EFFECT OF CRAB SHELL CHITOSAN PULP CAPPING MATERIAL ON ODONTOBLAST

PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION IN WISTAR RAT MOLARS

Wijayanti, Y.T., Rakhman, L.F., Purnamasari, S., Walupi, R.N.
Medical Faculty of Brawijaya University

ABSTRACT

Reversible pulpitis is an inflammatory condition of the pulp caused by noxious

stimulation such as caries or trauma. In cases where the tooth has reversible pulpitis,

and where the pulp is mechanically exposed, this is often treated with direct pulp

capping, usually with calcium hydroxide. Chitosan found in crab (Portunus pelagicus)

shells are compatible and biodegradable biopolymers which could potentially be used

as a direct pulp capping material. When placed over the pulp, the chitosan degrades to

produce bone morphogenic protein-7 (BMP-7). BMP-7 then binds with calcium (Ca+)

and phosphate (P) from the dentin and induces odontoblast to proliferate and

differentiate.

Objective:

This study aimed to show that chitosan can effect the proliferation and differentiation

of odontoblasts and increase the thickness of reparative dentin when placed over the

exposed pulp.

Methods:

A Post Test Only Controlled Group Design was used. Molar occlusal cavity preparations

with pulp exposures were carried out under general anesthesia on 24 randomized male

rats (Rattus novergicus) aged 6-7 weeks. The rats were divided into four different
groups: group A (negative control) received no pulp capping material; group B (positive

control) were pulp capped with Ca(OH) 2 0.5 mg; group C were pulp capped with

chitosan 0.5 mg; and group D were pulp capped with chitosan 0.75 mg. Following this,

glass ionomer cement type II was used as a restoration material. The rats were sacrified

and the jaws were excised on either the 14 th or 21st day. Specimens were viewed under

the microscope with H&E staining.

Results:

There was a significant differences (p<0.05) in odontoblast proliferation between each

group. Proliferation of odontoblasts under chitosan was higher than in negative

controls, but lower than Ca(OH)2. The differentiation of odontoblasts (as measured by

reparative dentin formation) was seen on 21st day following chitosan 0.75 mg

treatment.

Conclusion:

This study demonstrates that chitosan can positively affect the proliferation and

differentiation of odontoblasts resulting in an increase in reparative dentin thickness.

The maximum effect was seen with the chitosan dosage of 0.75 mg on the 21st day.

Keywords:

Chitosan, direct pulp capping, odontoblast, reparative dentin, reversible pulpitis

 1. Title page abstract (the same abstract submitted previously)

2. Structured abstract, no more than 300 words

3. Keywords

4. Introduction

5. Materials and methods

6. Results

7. Discussion

8. Conclusion

9. Acknowledgment

10. References

11. Tables and figures

3. Manuscript is written in English and double-spaces (Calibri, font size 12)

4. Margins should be at least 30mm on all sides

5. Typed and saved using Microsoft Word (.doc or .docx file)

Introduction

Karies gigi adalah penyakit infeksi kronis pada gigi. Karies sering menjadi

masalah kesehatan gigi dan mulut pada masyarakat Indonesia. Prevalensi karies secara

umum di Indonesia mencapai 90,05% sedangkan prevalensi karies gigi pada anak balita

sebesar 85% (Balitbang, 2007). Prevalensi di dunia karies gigi pada anak sekolah

mencapai 60-90% dan pada orang dewasa hampir mencapai 100% memiliki kavitas

karies (WHO, 2012). Karies yang berkelanjutan dan tidak dirawat akan mengakibatkan

pulpa terbuka dan rusaknya sebagian odontoblast. Sel odontoblast adalah sel yang

terdapat dalam jaringan pulpa dan memegang peran penting terhadap fungsi kerja

dentin dan pulpa (Vandito, 2004).

Pulpa gigi merupakan jaringan yang penting dalam menjaga vitalitas gigi. Pulpa

merupakan jaringan lunak yang akan bereaksi terhadap stimulus berbahaya dengan

respon inflamasi. Vitalitas gigi harus dilindungi karena berisi serabut, sel, dan berbagai

struktur seperti pembuluh darah, saraf sensoris, dan jaringan limfe. Sel odontoblast

adalah sel yang terdapat dalam jaringan pulpa dan memegang peran penting terhadap

fungsi dentin dan pulpa (Vandito, 2004). Odontoblast terletak didaerah garis predenti-

pulpa dan bertugas dalam deposisi dentin (Yu, 2007).

Iritasi pada jaringan pulpa dapat disebabkan oleh mikroorganisme, mekanis,

kimia dan termis yang mengakibatkan tubuh memberikan respon peradangan yang

dikenal dengan inflamasi. Trauma mekanik pada pulpa dapat mengakibatkan

terbukanya pulpa disertai perdarahan. Trauma ini mengakibatkan terjadinya proses

nekrosis menuju penyakit periradikuler (Walton, 2008). Pulpa terbuka mengakibatkan

bakteri dapat berpenetrasi pada jaringan gigi yang lebih dalam dan menyebabkan

peradangan pulpa dan berisiko menjadi pulpitis (Tarigan, 2006). Inflamasi pulpa

mengakibatkan sel odontoblast mengalami kerusakan dan harus diganti dengan sel

generasi baru. Sel yang memungkinkan untuk mengganti sel odontoblast yang rusak

adalah sel yang terletak dalam lapisan sub-odontoblast atau sel fibroblast pulpa. Sel

odontoblast diharapkan dapat berproliferasi dan berdiferensiasi, kemudian akan

bermigrasi ke daerah pulpa yang terbuka dan mensekresi dentin reparatif untuk

pembentukan dentin bridge (Suardita, 2008).

Pulp capping merupakan salah satu metode dalam perawatan pulpitis

reversibel. Perawatan ini dilakukan untuk mempertahankan agar pulpa tetap vital.

Salah satu syarat keberhasilan perawatan pulp capping adalah penggunaan bahan

pelapik (liner). Bahan pelapik pulpa harus memenuhi syarat biokompatibilitas yang

dapat diterima tubuh (Bergenholtz et al, 2003). Perawatan dilakukan dengan

mengaplikasikan bahan adhesif diatas pulpa gigi yang terbuka sehingga akan

memberikan fungsi protektif dari aktivitas mekanik, kimia, dan bakteri. Perawatan

tersebut dapat menstimulasi terbentuknya dentin reparatif (Sabir, et al., 2005). Dentin

reparatif merupakan reaksi dentin untuk membentuk barier fisiologis yang yang

berfungsi melindungi kamar pulpa yang terbuka sehingga rasa sakit dari pulpa dapat

dihambat. Terbentuknya dentin reparatif merupakan indikasi keberhasilan perawatan

pulpa terbuka (Murray, 2002).

Bahan-bahan pulp capping yang biasanya digunakan antara lain Ca(OH)2 namun

masih memiliki kekurangan. Penyebab kekurangan dikarenakan kandungan hydrex

didalam Ca(OH)2 yang bersifat iritatif, dan dapat menyebabkan nekrosis pulpa.
Kegagalan direct pulp capping dengan sistem dentin bonding dilihat secara klinis terjadi

kegagalan perekatan antarmuka pada jaringan pulpa (Silva, 2013).

MTA memiliki harga mahal dan hal ini dapat berdampak pada biaya perawatan

gigi menjadi mahal (Trimurti, 2007). Berdasarkan keterangan diatas, bahan pulp

capping Ca(OH)2 dijadikan sebagai kontrol positif dalam penelitian ini.

Potensi chitosan di kedokteran gigi dikembangkan menjadi quaternized

carboxymethyl chitosan digunakan sebagai bahan perawatan pulp capping dalam

menjaga pulpa tetap vital (Li Ping Sun et al, 2006). Chitosan menunjukan kemampuan

pembentukan jaringan keras osteotipik ireguler (Trimurti, 2007). Membran bilayer

porous chitosan mengandung TGF-β1 pada perawatan pulp capping dapat membantu

pembentukan dentin reparatif pada gigi anjing (Li, 2013). Monomer chitosan

mempengaruhi regenerasi jaringan pulpa sebagai upaya penyembuhan (Matsunaga,

2005). Chitosan dilaporkan tidak toxic dan mempengaruhi dalam penyembuhan luka

(Kadib, 2012). Chitosan juga memfasilitasi adhesi sel, proliferasi (Zhang, 2007) dan

mempengaruhi aktivitas growth factors (Ueno, 2001).

Kandungan Chitosan dapat diperoleh dari isolasi Chitin cangkang rajungan.

Chitosan merupakan biopolimer yang kompatibel dan biodegradable (Sonia, 2011).

Kitin ditemukan pada eksoskeleton dari krustasea dan beberapa jamur.

Mekanisme kerja dari chitosan sebagai pulp capping melalui penyerapan faktor

pertumbuhan (growth factors) dalam matriks dentin selama pembentukan jaringan

berkontribusi untuk stimuli sinyal peristiwa reparatif. Nano-Chitosan mengalami

biodegradation melepaskan Bone Morphogenis Protein-7 (BMP-7) lalu terhubung

dengan matrix N,N-dicarboxymethyl CHI membentuk sebuah polyelectrolyte complex.

Polyelectrolyte complex berkelasi dengan ion calsium dan phosphat sehingga

merangsang enzim DSPP dan mempengaruhi diferensiasi sel odontoblast dalam

pembentukan dentin reparatif.

Berdasarkan tinjauan diatas, penulis melakukan penelitian ini bertujuan untuk

mengetahui pengaruh Chitosan terhadap proliferasi sel odontoblast pada pulpitis

reversibel gigi tikus wistar.

Materials and methodes

Instrument

Scanning microscope (Olympus), compact disc program dot slide OlyVIA

(Olympus), mikroskop cahaya (Olympus), digital microscope (Olympus), digital camera

(Kodak), computer/laptop (Asus), digital microtome, water bath, pipet micro (Gilson),

Freezer (suhu -20˚C, merk Sharp), sterilized chamber, analitic weigher, vibrator,

Graticulae and sterilisator.

For maintenance on rat, there are several materials like plastic den with size 75

cm x 50 cm x 25 cm were covered with gauze and chaff, drink bottle was placed in its

den, and scales to weigh the rat. For anesthesia, dysposible syringe was used with size

1 ml as much as 1 piece for Ketamin fluid each rats and 1 syringe for fluid Novalgin fluid

each rats. For pulp capping preparation on rats, there are several materials used, such

as dysposible syringe ukuran 1 ml sebanyak 1 buah untuk cairan ketamin tiap tikus,

spuit 5 ml, pinset, cotton pelet, round diamond bur diameter 0,46 mm, handpiece low

speed contra angel, mikromotor, lup, paper point steril, sonde lurus, sonde half moon,

glass lab, chip blower, spatula GIC, filling instrumen plastik, celluloid strip, mixing pad.
Material of Research

Chitosan, ketamin untuk pembiusan pada saat ekstraksi gigi, eter buatan

Brataco Chemica untuk pembiusan pada saat dekaputas tikus, larutan buffer formalin

10% (pH 7,4) untuk fiksasi sediaan, pellet untuk makanan tikus, alkohol 70% untuk

dehidrasi, EDTA 10% tanpa sodium untuk dekalsifikasi, aquadestilata, etanol, xylol,

parafin, anestesi ketamin (65mg/kg/berat badan), xyzalin HCl (7 mg/kg/berat badan),

Phosphat Buffered Saline (PBS) steril, dentin conditioner, 0,9 natrium klorit, GIC tipe IX.

Methode

This study uses a pure experimental design (true experimental design) in the

laboratory by in vivo using Randomized Post Test Only Controlled Group Design.

Research Variables

In this study, two variables were used, the independent variables and the

dependent variables. The independent variables are giving chitosan, Ca(OH) 2. While

the dependent variables are parameter to be measured, such as amount of

odontoblast cell.

Sample

The sample of this research is rat. Maintenance is performed in a clean cage.

Samples were selected based on some criteria. The inclusion criteria are male, age 3-5

months, weight 200-500 grams, and healthy, characterized by active movement, clear

eyes, and thick and shiny fur. The exclusion criteria are rats that had never been used in

previous study and their condition decline or died during the study.
 Location

The experiment was conducted at the Pharmacology Laboratory, Biomedical

Laboratory, Histology Laboratory, Pathology Laboratory of Brawijaya and the Physics

Laboratory of Malang University.

Procedur

Perawatan Tikus sebagai Hewan Coba

Tikus Wistar jantan didatangkan ke laboratorium farmako untuk

dilakukan adaptasi selama 1 minggu. Tikus Rattus norvegicus dipelihara pada

kandang yang terbuat dari bak plastik. Tutup kandang dibuat dari anyaman

kawat.

Pembuatan Chitosan

a. Kepiting rajungan dibersihkan dan dipisahkan antara daging dan cangkang.

Cangkang dicuci sampai bersih dengan aquades. Cangkang dikeringkan dengan

oven. Kemudian diblender sampai halus lalu disaring dengan saringan partikel

120 mesh. Lalu timbang hasil yang diperoleh dan catat.

b. Lalu hasil cangkang rajungan yang halus, demineralisasi pada suhu 25-30°C

dengan larutan HCl 37% 1 M 1 : 10 (gr serbuk/ml HCl) diberi sedikit demi sedikit

sambil diaduk selama 120 menit kemudian didinginkan. Kemudian disaring dan

diambil endapannya. Pencucian endapan sekaligus proses penetralan dilakukan

menggunakan aquades sampai pH netral. Dicek sisa kandungan Cl dengan

menggunakan AgNO3, jika masih ada dapat diulangi prosedur pencucian

 endapan. Pengukuran pH dengan indikator universal lalu disaring, diambil

endapan dan dikeringkan dengan Oven Fisher Scientific 600C.

c. Proses selanjutnya deproteinasi pada suhu 60-70°C dengan larutan NaOH 1 M :

NaOH = 1 : 10 (gr serbuk/ml NaOH) dipanaskan sambil diaduk selama 60 menit.

Pencucian endapan dilakukan dengan aquades sampai pH netral lalu disaring

untuk diambil endapannya dan dikeringkan dengan Oven Fisher Scientific 600C.

d. Deasetilasi kitin menjadi chitosan dengan melarutkan crude kitin dalam larutan

NaOH konsentrasi 50% (berat) pada suhu 100°C sambil diaduk kecepatan

konstan 500 rpm perbandingan solid/liquid = 1 : 15, dan waktu kontak 45 menit.

Pemilihan konsentrasi NaOH 50% disebabkan oleh pada kondisi tersebut reaksi

hidrolisis amida dan pemutusan ikatan antara gugus asetil dengan atom

nitrogen berlangsung efektif. Maka terbentuklah chitosan.

e. Pengujian derajat deasetilasinya untuk memastikan apakah chitosan yang

dihasilkan telah memenuhi spesifikasi (derajat deasetilasi > 50%) atau belum.

Pengujian chitosan dilakukan dengan metode FTIR (Fourier Transform Infra

Red). Fungsinya lainya untuk identifikasi gugus-gugus fungsional yang terdapat

dalam suatu senyawa yang dianalisa.

Tindakan Perforasi Gigi Tikus Wistar

a. Persiapan alat dan bahan.

b. Tikus diukur berat badannya untuk mengetahui dosis ketamin yang

diberikan 40 ml/kgBB.

c. Tikus diinjeksi ketamin secara intramuscular dengan dosis 40 ml/kgBB.

 d. Tikus difiksasi dalam posisi supinasi. Posisi operator terhadap tikus

berada dibelakang kepala tikus.

e. Isolasi daerah kerja pada area sekitar gigi molar posterior pada sisi bukal

dan lingual menggunakan cotton pellet.

f. Siapkan penerangan dengan lampu agar dapat melihat rongga mulut

tikus dengan jelas.

g. Preparasi kavitas kelas I oklusal gigi molar tikus wistar menggunakan

round bur dengan diameter 0,46 mm sampai mencapai pulpa ditandai

dengan sedikit perdarahan.

h. Kemudian diirigasi dengan aquades dan gunakan kapas untuk

mengontrol perdarahan.

Aplikasi Bahan Pelapik

a. Aplikasi bahan pulp capping eugenol untuk kelompok kontrol negatif; MTA

untuk kelompok kontrol positif; chitosan untuk kelompok perlakuan 1; nano

chitosan untuk kelompok perlakuan 2. Lalu, diaplikasikan ke dalam kavitas

hasil perforasi yang telah dibuat. Kemudian, dikeringkan dengan chip

blower.

b. Menutup kavitas GIC tipe IX

Menutup kavitas yang sebelumnya telah diisi dengan bahan pulp capping

dengan GIC tipe IX. Fungsinya agar bahan pulp capping tersebut rapat dan

dapat bertahan lama dirongga mulut. Manipulasi GIC Tipe IX dengan cara

diaduk di atas mixing pad dengan spatula GIC dan diaplikasikan merata diatas

kavitas.
Pembedahan rahang tikus

Pembedahan rahang dilakukan pada hari ke-30. Tikus dianastesi total ether.

Setelah tikus dalam kondisi tidak sadar lalu dilakukan pembedahan rahang atas

tikus yang sudah diberi perlakuan. Pengambilan rahang atas dimulai dengan

membuka akses dari kulit kepala atas. Lalu memotong rahang atas dengan pisau

bedah membentuk balok meliputi gigi molar dan jaringan penyangga

disekitarnya.

Perendaman Jaringan Keras Gigi

Perendaman jaringan keras gigi berfungsi agar jaringan keras gigi

terfiksasi. Rahang yang telah diambil direndam dalam 10% neutral buffered

formalin pada botol organ minimal selama 18-24 jam.

Pembuatan Preparat dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin

Jaringan rahang dilakukan dekalsifikasi dengan cara direndam di dalam cairan

EDTA selama 30 hari untuk melunakan rahang dan gigi molar sehingga

memudahkan dalam pemotongan. Setelah lunak, rahang direndam dalam air

mineral.

Proses pembuatan preparat:

- Dilakukan dehidrasi dengan merendam pada alkohol bertingkat.

- Dilakukan clearing dengan xylol

- Dilakukan infiltrasi dengan parafin

- Dilakukan blocking dengan parafin cair dingin

- Dilakukan pemotongan blok parafin dengan menggunakan mikrotom

 - Hasil sayatan blok parafin dipasang pada gelas obyek, dan kemudian

dilakukan deparafinasi

- Jaringan yang telah dipotong diletakkan di atas gelas obyek.

- Dilakukan rehidrasi dengan alkohol bertingkat

- Tetesi dengan Harris Hematoksilin

- Cuci dengan alkohol bertingkat

- Tetesi dengan Eosin

- Cuci dengan alkohol bertingkat

- Bilas dengan aquades kemudian keringkan.

- Bilas dengan air mengalir kemudian keringkan

- Tetesi dengan entelan dan tutup dengan coverslip (Arieska, 2010)

Pemeriksaan Sediaan Histopatologis

Mengamati jaringan gigi khususnya pada pulpa dengan

menghitung proliferasi sel odontoblas dalam membentuk dentin reparatif pada

preparat di mikroskop. Analisis histopatologi menggunakan mikroskop kamera

dp 40. Parameter berikut dianalisis: ada atau tidak adanya dentin jembatan dan

banyaknya sel odontoblas yang berproliferasi.

Data Analysis

Data yang diambil berupa data-data hasil pengamatan jaringan melintang

histologi PA gigi molar tikus. Data-data tersebut diambil setelah dilakukan pembedahan

rahang pada hari ke-14 dan 21.To test statistically whether there is a significant

differences in any variable observation based treatment group and the control group

and observation time, the data were analyzed using one way ANOVA test and
Correlation-Regression Test. Apabila distribusi data normal dan varian homogen, maka

digunakan uji one way Anova karena memakai lebih dari dua kelompok uji. Selanjutnya

dilakukan uji Post Hoc Tukey sebagai lanjutan One Way Annova. Apabila data tidak

berdistribusi normal atau varian data tidak homogen, maka dilakukan uji Kruskal-Wallis.

Kemudian dilakukan uji Mann Whitney sebagai lanjutan uji Kruskal-Wallis. Uji

normalitas menggunakan Shapiro-Wilk karena jumlah sampel di bawah lima puluh.

Result

Pengujian Pembuatan Chito-cap

Pengujian derajat deasetilasi dilakukan untuk memastikan apakah kitosan yang

dihasilkan telah memenuhi spesifikasi (derajat deasetilasi > 50%) atau belum.

Pengujian kitosan dilakukan dengan metode FTIR (Fourier Transform Infra Red).

Gambar 5.1. FTIR Chitosan

Dari grafik diatas dilakukan perhitungan sebagai berikut:

 Hasil : DD % (Rumus Dexter) = 100 - {( A amida : A alkohol ) x 115} %

= 100 – 46 = 54 %

Hal ini menunjukan bahwa rajungan yang telah di proses merupakan chitosan.

Perbandingan Proliferasi Odontoblas

Perbandingan proliferasi odontoblas dapat dilihat dari hasil histologis kelompok kontrol

dan kelompok perlakuan pada pembedahan hari ke-14 dan ke-21.

A1 Hari ke-14 A2 Hari ke-14 A3 Hari ke-14 A4 Hari ke-21

A5 Hari ke-21 A6 Hari ke-21 B1 Hari ke-14 B2 Hari ke-14

B3 Hari ke-14 B4 Hari ke-21 B5 Hari ke-21 B6 Hari ke-21

C1 Hari ke-14 C2 Hari ke-14 C3 Hari ke-14 C4 Hari ke-21

C5 Hari ke-21 C6 Hari ke-21 D1 Hari ke-14 D2 Hari ke-14

D3 Hari ke-14 D4 Hari ke-21 D5 Hari ke-21 D6 Hari ke-21

Gambar 5.2. Gambaran Histologi pulpa gigi molar tikus wistar : (A1-A6) Perlakuan

Chito-cap 0,5 mg. (B1-B6) Perlakuan Ca(OH)2 . (C1-C6) Perlakuan Chito-cap 0,75 mg.

(D1-D6) tanpa perlakuan. (Pembesaran 400x)

Setelah dilakukan analisa secara statistic menggunakan Anova diperoleh hasil bahwa :

terdapat perbedaan bermakna (p<0,05) proliferasi sel odontoblas yang dilapik Chito-

cap dengan kontrol negatif (tanpa perlakuan). Sedangkan terdapat perbedaan

bermakna (p<0,05) pelapikan Ca(OH) 2 lebih banyak meningkatkan proliferasi sel

odontoblas daripada Chito-cap.

5.3 Perbandingan Pembentukan Dentin Reparatif

Perbandingan pembentukan dentin reparatif dapat dilihat pada gambaran histologis

dari diferensiasi odontoblas. Dilihat dari kelompok kontrol dan kelompok perlakuan

dengan pembedahan pada hari ke-14 dan 21.

Setelah dilakukan analisa secara statistik diperoleh hasil bahwa : terdapat perbedaan

bermakna (p<0,05) ketebalan dentin reparatif sel odontoblas yang dilapik (C) Chito-cap

0,75 mg dibandingkan (B) Ca(OH)2 .

Setelah dianalisa secara statistik diperoleh hasil bahwa pembentukan dentin reparatif

paling banyak pada hari 21 perlakuan C ( Chito-cap 0,75 mg).Pembentukan dentin

reparatif yang lebih banyak pada perlakuan Chito-cap dibandingkan Ca(OH) 2

dikarenakan banyaknya sel odontoblas yang mengalami diferensiasi menjadi dentin

reparatif. Sedangkan pelapikan Ca(OH)2 sel odontoblas masih dalam proliferasi, dan

pembentukan dentin reparatif lebih lambat. Maka, dalam penelitian ini terbukti bahwa

Chito-cap mempercepat pembentukan dentin reparatif sehingga gigi lebih terjaga

kevitalannya.

Conclusion
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan sebagai berikut:

1. Chito-cap meningkatkan proliferasi sel odontoblas primer.

2. Chito-cap meningkatkan diferensiasi sel odontoblas sekunder

3. Chito-cap mempercepat pembentukan dentin reparatif.

This study demonstrates that chitosan can positively affect the proliferation and

differentiation of odontoblasts resulting in an increase in reparative dentin thickness.

The maximum effect was seen with the chitosan dosage of 0.75 mg on the 21st day.

Acknowledge

Saran yang dapat diambil dari penelitian ini adalah:

1. Penelitian ini dilanjutkan dengan penelitian secara in vitro sebagai uji klinis.

2. Adanya penelitian lanjutan mengenai uji toksisitas chitosan sebagai direct-

pulpcapping.

Reference

Baum, Lloyd, Ralph W. Phillips, dan Melvin R. Lund. 1997. Buku Ajar Ilmu Konservasi

Gigi. Jakarta: EGC.

Cohen S. Diagnostic procedures. In: Cohen S, Burns RC. 2000. Pathway of the pulp. 3rd

ed. London: CV Mosby Co; p. 5–35.

Dammaschke, T. 2010. Rat molar teeth as a study model for direct pulp capping.

Horst et al. 2009. TGF-β1 Inhibits TLR-mediated Odontoblas Responses to Oral Bacteria.

JDR vol. 88 no. 4 333-338.

Machida Y, Nagai T, Abe M, Sannan T. 1986. Use of chitosan and hydroxyl propyl

chitosan in drug formulations to effect sustained release. Drug Dis Deliv;1:119-30.

Murray et al. 2002. Hierarchy of Variabels correlated to odontoblas-like cell numbers

following pulp capping. Journal of Dentistry Vol 30, Issues 7–8, September–November,

pages 297–304.

Murray. 2002. Analysis Of Pulpal Reactions To restorative Procedures materials. Pulp

capping, and Future Therapies. Crobm Vol.13 No. 6509-520

Muzzarelli RAA. 1989. Amphoteric derivatives of chitosan and their biological

significance. In: Skjak-Brak G, Anthonsen T, Sandford P, editors. Chitin and chitosan.

New York: Elsevier; p. 87-99.

Smith, AJ. 2003. Vitality of the dentin-pulp complex in health and disease: growth

factors as key mediators. Journal of Dental Education vol. 67 no. 6678-689.

Stanley HR. 1998. Criteria for standardizing and increasing credibility of direct pulp

capping studies. Am J Dent;11(Spec Iss): S17–34.

Tarigan, R. 2006. Perawatan pulpa gigi (endodonti). Jakarta: EGC

Tables and Figure