Cómo los virus de ARN mantienen la integridad de su genoma

Los genomas de ARN son vulnerables a la degeneración por una serie de actividades, incluyendo la
replicación inexacta por la réplica propensa a errores, el daño por factores ambientales, y el ataque
por nucleasasas y otras enzimas modificadoras de ARN que comprenden la respuesta inmune
intrínseca o innata de la célula. El daño a las regiones codificantes y la pérdida de señales críticas de
acción cis perjudican inevitablemente la aptitud del genoma; como consecuencia, los virus de ARN
han desarrollado una variedad de mecanismos para proteger la integridad de su genoma. Estos
incluyen mecanismos para promover la fidelidad a la réplica, actividades de recombinación que
permiten el intercambio de secuencias entre diferentes plantillas de ARN, y mecanismos para
reparar las terminaciones del genoma. En este artículo, revisamos ejemplos de estos procesos de
una gama de virus de ARN para mostrar los diversos enfoques que los virus han evolucionado para
mantener la integridad de la secuencia del genoma, centrándonos primero en los mecanismos que
los virus utilizan para proteger todo su genoma, y luego concentrándonos en los mecanismos que
permiten la protección de las terminaciones del genoma, que son especialmente vulnerables.
Además, discutimos ejemplos en los que podría ser beneficioso para un virus ' perder ' sus
terminales genómicos y reducir su eficiencia de replicación.

Mecanismos de mantenimiento para proteger todo el genoma del virus

La replicación del genoma del virus del ARN se realiza mediante el complejo de la replicasa viral, que
para la mayoría de los virus es probable que sea un conjunto de múltiples proteínas virales y
celulares. La subunidad catalítica de este complejo se denomina ARN polimerasa dependiente de
ARN (RdRp). Los RdRps son notoriamente propensos a errores, por lo que los genomas de virus de
ARN están sujetos a alteraciones potencialmente catastróficas de su propia maquinaria de síntesis
de ARN propensa a errores. Además, algunos virus de ARN de cadena negativa no segmentados
pueden ser susceptibles a inserciones dentro de la región de codificación del genoma como
consecuencia de su programa de edición. Genomas virales también pueden ser susceptibles a
ataques físicos o químicos por factores ambientales (Fig. 1). Abajo, nosotros describirmos ejemplos
de mecanismos que los virus han desarrollado para superar estos altercados.

Revisión de RdRp

La tasa de error del RdRp viral se estima entre 1.5*10-3 bp-1 (Qb phage) y 7.2*10-5 bp-1 (virus de
la influenza). Esta relajada fidelidad a la polimerasa es una faceta importante de la biología del virus
del ARN, ya que proporciona una fuente de diversidad de secuencias que puede permitir la
formación de cuasiespecies de virus, lo que permite que el virus se adapte con éxito a entornos
cambiantes. De hecho, se ha demostrado que un RdRp mutante con mayor fidelidad, aunque capaz
de replicarse eficientemente en cultivo celular, era incapaz de replicarse eficientemente en el
complejo entorno de un huésped animal debido a su incapacidad para producir variantes del virus.
Sin embargo, la otra cara de la moneda es que el error de la polimerasa también puede llevar a la
generación de plantillas inviables que reducen la aptitud viral general. El término "catástrofe de
error" se ha acuñado para describir el resultado de una tasa de error de RdRp en la que se generan
demasiadas plantillas inviables y una población de virus se vuelve insostenible, y se cree que muchas
RdRps virales operan cerca de este umbral. La sabiduría convencional sostiene que la tasa de error
RdRp limita el tamaño del genoma del ARN viral a un límite superior relativamente bajo. Sin
embargo, hay un rango significativo en la longitud del genoma del virus del ARN, con los filovirus y
algunos paramixovirus con longitudes de genoma de 18-19 kb, más de 7 veces más largos que los
genomas de los virus de ARN más pequeños, y los coronavirus siendo aún más grandes, con tamaños
máximos de genoma entre 27 y 32 kb. Los virus con longitudes de genoma más largas
probablemente requieren RdRps con una fidelidad inherentemente mayor, que podría ser conferida
pasivamente por la estructura RdRp, con otros factores como la estructura del genoma también
jugando un papel.

Curiosamente, evidencia reciente sugiere que los coronavirus también podrían tener un mecanismo
activo para promover la fidelidad. La proteína nsp14 de estos virus posee motivos de secuencia que
son análogos a los motivos del sitio activo de las enzimas celulares de exonucleasa, y se ha
demostrado que la proteína nsp14 del coronavirus relacionado con el síndrome respiratorio agudo
severo (SARS) tiene una actividad de exonucleasa in vitro de 3´-5´. La evidencia de que esta proteína
funciona como una enzima de corrección de pruebas proviene del hecho de que los virus mutantes
que tienen una proteína nsp14 defectuosa son más propensos a errores que los virus de tipo salvaje
por un factor de al menos 15 veces. Estos datos sugieren que nsp14 actúa como una exonucleasa
para remover y reparar nucleótidos mal incorporados, ayudando así a mantener la integridad de la
secuencia de los grandes genomas de ARN del coronavirus.

Fig1. Resumen de los mecanismos implicados en el mantenimiento y reparación del genoma. Las mutaciones
(indicadas por símbolos de relámpagos rojos) pueden ocurrir internamente en un genoma de ARN viral o en
los extremos. En la figura se muestran los mecanismos por los que podrían producirse mutaciones en estas
dos regiones del genoma y los posibles mecanismos por los que podrían repararse los diferentes tipos de
mutaciones. Los detalles se describen en el texto.

La edición de ARN y la "regla de los seis"

Algunos virus de ARN no segmentados, de cadena negativa, poseen una secuencia de "edición"
especializada que puede permitir que el RdRp añada a veces nucleótidos no templados durante la
transcripción de ARNm. Debido a que el RdRp a veces copia la plantilla fielmente y a veces agrega
nucleótidos no templados, esto resulta en la generación de transcripciones cualitativamente
distintas del mismo gen. Este mecanismo permite la expresión de múltiples polipéptidos a partir de
una sola unidad transcripcional y es esencial para que el virus exprese todo su complemento de
proteínas. Sin embargo, si se produjeran adiciones no planificadas durante la replicación del
genoma, esto podría conducir a la acumulación de genomas defectuosos, lo que podría ser letal
para el virus. Curiosamente, la mayoría (pero no todos) de los virus que tienen una función de
edición de ARN comparten un requisito estricto de que la longitud del nucleótido de su genoma sea
divisible por seis, un fenómeno conocido como la "regla de los seis". En estos virus, la proteína
nucleocápside viral (N) encapsula el ARN replicativo en una dirección 5´-3´ a medida que el ARN se
sintetiza y permanece asociado con el ARN genómico y antígenómico a lo largo del ciclo de
replicación del virus. Se cree que la "regla de los seis" refleja la estequiometría de los nucleótidos
de ARN a la proteína N. El RdRp viral reconoce las secuencias de ARN en el contexto de la estructura
nucleocápside, y las secuencias promotoras deben estar en fase correcta en relación con cada
monómero de la proteína N para que se produzca una replicación viral eficaz. Estas observaciones
condujeron a un modelo propuesto por Kolakofsky et al (2005), el cual es que, si ocurrieran
inserciones no templadas durante la replicación del genoma, generando genomas de longitud no
hexameral, la consecuente interrupción de la fase de ARN-N en la región promotora impediría que
estos productos de replicación mutante actuaran como plantillas para rondas posteriores de
replicación (Fig. 2). Si este modelo es correcto, entonces la "regla de los seis" es un mecanismo de
"revista" no catalítico para eliminar los genomas que contienen inserciones no templadas del grupo
genómico y ayudar a mantener la integridad genómica en la población de virus.

Reparación del daño por alquilación al ARN genómico

Los genomas de virus también pueden ser susceptibles a la modificación química. Una de estas
modificaciones es la alquilación, la adición de cadenas de carbono a los átomos de N y O en las bases
del ARN, en forma de metilación (adición de un solo carbono) o de cadenas de carbono más largas.
La alquilación podría inhibir la expresión del genoma y la replicación y podría causar el deterioro de
la base, resultando en un aumento en la tasa de mutación. Los agentes alquilantes se pueden
encontrar en el medio ambiente y dentro de las células, y los procariotas y eucariotas han
desarrollado mecanismos para proteger su ADN genómico de sus efectos. Uno de estos mecanismos
involucra a una proteína llamada AlkB, que tiene homólogos en todos los organismos multicelulares,
así como en algunas bacterias y hongos, y que ha demostrado reparar el daño al ARN, además del
ADN. El análisis bioinformático reveló que un número de diferentes virus de plantas de ARN de
cadena positiva contienen un dominio AlkB, y estudios funcionales han mostrado que algunos de
estos dominios pueden reparar el daño de ARN por desmetilación oxidativa. Estos hallazgos
sugieren que algunos virus han adquirido este mecanismo protector y que tiene un papel en el ciclo
de replicación del virus. Interesantemente, la presencia de los dominios AlkB no se correlaciona con
linajes taxonómicos específicos del virus, sugiriendo que el gen fue adquirido relativamente
recientemente, y se ha sugerido que existe dentro de virus que están altamente expuestos a
ambientes alquilantes, tales como pesticidas y/o el floema de plantas leñosas o perennes.
La "regla del seis" y la replicación del genoma en la subfamilia Paramyxovirinae. (a) La replicación exacta del
genoma produce un antigenoma de ARN que es el complemento exacto del genoma, lo que coloca la
secuencia promotora del ARN en el extremo del antigenoma en el contexto correcto en relación con la
proteína N asociada (óvulos rojos). Esto permite al RdRp (gris) unirse a nucleótidos específicos en el promotor
(en mayúsculas) para iniciar la síntesis del genoma de ARN. (b) Si el RdRp tartamudea en el sitio de edición
transcripcional durante la replicación del genoma, insertará residuos no templados en el producto de ARN (en
este ejemplo, 1 nt). Esto resulta en un antigenoma en el cual la secuencia de ARN es desplazada por 1 nt en
relación a la proteína N, evitando así que el RdRp reconozca al promotor eficientemente.

Recombinación en virus de ARN

La recombinación del ARN es una propiedad de los virus de ARN positivos -y negativos- que infectan
a las plantas y a los huéspedes bacterianos. La recombinación en un contexto viral generalmente
ocurre cuando un RdRp replicante deja de copiar una cadena de ARN y se transfiere a otra. Cuando
los sitios de transferencia comparten secuencias comunes, se dice que el evento de recombinación
es homólogo; por el contrario, cuando los sitios no están relacionados, el evento de recombinación
no es homólogo. Evidencia reciente sugiere que la recombinación del virus tripartito de ARN positivo
trenzado del virus del mosaico del bromo (BMV, por sus siglas en inglés) es extremadamente común.
Al analizar la descendencia de coinfecciones con genomas marcados, las frecuencias de
recombinación observadas y calculadas de la BMV implicaron que cada molécula de ARN replicante
se recombinó al menos una vez durante la amplificación de su linaje y, por lo tanto, pocos genomas
de progenies virales contenían nucleótidos copiados de una única plantilla parental.

Además de ser una fuente de diversidad de secuencias, se ha demostrado que la recombinación de

ARN es un mecanismo que también permite la reparación del genoma, una propiedad que fue
reconocida desde el principio en los estudios de la evolución del virus, y se predijo que permitiría a
los virus de ARN reparar genomas defectuosos o debilitados frente a una intensa presión selectiva.
Los eventos de recombinación podrían permitir la restauración de genomas dañados por una serie
de problemas, incluyendo el error RdRp, la modificación química y el daño causado por la luz UV
(Fig. 1). La reparación del genoma por recombinación ha sido reportada para varios virus y puede
ser extremadamente eficiente. El bacteriófago MS2 posee un elemento crítico de estructura
secundaria en una ubicación interna dentro del genoma, entre los genes de maduración y de
proteína de cubierta, que está involucrado en la regulación de la expresión de la proteína de
cubierta. La interrupción de este elemento estructural mediante la eliminación de 19 nt, incluida la
secuencia Shine-Dalgarno, redujo los títulos de virus en 10 órdenes de magnitud, lo que demuestra
la naturaleza crítica de este motif. Sin embargo, a pesar de la eliminación de una secuencia tan
grande, los revertantes capaces de amplificar a títulos altos de virus surgieron dentro de cultivos
nocturnos, y el análisis de la secuencia revertante del ARN MS2 mostró que el elemento estructural
había sido reparado y la secuencia Shine-Dalgarno restaurada. El análisis de secuencia reversible
sugirió que la reparación fue mediada a través del reclutamiento de nucleótidos adicionales a través
de un evento de recombinación no homólogo. Otros ejemplos de reparación de la secuencia interna
son la reparación de 87 nucleótidos faltantes del gen nucleocápside del virus de la hepatitis del ratón
y la reparación de nucleótidos faltantes del gen de la Qb replicasa del bacteriófago. En ambos casos,
los nucleótidos faltantes fueron suministrados a través de la recombinación homóloga de las
plantillas de ARN suministradas en trans y, aunque estos sistemas pueden no reproducir las
condiciones de las infecciones naturales, resaltan claramente la capacidad de las respectivas RdRps
virales para llevar a cabo la reparación recombinada dada la presencia de plantillas adecuadas de
donantes y aceptantes. También se cree que el RdRp del virus Sindbis de cadena positiva es capaz
de recombinación homóloga y no homóloga, como lo demuestra la producción de genomas aptos
para la replicación a partir de plantillas de donantes y aceptantes que eran individualmente
incompetentes para la replicación. De manera similar, se demostró que la recombinación homóloga
de dos variantes de ARN3 parcialmente eliminadas por el virus del moteado clorótico del garbanzo
RdRp es responsable de la generación rápida y frecuente de una secuencia de ARN3 intacta.
También vale la pena señalar que la recombinación puede ocurrir muy cerca del final de las plantillas
para reparar secuencias de terminales. Un experimento con plantillas de bunyavirus mutado mostró
que su RdRp era capaz de corregir las eliminaciones del promotor de 2 ó 15 nt. Esta reparación
dependía de la presencia de un promotor intacto suministrado en tándem, que se perdió durante el
proceso de reparación. Estos resultados sugieren que el RdRp del bunyavirus podría iniciarse en el
promotor externo intacto y luego "saltar" a la secuencia interna del promotor dañado, generando
así un producto corregido. Aunque se trata de una situación artificial, sugiere que el RdRp del
bunyavirus tendría la capacidad de reparar los terminales dañados, siempre que hubiera una fuente
de plantillas intactas para que se iniciara. Tomados en conjunto, estos experimentos sirven para
demostrar la naturaleza promiscua de algunas RdRps virales durante la replicación del genoma y el
beneficio potencial que podría ocurrir. Estos variados ejemplos de recombinación tienen un aspecto
en común: todos están mediados por el RdRp viral y el evento de recombinación ocurre co-
transcripcionalmente durante copia de la plantilla de ARN. Sin embargo, la evidencia reciente con
el poliovirus ahora indica que la recombinación puede se producen en ausencia de polimerasa
activa. Introduciendo genomas purificados del poliovirus divididos en dos fragmentos, con o sin
solapamiento secuencial, genomas intactos fueron recuperados, a pesar de que ninguno de los
fragmentos poseía una región de codificación de polimerasa intacta. Aunque el mecanismo
responsable sigue siendo elusivo, la ausencia de implicación de la polimerasa viral implica
fuertemente un papel para los componentes de la célula huésped. Se desconoce si esta
recombinación no replicativa actúa durante el curso de las infecciones naturales. Sin embargo, este
mecanismo posee el potencial no sólo de reparar truncados sino también para actuar como una
potente fuente de variación de secuencias mediante la combinación de secuencias de ARN tanto del
huésped como del virus. Cabe señalar que, si bien algunos virus de ARN demuestran una
recombinación promiscua, en otros es un caso poco frecuente. El salto o conmutación de plantillas
por el RdRp de virus de ARN negativo no segmentados puede ocurrir, como lo demuestra la
producción de partículas de interferencia defectuosas durante la amplificación de virus de alto
título. También hay ejemplos de duplicaciones de secuencias que surgen en la circulación de virus,
consistentes con la idea de que el RdRp puede ' saltar' dentro o entre plantillas. Además, la
observación de una incongruencia filogenética significativa en los genes del Ébola, las paperas, el
Hantaan y los virus de la enfermedad de Newcastle también apoya la idea de que la recombinación
puede desempeñar un papel en la evolución del virus del ARN de cadena negativa. Sin embargo, hay
muy pocos ejemplos de reparación mediada por recombinación para este grupo de virus. Se realizó
un experimento dirigido específicamente a probar la capacidad de reparación con el virus
respiratorio sincitial. A pesar de las condiciones experimentales que se optimizaron
deliberadamente para detectar la recombinación, sólo se generó un virus recombinante funcional
en seis experimentos de coinfección. Del mismo modo, el análisis de la secuencia de las cepas
circulantes del virus de la gripe, un virus de ARN segmentado, de cadena negativa, demostró que la
recombinación intragenica se produce sólo en raras ocasiones. La infrecuencia de la recombinación
intragénica en los virus de ARN de cadena negativa podría ser una consecuencia de su estructura de
plantilla genómica, en la que el ARN permanece encapsulado a lo largo de todo el ciclo de
replicación; sin embargo, hay ejemplos de virus de ARN de cadena positiva que también demuestran
niveles insignificantes de recombinación. Por lo tanto, la recombinación eficiente del ARN podría ser
una actividad que ha evolucionado en un subconjunto de virus que les proporciona la oportunidad
de variación genética y reparación genómica.

Mecanismos para proteger y restaurar los terminales del genoma

Las secuencias terminales de genomas de virus de ARN son particularmente vulnerables a la

eliminación o degradación. Los virus de ARN han desarrollado sofisticados mecanismos para evitar
el truncamiento de las secuencias de terminal durante el inicio y la terminación de la replicación.
Sin embargo, a pesar de estas medidas, los terminales de los genomas del virus siguen siendo
susceptibles a la degradación del ARN mediada por células huésped, ya sea a través de proteínas
huésped antivirales específicas o debido a los componentes de la maquinaria normal de biosíntesis
del ARN de células huésped. Los genomas de los virus poseen varias adaptaciones que les ayudan a
eludir estas actividades de la nucleasa. Por ejemplo, algunos genomas del virus del ARN de cadena
positiva tienen una tapa unida covalentemente, cola de poli(A) y/o proteína en sus terminales, y los
genomas de los virus del ARN de cadena negativa son secuestrados dentro de una nucleocápside
helicoidal durante todo el ciclo de infección. Además, se ha demostrado que muchos virus de ARN
se replican en compartimentos membranosos que podrían ofrecer protección contra las nucleasas.
Como segunda línea de defensa, los virus de ARN han desarrollado medios para reparar sus
terminales genómicos en caso de que se dañen ( Fig. 1). Los ejemplos de mecanismos de reparación
terminal abarcan numerosos linajes taxonómicos de virus (Tabla 1), indicando que la posesión de
una actividad de reparación terminal es un elemento fundamental de la biología molecular del virus
del ARN. Las siguientes secciones describen ejemplos de estos mecanismos de reparación.

Reparación como consecuencia del proceso de iniciación

Debido a que los genomas de ARN del virus son lineales, requieren mecanismos de replicación que
permitan la iniciación frente al nucleótido terminal 3´ de la plantilla o la recreación de nucleótidos
terminales durante el proceso de iniciación. Los virus de ARN utilizan una variedad de estrategias
para lograr esto, incluyendo la iniciación con cebado de proteínas, mecanismos de prime/realign
(en los cuales el RdRp se inicia internamente en la plantilla y luego realinea el ARN naciente y lo
utiliza como cebador), y RdRps estructurados para asegurar la iniciación frente al terminal 3´ de una
plantilla de una sola cadena con una fuerte preferencia por el NTP de inicio correcto. En algunos
casos, estos mecanismos altamente coordinados no sólo facilitan la replicación precisa, sino que
también pueden ofrecer la posibilidad de reparar terminales que carecen de un pequeño número
de nucleótidos. Por ejemplo, en el caso de varios virus, como el virus picornavirus coxsackie B3
(CB3V) y el virus de la poliomielitis, así como el virus de la patata Y y el virus de la viruela de la
ciruela, se ha demostrado que las pequeñas supresiones de 1 ó 2 nt de los terminos del genoma se
restauran en secuencias de tipo salvaje. Si bien el mecanismo o mecanismos de reparación en estos
casos no se han establecido y podrían implicar uno de los mecanismos descritos en las secciones
siguientes, el pequeño tamaño de las supresiones podría permitir potencialmente la reparación
como consecuencia del inicio de la replicación. Por ejemplo, la replicación del ARN del picornavirus
comienza con la uridililación de una proteína viral, VPg, para crear una molécula VPg-pU-pU, que
actúa como iniciador para la iniciación de la síntesis de ARN. Típicamente, la imprimación reconoce
los residuos de adenilato en el extremo 3´ de la plantilla; sin embargo, hay múltiples factores que
son importantes para posicionar el complejo de replicasa. Por lo tanto, es posible que el primer
todavía pueda funcionar para iniciar la replicación de ARN, incluso si no puede emparejarse con la
plantilla. Esto restauraría los nucleótidos faltantes y permitiría una rápida amplificación del genoma
reparado. Un virus que se inicia utilizando un mecanismo prime/realign también ha demostrado ser
capaz de reparar el terminal de su producto de replicación. La alteración o eliminación del extremo
3´residue de una plantilla de virus de influenza resultó en subsecuente restauración del nucleótido
silvestre. La evidencia sugiere que, en este caso, el virus de la influenza RdRp se inicia internamente
en la posición 4 y genera un cebador de dinucleótidos complementario a las posiciones 4 y 5, y luego
el RdRp y el cebador se realinean para recrear un terminal 5´ intacto.

Reparación mediada por imprimación usando transcripciones abortivas

Uno significa que el RdRp viral puede usar para reparar terminales dañados es usar material genético
derivado de terminales virales intactos o de los terminales de ARNs satélites asociados. Un ejemplo
de este tipo de mecanismo de reparación es la reparación mediada. La iniciación de la síntesis de
ARN es un proceso complejo que involucra varias etapas distintas, incluyendo una etapa en la cual
el RdRp pasa de un complejo iniciador a uno alargador. Si el RdRp no logra entrar en el modo de
elongación con éxito, se produce una transcripción abortiva corta del oligonucleótido, de
aproximadamente 3-12 nt, en un proceso conocido como ciclo abortivo. Las iniciaciones abortivas
son un evento frecuente en la síntesis normal de ARN, con transcripciones abortivas que alcanzan
excesos de 10 a 100 veces molares sobre transcripciones completas en algunos casos. La reparación
mediada por imprimación implica iniciar la replicación del ARN utilizando transcripciones abortivas
generadas a partir de un ARN viral intacto como imprimaciones para reparar un ARN dañado. Se ha
demostrado que la reparación usando transcripciones abortivas ocurre para un ARN satélite del
virus de la arruga del nabo. El ARN C satelital (satC) es uno de varios ARN pequeños que están
asociados con el genoma del VTC y replicados por el RdRp viral. El extremo 3´ de satC comparte
secuencias con el terminal 3´ del genoma TCV que se requieren para una replicación eficiente del
ARN, incluyendo una estructura estable de bucle de vástago seguida de la secuencia 5´-CUGCCC-3´.
Si un ARN satC que carecía del terminal 6 nt de esta secuencia se introdujo en las plantas junto con
el TCV de tipo silvestre, el satC se restauró eficientemente a su secuencia de tipo silvestre. Las
mutaciones de los marcadores mostraron que la fuente de los nucleótidos restaurados era el
genoma del VTC. Se demostró que el TCV RdRp genera abundantes transcripciones abortivas cortas
(4-8 nt) y fue capaz de usarlas in vitro para extender plantillas con eliminaciones parciales de
terminales (Fig. 3). El mecanismo exacto por el cual ocurre la reparación mediada por imprimación
no está claro, pero parece involucrar interacciones específicas entre las estructuras en el extremo
del ARN y el RdRp, y entre el RdRp y los primers de oligorribonucleótidos. La estructura de bucle de
vástago en el extremo 3´ de satC necesitaba estar intacta, indicando que el RdRp requería un sitio
de unión en el ARN truncado para poder usarlo como plantilla y mediar en la reparación.
Interesantemente, no fue necesario un emparejamiento de bases entre el extremo 3´ del ARN satC
y la imprimación de oligorribonucleótidos, pero la reparación sólo pudo ocurrir usando ciertas
secuencias de oligorribonucleótidos. Estos hallazgos sugieren que este mecanismo de reparación
implica la unión del RdRp del TCV al ARN de la plantilla defectuosa, reclutando oligorribonucleótidos
de secuencias específicas en su sitio activo y usándolos para iniciar la síntesis de ARN.
Estos hallazgos sugieren que la estrategia de utilizar un conjunto de transcripciones abortivas como
cebadores puede ser una forma útil de superar el problema de las eliminaciones terminales. Hasta
donde sabemos, la reparación de ARN asociados a TCV representa el único ejemplo descrito de
reparación de plantilla mediada por cebadores para un virus de ARN hasta la fecha, pero se ha
demostrado que RdRps de virus de ARN de cadena positiva, negativa y doble genera transcritos
abortivos y los oligonucleótidos cortos pueden usarse como cebadores para iniciar la síntesis de ARN
en varios sistemas de virus. Curiosamente, en algunos de estos casos, se demostró que el RdRp
demostró especificidad para cebadores de la secuencia correcta o longitud específica (Chen y
Patton, 2000; Kao & Sun, 1996; Kawakami et al., 1981). Por lo tanto, podría ser una característica
común de RdRps virales tener una preferencia para unir oligorribonucleótidos particulares en su
bolsillo de sustrato durante la fase de iniciación de la síntesis de ARN, lo que les permite reparar
plantillas defectuosas.

Fig. 3. Mecanismo de reparación mediada por cebadores TCV. (a) El genoma TCV (línea negra) y el
ARN satC (línea roja) comparten secuencias 3´-terminales comunes. En este escenario, el genoma
es una plantilla para transcripciones abortivas, que se generan a partir de las secuencias de 3´
terminales durante el inicio de la replicación; el extremo satC RNA 3´ está degradado. (b) Un
transcrito abortivo generado a partir del genoma de TCV intacto puede usarse para iniciar la
iniciación a partir de un molde de ARN satC truncado y extenderse mediante RdRp de TCV para
generar un complemento restaurado del ARN de satC.

Polimerización sin plantilla por la replicasa viral para generar cebadores aleatorios
En otra serie de experimentos que estudiaron la reparación del ARN satc TCV, se examinaron
plantillas con deleciones más cortas de 3-5 nt. Se descubrió que estas deleciones también se
repararon para crear ARN que era similar en longitud al ARN satc de tipo silvestre, pero, en este
caso, el extremo satC no se restauró consistentemente a su secuencia de tipo silvestre, sino que
consistía en aparentemente secuencia aleatoria, lo que indica que se empleó un mecanismo de
reparación alternativo. Si el extremo 3´ del satC eliminado se fusionó con una secuencia no
específica, la secuencia no específica se eliminó y se reemplazó con una secuencia aleatoria de
longitud apropiada. Esto ocurrió en el contexto de una reacción de replicasa in vitro, lo que sugiere
que esta reparación se produjo en un solo paso. Guan y Simon (2000) proporcionan un modelo para
estos resultados en el que TCV RdRp genera un pequeño ARN aleatorio independientemente de la
plantilla, luego utiliza este ARN como iniciador para iniciar la síntesis de ARN en el extremo 3´ de la
secuencia de ARN satC, posicionando el primer usando la estructura del tallo-lazo cerca del extremo
3´ del ARN satC.

Si el modelo propuesto por Guan y Simon (2000) es correcto, plantea la cuestión de cómo la
replicasa genera cebadores de ARN si no hay una secuencia promotora viable para que se inicie.
Una posible explicación proviene de estudios con la replicasa del fago de ARN Qb. Algunos estudios
han sugerido que la replicasa Qb es capaz de generar RNA de novo en ausencia de una plantilla.
Otros estudios han sugerido que la replicasa de Qb no es verdaderamente independiente de la
plantilla, sino que puede utilizar cualquier ARN como molde, incluso si el ARN solo está presente a
niveles bajos como contaminante y, mientras que la replicasa de Qb puede iniciar ARN. Síntesis al
azar, no entra en un modo de elongación estable si la iniciación ocurre en ausencia de la apropiada.
Por lo tanto, una explicación para la reparación mediada por TCV es que, en ausencia de una
secuencia promotora apropiada, la replicasa viral genera ARN de manera independiente de la
plantilla o se inicia aleatoriamente en cualquier ARN disponible, generando así un conjunto de
oligonucleótidos aleatorios, algunos de los cuales podría caber apropiadamente con RdRp para ser
utilizado como cebadores para iniciar la replicación, de manera similar al mecanismo descrito
anteriormente. Una vez que el RdRp ha generado un ARN "parcheado" que es capaz de soportar
incluso un bajo nivel de replicación, el ARN tendría la oportunidad de evolucionar hacia una
secuencia de tipo salvaje en múltiples ciclos de replicación.

TCV satC RNA no es el único ejemplo de un virus RNA (o RNA asociado a virus) que adquiere
secuencia heteróloga en sus extremos. Se han encontrado evidencias de residuos adicionales no
moldeados para los virus de ARN de cadena positiva virus del mosaico del pepino y virus dengue, y
los virus de ARN de cadena negativa virus de la enfermedad de Borna (BDV), virus de coriomeningitis
linfocítica (LCMV) y hantavirus Hantaan. Aunque no se conoce el mecanismo por el cual los
nucleótidos adicionales se añadieron a estos genomas víricos y podría implicar una actividad
transferasa terminal, como la que se describe a continuación, la naturaleza aleatoria de la secuencia
adicional es consistente con el mecanismo de iniciación no descrito descrito para TCV.

Mecanismos de reparación de la transferasa terminal y poli (A)

Muchos virus de ARN de cadena positiva poseen un tracto de 3´ poli (A), que cumple funciones en
la traducción, la estabilidad del ARN y la replicación del genoma. Estas colas poli (A) son
heterogéneas, pero deben tener una longitud mínima para admitir la replicación eficaz del virus, y
hay datos que apuntan a la existencia de un mecanismo viral que restaura los adenilatos que se
pierden del extremo 3´ de la poli (A). ) cola durante la replicación normal del genoma (van Ooij et
al., 2006). También hay evidencia de que las colas poli (A) completamente eliminadas se pueden
reparar. Por ejemplo, un clon modificado por ingeniería genética del virus del mosaico del caupí
recuperó una cola de poli (A) eliminada in vivo y existen ejemplos similares para varios otros virus.
Es posible que las colas poli (A) sean restauradas por una actividad de polimerasa de poli (A) celular
y, en algunos casos, hay evidencia de esto: el virus del mosaico del trébol blanco puede recuperar
una cola poli (A) eliminada, pero esto es depende de un motivo AAUAAA, que es una secuencia señal
para la poli (A) polimerasa celular. . Alternativamente, se ha demostrado que algunos virus poseen
actividad adeniltransferasa terminal codificada por virus que les permite transferir secuencias de
poli (A) al extremo 3´ de sus plantillas.

Curiosamente, también se ha demostrado que algunos flavivirus que no poseen colas de poli (A)
codifican la actividad transferasa terminal. Los estudios in vitro de la actividad transferasa terminal
del virus de la hepatitis C mostraron que, en este caso, la especificidad del nucleótido añadido está
guiada por la secuencia 3´ del molde de ARN, y la actividad transferasa terminal permite que RdRp
agregue un residuo terminal de citidilato a un 3´ terminal mutado y restaurar la función de plantilla.
De hecho, la actividad de la transferasa terminal está aparentemente extendida, habiéndose
informado de otros virus de ARN de cadena positiva, un virus de ARN bicatenario y un virus de ARN
de cadena negativa, lo que sugiere que podría ser un mecanismo común para facilitar la reparación
terminal.

El mecanismo para la actividad transferasa terminal viral no se ha elucidado por completo. La

actividad depende del sitio activo de la RdRp, lo que no es sorprendente, ya que las
ribonucleotidiltransferasas celulares usan un motivo catalítico similar. Sin embargo, esto plantea la
pregunta de cómo hace una RdRp catalizar la actividad transferasa terminal. El RdRp normalmente
posicionaría el extremo 3´ del molde de ARN en su canal plantilla, agregaría nucleótidos al extremo
3´ del ARN naciente en su sitio activo y luego extruiría el ARN naciente en una dirección 5´A3´ a
través de su canal de salida. Si el RdRp se une a la plantilla defectuosa en su orientación habitual, el
extremo 3´ del ARN no se colocaría apropiadamente con respecto al sitio catalítico para las adiciones
de nucleótidos. Los estudios sobre RdRp / transferasa terminal del bacteriófago w6 sugieren que la
explicación más probable es que, para que se produzca la actividad transferasa terminal viral, la
subunidad RdRp se orienta en la dirección opuesta con respecto al ARN de lo que sería para RdRp
dirigida a plantilla actividad y extrae el extremo 3´ del ARN a través de su canal de salida en el sitio
catalítico, de modo que el extremo 3´ del ARN se coloca apropiadamente en el sitio activo para que
ocurra la catálisis (figura 4). Sin embargo, queda por determinar por qué la actividad de la
transferasa terminal puede ser específica para un sustrato de NTP particular, o cómo la secuencia
terminal del molde de ARN puede determinar la especificidad de los nucleótidos añadidos.
Independientemente del mecanismo específico, parece probable que, si todos los elementos para
el inicio de la polimerización dirigida a la plantilla estuvieran presentes, incluidas todas las señales
de 3´ terminales, la RdRp sería más probable que vincule la plantilla en la orientación ilustrada en
Fig. 4 (a) e iniciar la replicación de ARN. Sin embargo, si las señales de 3´ terminales no estuvieran
intactas, la RdRp no podría formar un complejo de iniciación estable, lo que aumentaría su
propensión a adoptar una orientación de transferasa terminal hasta que el ARN se haya reparado lo
suficiente (figura 4c).
Fig. 4. Modelo putativo para el mecanismo de transferasa terminal RdRp. (a) La iniciación de la
replicación implica el ensamblaje del complejo de replicasa, que incluye el RdRp, en el ARN molde.
En el caso de la iniciación de novo en el extremo 3´, el extremo 3´ de la plantilla está ubicado en el
sitio activo. (b) Durante la síntesis de ARN, el grupo 3´ OH de la cadena naciente se coloca
apropiadamente en el sitio activo para la adición del siguiente nucleótido, y el ARN recién
sintetizado se extruye a través de un canal de salida. (c) Para la actividad transferasa terminal, se
propone que la RdRp y la 'plantilla' de ARN se roten una respecto de la otra. En este caso, el ARN
ingresa a través del canal de salida, colocando el grupo 3´ OH apropiadamente en el sitio activo para
que se agreguen más nucleótidos.

Un mecanismo de reparación común pero no caracterizado: un posible papel para la maquinaria

de degradación del ARN celular

Se descubrió que algunos genomas de virus poliadenilados que se sometieron a reparación para
restaurar la cola de poli (A) adquirieron nuevas secuencias ricas en U. Este fenómeno se describió
por primera vez para el virus de la vena amarilla necrótica de la remolacha. En este caso, si la cola
de poli (A) se eliminó completamente, los virus de progenie contenían una nueva región
heterogénea rica en U adyacente a la secuencia viral, seguida de una cola de poli (A). Se han
observado resultados similares para virus Sindbis, virus coxsackie B y virus de hepatitis C. El
mecanismo que genera el enlazador heterogéneo rico en U seguido de la cola poli (A) está hasta
ahora indeterminado y se ha sugerido que podría involucrar una actividad mediada por virus, como
la transferasa terminal codificada por virus, o iniciación interna seguida por primer salto. Sin
embargo, el hecho de que este tipo de reparación se haya observado para un rango diverso de virus,
algunos de los cuales se ha demostrado que poseen solo actividad adeniltransferasa (sin evidencia
de actividad uridiltransferasa), es intrigante y sugiere que este mecanismo de reparación podría
involucrar celular enzimas.

Un posible candidato para las inserciones ricas en U es la maquinaria de decaimiento de ARN celular.
Un creciente cuerpo de evidencia ha identificado las relaciones entre los complejos de replicación
de varios virus de plantas y animales y los sitios de procesamiento de ARN citoplásmico, como los
cuerpos de procesamiento y los gránulos de estrés. Esto sugiere una estrecha participación entre la
maquinaria de degradación celular y los sitios de replicación de virus. Un grupo de factores recién
descubiertos en el recambio de ARNm son las poli (U) polimerasas celulares; la cola de poli (U)
añadida por estas enzimas estimula la eliminación de la cápsula 5´, promoviendo la degradación del
ARNm. Las poli (U) polimerasas están muy extendidas, desde la levadura hasta los humanos, y no
son específicas en su sustrato de ARN; por lo tanto, tienen el potencial de actuar sobre una variedad
de ARN virales. Las poli (U) polimerasas también pueden relajarse en su especificidad de
nucleótidos: hay un ejemplo de una poli (U) RdRp que puede cambiar entre la adición de residuos
U o A. Por lo tanto, una posible explicación de cómo los genomas de virus adquieren secuencias
ricas en U no virales es que un ARN viral truncado [que carece de su cola de poli (A)] se une a la poli
(U) polimerasa para marcar su degradación (Fig. 5). Algunos virus pueden haber desarrollado
mecanismos que les permitan interceptar la ruta de degradación y promover la poliadenilación,
utilizando una actividad transferasa terminal codificada por virus, como se describió anteriormente,
o provocando que la poli (U) polimerasa cambie la especificidad de NTP por ATP. Se esperaría que
la adición de la cola poli (A) conferiría estabilidad al genoma del virus y, en combinación con señales
que actúan en cis en cualquier parte del genoma del virus, podría ser suficiente para permitir la
replicación y propagación del genoma.

Reparación de terminación 3´ por mimetismo tRNA

El mecanismo final de la reparación terminal casi con certeza implica una enzima celular y se ve
facilitada por el mimetismo de virus de tRNAs celulares. Una modificación 3´-terminal encontrada
en los genomas de ARN de muchos virus de ARN de planta es la aminoacilitación para cargar el
extremo 3´ del ARN del genoma con los aminoácidos valina, histidina o tirosina. El mecanismo por
el cual ocurre la aminoacilación de los genomas virales se relaciona con la aminoacilación de ARNt:
estos virus tienen secuencias de ARN 3´ terminales que pueden adoptar una estructura secundaria
/ terciaria muy organizada similar a la de los ARNt de la célula huésped, lo que les permite ser
cargados por los respectivos amino acyl tRNA sintetasa (revisado por Dreher, 2009). La similitud
entre el genoma del virus y una estructura de ARNt no solo permite que se produzca la acilación,
sino que también ofrece una oportunidad para la reparación de la secuencia 3´-terminal.

Los ARNt celulares tienen una estructura de hoja de trébol característica con un motivo CCA-OH no
apareado en el extremo 3´. El motivo CCA no está codificado por el genoma eucariótico, sino que se
agrega después de la transcripción por la enzima celular tRNA nucleotidiltransferasa, que también
funciona para mantener el extremo tRNA 3´ ante la constante degradación de la nucleasa. La ARNt
nucleotidiltransferasa funciona independientemente de una plantilla de ácido nucleico, con la
selección de nucleótidos aparentemente guiada por bolsas dentro de la estructura de la proteína,
creada por cambios conformacionales después de la adición de cada nucleótido. El extremo 3´ del
genoma del BMV termina en CC, pero se modifica a CCA al ingresar a la célula. Se cree que la
similitud entre las estructuras virales de tRNA 3´ y los tRNA celulares auténticos proporciona al
genoma del virus la capacidad de unirse a tRNA nucleotidiltransferasa, permitiendo que esta enzima
restaure el residuo 3´A de la misma manera que repararía un tRNA celular. Este mimetismo de ARNt
también proporciona una oportunidad para la reparación de genomas a partir de los cuales se han
eliminado los citidilatos en 3´ terminales. Los experimentos con BMV han demostrado que los
genomas que contienen deleciones 3´-terminales para el motivo de CCA se reparan a la secuencia
de tipo salvaje muy rápidamente en las células. Esta actividad de reparación no depende de otros
segmentos del genoma vírico que actúen como plantilla y no se produce en reacciones realizadas in
vitro utilizando replicasa purificada. Por lo tanto, el mecanismo más probable para la reparación es
la adición del motivo CCA por ARNt nucleotidiltransferasa.

Fig. 5. Modelo para la adquisición de una secuencia poli (U) no viral. De acuerdo con este modelo,
después de la eliminación o pérdida de la cola de poli (A) en el extremo 3´ del ARN del genoma viral,
la poli (U) polimerasa celular uridila el ARN truncado para marcarlo para la degradación. En algunos
casos, las proteínas virales podrían ser capaces de intervenir en este proceso, ya sea alterando la
actividad de la poli (U) polimerasa, de modo que agrega residuos de adenilato en el extremo 3´, o
permitiendo que el RdRp viral poliadenilice el ARN mediante actividad transferasa terminal.

Posibles beneficios de las eliminaciones terminales: genomas truncados y persistencia viral

Muchos virus de ARN que causan infecciones agudas dependen de una multiplicación rápida y
eficiente para permitir la propagación del virus a nuevas células huésped antes de la eliminación por
el sistema inmune del huésped. Esta estrategia viral requiere el mantenimiento de una secuencia
de genoma capaz de soportar niveles suficientes de replicación de virus, y este requisito
probablemente contribuya a la presión de selección que impulsa el desarrollo de las actividades de
reparación descritas anteriormente. Varios virus de ARN también están asociados con infecciones
persistentes, particularmente en ciertos tejidos u organismos. Durante la infección persistente, las
mutaciones que surgen pueden jugar un papel importante. Por ejemplo, las mutaciones en la región
codificante del virus de la hepatitis C pueden permitir que el virus evada el ataque inmune. Además,
la persistencia también se asocia frecuentemente con truncamientos en secuencias terminales que
actúan en cis. De hecho, la alta prevalencia de genomas terminalmente eliminados en algunas
infecciones de virus persistentes sugiere que las deleciones terminales podrían estar involucradas
directamente en el establecimiento y / o mantenimiento del estado persistente.

Ejemplos de asociaciones entre truncamientos terminales e infecciones persistentes

LCMV, un miembro de la familia Arenaviridae, es un virus ARN segmentado y de sentido negativo.

La infección por LCMV de ratones recién nacidos progresa desde una fase aguda inicial a una fase
persistente asociada con un bajo nivel sostenido de producción de virión. Experimentos de curso de
tiempo extendido en cultivo celular o ratones mostraron que ambos segmentos del genoma vírico
estaban dañados por supresiones terminales cortas y adiciones de nucleótidos de hasta 4 nt. La
abundancia de estos genomas dañados aumentó a lo largo del curso temporal en la medida en que,
a los 28 días después de la infección, entre el 60 y el 70% de todas las secuencias del genoma
presentaban deleciones. Curiosamente, estos cambios en la secuencia genómica parecían coincidir
con cambios complementarios en las cadenas antigenómicas correspondientes, lo que sugiere que
estos ARN alterados eran competentes para la replicación; sin embargo, eran deficientes en la
transcripción del ARNm. La presencia de segmentos genómicos competentes en la replicación, pero
incompetentes de la transcripción, es consistente con la disminución de la expresión de proteína
viral y el bajo rendimiento del virus infeccioso que son características de la infección persistente.
Los genomas eliminados terminalmente también son una característica del virus de Seúl, un
miembro del género Hantavirus, que es otro virus ARN de sentido negativo y segmentado que
establece infecciones persistentes a largo plazo en los hospedadores de roedores. Los experimentos
de tiempo extendido en cultivo celular revelaron que la abundancia de segmentos del genoma con
deleciones terminales exhibía un patrón cíclico, que aumentaba y disminuía a lo largo de la duración
del experimento. La abundancia de ARN viral y progenie del virus reflejaba la proporción de
genomas truncados, y por lo tanto implicaba fuertemente las deleciones en el mantenimiento del
estado persistente.

También se ha demostrado que las deleciones de secuencias terminales desempeñan un papel en

la transición entre infecciones agudas y persistentes de un virus de ARN de cadena positiva. El CB3V,
un enterovirus humano, se asocia frecuentemente con una miocarditis aguda que a menudo puede
provocar insuficiencia cardíaca. Los genomas CB3V pueden detectarse en tejido de individuos
previamente infectados, sin embargo, los virus infecciosos han sido casi imposibles de aislar, lo que
sugiere que el CB3V puede ser capaz de persistencia viral. La evidencia de un mecanismo de
persistencia provino del análisis de la secuencia, que mostró que los genomas de CB3V dentro de
los tejidos infectados poseían deleciones 5'-terminales de entre 7 y 49 nt. Se encontró que había
una correlación entre la presencia de términos completos o truncados, y la infección aguda o
persistente, respectivamente (Kim et al., 2005). Trabajos más recientes han detectado la presencia
de genomas eliminados terminalmente en tejido humano recogido de un caso mortal de miocarditis,
lo que sugiere que hay importancia para las deleciones terminales en el contexto de una infección
en humanos.

Evidencia de un mecanismo específico para el truncamiento terminal

El mecanismo por el cual estos virus adquieren truncamientos en sus extremos puede diferir. En el
caso de CB3V, las deleciones terminales surgen más rápidamente en los tejidos cardíacos intactos o
en los cultivos primarios de células de miocardio que en otras células, lo que sugiere que el entorno
celular tiene una gran influencia. Sin embargo, un virus asociado con infecciones persistentes de
virus parece haber desarrollado una estrategia específica para truncar sus términos. El BDV puede
establecer una infección persistente en sistemas de cultivo celular y también células cerebrales de
animales infectados. Este virus es un miembro del orden Mononegavirales, miembros de los cuales
típicamente poseen genomas que exhiben complementariedad terminal. Sin embargo, los extremos
5 'del ARN viral y los ARNc de aislados del BDV extraídos de células y animales infectados están
rebajados por 4 nt en comparación con los extremos 3'. Los experimentos han demostrado que el
virus recombinante con extremos 3 'y 5' perfectamente complementarios vuelve rápidamente a
tener extremos 5 'en receso, similares al virus natural. El alto nivel de precisión de este truncamiento
terminal sugiere que ocurre por un mecanismo específico, que posiblemente involucre la iniciación
de la replicación en un nucleótido ubicado internamente. Aunque ese mecanismo aún no se ha
elucidado, aparentemente implica una actividad que deja un resto de monofosfato en el extremo
5´, en lugar del 5´ trifosfato que normalmente se encontraría en el extremo 5´ del ARN viral. Los
estudios de expresión génica indican que los genomas recortados son plantillas eficientes para la
transcripción, pero plantillas ineficientes para la replicación, lo que limita la generación de partículas
infecciosas. Además, el resto de monofosfato 5´ y el extremo 5´ en receso de las cadenas genómicas
y antigenómicas permiten que el ARN viral evite la detección por el gen 1 inducido por ácido
retinoico (RIG-I). Esto plantea la interesante posibilidad de que, además de modular la replicación
del virus y la expresión génica, el recorte del genoma del BDV pueda ser un mecanismo para facilitar
la persistencia del virus evadiendo las respuestas antivirales celulares.

Observaciones finales

Los estudios descritos anteriormente demuestran una gama de mecanismos que existen para
permitir el mantenimiento y la restauración de la integridad del genoma en virus de ARN. Estos
estudios revelan que, a pesar de sus mecanismos a menudo fastidiosos para asegurar una iniciación
y terminación de replicación precisa, RdRps virales son suficientemente flexibles para acomodar
modos alternativos de iniciación y elongación, permitiendo la reparación terminal, la actividad de
transferasa terminal y la recombinación. Para cualquier virus dado, el comportamiento del RdRp en
el extremo 3´ de una plantilla podría verse afectado por la naturaleza de la secuencia de 3´
terminales. Parece probable que, si los términos del genoma están intactos y todas las secuencias
promotoras y accesorias requeridas para la iniciación de la replicación están presentes, la RdRp se
involucrará preferentemente en la iniciación precisa de la replicación. Sin embargo, si faltan
secuencias de terminal clave, el complejo de replicasa podría no ser capaz de ensamblarse
correctamente, liberando el RdRp para realizar acciones "anormales", como la polimerización sin
plantilla o la actividad de transferasa terminal. Una vez que se ha reparado un genoma, el RdRp
podría volver a su función "normal" de polimerización dependiente de la plantilla. Los virus que se
replican en ambientes particularmente duros o que no tienen defensas pasivas para proteger sus
genomas pueden tener replicas que acomoden mecanismos de iniciación alternativos para facilitar
la reparación terminal más fácilmente, y las diferencias fundamentales en el genoma del virus y la
arquitectura replicasa probablemente afecten la propensión a la recombinación de ARN. Es
llamativo que la mayoría de los ejemplos de reparación del genoma del virus RNA involucren virus
de cadena positiva, cuyos genomas podrían ser más vulnerables que los de los virus de doble cadena
o de sentido negativo, en los que los genomas están secuestrados en cápsides de proteínas durante
todo el ciclo de infección. Los datos también sugieren que la formación de genomas truncados, a la
vez que obstaculiza la cinética de replicación del virus, podría permitir o ayudar a que algunos virus
se volvieran persistentes, lo que finalmente podría ayudar a su propagación dentro de la población
huésped. Por lo tanto, la capacidad de reparación del genoma podría ser un factor importante en la
patogénesis del virus.