LABORATORIO ORGANIZACIÓN SUBCELULAR

EN CELULA ANIMAL Y VEGETAL

ACTIVIDAD N°1: OBTENCIÓN DE FRACCIÓN NUCLEAR DESDE HÍGADO

DE POLLO
1. Cortar el hígado (aprox. 2 g) en trozos pequeños y resuspender en Solución 1 enfriada
(10 ml).
2. Homogenizar el tejido en mortero.
3. Filtrar con gasa el homogeneizado conseguido
4. Traspasar a tubos de centrífuga, manteniendo en frío, centrifugar a 1000 g por 10 min.
5. Descartar el sobrenandante y resuspender el pellet en 500ul de Solución 1 y mantener
en hielo
6. En un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de la suspensión obtenida
anteriormente y que usted ha mantenido en hielo.
7. Coloque sobre ella un cubreobjetos y observe su preparación al microscopio usando
para ello el objetivo de 40X.
8. Agregue el azul de tripán y vuelva a observar su preparación. ¿Qué observa?

ACTIVIDAD N° 2: OBSERVACIÓN DE MITOCONDRIAS ACTIVAS

Consideraciones: 24 horas antes de la práctica, agregar 10 granos de levadura a 5 ml de
solución de glucosa al 5%. La suspensión se incuba a temperatura ambiente y sin cubrir el
envase (ambiente aeróbico). Transporte de igual manera.
Coloque en una placa petri 5 gotas de levadura en incubación. Agregue una gota de
colorante verde de Janus y deje actuar durante 2 minutos. Luego de hacer una preparación
microscópica, obsérvela con el objetivo de inmersión. Seleccione levaduras grandes donde
pueda observar las mitocondrias y el núcleo de las células. Haga esquemas de lo
observado y complete su informe de laboratorio.

ACTIVIDAD 3. ACTIVIDAD CATALASA

Para poder estimar la velocidad de reacción considere una escala entre 0 y 5 (0 = no hay
reacción; 1 = muy lento; 5 = muy rápido). Registre los datos en una tabla.

A. Actividad de la Catalasa de Tejido Vegetal sobre Agua Oxigenada.

Haga un corte fino de rábano y uno de papa, cuyas dimensiones sean iguales. Coloque
cada uno en diferentes placas Petri. Agregue sobre cada trozo tres gotas de H2O2. ¿Qué
observa?
B. Actividad de la Catalasa de tejidos animales sobre Agua Oxigenada.
Hacer un corte fino de tejido hepático y renal, cuyas dimensiones sean iguales. Colóquelos
sobre diferentes placas Petri y agregue tres gotas de agua oxigenada.
Interpretación de resultados:
¿Cuál es el tejido con mayor actividad y cuál el que tiene menor actividad?
¿Qué tienen en común y en qué se diferencian?
Mencione algunos procesos metabólicos de la célula que producen H2O2.
El H2O2 se usa frecuentemente, como antiséptico. ¿Por qué?
Cuando es agregado a heridas produce burbujas. ¿Qué indica esto?

ACTIVIDAD N°4. OBSERVACIÓN DE LA CÉLULA VEGETAL Y SUS

CONSTITUYENTES ESPECÍFICOS

1. Observación de estomas de tejido epidérmico bajo microscopía

óptica
- Hacer una incisión transversal, con un bisturí, de medio centímetro de longitud, en
el tercio superior de la hoja. Con las pinzas tirar de uno de los bordes del corte
rasgando en sentido longitudinal de la hoja. Se desprenderá fácilmente una fina
membrana, que es la epidermis de la hoja.
- Con el portaobjetos situado encima de la placa de Petri, añade a la muestra unas gotas
de colorante azul de metileno y esperar, 5 min para que este ejerza su acción.
- Transcurrido los 5 min, elimina el colorante vertiendo agua sobre la muestra, que
habrás sujetado al porta con ayuda de unas pinzas. El exceso de agua o de colorante que
queda en los alrededores de la muestra se seca con un trozo de papel de filtro.
- Añade unas 2 ó 3 gotas de glicerina al 50% y con cuidado coloca el cubreobjetos sobre
el fragmento de epidermis, cuidando de que no queden burbujas de aire entre el cubre y
el portaobjetos. Observa al microscopio comenzando con el objetivo de menor
aumento, para luego ir pasando a otros de mayor aumento.

2. Observación de plastidios bajo microscopía óptica

Observación de cloroplastos de hoja de espinaca

- Tomar 3 g de hojas de espinaca, lavarlas y secarlas.
- Cortar las hojas en trozos de aproximadamente 2 cm y añadirles 15 ml de tampón A
(0,4M Sacarosa, 0,03M KCl, 0,02M, Tricina pH 7,5) frío.
- Homogeneizar las hojas y filtrar a través de cuatro capas de gasa en un embudo de
vidrio.
- El filtrado se deposita en tubos de centrífuga (10 ml) y se centrifuga a 2000 rpm
durante 10 minutos.
- Se toma el precipitado (cloroplastos) y se descarta el sobrenadante con la mayoría
de los componentes celulares.
- El precipitado se resuspende con una pipeta pasteur en 500 ul de tampón A.
Observar bajo el microscopio.

Observación de cromoplastos de tomate

- Utilizando un Bisturí, corte en dos mitades el tomate.
- Obtén, ayudándose de unas pinzas, un trozo de pulpa de tomate de la zona indicada
en la figura de unos 2mm de grosor.
 - Deposítelo en el centro de un portaobjetos sin poner agua.
- Colocar encima un cubreobjetos y comprimir suavemente con los dedos hasta
obtener un completo aplastamiento del fragmento de pulpa de tomate (squash).
- Llevar la preparación a la platina del microscopio y realizar una observación con el
aumento menor. Seleccione el mejor grupo de células y pasar a aumentos mayores.
- Identifique los distintos orgánulos celulares visibles y dibuje lo que observe.

Observación de amiloplastos de papa

- Parte una papa y raspe con la punta del bisturí, depositando el producto obtenido en
un portaobjetos.
- Deje secar completamente y tiña con unas gotas de lugol. Deje actuar 2 min.
- Ponga el cubreobjetos y observe al microscopio.
- Con poco aumento busque la zona de la preparación en la que los granos estén
menos aglutinados; localizada ésta, cambie a aumentos mayores.
- Observe cerrando el diafragma lo máximo permitido por el foco luminoso. Los
granos de almidón se tiñen de color violeta intenso por el lugol.
- Los granos muestran por lo general, capas concéntricas de crecimiento del grano,
estas formas son muy variadas y por lo general específica de cada planta, fruto o
semilla. Los de papa presentan las capas de crecimiento en bandas excéntricas
alrededor de un punto central o hilio.
- Registre todas las observaciones realizadas

ACTIVIDAD N°5. SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS DESDE

CLOROPLASTOS

PARTE 1.- Separación de pigmentos mediante cromatografía en papel

Objetivo y desarrollo del trabajo práctico

El objetivo del trabajo práctico es extraer y separar los diferentes tipos de pigmentos de
cloroplastos por cromatografía en papel, en función de su polaridad relativa. Una vez
separados, se analizará su migración a lo largo de la fase estacionaria.
Extracción de pigmentos:

Comenzamos la experimentación con la extracción de los pigmentos de cloroplastos de 0,5

g de hojas frescas de espinacas, con 5 ml de acetona al 80%, disgregando el tejido vegetal
en un mortero, de modo que se extraigan los pigmentos y se disuelvan en acetona. Cuando
la acetona está bien verde, el macerado se introduce en un tubo de centrífuga de plástico y
se centrífuga a 2000 rpm durante 10 minutos. Después de centrifugar se obtiene un
sobrenadante verde que contiene los pigmentos.

Realización de la cromatografía en papel:

Se dispone de una tira de papel Whatman Nº1 (fase estacionaria) en la que se dibuja con
lápiz una línea a 1-2 cm de uno de sus extremos. Sobre el centro de esta línea se deposita
una gota pequeña del sobrenadante verde con una pipeta pasteur de vidrio. Esperamos a que
se seque y aplicamos una nueva gota en el mismo punto de aplicación que la anterior,
repitiendo la operación hasta añadir 7 a 8 gotas. Se introduce con cuidado la tira de papel
con la muestra en un tubo de ensayo que contiene 2 ml de la fase móvil (acetona:éter de
petróleo, 1:9 en volumen).
El extremo del papel que ha de quedar más próximo a la fase móvil es el que tiene la
muestra.
Esta no puede quedar sumergida en la fase móvil. Se deja durante unos 30 min en la
oscuridad. Al cabo de este tiempo se saca la tira de papel del tubo, se seca y se analizan los
resultados.

a) Calcular la movilidad relativa de los distintos pigmentos.

b) Explicar razonadamente los resultados

PARTE 2.- Cuantificación de clorofilas

Objetivo y desarrollo del trabajo práctico

El objetivo de esta parte del trabajo práctico es extraer los pigmentos de los cloroplastos de
hoja de espinaca y determinar la cantidad de clorofila contenida en los mismos.

Extracción de pigmentos:

PROTOCOLO 1: Extracción con acetona:

Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0,5 g de hojas frescas de espinacas, con 5 ml de
acetona al 80%, macerando el tejido vegetal en un mortero, de modo que los pigmentos
salgan al exterior y se disuelvan en acetona. Cuando la acetona está bien verde, el macerado
se introduce en un tubo de centrífuga de plástico y se centrífuga a 2000 rpm durante 10
min. Después de centrifugar se obtiene un sobrenadante verde que contiene los pigmentos.
Ajustar el volumen final a 6 ml con acetona al 80%.

PROTOCOLO 2: Extracción con etanol:

Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0,5 g de hojas frescas de espinacas
cortando las hojas en segmentos de aproximadamente 0,5 cm que se introducen en un tubo
de ensayo con 6 ml de etanol al 80%, de modo que los segmentos queden bien sumergidos
en el etanol. Incubar durante 20 minutos en un baño a 80°C para que las clorofilas salgan al
exterior y se disuelvan en el etanol. Al cabo de este tiempo los segmentos deberán quedar
totalmente decolorados y el etanol debe quedar de color verde.

Determinación del contenido de clorofila:

Se toman 0,5 ml del sobrenadante de cada uno de los extractos y se diluye hasta 5 ml con
acetona al 80% en la extracción con acetona (protocolo 1) y con etanol al 80% en la
extracción con etanol (protocolo 2). Después se mide en un espectrofotómetro a longitudes
de onda de 645 y 663 nm.

Para calcular las clorofilas totales aplicaremos la siguiente fórmula:

Clorofila total (μg/ml o mg/l) = (20.2 * DO645) + (8.02 * DO663)

a) Calcula los μg de clorofila que hay por gramo de hoja, extraída con cada uno de los
protocolos.
b) Compara los resultados obtenidos entre sí. ¿Qué protocolo te parece más adecuado
para el tipo de material vegetal empleado? Razona tu respuesta.
c) Relaciona la fórmula utilizada para la cuantificación de clorofilas con los espectros
de absorción de los pigmentos fotosintéticos.
ACTIVIDAD N°6. OBTENCIÓN DE PIGMENTOS DESDE VACUOLAS

Objetivo y desarrollo del trabajo práctico

El objetivo del trabajo práctico es obtener diferentes tipos de pigmentos de vacuola

almacenados en distintas plantas y órganos.

Obtención de pigmentos desde hoja de repollo morado, betarraga, pétalos de rosa roja
y arándanos
1. Corte en pequeños trozos el material vegetal entregado
2. Colóquelos separadamente en vasos precipitados con 10 ml de agua destilada
3. Deje hervir por 5 minutos
4. Deje enfriar y cuele la solución con gasa
5. Observe los colores obtenidos
6. Busque en la literatura y responda: ¿Qué compuestos dan cuenta de la coloración
específica de cada extracto?
7. Genere un cuadro comparativo donde se visualice especie, órgano, color y
compuesto
8. ¿Qué características químicas poseen estos compuestos obtenidos?
9. ¿Qué características nutricionales poseen estos compuestos obtenidos?