SOBREVIVENCIA DE VIRUS IN VITRO

Al carecer de las enzimas biosintéticas necesarias para su replicación, los virus no

pueden replicarse en medios de cultivo inertes, sino que necesitan de células vivas.
La replicación se realiza en el interior de una célula huésped susceptible.

En los comienzos de la virología, se utilizaron embriones de pollo o pato y/o

animales de experimentación para replicar los virus. Posteriormente, con el
advenimiento de las técnicas para mantener vivas células “in vitro” se pudieron
desarrollar numerosos cultivos celulares, aptos para la replicación de la mayoría de
los virus que causan patología humana y vegetal. En la actualidad, para el
aislamiento de virus se utilizan casi exclusivamente los cultivos celulares.

Luego de la penetración del virus en una célula susceptible, la replicación se lleva

a cabo utilizando los mecanismos biosintéticos de la célula, dirigidos por la
información contenida en el ácido nucleico viral. Este actúa como codificador de los
mecanismos enzimáticos de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas. De esta forma,
la célula parasitada por un virus en vez de producir sus propios ácidos nucleicos y
proteínas, recibe órdenes codificadas en el genoma viral parta sintetizar productos
virales que, luego de su ensamble, darán lugar a la formación de nuevos viriones.
Estos saldrán de la célula donde replicaron para iniciar nuevos ciclos de replicación
en otras células susceptibles.

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla
de ciencia y arte. Inicialmente fue considerada como una técnica particularmente
difícil de aprender. Sin embargo, hoy en día estas dificultades están superadas
gracias a factores como los medios de composición definida, la disponibilidad de
antibióticos, las instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo
laminar, incubadores estériles, etc.), dispositivos de cultivo (botellas con tapones
filtrantes, placas de Petri ventiladas, etc.).
El cultivo de los virus requiere un sustrato de células de mamíferos, plantas, hongos
o bacteria como hospedadores para el crecimiento y replicación de los virus. En las
condiciones adecuadas se pueden generar virus enteros, virus recombinantes o
productos virales en células diferentes a los hospedadores naturales. Dependiendo
de la especie del virus y el tipo celular que se utiliza como sustrato, la replicación
viral puede resultar en la lisis de la célula hospedadora y la formación de placas de
lisis virales.
LONGEVIDAD IN VITRO

La longevidad in vitro (LIV) es el período de tiempo después del cual la savia cruda
de una planta infectada con virus pierde su infectividad cuando se mantiene a
temperatura ambiente (20-22 ° C). Para determinar el LIV de un virus, las muestras
de savia bruta se eliminan del almacenamiento a intervalos y se prueban en plantas
de ensayo. En ausencia de información sobre la estabilidad de un virus en la savia,
la primera serie de intervalos debe tener una progresión geométrica, p. 1, 2, 4, 8,
16, 32 ... días, hasta que se pierda la infectividad. Tan pronto como se haya
establecido más o menos el LIV, la prueba se puede repetir en un intervalo más
estrecho de intervalos más cortos.

Longetivad del TMV en Nicotiana benthamiana

La acumulación del virus de la planta se investigó in vitro utilizando tres formas

diferentes de cultivo de tejidos vegetales. Las células suspendidas, las raíces
peludas y los teratomas tiroideos de Nicotiana benthamiana se infectaron con el
virus del mosaico del tabaco (TMV) utilizando la misma relación virus inicial:
biomasa. La infección viral no afectó el crecimiento o la morfología del tejido en
ninguno de los tres sistemas de cultivo. Las concentraciones medias máximas de
virus en raíces peludas y teratomas tiroideos fueron similares y en un orden de
magnitud mayor que en las células suspendidas. Las raíces peludas se
consideraron el hospedador preferido debido a su estabilidad morfológica en medio
líquido y la relativa facilidad de cultivo. La concentración promedio máxima de virus
en las raíces pilosas fue 0,82 ± 0,14 mg g-1 peso seco; la proteína de la envoltura
viral representaba un máximo de aproximadamente 6% de la proteína soluble total
en la biomasa. La acumulación de virus en las raíces pilosas se investigó aún más
utilizando diferentes modos de operación de cultivo semicontinuo destinados a
prolongar la fase de crecimiento de la raíz y proporcionar suplementos nutricionales;
sin embargo, las concentraciones de virus en las raíces no se mejoraron en
comparación con el cultivo discontinuo simple. La infectividad relativa del virus en la
biomasa disminuyó en un 80-90% durante todos los cultivos probados,
independientemente de la forma del tejido vegetal utilizado o el modo de operación
del cultivo. Los cultivos de raíz peluda inoculados con un vector transgénico basado
en TMV en cultivo discontinuo acumularon proteína verde fluorescente (GFP); sin
embargo, las concentraciones máximas de GFP en la biomasa fueron relativamente
bajas a 39 μg g-1 de peso seco, probablemente debido a la inestabilidad genética
del vector. Este trabajo resalta las ventajas de usar raíces velludas para la
propagación in vitro de TMV en comparación con teratomas shoty y células de
plantas suspendidas, y demuestra que el cultivo de raíces discontinuas es más
efectivo que las operaciones semicontinuas para la acumulación de altas
concentraciones de virus en la biomasa.