Pre Informe

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE AGROINDUSTRIA

ESCUELA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
“Año de la Consolidación del Mar de Grau”
Universidad Nacional Del

Santa
FACULTAD : Ingeniería
E.A.P: Agroindustria
ASIGNATURA : Lab. De Ingeniería de Bioprocesos
Pre – Informe del Experimento
TITULO :
“ Ingeniería del cultivo celular por lotes ”

CICLO: VII ciclo
PROFESOR: M.S. Augusto Castillo Calderón
INTEGRANTES:
 HUISA LUCIO Jirko
 PATRICIO MIRANDO Verónica
 RODRIGUEZ SANCHEZ Natanael
 SIFUENTES HERRERA Edwin
 ZAPATA OVIEDO Kevin
2016
INDICE
I. OBJETIVOS:...............................................................................................2
1.1.General:.....................................................................................2
1.2.Específicos o terminales:..........................................................2
II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:.............................................................3

2.1.Diseño de Medios de cultivos:..................................................3
2.2.Preparación de medios:............................................................6
2.3.CULTIVO DEL M.O., ETC.............................................................9
III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:....................................18
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS:..................................25
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:............................................................26
VI. ANEXOS:.............................................................................................27
“ Ingeniería del cultivo celular por lotes ”
I. OBJETIVOS:
1.1. General:
- “Diseñar una experiencia de cultivo celular por lotes en distintos

tamaños de matraces, empleando el M.O. Pichia stipitis NRRL
Y-7124, verificando el efecto de la fuente de carbono en la
cinética de crecimiento y la producción de etanol”.
1.2. Específicos o terminales:
- Diseñar y preparar el medio liquido de cultivo.

- Determinar la cinética de crecimiento de la biomasa.
- Determinar la cinética de consumo de la fuente de carbono.
- Determinar la cinética de generación de etanol.
- Determinación del µM, qs y los rendimientos del nutriente
limitante en células y en etanol, además de las respectivas
productividades en células y etanol.
Imagen 1: Pichia stipitis Imagen 2: Distintos tamaños

creciendo exponencialmente de matraces.
con cicatrices brote.
II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:
II.1. Diseño de Medios de cultivos:
El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección

de los componentes de los medios constituyen los efectores externos de
naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que
deben cumplir con:
Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados
Los requerimientos
del crecimiento y Y además suministrar
de formación de energía para la síntesis
productos. de metabolitos y para
el mantenimiento
celular.
con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como

son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos específicos
del proceso.
No obstante que los microorganismos (Pichia stipitis NRRL Y-7124) varían

considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible
efectuar la distinción de las siguientes categorías de componentes como son
los macronutrientes representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg y
micronutrientes representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co.
Requerimientos nutricionales
Para ello utilizamos un Medio de cultivo mínimo.
Fuente de N
Fuente de K
Glucosa y Sulfato sulfato de fosfato fosfato
Xilosa de magnesio diácido de diácido de
Fuente de amonio Potasio Potasio
carbono y Fuente de P
energía Fuente de
Mg y S
heptahidratado
Condiciones de cultivo
Estado
Medio líquido
Temperatura
30ºC
Velocidad de agitación(Shaker)
150 rpm
pH
4.5
Volumen del medio

30 – 40 % del volumen del matraz
concentracion celular final "Xf"

No superior a 2 g/L
Referencia de Composición de medios de mantención, activación y

cultivo para Pichia Stipitis NRRL Y-7124 para la producción de etanol
- Medio Sólido De Mantención
Tabla 1: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL)
Nutriente Concentración (g/L) Peso (g)

Extracto de levadura 3 0.15
Peptona de caseína 5 0.25
Extracto de malta 3 0.15
Agar 20 1
- Medio Activación: (T:30°C y N: 150rpm)
Tabla 2: Concentración de Nutrientes para el medio de activación (30 mL)

Nutriente Concentración (g/l) Peso (g)
xilosa 10 0.3
Extracto de malta 5 0.15
Solución de sales 5 ml/L 0.15
- Medio De Fermentación: (Ajustar pH 4.5)
Tabla 3: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación (200 ml)

Nutriente Concentración (g/L) Peso (g)
xilosa 14 2.8
(NH4)2SO4 3 0.6
KH2PO4 2 0.4
MgSO4-7H2O 1.1 0.22
Solución de sales 5 ml/L 1ml
Nutrientes Para El Medio De Fermentación:

% en So S'o
Element % en Yx/s
Nutriente P.M. Nutrient
o Célula (g/g) (g/l) (g/l)
e
C C5H10O5 150 46.57 48 0.52 3.49 3.49
C C6H12O6 180 46.57 40 0.43 4.19 8.38
N (NH4)2SO4 132 9.24 21.21 2.30 0.78 1.57
S (NH4)2SO4 132 0.55 24.24 44.07 0.04 0.08
K KH2PO4 136 2.75 28.68 10.43 0.17 0.35
P KH2PO4 136 2.5 22.78 9.11 0.20 0.40
(MgSO4.7H2O
Mg 246 0.3 9.87 32.90 0.05 0.11
)
(MgSO4.7H2O
S 246 0.55 12.99 23.62 0.08 0.15
)
 Nutriente Limitante: Xilosa

 μMax =0.301
 Tiempo de fermentación: 7.6 horas
Composición de la solución de sales utilizadas en los medios de cultivos

en g/L
Nutriente Concentración (g/l)

CaCl2.2H2O 2.9
ZnSO4.7H2O 0.4
FeSO4.7H2O 6.42
CuSO4.5H2O 0.25
CoCl2.6H2O 0.24
MgSO4.7H2O 2.2
HCl 0.06
II.2. Preparación de medios:

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es

una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Para ello debemos tener en consideración los siguientes procesos:
ACONDICIONAMIENTO DE LOS MATERIALES
LAVAR Y SECAR Materiales de vidrio a

utilizar
(Vasos precipitados, matraz y

tubos de ensayo). COLOCAR En la Estufa en posición
vertical
ESTERILIZAR A 121 °C por 15 minutos
Alcohol 96°
DESINFECTAR El área de trabajo
Matraz Nombre de cepa, Fecha

ROTULAR y nombre del grupo
La boca del matraz para matar

cualquier microorganismo
Matraz FLAMEAR presente en el aire y que pueda
contaminar en la práctica y
taparlo.
En posición inclinada y seguir

RESIEMBRA CELULAR flameando antes y después
PREPARACIÓN DEL MEDIO DE MANTENCIÓN, SEGÚN LA TABLA 01

PARA EL CULTIVO DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124
Extracto de levadura,
peptona, extracto de
malta y agar
PESAR
50ml de agua destilada

AÑADIR
CALENTAR Hasta lograr una

coloración celeste
Constantemente con un varilla por un

AGITAR minuto (aparición de la primera
burbuja).
PREPARAR 6 tubos de ensayo con tapa.
6-7 ml de la mezcla en caliente a

AGREGAR cada tubo de ensayo, con pipeta de
10 ml.
Una vez tapados los tubos de

ENFRIAR
ensayos, por 1 hora.
COLOCAR
En un vaso precipitado, y llevarlos a la
olla a presión (auto clave).
CALENTAR 121 ºC / 20 min
PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN, SEGÚN LA TABLA

COLOCAR
02 PARA EL CULTIVO DE PICHIAA STIPITIS
posición inclinada
NRRLa Y-7124.
T. Amb.
Xilosa, extracto de levadura,

extracto de malta y solución de PESAR
sales
Por separado.
- Extracto de levadura y de malta en
un matraz.
ESTERELIZAR - Xilosa en un matraz de 125 ml.
- Las sales en un tubo de ensayo.
DISOLVER Por separado los componente con

agua destilada
El volumen de las sales minerales.

ALISTAR
Al matraz que contiene el extracto

Sales minerales
de levadura, con la ayuda de la
AGREGAR micro pipeta.
EL pH a 7 de la solución que
AJUSTAR contiene glucosa y xilosa.
ESTERELIZAR 121ºC – 15 min.
MEZCLAR
PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN, SEGÚN LA TABLA 03

PARA EL CULTIVO DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124
Xilosa, extracto de levadura, (NH4)2SO4 ,

KH2 PO4, KH2 PO4 y solución de sales,
PESAR
Cada compuesto en agua destilada:
- Glucosa en un matraz de 1 L con agua

destilada.
DISOLVER - (NH4)2SO4 en un matraz con agua
destilada
- Solución de sales, KH2 PO4,
(MgSO4).7H2O en un matraz con agua
destilada.
ESTERELIZAR
Materiales a utilizar
(garantizar asepsia) Las disoluciones por separado.
ESTERILIZAR
ENFRIAR
ENCENDER Mechero para mantener
un ambiente estéril
El Asa Bacteriológica
(Al rojo vivo)
II.3. CULTIVO DEL M.O., ETC.SOMETER
RESIEMBRA CELULAR
ENFRIAR Por unos segundos
(SOLIDO - SÓLIDO)
Una azada del Tubo de

EXTRAER Ensayo que contenía las
células desarrolladas en
medio sólido
En tubos de ensayo
RESEMBRAR preparados con medio sólido
(Agar)
Imagen 3: M.O. Pichia
stipitis NRRL Y-7124
Azada desde dentro hacia
REALIZAR
fuera en el tubo
LLEVAR A la Incubadora a 30°C

durante 24 a 48 horas.
El tubo de Ensayo
Para cerrarlo FLAMEAR
ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO
De la cepa incubada en
Con una asa Bacteriológica EXTRAER
medio sólido Pichia
stipitis NRRL Y-7124
En el Matraz con los

INOCULAR
30ml del medio de
activación
TAPAR El Matraz con un tapón

de gasa y algodón.
Al Shaker a 150rpm, T° = 35
LLEVAR
°C y un t = 24
Hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado

por el incremento en la turbidez del medio.
DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA

BIOMASA (ESPECTOFOTOMETRO)
30ml de caldo (medio rico +

biomasa) INOCULAR En un matraz de 1L contenido
A partir de este pasodesemedio
270ml determinará la
definido.
cinética de crecimiento de la biomasa
Una muestra de 5ml del caldo. EXTRAER
MEDIR
X0 y S0 con D.O
Estas se realizaran cada

Se toman
5ml dellas medidas
medio de
de cultivo hora y media para la
EXTRAER
asepsia en la zona de primera muestra y
trabajo y el encendido del posteriormente cada hora
mechero. de la siguiente manera:
3ml para el tubo de
espectrofotómetro y el resto
SEPARAR se le agregó al tubo de
centrifugado.
La toma de muestras se
inicia desde la dilución del
medio de activación en el
medio de fermentación.
MEDIR Absorbancia a 640nm y pH
5ml en el tubo de
centrifugado, se devuelve.
COMPLETAR
A la máxima velocidad
CENTRIFUGAR por 20 minutos
VERTER Y GUARDAR El sobrenadante en viales y

ponerlos en refrigerador
Con el fin de después determinar el consumo de sustrato

Determinación de la cinética de crecimiento de la biomasa
1. Utilizando la ecuación ln(X/ X0) = μt, determinamos distintos valores de μ.

2. Tabular Si vs. μi
3. Con la ecuación 1/ μ = 1/μm + (KS/ μm) 1/S, graficamos.
4. la intercepción con el eje y será el valor de 1/μm siendo su inversa el
valor de μm, además la pendiente m= K S/ μm conocido anteriormente μm
determinamos KS.
dX / dt = μm X ……………….()
X = X0 e μmt
Determinación de la cinética de consumo de la fuente de carbono.
-dS / dt = (1/ YX/S) (dX/dt)
Reemplazando  en esta ecuación y conociendo YX/S.
Tenemos -dS / dt = (1/ Y X/S) μm X , conociendo μm ya para diferente concentraciones

finales podemos determinar la cinética de consumo de sustrato.
Determinación de los rendimientos del nutriente limitante en células.
Fuente de carbono y energía: Glucosa (C5 H10 O5), M= 150 g
YX/S = % de C en el nutriente / % de C en la célula

% de C en el nutriente = 12(5) x 100 / 150 = 40 %
% de C en la célula = 46.57 %
YX/S = (40/46.57) x 0.6 (este factor por ser aireado)
YX/S = 0.86 x 0.6 = 0.52 g/g
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL

DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO)
Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en

aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido
DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita
hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente
aforar hasta un litro.
Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra:
Volumen del reactivo DNS a

AÑADIR un volumen de muestra a
analizar
MANTENER baño: agua a ebullición

MEZCLA tiempo: 5’
ENFRIAR
Agua destilada
AÑADIR
10 volúmenes
LEER Absorbancia a 540 nm

blanco: agua destilada
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D.O
TOMAR MUESTRA Volumen conocido
CENTRIFUGAR 5000 rpm ; Tiempo: 20 ´
RESUSPENSER Sobrenadante
ELIMINAR Centrifugado con agua destilada
5000 rpm ; Tiempo: 20´ a

CENTRIFUGAR fin de eliminar restos de sustrato
NUEVAMENTE que pudieran alterar la
determinación.
ELIMINAR Sobrenadante
REDISOLVER Precipitado
SECAR Estufa: 80 °C hasta

peso constante
Determinación de Etanol por cromatografía de gases
a) REACTIVOS Y SOLUCIONES: Etanol y Propanol
b) PROCEDIMIENTO
- Preparación de 50 ml de solución patrón de Etanol a 6 g/L.

 Concentración de solución patron etanol = 6 g/l
 Volumen solución patrón etanol a 6 g/L = 50 ml
 Volumen solución etanol 99.7 % = 0.3809 ml
- Preparación de 50 ml de solución patrón de Propanol a 4 g/L.

 Concentración de solucuion patron propanol = 4 g/l
 Volumen solucion patrón etanol a 4 g/L = 50 ml
 Volumen solucion etanol 99.5 % = 0.2487 ml
Estándar interno
Concentración (g/l) Vol. Etanol (ml ) Vol. Propanol (ml) Vol. H2O(ml) área
3 5 5 0
2.1 3.5 5 1.5
1.2 2 5 3
0.6 1 5 4
0 0 5 5
Análisis cromatográfico
1. Instalar una columna capilar RTX-20 utilizando férulas de grafito para asegurar conexiones
herméticas.
2. Encender el cromatógrafo de gases, abrir la válvula del gas portador (helio) y regular
cuidadosamente su flujo.
3. Ajustar las condiciones cromatográficas.
4. Abrir las válvulas de los otros gases, primero el aire y luego el hidrógeno.
5. Con una solución de jabón o detergente, verificar fugas de gases en todas las conexiones.
6. Encender el detector y obtener una línea de base estable.
Condiciones Cromatográficas
 Tº inicial del horno 55ºC. Luego de

Tº final del horno 120ºC.
establecidas
Tiempo inicial 3min.
las
Tiempo final 2min
Velocidad de calentamiento 10 ºC/min.(RATE =rampa) condiciones
Tº inyector 200ºC
Volumen de inyeccion 1µl.
Modo de inyeccion Split
Radio Split 300
Velocidad lineal 32.9 cm/seg
cromatográficas, se procede a la determinación de los parámetros en estudio.
CINÉTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

Plan de Muestreos y Registro de Datos
Grupo: B1
Día de la experiencia: ……………………………………………………………………………………………
Micro-organismo: ………………………………………… Fuente Carbono:………………….…………
pH……………… T °C…………………….. N rpm………………………
TIEMPO Absorbancia Nombre del

Nº HORA Observaciones
(horas) (640 nm) alumno
III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
III.1. Preparación de Medios:
III.1.1. Medio de Mantención:
III.1.1.1. Materiales y equipos  Capachos de

 Balanza analítica papel
 Olla a presión  Vaso de
 Mechero precipitados 250ml
Bunsen
 Pipetas de 10 III.1.1.2. Reactivos
ml.
 6 tubos de  Sustrato: Xilosa
ensayo con tapas
 Muestra: Pichia stipitis.
 Varilla de vidrio
 Agua destilada.
 Matraz
Erlenmeyer  Extracto de levadura y
 Probeta malta.
graduada  Peptona.
 Agar
III.1.2. Medio de Activación:
III.1.2.1. Materiales y equipos  Tapón de Algodón y

 Matraz de 125 ml Gasa
 2 tubos de ensayo  Varilla de vidrio
 Balanza analítica
 Agua destilada
 Shaker III.1.2.2. Reactivos
 Mechero Bunsen
trípode y rejilla.  Xilosa, solución de
 Olla a presión sales, extracto de
 Pipetas levadura y malta
 Capachos de papel  Alcohol
 pHmetro
III.1.3. Medio de Fermentación
III.1.3.1. Materiales y Equipos
 Matraz de 1 L  Laminillas porta y cubre objeto
 Matraces de 125 ml
 Micropipeta III.1.3.2. Reactivos
 Espectrofotómetro
 Capachos de papel  Xilosa, extracto de levadura,
(NH4)2SO4 , KH2 PO4, KH2 PO4 y
 Balanza analítica solución de sales,
 pHmetro
 Agua destilada
 Incubadora
 Alcohol
 Microscopio
III.2. Resiembra celular III.3. Activación celular y

(Solido - sólido ) desarrollo del inóculo
III.2.1. Materiales y equipos III.3.1. Materiales y equipos
 Asa bacteriológica  Matraz de 125

 Tubo de ensayo con ml.
medio sólido donde se  Algodón y
encuentra el M.O. Gasa
 Mechero Bunsen,  Agua
trípode y rejilla. destilada
 Shaker
 Mechero
Bunsen, trípode y rejilla.
III.4. Determinación de la cinética de crecimiento de la biomasa
III.4.1. Materiales y equipos

 Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación
 Espectrofotómetro
 pHmetro
 Gasa y algodón
 Centrifuga
 Tubos de ensayo y Capachos de papel aluminio
III.5. Método del DNS (Ácido Dinitrosalicílico)
III.5.1. Materiales y equipos  Mechero bunsen
 Barra magnética III.5.2. Reactivos

 Vaso de precipitado 250ml
 Matraz de aforo de 100ml.  10 g /L de ácido 3,5
dinitrosalicilico (DNS)
 Papel aluminio
 200 mL / L de NaOH
 Balanza de platos 2N
 300 g/L de tartrato de
 Balanza analítica
sodio y potasio
 Frasco de vidrio tetrahidratado
 Agitador magnético
DESCRIPCIÓN DE ALGUNOS MATERIALES
Matraz Erlenmeyer: Es más seguro que un vaso de precipitado, ya

que la estructura del matraz evita perdidas de la sustancia o
solución contenida (agitación o evaporación).Es ideal para agitar
soluciones. Se puede tapar fácilmente utilizando algodón o tapa.
Tubo de ensayo: Es un pequeño tubo de vidrio con una abertura en

la zona superior, y en la zona inferior es cerrado y cóncavo. Esta
hecho de un vidrio especial que resiste las temperaturas muy altas,
sin embargo los cambios de temperatura muy radicales pueden
provocar el rompimiento de tubo (Pyrex). Hay de varios tamaño y
tambien pueden tener tapas.
Varilla de vidrio: Son unas varillas de unos 20 cm de longitud que

se utilizan para agitar las disoluciones ayudando a que los sólidos se
disuelvan en los disolventes más rápidamente.
Probeta: Vaso de vidrio de forma tubular, con pie, generalmente

graduado, que se usa en los laboratorios para medir líquidos o
gases.
El asa bacteriológica o asa de platino es un instrumento de

laboratorio tipo pinza que consta de una base que puede estar
hecha deplatino, acero, aluminio y un filamento que puede ser
de nicromo, tungsteno o platino que termina o en un arito de 5 mm
o en punta.
Pipeta volumetrica: Tubo de vidrio, generalmente graduado y más

ancho por la parte central, usado en los laboratorios para
transvasar pequeñas porciones de líquido; el tubo, que se llena de
líquido por succión, se vacía cuando se saca el dedo que obstruye la
parte superior.
Olla a presion: es un recipiente hermético para cocinar que puede

alcanzar presiones más altas que la atmosférica. Simila el rol de un
autoclave, que sirve para esterilizar.
mechero (de) Bunsen Mechero utilizado en el laboratorio, que

funciona con gas y permite obtener una llama oscura de gran poder
calorífico y sin humo.
capachos de aluminio o luna de reloj: es una lamina que se utiliza

en el laboratorio para pesar los solidos.
tapón de gasa y algodón: es una herramienta utilizada para sellar
un contenedor, por ejemplo una botella, un tubo o un barril.
DESCRIPCIÓN DE LOS REACTIVOS
BALANZA ANALÍTICA
Marca: Adventurer
Una balanza analítica es una clase de balanza de laboratorio diseñada para medir
pequeñas masas, en un principio de un rango menor del miligramo (y que hoy día, las
digitales, llegan hasta la diezmilésima de gramo: 0,00001 g o 0,01 mg).
Cepa de Pichia La xilosa tambié Extracto de Extracto de

levadura: Es un
stipitis NRRL Y- n excelente estimulado
malta: Debido a
7124: es una llamada azúcar d r del crecimiento de su especial sabor,
levadura e madera es una bacterias, color y agradable
fermentadora de aldopentosa - es utilizado en la aroma, el
hexosas y un monosacárido preparación extracto de
de medios de cultivo
pentosas que que contiene microbiológicos.
malta se usa
presenta un cinco átomos de Extracto de ampliamente en
CENTRÍFUGA
rendimiento de carbono y que Levadura es la la industria
Marca:de
etanol P-Selecta
0.4 gg- contiene un parte soluble en alimentaria con
Una centrifugadora
1, sin producción es una máquina
grupo funcionalque pone en agua
rotación una muestra elpara
fin de mejorar
(por fuerza centrífuga) acelerar la decantacióndeo autolisis
la levadura
sedimentación de sus
de xilitol. Este aldehído- que que es
las propiedades
componentes
cultivo o fases (generalmente
a trabajar tiene una sólida ycuidadosamente
una líquida), según suorganolépticas,
densidad. Es
muy usada en laboratorios de control de calidad y en fábricas que elaboran zumos a
nos da referencia un isómero funci
base de cítricos, para controlar el nivel de pulpa fina,controlada valordel
para separación
mediante
nutricional,
zumo
para el
exprimido. medio onal que es preservar la forma textura y vida útil
cultivo. la xilulosa. natural del complejo de los productos.
B.
ESPECTROFOTÓMETRO
Marca: Sigma
Modelo: 2-16PK
Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para
medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma
magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o
reacciones químicas que se miden en una muestra. También es utilizado en los
laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.
(NH4)2SO4 = sulfato de MgSO4.7H2O = El sulfato de

KH2PO4 = fosfato de potasio
amonio magnesio heptahidratado
PHMETRO
Marca: Inolab
DESCRIPCIÓN
El pH-metro es un sensor DE
utilizado en el LOS EQUIPOS
método electroquímico para medir el pH de
una disolución. La determinación de pH consiste en medir el potencial que se
desarrolla a través de una fina membrana de vidrio que separa dos soluciones con
diferente concentración de protones. En consecuencia se conoce muy bien la
sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio delante el pH. Una celda
para la medida de pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel ( mercurio,
cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolución de la que queremos
medir el pH.
alcohol agua destilada peptona
AGITADOR MAGNÉTICO
Marca: Thermolyne
Modelo: Maxi-mix II
Un agitador magnético consiste de una pequeña barra magnética (llamada barra de agitación)
la cual está normalmente cubierta por una capa de plástico (usualmente Teflón) y una placa
debajo de la cual se tiene una magneto rotatoria o una serie de electromagnetos dispuestos
en forma circular a fin de crear un campo magnético rotatorio. Es muy frecuente que tal placa
tenga un arreglo de resistencias eléctricas con la finalidad de dotarle de calor necesario para
calentar algunas soluciones químicas.
Shaker:
El agitador orbital modelo SAROTIUS STEDIM está diseñado para usos generales en
laboratorios de análisis clínicos, industriales, de física, química y en todo tipo de ensayos que
requieran agitar, mezclar, disolver casi todo tipo de líquidos y soluciones con distinto grado de
viscosidad. Están diseñados ergonómicamente para ser funcionales y confiables ahora y en el
futuro. Su sistema microprocesado, permite un control exacto de la velocidad de giro,
independiente de la carga, puesto que supervisa constantemente la velocidad corrigiendo
automáticamente cualquier variación de la misma. Posee además un timer que permite
controlar con precisión en el tiempo de la experiencia a realizar. El dispositivo mecánico de
agitación está formado por una base amplia, metálica, con fuertes nervaduras, y una
plataforma móvil.
AUTOCLAVE
Una autoclave es un recipiente de presión metálico de paredes gruesas con un cierre
hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial, una cocción
o una esterilización con vapor de agua. Su construcción debe ser tal que resista la presión y
temperatura desarrollada en su interior. La presión elevada permite que el agua alcance
temperaturas superiores a los 100 °C. La acción conjunta de la temperatura y el vapor
produce la coagulación de las proteínas de los microorganismos, entre ellas las esenciales
para la vida y la reproducción de éstos, hecho que lleva a su destrucción.
ESTUFA ELECTRICA:
MARCA: P-SELECTA
MODELO: 209
DESCRIPCION: Equipo de 75 litros de capacidad, con una cavidad de 500 x 400 x 400 mm, que permite
el secado de muestras en un rango de temperatura útil comprendido entre 0 y 200 °C. La estufa de
secado se emplea para esterilizar o secar el material de vidrio y metal utilizado en los exámenes o
pruebas, que realiza el laboratorio y que proviene de la sección de lavado, donde se envía luego de ser
usado en algún procedimiento. La esterilización que se efectúa en la estufa se denomina de calor seco y
se realiza a 180 °C durante 2 horas; la cristalería, al ser calentada por aire a alta temperatura, absorbe la
humedad y elimina la posibilidad de que se mantenga cualquier actividad biológica debido a las elevadas
temperaturas y a los tiempos utilizados.
INCUBADORA ELECTRICA
MARCA: P-SELECTA
MODELO: 206
DESCRIPCION: una incubadora es un dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer
cultivos microbiológicos o cultivos celulares. La incubadora mantiene la temperatura, la humedad
y otras condiciones en grado óptimo, tales como el contenido de dióxido de carbono (CO2) y de
oxígeno en su atmósfera interior. Las incubadoras son esenciales para una gran cantidad de
trabajos experimentales en biología celular, la microbiología y en biología molecular y se utilizan
para cultivos celulares, tanto bacterianos como de células eucariotas.
REFRIGERADORA DOMESTICA
MARCA: PHILLIPS
DESCRIPCION: La función de una máquina de refrigeración es tomar el calor de un ambiente a
baja temperatura (en este caso un armario cerrado y aislado térmicamente) y cederlo en el
ambiente exterior (para el refrigerador doméstico sería la cocina), empleando una fuente de
energía externa para mantener el proceso. Un refrigerador es una bomba de calor (como las de
agua, bombea calor de un lugar a bajo nivel térmico a otro de mayor nivel), impulsada
generalmente por un motor eléctrico. Es asimismo posible emplear sales eutécticas o absorción.
Fermentador:
Marca: Sartoriustedin
Capacidad: 2 litros
Partes: software, CPU, reactor.
Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo. En
algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que
involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos.
Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbio. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos,
variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son usualmente fabricados
en acero inoxidable. Un biorreactor puede ser también un dispositivo o sistema empleado para
hacer crecer células o tejidos en operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran
en desarrollo para su uso en ingeniería de tejidos.
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS:

FECHA
ABRIL MAYO
ACTIVIDADES
SEMANA 2 SEMANA 3 SEMANA 4 SEMANA 5 SEM. 6
18 19 20 21 22 25 26 27 28 29 02 03 04 05 06 09 10 11 12 13 16 17
Presentación del pre - informe X

Selección y prelación de reactivos y esterilización de materiales X
Preparación y/o esterilización de medio de cultivo X
Inoculacioó n del medio de cultivo X

preparación de la solución tampón X
Obtencioó n de curva de calibrado DNS X

Evaluacioó n y supervisioó n del medio X


Determinacioó n de las cineó ticas de crecimiento, consumo de X
fuente de carbono y generacioó n de etanol.
Sustentación de unidad l X
Examen de unidad X
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
Castillo Plata Ana K. 2010. “Determinación de parámetros de

cultivo de scheffersomyces stipitis y saccharomyces cerevisiae
para la fermentación de residuos lignocelulosicos para la
obtención de bioethanol”.
Ertola Rodolfo, Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone. 2011.

Monografía redactada: Medios de Fermentación. Programa
Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico de la OEA.
Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia.
Universidad de Salamanca.
Enari, T. M. and M. L. Suihko. 1984. Biotechnol. Bioprocess.

Department of Molecular Science and Technology. Korea.
Martínez, A., Rodríguez M. E. & York S. W. 2011. Ethanol

production of pentose and hexoses from cellulose materials. CRC
Crit. Rev. Biotechnol. Vol. 28, pp. 151.
VI. ANEXOS:
DISEÑO DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN Y DE FERMENTACIÓN
 HALLANDO EL % EN CÉLULAS: se sabe la fórmula del m.o.:
CH1,79 O0,6 N0,17
ELEMENTO Peso Cantidad Peso (g) % por

molecula element
r o
C 12 1 12 46.57
H 1 1.79 1.79 6.95
O 16 0.6 9.6 37.25
N 14 0.17 2.38 9.24
TOTAL(g) 25.77
Peso (g) = peso molecular * cantidad
Peso ( g )∗100
por elemento=
TOTAL
Calculando el porcentaje por elemento por tablas para bacterias:

ELEMENTO PORCENTAJE PROMEDIO
S 0.1 – 1 0.55 %
Mg 0.1 – 0.5 0.3%
K 1 – 4.5 2.75%
P 2-3 2.5%
Fe 0.02-0.2 0.11%
 HALLANDO EL % EN NUTRIENTE:
PM del componente∗cantidad
%NUTRIENTE= X 100
PM del compuesto
 HALLANDO EL % Y X/S: (solamente para el carbono multiplicar la fórmula de

rendimiento por 0.5)
nutriente
Y x / s=
celula
Element Nutriente P.M. % en % en Yx/s So S'o

o Célula Nutrient (g/g) (g/l) (g/l)
e
C C5H10O5 150 46.57 48 0.52 3.49 3.49
C C6H12O6 180 46.57 40 0.43 4.19 8.38
N (NH4)2SO4 132 9.24 21.21 2.30 0.78 1.57
S (NH4)2SO4 132 0.55 24.24 44.07 0.04 0.08
K KH2PO4 136 2.75 28.68 10.43 0.17 0.35
P KH2PO4 136 2.5 22.78 9.11 0.20 0.40
Mg (MgSO4.7H2O 246 0.3 9.87 32.90 0.05 0.11
)
S (MgSO4.7H2O 246 0.55 12.99 23.62 0.08 0.15
)
º
X
S ΔX %Elemento en nutriente
Y = = ×f
− ΔS %Elemento en biomasa ... (1)
Para fuente de carbono, f =0.6
Para otra fuente, f =1
Donde:
º
X
S %Elemento en nutriente
Y = ×f
%Elemento en biomasa … (2)
º
X
S ΔX
Y =
− ΔS … (3)
De (3):
º
X
S ΔX
Y =
−( S f − Si ) … (4)
De (4):
ΔX
S i ( g/ L )= º
×n
S f =0 . Entonces;
X
Si Y S
… (5)
 HALLANDO EL % S0:
∆ Biomasa
So=
Y x /s
Dato:
C0= 10%Cf= 10% (2) =0.2
Cf-Co=Δ biomasa=2-0.20=1.8
 HALLANDO EL % S´0: menos al limitante

So ´ =So∗2
HALLANDO EL UMAX:
Según bibliografía el rango de tiempo de duplicación (td) característicos para las levaduras está
de: 1.0 – 4.0
ln ( 2 )
=μ Max
td
ln ( 2 )
=0.301
2.31
 HALLANDO TIEMPO DE FERMENTACION:
ln ( XX )=μ
o
Max ∗t
ln ( 0.22 )=0.301∗t
t=7.6 horas=7 horas ,36
CONFECCIÓN DE LOS CAPACHOS
 Se corta el papel aluminio en forma cuadrada, de tal manera que pueda

ser suficientemente grande como para cubrir el molde el cual se desea
confeccionar. Luego el papel aluminio que se ha cortado se coloca
encima del molde y se empieza a dar forma de éste.
 Luego de haberse realizado el moldeado se procede a sacar del molde.
Posteriormente de haber realizado el procedimiento anterior, ya no se
puede manipular directamente, sino que debe hacerse por medio de
pinzas.
CONFECCIÓN DEL TAPÓN PARA MATRACES
 Para confeccionar este tapón se cortará un pedazo de gasa, el cual

debe de ser doble para obtener una buena consistencia del tapón.
 Luego este pedazo de seda es colocado perpendicularmente en la boca
del matraz.
 Después se hundirá con algodón hasta que cubra todo el cuello del
matraz, pero este llenado deberá ser a presión para que no deje entrar
mucho aire, sólo el necesario para el microorganismo
 Luego de haber culminado se realizarán los nudos respectivos para
sujetar el algodón y así impedir su caída, pero también servirá para
poder manipular los matraces a través de estos nudos.
ESTERILIZACIÓN DE PIPETAS
 Se lavan las pipetas con cuidado y se dejan secar por un lapso de

tiempo.
 Después se colocará algodón la boquilla de la pipeta, cuidando de no
presionarse mucho ya que cumplirá la función de un filtro.
 Luego de haber realizado este procedimiento se agrupan las pipetas y al
mismo tiempo envolverlas con papel aluminio, tratando de cubrir todas
las pipetas y marcando la sección en donde está colocado el filtro de la
pipeta para que así al manipularlas no se contaminen.
 Se introducirán las pipetas a la estufa a 120 C por 2 horas.
 Pasado este tiempo se sacarán de la estufa, pero cuidando de no
desenvolver las pipetas, para evitar su contaminación.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE AGROINDUSTRIA

Universidad Nacional Del

Pre – Informe del Experimento

“ Ingeniería del cultivo celular por lotes ”

II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:.............................................................3

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:....................................18

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS:..................................25

“ Ingeniería del cultivo celular por lotes ”

- “Diseñar una experiencia de cultivo celular por lotes en distintos

1.2. Específicos o terminales:

- Diseñar y preparar el medio liquido de cultivo.

Imagen 1: Pichia stipitis Imagen 2: Distintos tamaños

II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:

II.1. Diseño de Medios de cultivos:

El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección

con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como

No obstante que los microorganismos (Pichia stipitis NRRL Y-7124) varían

Para ello utilizamos un Medio de cultivo mínimo.

Volumen del medio

concentracion celular final "Xf"

Referencia de Composición de medios de mantención, activación y

- Medio Sólido De Mantención

Tabla 1: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL)

Nutriente Concentración (g/L) Peso (g)

- Medio Activación: (T:30°C y N: 150rpm)

Tabla 2: Concentración de Nutrientes para el medio de activación (30 mL)

Tabla 3: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación (200 ml)

Nutrientes Para El Medio De Fermentación:

 Nutriente Limitante: Xilosa

Composición de la solución de sales utilizadas en los medios de cultivos

Nutriente Concentración (g/l)

II.2. Preparación de medios:

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es

Para ello debemos tener en consideración los siguientes procesos:

ACONDICIONAMIENTO DE LOS MATERIALES

LAVAR Y SECAR Materiales de vidrio a

(Vasos precipitados, matraz y

ESTERILIZAR A 121 °C por 15 minutos

Matraz Nombre de cepa, Fecha

La boca del matraz para matar

En posición inclinada y seguir

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE MANTENCIÓN, SEGÚN LA TABLA 01

50ml de agua destilada

CALENTAR Hasta lograr una

Constantemente con un varilla por un

PREPARAR 6 tubos de ensayo con tapa.

6-7 ml de la mezcla en caliente a

Una vez tapados los tubos de

CALENTAR 121 ºC / 20 min

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN, SEGÚN LA TABLA

Xilosa, extracto de levadura,

DISOLVER Por separado los componente con

El volumen de las sales minerales.

Al matraz que contiene el extracto

ESTERELIZAR 121ºC – 15 min.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN, SEGÚN LA TABLA 03

Xilosa, extracto de levadura, (NH4)2SO4 ,

- Glucosa en un matraz de 1 L con agua

Una azada del Tubo de

LLEVAR A la Incubadora a 30°C

ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO

En el Matraz con los

TAPAR El Matraz con un tapón