RESUMEN: Photocages son grupos protectores químicos sensibles a la luz que proporcionar control externo sobre cuándo, dónde

y cuánto de un
producto biológico el sustrato se activa en las células utilizando irradiación con luz dirigida. Lamentablemente, la mayoría photocages populares
(por ejemplo, grupos o-nitrobencilo) absorben daño a las células longitud de onda ultravioleta. Un desafío para lograr un enlace de longitud de
onda más largo La fotoquímica es que los cromóforos de longitud de onda larga absorben tienen vidas de estado excitado más cortas y energías
disminuidas de estado excitado. Sin embargo, aquí presentamos la síntesis de una familia de derivados de BODIPY fotocajas con absorciones
sintonizables a través del visible / infrarrojo cercano que liberar carga química bajo irradiación. Derivados con styryl adjunto los grupos presentan
absorciones superiores a 700 nm, produciendo fotocajas cortadas con las más altas longitudes de onda conocidas de luz a través de un mecanismo
directo de liberación de fotones individuales. Se muestra fotorrelease con luz roja en células HeLa vivas, células S2 de Drosophila y células GM07373
bovinas tras ~ 5 min de irradiación. No se observa citotoxicidad a los 20 Concentración de photocage μM usando el ensayo de exclusión con azul
tripán. Los derivados B-alquilados mejorados presentan un quantum mejorado eficiencias de photorelease ~20 veces más grandes, a la par con los
photocages o-nitrobenzyl populares (εΦ = 50-100 M-1 cm-1), pero absorbiendo la luz roja / casi IR en la ventana biológica en lugar de la luz UV.

INTRODUCCIÓN

Photocages son mitades sensibles a la luz que son apreciadas para dar investigadores control espacial y temporal sobre la liberación de sustratos
covalentemente vinculados.1-4 Cuando una fotocaja bloquea un grupo funcional crítico en el sustrato (por ejemplo, un carboxílico ácido), el
sustrato se vuelve biológicamente inerte. Inducido por la luz la escisión del enlace fotocápo-sustrato restaura la reactividad o función del sustrato.
Photocages han sido usado para activar proteínas, 5,6 nucleótidos, 7,8 iones, 9-11 neurotransmisores, 12,13 productos farmacéuticos, 14,15 y
tintes fluorescentes usando la luz.16-18 La gran mayoría de los compuestos fotorreactores utilizado en estudios biológicos explotar las fotocajas
de o-nitrobencilo19,20 y sus derivados, pero otros incluyen aquellos basados en el fenacilo, 21,22 acridinilo, 23 benzoinilo, 24,25 cumarinilo, 26 y
estructuras de o-hidroxinaftilo27.

Una limitación importante de estos photocages populares es que su Los cromóforos se absorben principalmente en la región ultravioleta del
espectro óptico. La luz ultravioleta tiene una penetración de tejido limitada restringir los estudios fotográficos a las células y las rebanadas de
tejido. Además, la exposición de células o tejidos a la luz ultravioleta intensa da como resultado daño celular fototóxico o muerte. El ideal rango
de longitud de onda para ser utilizado en tejidos animales, conocido como el ventana biológica, es ~ 600-1000 nm, donde los tejidos tienen máxima
transmitancia de la luz. En estos lejanos rojo / infrarrojo cercano longitudes de onda, la luz logra una penetración máxima del tejido mientras
minimizando la fototoxicidad.28 Fotorrelease usando estas longitudes de onda mantiene la promesa de estudios en animales vivos o como terapias
fotoactivadas dirigidas.

Los inconvenientes de usar luz UV como iniciador biológico tienen condujo a una serie de enfoques diferentes para permitir la liberación de
fotografías de sustratos biológicamente activos utilizando luz visible. El de facto método para liberar moléculas diana con luz visible es explotar los
métodos de absorción de multifotones, en donde un absorbente de UV photocage está entusiasmado con dos o más luces visibles photons.29-31
Otros métodos para lograr photorelease usando la luz visible incluye la liberación de luz iniciada a través de fotoinducida transferencia de
electrones, 32-34 a través de fotocleavage metal-ligando, 35 o por utilizando fotosensibilizadores que generan oxígeno singlete reactivo que puede
iniciar cascadas de reacción, lo que lleva a la liberación de sustrato.36-3

Sin embargo, es ventajoso lograr photorelease con estructuras orgánicas simples, biológicamente benignas que directamente suelta sustratos con
fotones individuales de luz visible. Recientemente, una nueva clase de grupos protectores fotormovibles derivados de colorantes BODIPY meso-
sustituidos fueron informados por nosotros y Weinstain.39,41 Para estos photocages (1 y 2 Figura 1), la escisión se produce utilizando longitudes
de onda verdes ~ 520 nm. En relacionado trabajo reciente, Klan y compañeros de trabajo también han demostrado la fotorelease de monóxido de
carbono de la irradiación de BODIPY-42 y ácidos carboxílicos sustituidos con xanteno43. También de relevancia, se informa que las aminoquinonas
se someten a la abstracción de los átomos H vecinos con luz de longitud de onda larga que puede conducir a hidroquinonas que liberan dejando
anexado grupos a través de una vía de liberación autoinmolable. Una reciente relación estructura-actividad variando los sustituyentes y dejando
grupos en photocages BODIPY se llevó a cabo en colaboración trabajar entre nosotros, Weinstain, y Klan.40 Sitkowska, Feringa, y Szymanski han
demostrado recientemente la liberación de aminas Derivados de BODIPY por irradiación de carbamatos BODIPY.45

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Hemos sintetizado los compuestos 3-9 que se han extendido conjugación y un λmax de desplazamiento rojo entre 580 y 690 nm (λem entre 600 y
750 nm) (Figura 2). Los compuestos 3-9 son térmicamente estables, y no muestran cambios por RMN cuando se refluye en la oscuridad durante 1
h (Figura S11), aún liberación de carboxilatos cuando se irradia con luz visible (FiguraS1). Los rendimientos cuánticos de la liberación de los grupos
salientes (φ) de 3-9 se determinaron mediante actinometría de ferrioxalato (ver Información de apoyo (SI)) y se informa como el promedio valor
de tres ensayos. El coeficiente de extinción (ε) en λmax se determinó mediante espectroscopia UV-vis (Tabla 1). Estas photocages presentan altos
coeficientes de extinción típicos de Colorantes BODIPY (~50 000-120 000 M-1 cm-1 a λmax). En en general, los rendimientos cuánticos (φ) para la
fotorrespuesta de ácido acético para los fotogajes de longitud de onda más larga 3-6 son orden de magnitud más bajo que los de los no conjugados
sustratos (1 o 2).

Sin embargo, la alquilación de boro conduce a un gran aumento en la rendimiento cuántico de liberación, aunque no perturba significativamente
el λmax del cromóforo. Por ejemplo, el boro alquilado 7 tiene un rendimiento cuántico ~ 20 veces mayor que el de 6, que es boro-fluorado Porque
muchos biológicamente interesantes los compuestos tienen alcoholes, también hemos sintetizado el compuesto 9 para demostrar la liberación de
alcohol bencílico. Este compuesto libera alcohol bencílico con un rendimiento cuántico similar al de los carboxilatos a través de un mecanismo de
descarboxilación que libera CO2 como subproducto. Para comparar, los más populares photocages, los photocages de o-nitrobencil, tienen εΦ ≈
100 M-1 cm-1 a λirr = 350 nm, y mucho menos a λirr> 400 nm. Por lo tanto, las eficiencias cuánticas de 8 y 9 están en el mismo orden de magnitud
como fotocajas de nitrobencilo, pero absorben la luz en el ventana biológica ~700 nm en lugar de luz UV. Un interesante observación es que
mientras que el mono-estirilo 4 lleva una grupo dimetilamino tiene un rendimiento cuántico menor que 3 teniendo un compuesto metoxi, bis
(estiril) 8 que lleva los dos los grupos dimetilamino tienen un rendimiento cuántico mayor que 7 teniendo los dos grupos metoxi. Este cambio no
puede ser explicado de una manera simple, como un cálculo del porbital LUMO coeficientes en el meso carbono de estos compuestos hicieron no
revela una tendencia que explica la diferencia en cuanto a quantum rendimientos (Esquema S2). Probablemente, efectos más sutiles como el las
tasas de vías competitivas son necesarias para explicar esto diferencia.

El compuesto 10 se sintetizó para probar la utilidad de estos photocages en imágenes de células vivas. Se usó ácido 4-nitrobenzoico como el grupo
saliente, ya que se conocen ácidos nitrobenzoicos extintores de fluorescencia de colorantes BODIPY. Un etileno corto la cadena de glicol se añadió
a los grupos de estirilo para ayudar con Solubilidad del agua. El compuesto 10 no muestra valores detectables fluorescencia cuando se mantiene
en la oscuridad a temperatura ambiente. Nosotros anticipado que, tras la irradiación y liberación de 4-nitrobenzoico ácido, un fotoproducto
fluorescente se formaría con un λem ≈ 685 nm. Sin embargo, encontramos que, cuando 10 fue irradiado en MeOH o tampón de cultivo celular bajo
aire, en su lugar observamos una aumento en la fluorescencia a 610 nm. Del mismo modo, cuando 6 era irradiados en metanol, vimos un pico
crecer a 610 nm como el pico a 685 nm disminuido (ver Figuras 3 y S6). Esta nueva el pico fluorescente desplazado en azul es similar a la emisión
longitud de onda de 3. 1 H RMN estudios de la fotólisis de 10 confirmar que el extintor se libera tras la irradiación (Figura S10). Los estudios de
fotoproductos de 6 y 10 bajo aire muestran que, en Además del ácido acético, p-anisaldehído es un fotoproducto menor para 6, y el anisaldehído
sustituido con tri (etilenglicol) es un fotoproducto menor para 10 (Figuras S2 y S3). Formación de el benzaldehído y un λem a una longitud de onda
similar a la de 3 indican que los subproductos de photocage se han escindido o se rompió la conjugación de un grupo estirilo (más información en
estudios de productos de 6 se pueden encontrar en la SI), explicando el cambio de longitud de onda Consideramos dos posibles mecanismos para
esta escisión y formación de aldehídos. Primero, el photocage podría sensibilizar singlete de oxígeno, que luego podría romper oxidativamente la
olefina. Este proceso sería independiente de la liberación de la foto. Alternativamente, la división oxidativa podría surgir del atrapamiento de
oxígeno catión intermedio (posiblemente en su estado triplete), un mecanismo eso está correlacionado con el proceso de liberación de la foto. El
mecanismo de liberación más simple a considerar es una fotoheterólisis mecanismo, ya sea de la singlete o triplete excitado estado. El carbocatión
putativo formado por heterolisis de 6 es calculado para ser un carbocatión de estado fundamental triplete por ca. 3 kcal / Mol usando la teoría
funcional de densidad (UB3LYP / 6-31G (d), incluida la corrección por contaminación con spin singlete; ver SI). La fotólisis que ocurre a través del
estado de triplete excitado sería se espera que produzca el carbocatión triplete para conservar el espín. De hecho, seleccionamos colorantes
BODIPY meso-sustituidos como posibles photocages basados en estos iones que tienen un diradical bajo estados, que previamente habíamos
sugerido podrían ser críticos para proporcionar un cruce de superficie (intersección cónica) entre superficie del estado excitado y la superficie del
par de iones del estado del suelo.46 Inspección de los SOMO calculados del carbocatión triplete indica que los radicales están ubicados en los
grupos de estirilo. Pequeño es conocido sobre la reactividad del carbocatión triplete, 47 pero triplete Se sabe que los diradicals reaccionan con
oxígeno, lo que podría llevar a una vía que implica la escisión oxidativa en uno de los grupos estirilo. Se ha demostrado que un compuesto estirilo
BODIPY similar ser reactivo a los radicales en el estado fundamental, rompiendo el conjugación de la olefina y causar un cambio de longitud de
onda similar a lo que observamos. Para corroborar que este desplazamiento azul de fluorescencia era correlacionado con la liberación del ácido
carboxílico, un derivado de compuesto 6 sin grupo saliente fue sintetizado como control y no mostró fluorescencia azul-cambio en la fotólisis
(Esquema S1 y figura S7). Irradiación de este compuesto simplemente condujo a un blanqueo de fluorescencia lento a larga irradiación veces. Si la
división oxidativa fuera independiente de la fotorrelease proceso, este compuesto, que es idéntico, excepto por el ausencia del grupo saliente, se
esperaría que tuviera una fluorescencia azul similar. Que no es compatible con el mecanismo que implica el atrapamiento de un intermedio reactivo
después de la liberación de la foto.

Esta fluorescencia con desplazamiento azul proporciona un ensayo conveniente que seguir el proceso de liberación de la foto usando fluorescencia
microscopía, ya que el ácido fotoestable 6 no absorbe a 605 nm, la longitud de onda a la cual el subproducto desplazado azul absorbe Los estudios
de RMN mostraron que hay un balance de masa entre compuesto 6 y ácido acético durante 3 h de irradiación (Figura S5). Como demostración de
demostración de que photorelease podría realizarse en células, el compuesto 10 20 μM era incubados con células HeLa a 36 ± 2 ° C. Las celdas eran
irradiado con luz de 635 ± 15 nm. La emisión de fluorescencia era medido a 605 nm. Se realizaron experimentos de control sin irradiación Se
observó un aumento en la fluorescencia en 605 nm cuando se irradia (Figura 3A-D). En estudios de control, no aumento en la fluorescencia se
observó en la oscuridad (Figura 3E-H). Se realizaron estudios de imágenes similares en bovinos Células GM07373 y células S2 de Drosophila (Figuras
S13 y S14), obteniendo resultados similares. Estudios de citotoxicidad (azul tripán ensayo de exclusión) no mostró disminución en la viabilidad
celular con tratamiento de 10 (90 ± 3% para las células HeLa sin tratamiento, 92 ± 5% para las células HeLa con 10, 95 ± 2% para las células S2 sin
tratamiento, 93 ± 2% para las células S2 con 10, 90 ± 1% para GM07373 células sin tratamiento, y 92 ± 5% para las células GM07373 con 10).

CONCLUSIONES

Se ha sintetizado una familia de photocages derivados de BODIPY que libran cargas químicas en un rango de longitudes de onda en el visible desde
~450-700 nm. La longitud de onda más larga que absorbe los derivados (8, 9) representan photocages que pueden liberar sustratos con las
longitudes de onda de luz más altas conocidas a través de un vía de fotorrelease directa de un solo fotón. La amplia gama de las longitudes de onda
de absorbancia permiten que se logre la fotorrelease usando esencialmente cualquier color de luz visible. Este trabajo se abre la posibilidad de la
liberación selectiva y controlada de productos farmacéuticos u otras biomoléculas que utilizan irradiación con luz roja en la ventana biológica. Es
notable que una red La reacción de fotoheterolisis se puede lograr usando luz roja dada las energías de fotones muy disminuidas asociadas con
estos longitudes de onda (~40 kcal / mol para 700 nm vs ~ 100 kcal / mol para una Fotón UV), y será interesante probar el máximo longitudes de
onda de la fotorrelease posible, como el aumento de longitudes de onda corresponden a energías de fotones cada vez más disminuidas.
2.
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