Vous êtes sur la page 1sur 3

PEMBAHASAN BIOTEK: ISOLASI DNA PLASMID

Tabung yang berisi DNA plasmid disimpan pada suhu -20°C. Penyimpanan
DNA plasmid pada suhu -20°C bertujuan untuk melindunginya dari kontaminan
sehingga DNA plasmid dapat bertahan selama 3 bulan sedangkan pada suhu -70°C
DNA plasmid dapat bertahan selama 1 tahun.
Berikut merupakan gambar peta plasmid pD861 yang diisolasi dari bakteri E.coli:

Untuk memvariasikan tingkat ekspresi, vektor dengan promotor rhaBAD


tersedia dengan berbagai jenis pengikat ribosom yang berbeda dan kemampuan
high copy atau low copy dari daerah asal replikasi (origin replication). Vektor ini
juga tersedia dengan penggabungan dari sinyal afinitas dan dengan sinyal sekresi
untuk memandu ekspresi periplasma. Pilihan penanda resistensi juga tersedia pada
promotor rhaBAD.

Tingkat ekspresi protein dalam setiap sel dapat ditingkatkan dengan


menggunakan rhamnose yang lebih tinggi konsentrasinya. Ini berbeda dengan
sistem IPTG-inducible dimana konsentrasi IPTG yang lebih tinggi meningkatkan
fraksi sel yang mengekspresikan protein daripada jumlah yang dihasilkan oleh
masing-masing sel. Promotor rhaBAD kompatibel dengan strain E. coli atau bakteri
Gram-negatif lainnya.

Selain itu dalam bakteri E. coli terdapat suatu enzim yang bekerja untuk
memotong fragmen DNA pada situs spesifik, enzim tersebut disebut enzim
restriksi. Enzim restriksi yang ditemukan pada bakteri Escherichia coli adalah
EcoRI. Sekuen pengenalan merupakan sekuen DNA yang menjadi tempat
menempelnya enzim restriksi dan melakukan pemotongan pada sekuen tersebut.
Setiap enzim mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya
sepanjang 4-6 pasang basa. Situs pengenalan bersifat palindrome, merupakan
daerah yang memiliki urutan basa yang sama dengan utas pasangannya jika dibaca
dari arah yang sama yaitu 5’ – 3’ . Enzim ini termasuk subtipe ortodoks, yang
memotong pada situs pengenalan urutan heksanukleotida 5’- GAATTC-3’.

Pada peta plasmid pD861 terdapat daerah M_Kanamycin-r yang berperan


sebagai daerah resisten antibiotik. Agen bakteriosidal ini efektif menghambat
translokasi ribosom sehingga menyebabkan miscoding. Gen yang mengkodekan
resistensi kanamisin adalah Neomycin phosphotransferase II (NPT II / Neo). E.coli
ditransformasikan dengan plasmid yang mengandung gen resistensi kanamisin
sehingga dapat tumbuh pada media yang mengandung kanamycin 25 μg/ml.
Kanamisin adalah bubuk putih yang larut dalam air (50mg/ml).

Daerah ori_pUC yaitu tempat dimulainya replikasi atau sering dikenal


sebagai origin of replication dengan adanya urutan genom. Ori pUC adalah bentuk
mutasi yang berasal dari E. coli plasmid pBR322 yang memungkinkan untuk
produksi lebih dari 500 eksemplar plasmid per sel. Daerah ori ini terdapat pada
pasang basa ke 300 hingga pasang basa yang ke 100.

Selanjutnya pada peta plasmid pD861 tersebut juga terdapat titik strong RBS.
RBS yaitu ribosome binding site atau dikenal juga dengan situs pengikatan ribosom
merupakan urutan mRNA yang terikat oleh ribosom selama translasi protein. Situs
yang terikat tersebut bisa jadi cap 5 ' dari mRNA di eukariot, wilayah 6-7
nukleotida di bagian ujung kodon awal AUG di prokariot (disebut urutan Shine-
Dalgarno), atau situs masuk ribosom internal (IRES) dalam virus. Ribosom
prokariotik mengenali RBS terutama melalui pasangan dasar antara RBS dan ujung
yang tidak terstruktur dari molekul rRNA 16s yang membentuk bagian ribosom.
Tingkat inisiasi translasi mRNA tertentu dapat diatur oleh urutan RBS, yang
menghasilkan berbagai ikatan (strengths-strong, medium, weak).

Vous aimerez peut-être aussi