, el translocón es un canal similar a los canales iónicos.
Cuando el translocón se abre por primera vez, un asa de la cadena naciente, que contiene la secuencia de señalización y aproxima
damente 30 aminoácidos adyacentes, puede introducirse en el poro del translocón.
El mecanismo por el que el canal del translocón se abre y se cierra pueden ser las siguientes:
• una proteína de la luz del RE bloquea el poro del translocón cuando no hay un ribosoma unido del lado citosólico del translocón.
• los complejos Sec6 1 pueden encontrarse normalmente en la membrana del RE en un estado no ensamblado y que el proceso de
compuerta involucra la formación de un canal de translocón en el sitio de la membrana al que son transportados el ribosoma y la c
adena naciente por la SRP y el receptor de SRP. A medida que la cadena polipeptídica creciente entra en la luz del RE, la secuenci
a de señalización es eliminada por la peptidasa de señal, una proteína transmembrana del RE asociada con el translocón. Esta prot
easa reconoce una secuencia en el Ct del núcleo hidrófobo del péptido señal y corta específicamente la cadena en esta secuencia u
na vez que emerge al espacio luminal del RE. Después de la separación de la secuencia de señalización, el polipéptido creciente p
asa a través del translocón hacia la luz del RE. El translocón permanece abierto hasta que la traducción se completa y toda la cade
na polipeptídica ha pasado a la luz del RE.
Receptores KDEL
Las proteinas que terminan en el RE son transportadas en vesículas hacia la membrana plasmática donde allí se fusionan con la mi
sma. Previo, las vesículas deben dirigirse hacia el cis-Golgi, la region interna y mas próxima al RE.
Las proteinas que se encuentran dentro de las vesículas, al fusionarse con la membrana plasmática son liberadas al exterior celular
(estas proteinas son las secretorias), mientras que si la proteinas se mantienen ancladas a la membrana vesicular, cuando la vesícu
la se fusione con la membrana plasmática, la proteina formara parte de las proteinas de transmembrana.
Para regular el flujo de vesículas, existe un sistema anterógrado, que regula el transporte de vesicular del RE al Golgi, y uno retrog
rado, donde las proteinas que hayan llegado al Golgi, y presenten una señal de retención, la KDEL, volverá hacia el RE.
El transporte anterógrado desde el RE al Golgi, el cuál es el primer paso en la vía secretoria está mediado por las vesículas COPII,
mientras que en el transporte retrógrado es inverso, es decir, desde el cis-Golgi al RE e intervienen las vesículas COPI.
Este transporte vesicular retrógrado sirve para que el RE recuperar proteínas y membrana para proveer el material necesario para c
iclos adicionales de gemación vesicular del RE.
El transporte retrógrado mediado por COPI también recupera proteínas residentes del RE desde el cis-Golgi para corregir errores d
e clasificación. Las proteínas que se entregaron correctamente al Golgi avanzan a través de sucesivos compartimientos del Golgi
mediante progresión cisternal.
Papel del receptor de KDEL en la recuperación desde el Golgi de las proteínas luminales residentes en el RE:
Las proteínas luminales del RE, sobre todo las presentes en altos niveles, pueden ser incorporadas en forma pasiva en las vesículas
COPII y transportadas hacia el Golgi. Muchas de tales proteínas portan una secuencia KDEL C-terminal que les permite retornar.
El receptor de KDEL, localizado principalmente en la red cis-Golgi y tanto en las vesículas COPII como en las COPI, une proteín
as que portan la señal de clasificación KDEL y las regresa hacia el RE. Este sistema de devolución evita el agotamiento de las prot
eínas luminales del RE como las que se necesitan para el plegamiento apropiado de las proteínas secretorias recién sintetizadas. La
afinidad de unión del receptor de KDEL es muy sensible al pH. La pequeña diferencia entre el pH del RE y el del Golgi favorece
la fijación de las proteínas que portan KDEL al receptor en las vesículas derivadas del Golgi y su liberación en el RE.
Proteínas tipo I:
Una secuencia de aproximadamente 22 aminoácidos hidrófobos existente en el medio de la proteína tipo I detiene la transferencia
de la cadena naciente a través del translocón. Debido a sus características hidrófobas, esta secuencia interna puede desplazarse late
ralmente entre las subunidades de proteína que forman la pared del translocón y queda anclada en la bicapa de fosfolípidos de la m
embrana, donde permanece. Por su función dual, esta secuencia se denomina secuencia de detención de transferencia y anclado. U
na vez interrumpida la translocación, la traducción continúa en el ribosoma que todavía está fijo al ahora vacío y cerrado translocó
n. A medida que se sintetiza el C-terminal de la cadena de la proteína, forma un asa en el lado citosólico de la membrana. Cuando
termina la traducción, el ribosoma se separa del translocón y el C-terminal de la proteína tipo I recién sintetizada queda en el citos
ol.
TRANSLOCACIÓN POST-TRADUCCIONAL
La hidrólisis del ATP impulsa la translocación postraduccional de algunas proteínas secretorias en las levaduras
En la mayoría de las eucariotas, las proteínas secretorias entran en el RE por translocación simultánea con la traducción, usando la
energía derivada de la traducción para atravesar la membrana. Sin embargo, en las levaduras, algunas proteínas secretorias ingres
an en la luz del RE después de que se completa la traducción. En este tipo de translocación postraduccional, la proteína translocad
a atraviesa el mismo translocón de Sec6 1 que se usa en la translocación simultánea a la traducción. Sin embargo, la SRP y el rece
ptor de SRP no participan en la translocación postraduccional y en estos casos la interacción directa entre el translocón y la secu
encia de señalización de la proteína completada parece ser suficiente para el direccionamiento hacia la membrana del RE. Adem
ás, la fuerza necesaria para la translocación unidireccional a través de la membrana del RE es proporcionada por un complejo de p
roteínas adicional, conocido como complejo Sec6 3 y un miembro de la familia de chaperonas conocido como BiP. El complejo te
tramérico Sec6 3 está incluido en la membrana del RE en la vecindad del translocón, mientras que BiP se encuentra en la luz del R
E. BiP tiene un dominio ligador de péptidos y un dominio ATPasa. Estas chaperonas se unen y estabilizan proteínas desplegadas o
parcialmente plegadas.
El modelo actual para la translocación postraduccional de una proteína hacia el RE es el siguiente:
• una vez que el segmento del N-terminal de la proteína ingresa en la luz del RE, la peptidasa de señal corta la secuencia de señaliz
ación de la misma forma que en la translocación cotraduccional.
• la interacción BiP-ATP con la porción luminal del complejo Sec6 3 produce la hidrólisis del ATP unido a él, lo que determina u
n cambio de conformación en el BiP que promueve su unión a la cadena polipeptídica expuesta.
• dado que el complejo Sec6 3 está localizado cerca del translocón, el BiP se activa en los sitios en los que los polipéptidos nacient
es pueden entrar en el RE.
• en ausencia de unión al BiP, un polipéptido desplegado se desliza de un lado a otro dentro del canal del translocón. Estos movim
ientos de deslizamiento al azar rara vez hacen que todo el polipéptido atraviese la membrana del RE. La unión de una molécula de
BiP-ADP a la porción luminal del polipéptido impide que el polipéptido se deslice fuera del RE.
• a medida que los movimientos de deslizamiento adicionales al azar exponen una mayor porción del polipéptido en el lado lumin
al de la membrana del RE, la unión sucesiva de moléculas de BiP-ADP a la cadena polipeptídica actúa como retén y tracciona fina
lmente todo el polipéptido dentro del RE. Las moléculas de BiP intercambian espontáneamente su ADP por ATP, lo que produce l
a liberación del polipéptido, que puede plegarse para adoptar su estructura nativa.
• el BiP-ATP reciclado está entonces disponible para otra interacción con Sec6 3.
• PEROXISOMAS
Los peroxisomas son orgánulos pequeños limitados por una sola membrana. A diferencia de las mitocondrias y los cloroplastos, lo
s peroxisomas carecen de DNA y ribosomas. Por lo tanto, todas las proteínas peroxisómicas son codificadas por los genes nuclear
es, se sintetizan en los ribosomas libres del citosol y luego se incorporan a peroxisomas preexistentes o recién formados. A medida
que los peroxisomas se agrandan por el agregado de proteínas (y lípidos) pueden finalmente dividirse y formar nuevos peroxisom
as, como sucede con las mitocondrias y los cloroplastos. El tamaño y la composición enzimática de los peroxisomas varían consid
erablemente según los diferentes tipos de célula. Sin embargo, todos los peroxisomas contienen enzimas que usan oxígeno molecu
lar para oxidar diversos sustratos y forman agua oxigenada (H2O2). La catalasa, una enzima del peroxisoma, descompone eficazm
ente el H2O2 a H2O. Los peroxisomas son muy abundantes en las células del hígado, donde constituyen del 1 al 2% del volumen
celular.
• NÚCLEO
La membrana nuclear es una doble membrana lipídica que delimita al núcleo. La misma presenta poros nucleares, por donde pasa
n moleculas pequeñas pero no proteinas plegadas. Las proteinas nucleares entran debido a que se encuentran orientadas por acción
del péptido señal. Este péptido señal no es eliminado luego de haber sido translocado. La ubicación del péptido señal es variable,
pero suele encontrarse a aproximadamente a la mitad de la proteina.
En la división celular se degrada la membrana nuclear, de manera que todas las proteinas nucleares se dispersan en el citoplasma.
Luego de la citocinesis, en las células hijas se vuelven a formar las membranas nucleares. Las proteinas nucleares, debido a que no
perdieron dicha secuencia pueden retornar al núcleo.
Por otro lado, el sitio de armado de los ribosomas se da en el nucléolo, donde se sintetiza los rRNA, que formará parte de las subu
nidades ribosómicas.
OPERON LACTOSA
El operón de la lactosa (lac) incluye los genes de:
• la beta-galactosidasa (Z)
• la galactósido permeasa (Y)
• la tiogalactósido transacetilasa (A)
La ultima de estas enzimas parece modificar los galactósidos tóxicos para facilitar su eliminación por la célula. Cada uno de los tr
es genes está precedido por un sitio de unión a ribosoma (RBS), que dirige independientemente la traducción de cada gen.
La regulación negativa del operón lac sigue el mecanismo siguiente:
En ausencia de lactosa, los genes del operón lac están reprimidos. Mutaciones en el operador o el gen I, provocan la síntesis const
itutiva de los productos génicos.
El gen I codifica para el represor del sistema. Cuando el gen I es defectuoso, la represión puede restablecerse mediante la introduc
ción de un gen I funcional dentro de la célula como otra molécula de DNA (plásmido) denominada represor Lac de DNA, lo que
demuestra que el gen I codifica una molécula que difunde causando la represión génica. Esta molécula es una proteina denominad
a represor Lac.
El operador al que se une mas fuertemente (O1) es contiguo al sitio de inicio de la transcripción. El gen I se transcribe a partir de s
u propio promotor (PL), independientemente de los genes del operón lac. El operón lac tiene dos sitios de unión secundarios para e
l represor Lac. Uno, llamado (O2) esta ubicado dentro del gen que codifica la beta-galactosidasa (Z); el otro (O3) esta dentro del ge
n I. Para reprimir el operón, el represor Lac parece que se une tanto al operador principal como a uno de los dos sitios secundarios,
con el DNA interpuesto formando un lazo. Cualquiera de las dos formas de unión bloquea el inicio de la transcripción.
A pesar de la complejidad del complejo de unión, la represión no es absoluta. La unión del represor Lac reduce la tasa de inicio de
la transcripción en un factor de 103. Si se eliminan los sitios O2 y O3 la unión del represor solamente a O1 reduce la transcripción
en un factor alrededor de 102. Incluso en el estado reprimido, las células tienen unas pocas moleculas beta-galactosidasa y de galac
tósido permeasa, probablemente sintetizadas en las raras ocasiones en que el represor se disocia transitoriamente de los operadores
. Este nivel basal de transcripción, no obstante, es esencial para la regulación del operón.
Cuando se suministra lactosa a las células, se induce el operón lac. Una molécula inductora (señal) se une a un sitio especifico del
represor Lac, causando un cambio de conformación, que provoca la disociación del represor del operador. El inductor en el sistem
a del operón lac no es la propia lactosa sino la alolactosa, un isómero de la lactosa. Una vez en el interior de la célula (mediante la
s pocas moleculas de permeasa existentes), la lactosa se convierte en alolactosa por una de las pocas moleculas de beta-galactosida
sa presentes. La liberación del represor Lac del operador, provocado por la unión de la alolactosa al represor, permite que los gene
s del operón se expresen y provoca un incremento de 103 veces en la concentración de beta-galactosidasa.
Varios beta-galactósidos estructuralmente relacionados con la alolactosa son inductores del operón lac, pero no son sustratos de la
beta-galactosidasa; otros son sustratos pero no inductores. Un inductor muy efectivo y no metabolizable del operón lac, que a men
udo se utiliza experimentalmente, es el isopropiltiogalactósido (IPTG).
Un inductor que no se pueda metabolizar permite estudiar la funcion fisiológica de la lactosa como fuente de carbono para el creci
miento, con independencia de su funcion en la regulación de la expresión génica.
La regulación positiva del operón lac sigue el mecanismo siguiente:
La glucosa metabolizada directamente por la glucolisis, es la fuente de energía preferida de los organismos procariotas. Otros azuc
ares pueden servir como principal o único nutriente, pero se necesitan etapas adicionales para preparar su entrada en la glucolisis.
La síntesis de enzimas adicionales que metabolicen azucares tales como la lactosa o la arabinosa es un derroche energético si la gl
ucosa es abundante.
Cuando hay tanto glucosa como lactosa en el medio, se activa otro mecanismo de regulación llamado represión por catabolito, que
impide la expresión de los genes para el catabolismo de la lactosa, la arabinosa y otros azucares en presencia de glucosa, incluso c
uando estos azucares secundarios también están presentes. El efecto de la glucosa esta facilitado por el cAMP, como inductor, y la
proteina receptor de cAMP (CRP) como activador.
La CRP presenta sitios de unión al DNA y al cAMP. En ausencia de glucosa, la CRP – cAMP se une a un sitio cerca del promotor
lac y estimula 50 veces la transcripción del RNA.
La CRP se une al DNA con mayor afinidad cuando las concentraciones de cAMP son altas. En presencia de glucosa, la síntesis de
cAMP esta inhibida y se estimula la salida de cAMP de la célula. A medida que la [cAMP] desciende, la unión de la CRP al DNA
disminuye y en consecuencia también disminuye la expresión del operón lac.
De esta manera, la CRP – cAMP es un elemento de regulación positiva sensible a los niveles de glucosa, mientras que el represor
Lac es un elemento de regulación negativa sensible a la lactosa.
Los dos actúan conjuntamente:
• La CRP-cAMP tiene poco efecto sobre el operón lac cuando el represor Lac esta bloqueando la transcripción. Esto es lógico ya q
ue no hay lactosa, entonces por mas que no haya glucosa, no tienen ningún sentido que haya transcripción del operón lac.
• La disociación del represor del operador Lac tiene poco efecto en la transcripción del operón lac a menos que la CRP – cAMP es
te presente para facilitar la transcripción. Esto se a que la glucosa es preferentemente metabolizable con respecto a la lactosa, de es
ta manera aun en presencia de lactosa si hay glucosa no se activa el operón lac. Esto se debe a que cuando la CRP no esta unida, el
promotor lac wt es un promotor relativamente debil, de manera que el complejo abierto de la RNApol y el promotor no se forma f
ácilmente a menos que la CRP – cAMP este presente. La CRP interacciona directamente con la RNApol a través de la subunidad
alfa.
Por ende, una fuerte inducción del operón lac requiere tanto lactosa (para inactivar el represor lac) como una baja concentració
n de glucosa (para provocar un aumento de la [cAMP], así como de la unión del cAMP a la CRP).
EJEMPLO:
Se ensayo la actividad beta-galactosidasa (Z) y transacetilasa (A) en dos cepas de E. coli (1 y 2) y en el heterocigota merodiploide.
Los ensayos se realizaron en presencia y en ausencia de inductor:
Determinar el genotipo de cada una de las cepas considerando además de la beta-gal y la transacetilasa, a los genes que codifica p
ara el inductor (lacI), y la secuencia del operador (lacO).
• Cepa I: lacZ- lacY+ lacI+ lacO+
lacZ- porque tanto en presencia de inductor como en su ausencia, no hay cambios en la actividad de la beta-gal.
lacY+ porque existe una notable diferencia en la actividad de la transacetilasa en presencia del inductor con respecto al que no tien
e inductor.
lacI+ es evidente debido a que en la transacetilasa se ve represión en ausencia de un inductor.
lacO+ es evidente por lo mismo que lo anterior, al haber una represión implica que el operador (el sitio de unión del represor) esta
intacto.
De esta manera, en la cepa II si o si el genotipo debe ser lacO+/lacI- debido a que si fuese constitutivo, el merodiploide también lo
seria, porque es dominante frente a lacO+. De manera que la sobreproducción de lacZ se debe a una falla en el represor.
OPERON TRIPTOFANO
El operón del triptófano contiene cinco genes, los cuales son las que requiere para convertir el corismato en triptófano. El mRNA
del operón trp tiene vida media corta, lo que permite que la célula responda rápidamente a las necesidades cambiantes de este ami
noácido.
La regulación negativa del operón trp sigue el mecanismo siguiente:
Cuando el triptófano es abundante, se une al represor trp, provocando un cambio de conformación que permite al represor unirse a
l operador trp e inhibir la expresión del operón trp. El sitio del operador trp se solapa con el promotor, por lo que la unión del repr
esor puede bloquear la unión de la RNApol.
La regulación por atenuación del operón trp sigue el mecanismo siguiente:
Acabada la represión y restablecida la transcripción, la velocidad de transcripción se ajusta mediante un segundo proceso de regul
ación denominado atenuación de la transcripción, en el que la transcripción se inicia normalmente pero se interrumpe bruscamente
antes de que los genes del operón se transcriban. La frecuencia de atenuación de la transcripción esta regulada por la disponibil
idad del triptófano y depende del rígido acoplamiento de la transcripción y la traducción en las bacterias.
El mecanismo de atenuación del operón trp utiliza cuatro secuencias dentro de una region llamada guía de aprox 160 nucleótidos e
n el extremo 5’ del mRNA. Esta region guía precede al codón de inicio del primer gen.
Las secuencias 3 y 4 constituyen una región denominada atenuador de la transcripción. Estas secuencias se aparean para formar un
a estructura en horquilla rica en GC, seguida inmediatamente por una serie de residuos U. La estructura del atenuador actúa (es an
áloga) a la secuencia terminadora de la transcripción.
Las secuencias 2 y 3 constituyen la region conocida como continuador de la transcripción. Si se aparean las secuencias 2 y 3, la es
tructura atenuadora no se puede formar y la transcripción continua en los genes biosintéticos trp; el lazo formado por el apareamie
nto de las secuencias 2 y 3 no obstaculiza la transcripción.
Mecanismo:
Partiendo de que a medida que se va sintetizando el operón trp, va ocurriendo su traducción, se puede afirmar que el mecanismo
consistencia en una competencia por cual de las dos regio es se forma primera, si la region atenuadora o si la region continuador
a.
El hecho de que ocurra uno u otro apareamiento depende exclusivamente de la velocidad con la que este traduciendo el ribosoma
la secuencia 1.
La secuencia 1 se traduce inmediatamente despues de su transcripción por un ribosoma que sigue de cerca a la RNApol a medida
que avanza la transcripción. Dicha secuencia codifica un péptido llamado guía el cual presenta dos residuos de Trp. La única funci
ón del péptido guía es sensar la concentración de trp intracelular.
• Cuando las concentraciones de triptófano son elevadas, las concentraciones de tRNA cargados con triptófano (Trp – tRNATrp) ta
mbién son elevadas. Esto permite que la traducción proceda rápidamente, pasando por los dos codones Trp de la secuencia 1 haci
a la secuencia 2. En esta situación la secuencia 2 quede cubierta por el ribosoma, lo que la inhabilita para aparearse con la secuenc
ia 3 cuando esta es sintetizada; se forma la estructura atenuadora (secuencias 3 y 4) y se interrumpe .a transcripción.
• En cambio, cuando las concentraciones de triptófano son bajas, el ribosoma queda parado en los dos codones de Trp de la secuen
cia 1 porque hay menos tRNATrp cargados. La secuencia 2 permanece libre mientras se sintetiza la secuencia 3, permitiendo que es
tas dos secuencias se apareen y que se produzca la transcripción. De esta manera la proporción de transcritos que se atenúa descie
nde a medida que disminuye la concentración de triptófano.
CONTROL TRADUCCIONAL
En las bacterias, un incremento en la demanda celular de síntesis proteica se satisface mediante el incremento del numero de ribos
omas en lugar de alterar la actividad de los ribosomas individuales. En general, el numero de ribosomas aumenta a medida que au
menta la tasa de crecimiento celular. A tasas altas de crecimiento, los ribosomas constituyen aproximadamente el 45% del peso se
co celular. La proporción de recursos celulares dedicados a la producción de ribosomas es tan grande y la funcion de los ribosoma
s tan importante que las células tienen que coordinar la síntesis de los componentes ribosómicos: proteinas ribosómicas (proteinas
r) y RNA (rRNA). Esta regulación es diferente debido a que tiene lugar a la altura de la traducción.
Las diferentes proteinas r se encuentran distribuidos en mas de 20 operones de 1 a 11 cistrones.
Algunos de estos operones también contienen los genes para las subunidades de la DNA primasa, la RNApol y los factores de elo
ngación de la síntesis proteica, lo que explica el estrecho acoplamiento de la replicación, la transcripción y la traducción durante el
crecimiento celular.
Los operones de proteinas r se regulan principalmente mediante un mecanismo de retroalimentación tradicional. Una proteina r co
dificada por un operón también actúa de represor de la traducción, uniéndose al mRNA de su propio operón y bloqueando así la tr
aducción de todos los genes codificados por el mensajero. En general, la proteina r que desempeña el papel de represor también se
une directamente a un rRNA. Cada proteina r represora de la traducción se une con mayor afinidad al rRNA apropiado que a su m
RNA.
De esta manera, la proteína r cuando se une al mRNA reprime la traducción solo si el nivel de la proteina r excede al de rRNA. Ell
o asegura que la traducción de los mRNA que codifican proteinas r se reprima solo cuando el nivel de proteinas r exceda lo necesa
rio para producir ribosomas funcionales. De esta forma la velocidad de síntesis de proteinas r se mantiene en equilibrio con la disp
onibilidad de rRNA.
El sitio de unión del mRNA para el represor de la traducción esta cerca del sitio de inicio de la traducción de uno de los genes del
operón, generalmente el primer gen. En otros operones se vería afectado solo ese gen en particular, ya que en los mRNA policistró
nicos bacterianos la mayoría de genes tienen señales de traducción independientes. Sin embargo, en los operones de proteinas r, l
a traducción de un gen depende de la traducción de todos los demás. El mecanismo de este acoplamiento de la traducción aun no s
e conoce en detalle. No obstante, en algunos casos la traducción de múltiples genes parece que se bloquea mediante el plegamient
o del mRNA en una estructura tridimensional compleja que se estabiliza tanto por apareamiento interno como por la unión de la pr
oteina represora de la traducción. Cuando el represor de la traducción esta ausente, la unión del ribosoma y la traducción de uno o
mas genes elimina la estructura plegada del mRNA, permitiendo que se traduzcan todos los genes.
Debido a que la síntesis de proteinas r esta coordinada con la disponibilidad de los rRNA, la regulación de la producción de riboso
mas refleja la regulación de la síntesis de rRNA. En E. coli, la síntesis de rRNA a partir de los siete operones de rRNA refleja la ta
sa de crecimiento celular y los cambios en la disponibilidad de nutrientes cruciales, especialmente aminoácidos. La regulación coo
rdinada con las concentraciones de aminoácidos se denomina respuesta grave. Cuando las concentraciones de aminoácidos son baj
as, la síntesis de rRNA se detiene. La deficiencia de aminoácidos provoca la unión de tRNA descargados al sitio A de los ribosom
as; ello desencadena una secuencia de acontecimientos que empieza con la unión de una enzima llamada factor de respuesta grave
(proteina RelA) al ribosoma. Cuando esta unido al ribosoma, el factor de respuesta grave cataliza la formación del nucleótido poc
o común guanosina tetrafosfato (ppGpp), que añade pirofosfato a la posición 3’ del GTP, en la reacción:
GTP + ATP pppGpp + AMP
A continuación una fosfohidrolasa elimina un fosfato para formar ppGpp. El aumento brusco del nivel, de ppGpp en respuesta a la
carencia de aminoácidos produce una gran reducción de la síntesis de rRNA, debida al menos en parte, a la unión de ppGpp a la
RNApol.
El nucleótido ppGpp, junto al AMPc, pertenece a una clase de nucleótidos modificados que actúan como segundos mensajeros cel
ulares. En E. coli, estos dos nucleótidos sirven como señal de carencia de nutrientes, y causan grandes cambios en el metabolismo
celular, aumentando o disminuyendo la transcripción de centenares de genes. En las células eucarióticas, nucleótidos similares que
actúan de segundos mensajeros también tienen funciones de regulación múltiples. La coordinación del metabolismo células con el
crecimiento celular es muy compleja y sin duda existen otros mecanismos de regulación por descubrir.
CONTROL TRANSCRIPCIONAL
ACCESO A LOS PROMOTORES EUCARIOTICOS ESTA RESTRINGIDO POR LA ESTRUCTURA DE LA CROMATINA
La cromatina se puede clasificar en dos tipos dependiendo de su estado de condensación:
• Heterocromatina: es la cromatina que se encuentra condensada. Existen dos tipos: constitutiva, como por ejemplo los telómeros
y los centrómeros, cuya función es exclusivamente estructural sin funciones codificantes; y la facultativa que su estado de condens
ación depende de la diferenciación celular.
• Eucromatina: es la cromatina descondensada, transcripcionalmente activa.
Heterocromatina Eucromatina
La heterocromatina implica que los genes que se encuentran dentro de ella se encuentran inactivos transcripcionalmente, y que req
uieren un proceso de activación para activarse.
• La eucromatina implica que los genes que se encuentran dentro de ella se encuentran activos transcripcionalmente, y que requier
en un proceso de represión para que se inactiven.
El DNA que se encuentra siempre condensada se llama heterocromatina constitutiva (y no sufre procesos de activación).
El DNA que se encuentra siempre condensada se llama eucromatina (y no sufre procesos de represión).
El DNA que sufre procesos de activación/represión se lo conoce como heterocromatina facultativa.
En una célula eucariótica típica, alrededor del 10 % de la cromatina se encuentra en un estado mas condensado que el resto de la c
romatina. Esta forma, la heterocromatina, es transcripcionalmente inactiva. La heterocromatina, esta asociada generalmente a estr
ucturas cromosómicas definidas. La cromatina restante, menos condensada, se denomina eucromatina.
La transcripción de un gen eucariótico esta fuertemente reprimida cuando su DNA esta condensado en la heterocromatina. Una pa
rte de la eucromatina, pero no toda, es transcripcionalmente activa. Las regiones cromosómicas transcripcionalmente activas se ca
racterizan no solo por un estructura de la cromatina mas abierta sino también por la presencia de nucleosomas con modificación y
composición especifica.
• Tanto la activación como la desactivación comparten dos mecanismos en común:
- La unión de activadores o represores produciendo la activación o inhibición directa de los elementos espacialmente próximos (es
to implica que una secuencia regulatoria puede estar cerca o lejos de la secuencia codificadora; los bucles generados por las histon
as permiten que dos secuencias que se encuentran alejadas en la estructura primaria puedan influirse entre si).
La activación y la represión dada por el sitio de unión de DNA a la proteina puede solaparse, de manera que le llegada de un repre
sor impide la interacción con el activador y viceversa.
- Sitios reclutadores de enzimas (ya sea para la activación o inactivación).
También puede ocurrir que el represor interactúa con el sitio de reclutamiento del complejo enzimático activador.
La activación abarca los siguientes procesos:
- reclutamiento de la HAT, la cual acetila los residuos de Lys de las colas Nt de las histonas). Al ser acetilado pierde sus cargas po
sitivas y produce la descondensación en la cromatina circundante.
- reclutamiento del complejo remodelador de la cromatina, el cual modifica la estructura del nucleosoma, produciendo la apertura
del mismo
- también existen procesos de sustitución de histonas que permiten que la cromatina sea mas laxa, o directamente se eliminan las h
istonas, ambos procesos están mediados por chaperonas.
Existe un mecanismo de metilación de histonas que produce tanto la activación como la represión de la transcripción dependiend
o de qué residuos de lisina en qué histonas son metilados.
• La metilación puede hacer mas resistente al pasaje del DNA de la cromatina condensada a la descondensada. Las histonas que
se encuentran metiladas son capaces de unirse con mayor afinidad al ADN, de manera que hace a dicha region transcripcionalm
ente inactiva.
• También la metilación puede favorecer la descondensación. La histona es metilada (por metilasas especificas de histonas) en lo
s nucleosomas en la Lys (cerca del extremo 5’ de la region codificante y a lo largo de toda la region codificante), facilitando la u
nión de histona acetiltransferasa (HAT), enzimas que acetilan residuos Lys específicos.
Las modificaciones asociadas con la activación transcripcional, principalmente metilación y acetilación, serian reconocidas por en
zimas que hacen que la cromatina sea mas accesible a la maquinaria de la transcripción. En efecto, algunas de las modificaciones s
on esenciales para la interacción con proteinas que juegan un papel clave en la transcripción.
El conjunto de cambios estructurales de la cromatina asociados a la transcripción se generan mediante un proceso denominado re
modelación de la cromatina. Algunas enzimas modifican covalentemente las histonas del nucleosomas. Otros utilizan la energía q
uímica del ATP para reposicionar los nucleosomas en el DNA. Otros, finalmente, alteran la composición en histonas de los nucleo
somas.
La acetilación y la metilación de las histonas juegan un papel destacado en los procesos de activación de la cromatina para la trans
cripción. Los dominios Nt de las histonas internas son generalmente ricos en residuos Lys y Arg, puntos de metilación y acetilació
n.
Las HAT citosólicas (tipo B) acetilan histonas recién sintetizadas antes que sean importadas por el núcleo. El posterior ensamblaj
e de las histonas en cromatina esta facilitado por chaperonas de histonas.
Allí donde la cromatina esta siendo activada para la transcripción, las histonas del nucleosoma se acetilan aun mas por HAT nucle
ares (tipo A). La acetilación de múltiples residuos Lys en los dominios Nt de las histonas H3 y H4 puede reducir la afinidad del nu
cleosoma completo hacia el DNA. La acetilación de residuos Lys concretos es critica para la interacción del nucleosoma con otras
proteinas. Cuando la transcripción de un gen ya no es necesaria., la acetilación de los nucleosomas en la region donde se encuentr
a disminuye por acción de las histonas desacetilasas (HDAC), como parte del proceso general de silenciamiento de genes que rest
ablece el estado transcripcionalmente inactivo de la cromatina. Además de la eliminación de determinados grupos acetilo, nuevas
modificaciones covalentes de las histonas marcan la cromatina como transcripcionalmente inactiva.
EPIGENÉTICA
La metilación en posición 5’ de los residuos citosina de las secuencias CpG es frecuente en el DNA eucariótico, pero el DNA de l
a cromatina transcripcionalmente activa tiende a estar poco metilado. Además, los sitios CpG de genes particulares están a menud
o metilados en las células de los tejidos donde esos genes se expresan que en aquellos en que no se expresan.
La metilación se la considera como un mecanismo de mantenimiento de la expresión génica, en donde se requiere que la expresió
n génica de un determinado gen sea constante en un lapso de tiempo indefinido. De esta manera, la metilación permite un libre acc
eso a la expresión sin necesitar de otra forma regulatoria.
La epigenética se basa en la metilación de las citosinas. Estas metilasas son metilasas de mantenimiento, distinta a las que metilan
a las histonas. La epigenética es un mecanismo de regulación único debido a que son los cambios ambientales lo que desencadena
n la metilación o no de un determinado gen, que a su vez garantiza que la progenie celular, en esa secuencia metilada, también se
va a encontrar metilada. Por lo general, ocurre en células que están a punto de diferenciarse.
RNA DE INTERFERENCIA
En los eucariotas superiores, se ha descubierto una clase de pequeños RNA, denominados microRNA (miRNA), que participa en e
l silenciamiento de muchos genes. Estos RNA actúan interaccionando con el mRNA, a menudo en el 3’UTR, provocando su degra
dación o la inhibición de la traducción. En ambos casos, el mRNA, y por lo tanto el gen que lo produce, es silenciado. Esta forma
de regulación génica controla el desarrollo temporal en al menos algunos organismos. También se utiliza como un mecanismo de
proteccion frente a virus RNA invasores (de especial importancia en las plantas que carecen de sistema inmune) y para controlar l
a actividad de los transposones. Además, estas pequeñas moleculas de RNA juegan un papel fundamental (aunque aun no esta bie
n definido) en la formación de la heterocromatina.
Muchos miRNA están presentes solamente de manera transitoria durante el desarrollo, y a veces se denominan pequeños RNA te
mporales (stRNA). En las eucariotas superiores se han identificado múltiples miRNA diferentes, que pueden influir en la regulaci
ón de algunos genes de los mamíferos. Se transcriben en forma de RNA precursor de unos 70 nucleótidos, con secuencias comple
mentarias internas que forman estructuras en horquilla. Los precursores se cortan con endonucleasas (como Drosha o Dicer) para f
ormar dúplex corto de 20 a 25 nucleótidos de longitud.
Una de las hebras del miRNA maduro se asocia con el mRNA diana (o con el RNA de un virus o de un transposon), provocando l
a inhibición de la traducción o de la degradación del RNA. Algunos miRNA se unen y afectan un único mRNA, con lo que así infl
uyen en la expresión de un solo gen. Otros interactúan con múltiples mRNA y, por lo tanto, constituyen el núcleo del mecanismo
de los regulones que coordinan la expresión de una multiplicidad de genes.
Este mecanismo de regulación génica tiene un aspecto interesante y practico lo que hace sumamente útil. Si se introduce en un org
anismo una molécula de RNA dúplex, correspondiente a la secuencia de prácticamente cualquier mRNA, la endonucleasa Dicer c
orta el dúplex en cortos fragmentos denominados pequeños RNA de interferencia (siRNA). Estos fragmentos se unen al mRNA y
lo silencian. El proceso se conoce como interferencia por RNA (iRNA).
En las plantas, prácticamente cualquier gen puede ser silenciado de esta manera.
Esta técnica se ha convertido rápidamente en una herramienta muy eficaz para estudiar la función génica, porque puede suprimirla
sin necesidad de crear un organismo mutante. Este procedimiento también se puede aplicar en humanos. Se han usado siRNA sint
etizados en el laboratorio para bloquear el VIH y las infecciones por polivirus en células humanas en cultivo durante una semana a
proximadamente. Los rápidos progresos de los estudios sobre el RNA de interferencia presiden un claro uso medico de esta tecnol
ogía.
RNA NO CODIFICANTE
Los RNA de función especializada de los eucariotas incluyen los miRNA, los snRNA (implicados en el splicing), y los snoRNA (i
mplicados en la modificación del rRNA).
Todos los RNA que no codifica para proteinas (incluyendo los rRNA y los tRNA), se lo agrupa bajo el nombre de ncRNA (RNA
no codificante).
Los genomas de los mamíferos parecen codificar mas ncRNA que mRNA codificantes.
La mayoría de los ncRNA interaccionan con proteinas en lugar de con RNA, y afectan la funcion de las proteinas unidas, y/o afec
tan la transcripción de diversas maneras.
CONTROL TRADUCCIONAL
MUCHOS mRNA EUCARIÓTICOS ESTAN SOMERIDOS A REPRESION TRADUCCIONAL
La regulación a nivel de traducción supone un papel mucho mas destacado en los eucariotas que en las procariotas y se observa en
una variedad de situaciones celulares. En contraste con el estrecho acoplamiento entre la transcripción y la traducción en las bacte
rias, los transcritos generados en un núcleo eucariótico tienen que ser modificados y transportados hacia el citoplasma antes de la t
raducción. Ello puede implicar un retraso significativo en la aparición de una proteina.
Cuando se requiere un incremento rápido de la producción de una proteina, un mRNA reprimido traduccionalmente presente en el
citoplasma puede ser activado para que sea traducido sin retraso. La regulación de la traducción puede desempeñar un papel espec
ialmente importante en la regulación de ciertos genes eucarióticos muy largos, para los que la transcripción y la maduración del m
RNA puede requerir muchas horas. Algunos genes se regulan tanto en las etapas de transcripción como de traducción, estando im
plicada esta ultima en el ajuste preciso de los niveles de proteinas celulares. En algunas células anucleadas, tales como los reticulo
citos (eritrocitos inmaduros), el control de la transcripción es totalmente inasequible y el control de la traducción de los mRNA al
macenados se convierte en esencial.
Los controles de la traducción pueden tener también un significado espacial durante el desarrollo, donde la traducción regulada de
mRNA pre posicionados crea un gradiente local del producto proteico.
Los eucariotas tienen al menos cuatro mecanismos principales de regulación de la traducción:
• Los factores de inicio de la traducción están sujetos a fosforilación por proteinas quinasas. Las formas fosforiladas son menudo
menos activas y causan una depresión general de la traducción en la célula.
• Algunas proteinas se unen directamente al mRNA y actúan como represores de la traducción y muchas se unen a sitios específic
os de la region 39 no traducida (39UTR).
Una vez posicionadas, interaccionan con otros factores de inicio de la traducción unidos al mRNA o con la subunidad ribosómica
40S para impedir el inicio de la traducción.
• Proteinas de unión, presentes en las eucariotas desde las levaduras hasta los mamíferos, impiden la interacción entre eIF4E y el e
IF4G. Las proteinas de los mamíferos se denominan 4E-BP (proteinas de unión eIF4E). Cuando el crecimiento celular es lento, est
as proteinas limitan la traducción uniéndose al sitios de eIF/E que normalmente interacciona con eIF4G. Cuando se reanuda o aum
enta el crecimiento celular en respuesta a factores de crecimiento u otros estímulos, las proteinas de unión se inactivan mediante f
osforilación dependiente de proteinas quinasas.
La regulación de la expresión génica dirigida por RNA, a menudo se produce a nivel de la represión de la traducción.
CONTROL POSTRADUCCIONAL
Modificaciones, plegado y control de calidad de las proteínas en el RE
Las proteínas de membrana y secretorias solubles sintetizadas en el RER son sometidas a cuatro modificaciones principales antes
de alcanzar sus destinos finales:
1) agregado y procesado de hidratos de carbono (glucosilación) en el RE y el Golgi.
2) formación de puentes disulfuro en el RE.
3) plegado apropiado de las cadenas de polipéptidos y ensamblaje de proteínas compuestas de subunidades múltiples en el RE.
4) cortes proteolíticos específicos en el RE, el Golgi y las vesículas secretorias.
A la inmensa mayoría de las proteínas que se sintetizan en el RER se le agregan una o más cadenas de hidratos de carbono; de hec
ho, la glucosilación es la principal modificación química que sufre la mayor parte de estas proteínas. La cadena de hidrato de carb
ono de las glucoproteínas puede unirse al grupo hidroxilo de la serina y treonina o al nitrógeno de la amida de la asparagina. Estas
cadenas son llamadas oligosacáridos O-ligados y N-ligados, respectivamente.
• los oligosacáridos O-ligados a menudo contienen sólo uno a cuatro residuos de azúcar.
• los oligosacáridos N-ligados son más frecuentes, más grandes y más complejos, y contienen varias ramas en las células de mamí
fero.
Después de la glucosilación inicial de una proteína en el RE, la cadena del oligosacáridos es modificada en el RE y normalmente t
ambién en el Golgi.
La formación de puentes disulfuro, el plegado de proteínas y el ensamblaje de proteínas multiméricas, que tienen lugar exclusivam
ente en el RER, es de vital importancia: sólo las proteínas plegadas y ensambladas adecuadamente son transportadas del RER al
complejo de Golgi y por último a la superficie celular u otro destino final. Las proteínas desplegadas, mal plegadas o parcialmente
plegadas y ensambladas son retenidas selectivamente en el RER.
Las secuencias de señalización hacia el RE del N-terminal son escindidas de las proteínas secretorias y de las proteínas de membra
na tipo I en el RE. Algunas proteínas también son sometidas a otros cortes proteolíticos específicos en el complejo de Golgi o en l
as vesículas secretorias en formación.
Los puentes disulfuro son formados y reordenados por proteínas de la luz del RE
Los enlaces disulfuro (-S-S-) intramoleculares e intermoleculares ayudan a estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria de much
as proteínas. Estos enlaces covalentes se forman por el enlace oxidativo de grupos sulfhidrilo (-SH), también conocidos como gru
pos tiol, existentes en dos residuos de cisteína de la misma o diferentes cadenas polipeptídicas. Esta reacción puede tener lugar esp
ontáneamente sólo cuando hay un agente oxidante adecuado. En las células eucariotas, los puentes disulfuro se forman sólo en la l
uz del RER; en las células bacterianas, se forman en el espacio periplasmático entre la membrana interna y externa. Por lo tanto, l
os enlaces disulfuro sólo se encuentran en las proteínas secretorias y en los dominios exoplasmáticos de las proteínas de membran
a. Las proteínas citosólicas y las proteínas de los organelas sintetizados en los ribosomas libres carecen de enlaces disulfuro y dep
enden de otras interacciones para estabilizar sus estructuras. La formación eficiente de enlaces disulfuro en la luz del RE depende
de la enzima disulfuro isomerasa de proteínas (PDI) presente en todas las células eucariotas. Esta enzima es especialmente abunda
nte en el RE de las células secretorias de órganos como el hígado y el páncreas, donde se producen grandes cantidades de proteína
s que contienen puentes disulfuro. El puente disulfuro en el sitio activo de la PDI puede transferirse con facilidad a una proteína p
or dos reacciones secuenciales de transferencia de tiol-disulfuro. La PDI reducida generada por esta reacción vuelve a su forma ox
idada por la acción de una proteína residente en el RE, denominada Ero 1, que lleva un puente disulfuro que puede transferirse a la
PDI.
En las proteínas que contienen más de un puente disulfuro, el apareamiento apropiado de los residuos de cisteína es esencial para a
segurar una estructura y actividad normales. Por lo general, los puentes disulfuro se forman entre cisteínas que se encuentran segui
das en la secuencia de aminoácidos mientras un polipéptido todavía está creciendo en el ribosoma. Sin embargo, esta formación se
cuencial algunas veces produce puentes disulfuro entre cisteínas que no corresponden.
En las células, la redisposición de los enlaces disulfuro también es acelerada por la PDI, que actúa sobre un amplio rango de sustra
tos proteicos, permitiéndoles alcanzar su estructura termodinámicamente más estable. Los puentes disulfuro suelen formarse en un
orden específico, estabilizando primero dominios pequeños de un polipéptido y luego las interacciones de segmentos más distante
s.
Las chaperonas y otras proteínas del RE facilitan el plegado y el ensamblaje de las proteínas
Aunque algunas proteínas reducidas desnaturalizadas pueden plegarse espontáneamente a su estado nativo in vitro, este plegado s
uele requerir horas para completarse. En cambio, las nuevas proteinas solubles y de membrana producidas en el RE se pliegan hast
a alcanzar su estructura adecuada minutos después de su síntesis. El plegado rápido de estas proteínas recién sintetizadas en las cél
ulas depende del efecto secuencial de varias proteínas presentes dentro de la luz del RE.
• La chaperona BiP puede manejar la translocación postraduccional en las levaduras, uniéndose a los polipéptidos totalmente sinte
tizados a medida que ingresan en el RE. La BiP también puede unirse tempranamente a las cadenas nacientes; cuando ingresan en
el RE durante la translocación cotraduccional. BiP unida impide que segmentos de una cadena naciente se plieguen mal o formen
agregados, promoviendo así el plegado de todo el polipéptido en su estructura apropiada.
• La disulfuro isomerasa de proteínas (PDI) también contribuye al plegado apropiado, que en muchas proteínas se estabiliza por lo
s puentes disulfuro.
• Otras dos proteínas del RE, los homólogos de lectinas (proteínas ligadoras de h1dratos de carbono) calnexina y calrreticulina, se
unen selectivamente a ciertos oligosacáridos N-ligados en las cadenas nacientes en crecimiento. El ligando para estas dos lectinas,
que contienen un solo residuo de glucosa, se genera por una glucosiltransferasa específica presente en la luz del RE. Esta enzima s
olo actúa sobre cadenas polipeptídica que están desplegadas o mal plegadas. La unión de la calnexina y la calrreticulina a las cade
nas nacientes desplegadas impide la agregación de segmentos adyacentes de una proteina mientras se esta sintetizando en el RE. A
sí, la calnexina y la calrreticulina, como el BiP, previenen el plegado prematuro incorrecto de segmentos de una proteína recién si
ntetizada.
• Otras enzimas importantes del plegado de las proteínas en la luz del RE son las peptidil-prolil isomerasas, una familia de enzima
s que aceleran la rotación alrededor de los puentes peptidil-prolil en los segmentos del plegado de un polipéptido:
Estas isomerizaciones a veces son el paso que limita la velocidad de plegado de los dominios de las proteínas
Muchas peptidil-prolil isomerasas pueden catalizar indiscriminadamente la rotación de los puentes peptidil-prolil isomerasas expu
estos en numerosas proteínas, pero algunas tienen sustratos proteicos muy específicos.
Las proteínas tipo silvestre (wild type) que se sintetizan en el RER no pueden abandonar este compartimiento hasta que alcanzan s
u estructura completamente plegada. En forma similar, casi cualquier mutación que impide el plegado apropiado de una proteína e
n el RE también bloquea el desplazamiento del polipéptido de la luz del RE o de la membrana al complejo de Golgi. Es probable q
ue los mecanismos para retener las proteínas desplegadas o plegadas incompletamente dentro del RE aumenten la eficacia global d
el plegado manteniendo las formas intermedias en proximidad de los enzimas de plegado, que son muy abundantes en el RE. Por l
o general, las proteínas plegadas inadecuadamente retenidas dentro del RE se unen en forma permanente a las chaperonas del RE
BiP y calnexina. Así, estas enzimas luminales de plegado tienen dos funciones relacionadas: ayudan al plegado de las proteínas no
rmales impidiendo su agregación y se unen a proteínas irreversiblemente mal plegadas. Las células de mamíferos y las levaduras r
esponden a la presencia de proteínas desplegadas dentro del RER aumentando la transcripción de varios genes que codifican chap
eronas del RE y otros enzimas de plegado.
A menudo las proteínas no ensambladas o mal plegadas presentes en el RE son transportadas al citosol para su degradación
Las proteínas secretorias y de membrana mal plegadas, así como las subunidades de proteínas multiméricas no ensambladas, a me
nudo se degradan una hora o dos después de su síntesis en el RER.
Las proteínas secretorias y de membrana mal plegadas son transportadas fuera de la luz del RE, siguiendo un camino "al revés" a t
ravés del translocón, hacia el citosol, donde son degradadas por la vía proteolítica mediada por la ubiquitina.. La enzimas ubiquiti
nilantes localizadas en la superficie citosólica del RE agregan ubiquitina a las proteínas mal plegadas del RE cuando salen de éste.
Esta reacción, que se acompaña por hidrólisis de ATP, puede proporcionar parte de la energía necesaria para llevar estas proteínas
nuevamente al citosol. Los polipéptidos poliubiquitinilados resultantes son rápidamente degradados en los proteosomas.
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TECNICAS RELACIONADAS CON EXPRESIÓN GÉNICA
• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA BETA G
ALACTOSIDASA
Se hace uso de una medida indirecta. Se utiliza como un sustrato que sea reconocido por la enzima (el X-gal) para dar un producto
coloreado (X, azul). La intensidad del color será proporcional a la actividad de la enzima. Esto solo se cumple en condiciones de s
ustrato saturantes. Se utiliza como unidad enzimática a las unidades Miller.
UM = 1000 × DO480/ t v DO600
donde:
t = tiempo de reacción (en min)
v = volumen del cultivo usado en el ensayo (en mL)
La fracción DO480/DO600 representa indirectamente al numero de mRNA del operón lac generados con respecto al numero de bac
terias. Esto es necesario ya que permite estandarizar el numero de mRNA generados, en promedio, por bacteria.
De no ser así, se podría cometer un error al suponer que una muestra genera mayor numero de mRNA que otra muestra a una dete
rminada condición cuando en realidad, no es que haya mas inducción del operón lac sino que el numero de bacterias es mayor y p
or ende va haber mayor coloración.
Por lo general se utiliza como inductor al IPTG y como sustrato colorimétrico al ONPG, el cual genera una coloración amarillenta.
Se utiliza la propiedad de que el ONPG en medio básico se desprotona aumentando su absorbancia en una longitud de onda de 42
0. El medio básico, a su vez, desestabiliza a la beta-galactosidasa de manera que también se detiene la reacción. Se utiliza al Na2C
O3 como medio para alcalinizar.
DISEÑO DE SONDAS:
Las sondas se arman con transcriptasa reversa empleando ramdom primers, que son oligonucleótidos sintetizados químicamente d
e 6 nucleótidos ordenados al azar, de manera que son fragmentos inespecíficos que se aparea con cualquier RNA.
Los nucleótidos deben estar marcados, generalmente de forma radiactiva.
Otra forma de marcar sondas es empleando nucleótidos que tienen biotina el cual interactúa con la estreptavidina, el cual está unid
a a una enzima cuya reacción que cataliza genera un producto fluorescente o coloreado.
NORTHERN BLOT:
• Se toma alícuotas a distintos tiempos.
• Se centrifuga
• Buffer de lisis
• Extracción de RNA
• Corrida electroforética: desnaturalizante, agregado de agente renaturalizante y un agente intercalante para revelar (corrida por ta
maño). Habrá una chorreado de RNA con algunas bandas mas prominentes. Estos son los mas estables o con mas t medios mas gr
andes. Se observara bandas mas prominentes correspondientes al rRNA debido a que son mas estables.
• Empleando un papel de nitrocelulosa se realiza una impresión del patrón. Se hace una pre-hibridación para evitar interacciones i
nespecíficas. Se agrega la sonda marcada y se revela.
CONTROL INTERNO
Permite normalizar el gen de interés. Esto es, permite saber las proporciones que se transcriben en determinadas condiciones por e
jemplo en presencia de hormonas.
La cuantificación exacta de los niveles de ARNm requiere la normalización del gen de interés para un gen con niveles transcripcio
nales que no varían a través del ciclo celular o con un tratamiento particular.
Los cambios en la expresión bajo determinadas condiciones debe ser normalizado empleando housekeeping genes. Estos son gene
s que se expresan en todos los tejidos, aproximadamente en la misma proporción (genes constitutivos). Estos no presentan una reg
ulación extra (ni represores ni activadores) de manera que su la concentración de mRNA es independiente de las condiciones celul
ares.
Los genes que se utilizan como estándar son: la actina, G3PD, albúmina, entre otros.
El aumento de veces corregido es igual es igual a la razón entre lo incremento el gen target y lo que incremento el gen housekeepi
ng, en unidades arbitrarias (absorbancia, fluorescencia, radiactividad, etc).
DOT BLOT
Se prepara un cultivo de bacterias con un medio que tiene uridina tritiada.
• Se toma alícuotas a distintos tiempos.
• Se centrifuga
• Buffer de lisis
• Extracción de RNA
• Se usa DNA no marcado ligado al soporte solido, luego se lava todo el RNA no marcado.
Se apreciada en las placas un aumento de la marca proveniente del mRNA radiactivo a medida que aumenta el tiempo, hasta que s
e mantiene constante.
RT-qPCR
La PCR a tiempo real o PCR cuantitativa es una variación de la PCR estándar utilizada para la cuantificación de DNA o de RNA
mensajero (mRNA) de una muestra. Utilizando primers específicos de secuencia, es posible determinar el número de copias o la c
antidad relativa de una determinada secuencia de DNA o RNA. Cuando la PCR a tiempo real se combina con una reacción de retr
o-transcripción o RT (RT-PCR), puede determinarse la cantidad de mRNA de una muestra mediante una cuantificación relativa.
Dicha cuantificación se denomina relativa ya que se compara entre diferentes muestras (tejidos, tratamientos, etc) la cantidad relat
iva o relación del mRNA de un gen específico respecto a la cantidad de mRNA de un gen constitutivo (control endógeno).
Para la cuantificación, se mide en cada ciclo de PCR la cantidad de amplicón producido. La cuantificación del producto se produc
e mediante la adición de fluoróforos que se unen al amplicón de forma cuantitativa, de forma que a mayor producto mayor fluores
cencia se emitirá. Los sistemas de PCR a tiempo real detectan la cantidad de fluorescencia producida en cada ciclo de PCR y los
softwares de análisis representan dicha fluorescencia gráficamente respecto al número de ciclos. La cantidad de amplicón produci
do es proporcional al número de moléculas de RNA/DNA iniciales, de forma que en aquellas muestras con mayor expresión del
gen el amplicón fluorescente aparecerá en ciclos anteriores.
Tipos de fluoróforos
Se utilizan principalmente dos tipos de fluoróforos.
• SYBR Green o Eva Green: se unen al DNA de doble cadena de manera inespecífica.
El SYBR Green o el Eva Green se unen inespecíficamente al DNA de doble cadena y producen fluorescencia. Estos fluoróforos n
o son específicos ya que se unen a toda molécula de DNA de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer. El uso de
SYBR Green o Eva Green implica un diseño muy cuidadoso de los primers con el fin de evitar dímeros de primer, y e
vitar la amplificación de DNA genómico contaminante en la muestra de cDNA, para ello, deben diseñarse los primers de
forma que el amplicón contenga secuencias de diferentes exones.
• Sondas de hidrólisis TaqMan-MGB o UPLs: se unen al DNA doble cadena de manera especifica.
Esta técnica permite la cuantificación específica del cDNA de interés incluso en la presencia de amplificación inespecífic
a (dímeros de primer, DNAg).
Controles endógenos
La medida de la expresión génica por medio de RT-PCR es una cuantificación relativa, en la que se compara entre las diferentes
muestras la expresión del gen objeto de estudio respecto a la expresión de un gen constitutivo cuya expresión no varía en las condi
ciones del experimento (control endógeno). Es lo que se denomina como normalización de la expresión del gen específico, o norm
alizar respecto a la diferente concentración de RNA total de las muestras, ya que si la cantidad de control endógeno varía es debid
o a cambios en la cantidad de RNA total empleada en la síntesis de cDNA, no a cambios en su expresión. Es el mismo control qu
e se hace en Northern blot.
EMSA
ENSAYO DE FOOTPRINTING
Se utiliza para identificar las secuencias de DNA a las que se une una proteina determinada. Se aísla un fragmento de DNA que su
puestamente contiene secuencias reconocidas por un proteina de unión al ADN y se marca radiactivamente un extremo de una de l
as secuencias.
Por lo general, esto se logra tratando un conjunto de fragmentos de restricción mas largos con una enzima que fija marcadores en
ambos extremos y, despues, se cortan estas moleculas marcadas con una segunda enzima de restricción y se purifica uno de los co
njuntos de fragmentos terminales.
A fragmentos continuación se utilizan reactivos químicos o enzimáticos para introducir roturas al azar en el fragmento de DNA (d
ebe estar a punto para que haya de promedio, un corte por molécula). La separación de los productos de corte radiactivos (fragmen
tos rotos de distintas longitudes) mediante electroforesis de alta resolución produce una “escalera” de bandas radiactivas. En un tu
bo aparte se repite el procedimiento de corte con el fragmento de DNA original al que se ha unido la proteina. Los dos conjuntos d
e productos de corte se analizan y comparan por electroforesis. En la “escalera” de bandas radiactivas obtenidas de la muestra que
contiene la proteina se observa un agujero (huella), atribuible al DNA protegido por la proteina unida, que identifica las secuencia
s reconocidas pro la proteina.
Se puede determinar la localización precisa del sitio de unión de la proteina por secuenciación directa del mismo fragmento de DN
A, incluyendo los carriles de secuenciación en el mismo gel que la huella.
• DISEÑO DE PLÁSMIDOS
TRANSCRIPCION IN VITRO
No se puede obtener RNA in vitro porque el mismo es muy inestable. Solo puedo hacerlo en un plásmido, empleando la polimeras
a de T7 (un bacteriófago)
Se puede realizar un ensayo para saber si el RNA es autocatalíticos:
En dos muestras de RNA obtenidas de bacterias transformadas con este plásmido, se agregan NTPs. Si sufren procesamiento son
del tipo autocatalíticos, para saber si son del tipo I o II se sigue el siguiente razonamiento:
Si en el tubo I (sin NTP): no hubo procesamiento
ACCESIBILIDAD DE LA DNAasa I
Permite evaluar que genes dejan de ser transcripcionalmente activos o al revés (genes que eran inactivos y pasan a ser activos ) en
células que se diferenciaron o en diferentes tejidos celulares.
- Se prepara cromatina descondensada de eritroblastos , y se prepara cromatina condensada de eritrocitos.
El gen de la beta-globina se encuentra en el mismo tramo de DNA, por lo que se puede cortar el gen de interés con enzimas de rest
ricción.
Se agregan [DNAasa I] en concentraciones ascendentes en ambas muestras.
A medida que aumenta la concentración de DNAasa I una de las dos bandas ira desapareciendo como producto de su degradación
(es el caso del DNA descondensado), mientras que la banda del DNA que esta condensado se mantendrá aprox igual en todas las c
oncentraciones empleadas.
• PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: DISEÑO DE MUTANTES POR DELECION CON UNA CONSTRUCCION REPOR
TERA PARA LA DETECCION DE DOMINIOS FUNCIONALES
La construcción deberá contener un gen reportero como lacZ y una caja TATA ligada a un elemento regulador (R) que contiene v
arios sitios de unión para un factor de transcripción (FT) (generalmente activador, pero también sirve para represores transcripcion
ales).
Las construcciones del gen reportero y el DNA que codifica al factor de transcripción de tipo silvestre o mutante (eliminado) fuero
n introducidas simultáneamente en células eucariotas mutantes para FT y se analiza la actividad de la beta-galactosidasa expresada
a partir de lacZ. La actividad será más alta si el DNA de R introducido codifica una proteína funcional.
Las deleciones (eliminaciones) de los aminoácidos N-terminales en un dado punto anulan la capacidad de FT para unirse a la R y
para de estimular la expresión de la beta-gal a partir del gen indicador.
También se hacen deleciones en el extremo C-terminal.
De esta manera se puede localizar el dominio de unión al DNA en el N-terminal de la region R. La capacidad para activar la expre
sión de la beta-galactosidasa no se elimina totalmente a menos que se suprima alguna región comprometida funcionalmente.
Diseño: se realiza una RT-PCR para obtener cDNA doble cadena. Se prepara de manera tal que contenga todos los elementos de
un gen, es decir, un ORF, las regiones no traducibles 5’ y 3’ UTR, el promotor y el ter.
Tanto el promotor como el ter pueden ser pertenecientes a la de la RNApol T7, que mediante por transcripción in vitro, se obtiene
una gran cantidad de mRNA. En primer lugar se incorpora el fragmento de cDNA en un plásmido con todas sus elementos, y por t
ransformación, se emplea la maquinaria enzimática para la amplificación.
Una vez obtenido el plásmido, mediante traducción in vivo empleando aminoácidos marcados, y finalmente se agregan las mitoco
ndrias.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Una de las enzimas base para producir y propagar una molécula de DNA recombinante son las enzimas de restricción.
Las endonucleasas de restricción (o enzimas de restricción) reconocen y cortan el DNA en secuencias especificas (sitios de restric
ción), generando una serie de fragmentos mas pequeños.
Las endonucleasas de restricción se encuentran en muchas especies bacterianas, y su funcion es reconocer y cortar DNA foráneo (
procedente de otro lugar), como puede ser el caso de DNA de un virus infeccioso. En el DNA de la célula huésped, la secuencia re
conocida por la propia endonucleasa de restricción esta protegida de la digestión (el corte por parte de la endonucleasa) por metila
ción del DNA, catalizada por una metilasa de DNA especifica (la metilación evita que las endonucleasas corten el DNA propio de
la bacteria). El conjunto formado por la endonucleasa de restricción y la metilasa correspondiente se conoce a veces como sistema
de modificación-restricción.
Hay tres tipos de endonucleasas de restricción, designados como I, II, y III. Los tipos I y III son grandes complejos formados por
múltiples subunidades que contienen, simultáneamente, las actividades endonucleasa y metilasa.
• Las endonucleasas de restricción tipo I (ERI) cortan el DNA al azar, en lugares que pueden encontrarse a 1000 pb o mas de la se
cuencia de reconocimiento.
• Las endonucleasas de restricción tipo III (ERIII) cortan el DNA a unos 25 pares de bases de la secuencia de reconocimiento.
Ambos tipos de enzimas se mueven a lo largo del DNA mediante un mecanismo que necesita ATP.
• Las ERII son mas sencillas no necesitan ATP y cortan el DNA en la misma secuencia de reconocimiento.
Las secuencias reconocidas tienen normalmente de 4 a 6 pares de bases y son palindrómicas.
Una secuencia palindrómica es una secuencia de ácido nucleico (DNA o RNA) que es lo mismo si se lee de 5' (cinco-prima) a 3' (t
res prima) en un filamento o de 5' a 3' en el filamento complementario, con el cual se forma una doble hebra.
Algunas endonucleasas de restricción realizan cortes indentados en las dos hebras del DNA, que dejan de dos a cuatro nucleótidos
desapareados en cada extremo resultante. Se denominan extremos cohesivos, ya que pueden aparearse entre si o con extremos co
hesivos complementarios de otros fragmentos de DNA. Otras endonucleasas de restricción cortan ambas hebras del DNA en los e
nlaces fosfodiéster opuestos, y no dejan bases desapareadas en ningún extremo; estos extremos se denominan extremos romos.
El tamaño medio de los fragmentos producidos al cortar DNA genómico con una determinada endonucleasa de restricción en la m
olécula de DNA, que a su vez, depende en buena medida del tamaño de la secuencia de reconocimiento.
OBTENCION DE GENES POR ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Se extrae gDNA de cualquier tejido, ya que el genoma es el mismo en todos los tejidos. Considerar que las células de ese tejido de
be tener núcleo. Al conocer la secuencia del gen y la secuencia de sus partes flanqueantes, se puede aislar, empleando cortes con e
nzimas de restricción de manera que el gen no se vea afectado. De esta manera, se realiza una digestión parcial, obteniendo fragm
entos de dsDNA.
Una vez obtenido el gen, el numero de copias de este segmento de DNA puede amplificarse enormemente con la PCR.
Uno de los problemas que tiene la obtención de genes por PCR, es que luego de obtener el gen amplificado, se necesita emplear e
nzimas de restricción para acoplarlo a un pDNA, lo cual es critico, ya que si se emplea una enzima de restricción hay que asegurar
se que la secuencia de restricción no se encuentre en el gen de interés.
Se tienen que cumplir tres requisitos para que funcione luego el vector:
1- En primer lugar tiene que haber una secuencia que pueda ser reconocida por la enzima de restricción.
2- En segundo lugar la secuencia de restricción no debe estar incluida en el gen, ya que de ser así, la enzima rompería el gen.
3- En tercer lugar, que el DNA se aparee de manera correcta al plásmido. Esto es importante cuando se quiere expresar el gen, de
manera que el gen sea codificante a una proteina funcional. Da lo mismo la orientación de como se inserta el gen, si solamente se
quiere clonar.
Una forma muy utilizada que solucionan estos problemas, consiste en el diseño y síntesis de primers de manera que contengan el s
itio de corte de una endonucleasa de restricción (como extremos cohesivos).
Esto se utiliza debido a que los productos de PCR presenta en su secuencia los primers, de tal forma que en la secuencia también v
a a estar incorporado la secuencia de restricción.
Si por ejemplo, estamos en el tercer ciclo de la PCR, donde tenemos 8 moléculas de DNA, se ve que los primers se encuentran inc
orporados en el gen de interés. Luego del 30 ciclos, habrán 1 × 109 de estos fragmentos, mientras que solo 6 × 102 fragmentos de l
ongitud variable.
Los extremos cohesivos para mayor seguridad deben hacerse para dos enzimas de restricción diferentes, de manera que solo una d
irección sea la que se pueda aparear con el vector. Es por este motivo que los vectores actualmente poseen secuencias con sitios d
e reconocimiento para varias enzimas de restricción (sitio múltiple de clonado o polylinker).
Por otro lado, emplear dos enzimas de restricción ahorra un paso siguiente: el empleo de la fosfatasa alcalina. Si se emplea una úni
ca enzima de restricción, la probabilidad de que haya recircularización de la enzima sin haber ligado el DNA amplificación es mu
y alta, principalmente por la cercanía de los extremo, y por tratarse de una reacción unimolecular.
La fosfatasa alcalina elimina los grupos fosfatos del plásmido de manera que no hay productos de religación, y la inserción ocurre
porque los fosfatos son aportados por el inserto, lo cual permite la formación del enlace fosfodiéster catalizado por la ligasa. El pr
oblema de la fosfatasa alcalina es que luego hay que inactivar la enzima.
Por ello, para evitar recircularización se debe emplear una [DNA]amplificado >> [DNA]plásmido en una proporción 3 : 1.
El vector de clonación ya tiene el polylinker que viene con varias secuencia de restricción. Por ejemplo:
5' AGGGAAAAGGCCATAACGAT CTA CT TAGCTA …(450 pb)… CTCAGCCGTATCGTTATCAC TCC CGTATGGA 3'
3' TCC CT TTT CCGGTATTGCTAGATGAATCGAT …(450 pb)… GAGTCGG CATAGCAATTG TG AGGGCATACCT 5'
Si se tiene el fragmento de interés dentro de 450 pb, se podrían plantear los primers como secuencias complementarias a las secue
ncias que están en negrita para hacer la PCR, siendo las bases marcadas con negro las regiones que no se van a aparear y van a co
ntener en su lugar los sitios de restricción. De esta manera, el producto de PCR contiene la secuencia de restricción. Los primers p
or lo general son oligonucleótidos de no mas de 20 nucleótidos.
El diseño de primers consiste en hacer complementario los nucleótidos que se apareen por su lado 3’, de manera que pueda trabaja
r la DNApol (un % elevado de GC ayuda en la estabilidad del apareamiento primer-gen). El extremo 5’ va a contener la secuencia
de restricción que no va a ser complementario (es muy poco probable encontrar una secuencia de restricción en particular flanquea
ndo al gen de interés). El extremo 5’ no es necesario que se encuentre apareado porque la DNApol empieza a sintetizar del extrem
o 3’.
Primer directo: 5' AAGTCGGATCTACTTAGCTA 3'
Primer inverso: 5' AAGTAAACGATACGGCTGAG 3'
Los segmentos en cursiva son los sitios de restricción
Una vez obtenidos los fragmentos se procede a la purificación:
Se emplean geles de agarosa. Como las fragmentos a replicar son de unos 450 pb, y los primer a usar son de 20 pb cada, se esperar
ían bandas de 470 pb aprox. En el caso de dar, positivo, para aislarlo:
- Se puede eluir el fragmento de la agarosa.
- Emplear directamente el tubo de PCR.
Este depende de la cantidad de muestra que se necesite, y del grado de purificación.
En el caso de haber muchas bandas en el gel, para usar directamente del tubo de PCR se debe purificar.
ANALISIS DE GENOTECAS
Tanto las bibliotecas como las bibliotecas de cDNA de diversos organismos contienen cientos de miles a mas de un millón de clon
es individuales en el caso de las eucariotas superiores. Se dispone de dos metodologías generales para realizar búsquedas en biblio
tecas a fin de identificar clones específicos que porten un gen u otra region de DNA de interés:
1- la detección con sondas de oligonucleótidos que se unen al clon de interés.
2- la detección basada en la expresión de la proteina codificada.
=> HIBRIDACION:
La base para la detección con sondas de oligonucleótidos es la hibridación, la capacidad de moléculas de DNA o RNA de hebra si
mple complementarias de asociarse (hibridar) específicamente entre si mediante el apareamiento de bases. El DNA de hebra doble
(dsADN) puede ser desnaturalizado para obtener DNA simple hebra (ssADN) por calentamiento en una solución salina diluida. S
i luego la T se baja y se eleva la concentración de iones, el ssADN se reasociarán para formar el ssADN.
En una mezcla de ácidos nucleicos, solo las hebras de cDNA se reasociarán; mas aun, la extensión de su reasociación no se ve casi
afectada por la presencia de hebras no complementarias.
En esta técnica se utiliza una sonda de ssADN para detectar los fragmentos de DNA en una mezcla que son complementarios a la
sonda.
Primero se desnaturaliza la muestra de DNA y se adhieren las hebras simples a un soporte solido, por lo común un filtro de nitroce
lulosa o una membrana de nailon tratada. Luego se incuba la membrana en una solución que contiene una sonda marcada radiactiv
amente. En condiciones de hibridación (cerca del pH neutro, 40-65 °C; 0,3-0,6 M NaCl), esta sonda marcada se hibrida a cualquie
r hebra de acido nucleico complementaria fijada a la membrana. Cualquier exceso de sonda no hibridada se elimina por lavado y l
os híbridos marcados se detectan mediante autorradiografía del filtro.
VECTOR DE EXPRESIÓN
Los vectores de expresión son vectores de clonación que poseen toda la información necesaria para expresar una secuencia amino
acídica.
Las moléculas de cDNA son las que se va a insertar en vectores que favorezcan su expresión eficiente en hospedadores. Para cons
eguir un grado máximo de transcripción, el cDNA se inserta en el vector con la pauta de lectura correcta y cerca de un promotor b
acteriano muy activo. Además, estos vectores aseguran una traducción eficiente porque codifican en el mRNA, cerca del codón de
iniciación, una secuencia de unión de ribosomas. Los clones que contienen cDNA se pueden analizan en base a su capacidad para
sinterizar una proteina ajena a las bacterias.
B- Vector de expresión
Elementos:
- Los mismos que los que tiene un vector de clonación
- Promotor: sitio de unión de la RNApol
- Terminador: sitio de terminación de la transcripción
- Sitio de unión a ribosomas (RBS): se une la subunidad menor del ribosoma en el momento de iniciarse la traducción.
- En algunos casos, hay primers universales.
Se define como:
ET = N° de colonias transformantes/ug de DNA dador.
FT = (N° de colonias transformantes/N° de colonias viables) × 100
El numero de colonias viables se calcula como UFC × D × F, siendo D el factor de dilución de las diluciones seriadas 1/10 y F es l
a fracción de siembra, es decir, el cociente entre lo que se sembró y el volumen total de la mezcla.
• Para el caso de los fagos, el sistema es otro. Una vez los fragmentos del bacteriófago lambda han sido ligados con fragmentos de
DNA foráneo de tamaño adecuado, los DNA recombinantes resultantes se empaquetan en partículas de fago añadiendo un extract
o crudo de células bacterianas que contenga todas aquellas proteinas necesarias para ensamblar un fago completo. Esta operación r
ecibe el nombre de empaquetamiento in vitro. Todas las partículas de fago viables contendrán un fragmento de DNA foráneo. La t
ransmisión ulterior del DNA recombinante a células de procariotas es muy eficiente.
• Los BAC son introducidas en las bacterias huésped por electroporación. Las bacterias huésped usadas con los BAC recombinant
es tienen mutaciones que afectan la estructura de la pared bacteriana que facilitan la incorporación de estas grandes moléculas de
DNA.
=> TRANSFECCIÓN
Una desventaja de los sistemas de expresión bacterianos es que muchas proteínas eucariotas sufren diversas modificaciones despu
és de su síntesis sobre los ribosomas. Estas modificaciones postraduccionales suelen ser necesarias para el funcionamiento celular
normal, pero no pueden ser introducidas por las células de procariotas, que carecen de las enzimas necesarias. Para superar esta li
mitación, los genes clonados son introducidos en células animales cultivadas, un proceso llamado transfección (la transfección es l
a transformación no viral de células animales).
Dos métodos comunes para transfectar células animales difieren en si el DNA vector recombinante está integrado o no al gDNA d
e la célula huésped. En ambos métodos, las células animales cultivadas deben ser tratadas para facilitar la incorporación inicial de
un vector plasmídico recombinante. Esto puede hacerse al exponer células a una preparación de lípidos que penetran en la membra
na plasmática, incrementando su permeabilidad al DNA. En forma alternativa, puede aplicarse a las células un pulso eléctrico brev
e de varios miles de voltios, una técnica conocida como electroporación, que las hace transitoriamente permeables al DNA. El pD
NA suele añadirse en una concentración suficiente como para asegurar que una gran proporción de las células cultivadas reciba al
menos una copia.
=> Transfección transitoria
El más simple de los dos métodos de expresión, llamado transfección transitoria, emplea un vector similar a los vectores lanzadera
s de levadura. Para usarlos en las células de los mamíferos, los plásmidos son también diseñados para tener un origen de replicació
n derivado de un virus que infecta esas células, un promotor fuerte reconocido por la RNApol de mamíferos y el cDNA clonado, q
ue codifica la proteína por ser expresada, adyacente al promotor.
Una vez que ese plásmido penetra en una célula de mamífero, el origen de replicación viral le permite replicarse con eficiencia, lo
que genera numerosos plásmidos a partir de los cuales se expresa la proteína. Sin embargo, durante la división célula esos plásmid
os no son segregados fielmente en ambas células hijas y con el tiempo, una fracción sustancial de las
células en un cultivo no contendrán el plásmido, de ahí el nombre de transfección transitoria.
TRANSCRIPCION
1 – Realice un esquema del proceso de transcripción señalando:
• ¿Qué es una unidad transcripcional?
• ¿Cuáles son los elementos necesarios para la transcripción?
• Los productos de transcripción en un procariota y su diferencia con un eucariota.
• Indicar cual es la hebra molde y cual la hebra codificante. Incluir sus polaridades durante la transcripción.
• Incluir también la RNApol y señalar la dirección de avance de la misma.
TRADUCCION
1 - Realice un esquema del proceso de traducción señalando:
• Sobre el mRNA, los polipéptidos que se obtienen por acción de dos ribosomas traduciendo simultáneamente.
• Incluir la polaridad de la cadena polipeptídica.
• Incluir la dirección de avance del ribosoma.
• Señalar la polaridad de mRNA y su interacción con el tRNA.
• Marcar la unión del aminoácido al tRNA.
APLICACIONES BIOTÉCNOLOGICAS
1 - Una enfermedad dominante se debe a la presencia de un gen solo cuando la misma presenta mas de 40 repeticiones del trinucle
ótido CGG. Asimismo, presenta secuencias conservadas que flanquean la region de las repeticiones tal como se indica:
CTAGGTCAACAGTATGCACAATGAA --- (CGG)42 --- ATGCGTAATTAGCCGATGCCATTCG
A – Se decidió clonar el fragmento empleando la transformación:
• Realizar un esquema de un vector de clonado.
• ¿De que manera obtendría los fragmentos clonados en bacterias?
• ¿Qué precauciones se requiere a la hora del aislamiento?
• ¿Qué controles se debe tomar para realizar la transformación?
B – Se requiere amplificar el segmento de DNA a partir de PCR:
• Escribir las secuencias de los primers directo e inverso que permiten amplificarlo.
• Indique los tamaños de el/los productos de PCR esperados. Justificar en función del sitio de hibridación de los primers.
2 – Tres cepas de procariotas (CI y CI) se cultivaron a 30 °C (T° permisiva), y despues de 30 min se subió la T a 42 °C (T° restric
tiva). CI es ligasa- y CII es primasa-
• Dibuje claramente un esquema de una horquilla de replicación en el que se puedan apreciar (y diferenciar) las hebras parentales
e hijas, el origen de replicación y el carácter bidireccional y semi-discontinua de la replicación. Marque las polaridades tanto de la
s hebras parentales como la de las hijas.
• Esquematizar un procedimiento que permita determinar que la replicación es semidiscontínua y semiconservativa.
• Esquematizar de que manera influye estas alteraciones en las enzimas en la replicación, explicando su importancia en dicho proc
eso.