Instituto Politécnico Nacional

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIA BIOLÓGICAS

Sección de Química Orgánica
Laboratorio de Química Orgánica para Ingenieros en Bioquímica

Practica 5: “Cromatografía.”
Fecha de realización Grupo: Jueves 14 de Mayo del 2015
Sección y número de equipo: 2IM2 – Equipo Núm. 20
Nombres de los integrantes del equipo: Olvera Flores Ivan de Jesus
Osorio Quiroz Noemí Karina
OBJETIVOS:

1.- Conocer la técnica de cromatografía y los factores experimentales que la afectan.

2.- Aplicar y comparar los métodos cromatográficos de capa fina y columna, para separar, identificar
y purificar compuestos orgánicos.

3.- Observar el efecto de diferentes fases móviles y estacionarias en la separación.

4.- Determinar los valores de Rf, como un parámetro en la identificación de los compuestos
separados.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 Observaciones:
En la primera experiencia, al hacer la mezcla de los disolventes en este caso del hexano y acetato
de etilo se pudo ver que estos eran solubles entre si, ya que la mezcla era homogénea y
totalmente transparente, al adicionar con la sílice gel que ya estaba dentro de la columna,
tampoco se notó una reacción y tomo un color blanquecino, y esta solución llego a la mitad de
nuestra columna, lo mismo sucedió con el sulfato anhidro este se quedó como una superficie
sobre la mezcla.
Al adicionar una cantidad de licopenos se quedó arriba de la superficie de sulfato anhídrido, cabe
destacar que el color era naranja con una tonalidad de rojo, y enseguida se abrió la llave & lo
primero que empezó a salir fue la mezcla pura, esta mezcla se le volvió a adicionar a la columna
y ahí fue cuando se tomó la primera muestra de nuestros licopenos se observó que fue de color
naranja casi no se notó un cambio de tonalidad, de ahí se hicieron los mismos pasos y se
recolectaron 10 muestras, se observó que la tonalidad fue descendiendo considerablemente hasta
un color amarillo transparente.

En nuestra segunda experiencia de separación por cromatografía en placa fina, se pudo observar
que es difícil llevarla a cabo, ya que al no tener tanta experiencia, las manchas eran grandes, pero
finalmente se logró hacer la manchas al mismo tamaño y cuando las metimos dentro de la cámara
con el disolvente se notó que lo carotenos tenían un mejor color, un color muy característicos a
comparación con los licopenos, y el disolvente los hacía notar aún, sin embargo se observó que la
velocidad inicial era rápida porque alcanzo en poco tiempo más de la mitad del punto de origen
hacia el frente del disolvente, después en esa mitad tardo más para llegar al punto final o al frente

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de disolvente, enseguida se detuvo y siguió subiendo más hasta que se detuvo totalmente, por lo
tanto se tomó la decisión de sacar las muestras y tomar los respectivos cálculos.

 Resultados

PROPIEDADES

Reactivo Formula química Peso molecular Punto de Solubilidad

ebullición
Hexano C₆H₁₄ 86.18°Cg/mol 68.0°C Soluble en agua
Acetato de etilo C4H8O2 88,11 g/mol 77,1 °C Soluble en agua
Metanol CH4O 32,04 g/mol 64,7 °C Insoluble con
ácidos, cloruro
de ácido &
metales
alcalinos
Metilo-azul de C16H18N3SCl 319,85 g/mol --------------- --------------------
metileno

Cálculo de él Rf:

Se calcula de la siguiente manera:

Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y)

Carotenos Licopenos
Muestra 3 Muestra 6 Muestra 10 Muestra 9
0.925 1 1.05 1.14

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 Discusión de resultados:

La verdadera experiencia comenzó en la “elección” del disolvente, escogimos disolventes no polares,

debido a que utilizamos gel de sílice “polar”, fue la primera observación realizada para determinar
que los primeros componentes en separarse serían los componentes menos polares. Después al
final al cambiar de disolvente con una polaridad más alta, entonces después los componentes más
polares fueron movidos. Por consiguiente primero extrajimos los compuestos menos polares, y luego
los más polares.

En cambio en cromatografía de capa fina, utilizamos como fase móvil usamos acetato de etilo :
etanol (7:3) por consiguiente, fue una fase móvil polar, lo cual hizo que los componentes más polares
se movieran más rápido a través de la cromatoplaca.

Sabiendo esto podemos saber con mediana certeza en el análisis de la cromatografía de capa fina,
que componente es cual. Y por consiguiente también saber si se desarrolló correctamente la
separación de los componentes.

CONCLUSIONES

Se cumplieron los objetivos del experimento. Se sabe ahora cómo es un sistema de cromatográfica,
para que sirve, sus componentes, la función de sus componentes, como montarlo, los principios de
su funcionamiento, los factores que la afecta, y los cuidados que se deben tener en el desarrollo. Es
muy importante conocer estos elementos ya que el HPLC (High-Performance Liquid
Chromatography), una técnica de identificación de compuestos muy utilizada para la identificación de
compuestos, es de gran uso en la Ingeniería Bioquímica, y comprender estos elementos es
fundamental para poder entender este sistema mas complejo.

También se conocieron los dos tipos distintos de cromatografía más sencillos que hay, entre ellas
sus diferencias, en que momento usarlas, para que se usa cada una, las diferencias entre ellas, y
como interpretar sus resultados. Es muy importante en la industria ya que de otra manera, no
seriamos capaz de identificar diferentes compuestos, o determinar la efectividad de la fase móvil, y
muchos aspectos importantes.

Se aprendió también el efecto que presenta cambiar la polaridad de la fase móvil y fase estacionaria,
y como afecta al desarrollo de la cromatografía. Se sabe que dependiendo de la polaridad de la fase
móvil el desplazamiento de los componentes se verá afectado. Siendo el primer componente en
desplazarse el que tenga mayor afinidad por el disolvente. Esto también es muy importante ya que
en la técnica de HPLC se deben de manejar correctamente las fases móviles y su afinidad a los

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componentes, a pesar de que este computarizado, nosotros somos quienes proporcionamos los
disolventes al aparato.

Ahora los valores de Rf también fueron sencillos de aprender, donde se sabe que es una relación
entre la distancia recorrida por el disolvente y la distancia recorrida por el componente. Estos valores
suelen guardarse para futuras identificaciones, y también nos ayuda a saber si el disolvente a sido el
adecuado para realizar la separación.

BIBLIOGRAFÍA DE CONSULTA:

Wikipedia:
https://en.wikipedia.org/wiki/High-performance_liquid_chromatography
https://en.wikipedia.org/wiki/Silica_gel
https://es.wikipedia.org/wiki/Afinidad_qu%C3%ADmica
https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa

Youtube:
https://www.youtube.com/watch?t=207&v=vtR3grEQI9k
https://www.youtube.com/watch?v=rTergD8MYWo
https://www.youtube.com/watch?v=rHeH3cOm_nI
https://www.youtube.com/watch?v=WO0OsxaPYs8
https://www.youtube.com/watch?v=7TpZP8-ihrs

Otros:
http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm
http://www.areaciencias.com/quimica/cromatografia.html
http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/cromatografa

CUESTIONARIO

1. Indicar que precauciones se deben de tener al empacar una columna de cromatografía

Las precauciones que se deben tener a la hora de empacar la columna, son:

 Colocar un algodón al inicio, ya que si no, la fase estacionaria caería y/o taparía la columna.

 Después del algodón colocar un poco de arena de mar o algo que funcione parecido a un
“filtro”.

 Con la fase móvil y la fase estacionaria formar una mezcla y empaquetar la columna, esto
para que no queden burbujas en la fase estacionaria.
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 Colocar ahora un sobre la superficie de la fase estacionario, un “filtro” como en el paso uno, y
rellenar toda la columna con el disolvente, con cuidado ya que si se hace muy rápido las
capas se destruirán y no se desarrollara homogéneamente.

 Cuando se adiciona la mezcla a separar, también hacerlo con cuidado por la misma razón del
punto anterior, destruiríamos las capas, y la cromatografía no se desarrollaría
homogéneamente.

Las precauciones que se deben cuando se empieza el desarrollo de la cromatografía son:

 Tener cuidado con la obtención de eluatos, ya que hay que cambiar constantemente el tubo
recolector cuando la coloración empieza a cambiar.

 Nunca dejar que el nivel del disolvente (o fase móvil) descienda de la última capa, ya que esto
formaría burbujas, secaría la fase estacionaria, y no se desarrollaría homogéneamente.

2. Indicar que fracciones se separaron por cromatografía en columna, de los extractos de

espinaca, jitomate y como se identificaron.
En las espinacas se separaron: Clorofila A de color verde oscuro, Clorofila B de un tono verde
más tenue, xantofilas de color amarillo pálido & carotenoides de color amarillo intenso.
En los jitomates se separaron: Licopenos de color amarillo rojizo, β-carotenos de un tono
amarillo fuerte y xantofilas de color amarillo tenue

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3. Hacer una comparación entre la cristalización, extracción, destilaciones y

cromatografía, en cuanto a la eficiencia como métodos de separación y purificación.

Todos estas técnicas antes mencionadas son técnicas de separación y purificación de mezclas y
ayudan a la identificación de componentes en las mezclas.

La destilación simple o fraccionada, es de los métodos de separación más sencillos y útiles,

debido a que solo utilizan una fuente de calor. Esta se basa en la separación de una mezcla de dos
líquidos (que no actúan como mezcla azeotrópa) con distintos puntos de ebullición, que harán que a
cierta temperatura y después de cierto tiempo se separen.

La cristalización o recristalización, principalmente se usa para la purificación de un cristal, la

principal característica de este es la de en el proceso de purificación eliminar impurezas coloridas, y
utilizando el diluyente correcto, las impurezas insolubles y solubles en este. El proceso es rápido,
barato, y efectivo.

La extracción liquido-liquido se usa principalmente para la separación de un soluto, soluble en dos

fases inmiscibles, donde una fase es muy volátil, y por consiguiente puede separar el soluto. Las
ventajas de este tipo de separación, son la de poder separar sólidos, de líquidos fácilmente, es una
técnica que solo solicita soluciones las cuales sean inmiscibles, y el soluto sea soluble en ambas,
también pide que el disolvente con el cual separaremos el soluto sea fácil de eliminar (muy volátil).

La cromatografía presenta la ventaja de lograr separar y nos ayuda a identificar los muchos
componentes que se presentan en una mezcla, esta técnica presenta más complejidad, debido a los
inconvenientes que pueden presentar los componentes de la mezcla. Estos son separados debido a
la movilidad de los componentes de una mezcla atreves de una fase móvil, gracias a la ayuda de las
fuerzas intermoleculares. De esta forma (si los componentes son coloridos), son fácilmente
separados e identificados. Para la detección de estos problemas, entra la cromatografía en capa fina,
donde con una sencilla prueba podremos observar si la mezcla efectivamente fue separada y
también a identificar componentes que no son vistos como coloridos.

4. Establecer una distinción clara entre cromatografía en columna y capa fina e indicar en
qué casos es preferible cada uno de estos métodos.

La cromatografía en columna y la cromatografía en capa fina son muy similares. La principal

diferencia entre las dos estriba en la manera de realizarlas. Siempre es conveniente utilizar ambas,
ya que la cromatografía en capa fina, nos ayuda a observar cómo se comportara la mezcla original y
los componentes en un cierto disolvente. Lo cual nos ayudara a decidirnos por un disolvente acorde
a la polaridad de los componentes que queremos que se separen más rápido. Otra clara distinción
es en la posiciones de las fases, ya que en la cromatografía de capa fina el eluyente va de arriba
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abajo, y las cantidades a utilizar son menores. Mientras que en la cromatografía en columna,
necesitamos grandes cantidades de disolvente (primero uno polar, y luego otro no polar). Tambien
en caso de componentes que no puedan observarse a simple vista, o que no presenten coloración
visible, entonces será necesario componentes colorantes, o lámparas que nos ayuden a identificar a
estos.

 IMÁGENES

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