Hígado Descelularización Protocolo Optimizado

Optimización de la descelularización hepática

Mantiene la microarquitectura y la composición
extracelular de la matriz que predisponen a la siembra
eficaz de la célula

Abstracto
La ingeniería hepática del tejido usando los andamios descelulares es una alternativa terapéutica potencial al trasplante
convencional. Sin embargo, los andamios se obtienen generalmente utilizando protocolos de descelularización que
destruyen la matriz extracelular (ECM) y dificultan la traducción clínica. Nuestro objetivo es desarrollar una técnica de
descelularización que mantenga confiablemente la microarquitectura hepática y los componentes ECM. Los hígados
aislados de la rata fueron descelulares por la técnica detergente-enzimática con (EDTA-det) o sin el EDTA (det). La
histología, la cuantificación de ADN y la proteómica confirmaron la descelularización con una mayor reducción del ADN
con la adición de EDTA. La cuantificación, la histología, la inmunotinción y la proteómica demostraron la preservación de
componentes de matriz extracelular en ambos andamios con una mayor cantidad de colágeno y glicosaminoglicanos en
el andamio EDTA-det. La microscopia electrónica de la exploración y la proyección de imagen del contraste de la fase de
radiografía demostraron la preservación de la microarquitectura, con los andamios EDTA-det ensamblados más
firmemente. La siembra de andamios det con una línea celular hepatocelular demostró repoblación completa en 14 días,
con células proliferantes en ese momento. La descelularización mediante det preserva la microarquitectura y los
componentes de la matriz extracelular, al tiempo que permite el crecimiento de las células durante un tiempo de hasta
14 días. La adición de EDTA crea una matriz más densa y compacta. El trasplante de los andamios y la ampliación de la
metodología son los siguientes pasos para la ingeniería hepática exitosa.

2013-STG-337057). Se y PDC son apoyados por Great Ormond Street Hospital children's Charity. Los autores también agradecen a la Royal
Society/Fundación Wolfson para la concesión de renovación de laboratorio de ingeniería tisular obtenida para el Departamento de cirugía
pediátrica del Instituto de salud infantil de UCL. Los donantes no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de
datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Intereses competidores: los autores han declarado que no existen intereses competidores.

Introducción
Los tejidos descelulares han proporcionado una opción para el tejido de la ingeniería para el trasplante y
para el modelado de la enfermedad. Sin embargo, los andamios ideales deben tener características
arquitectónicas y mecánicas que permitan la migración y proliferación de las células introducidas, un
perfil de biodegradación definido y una respuesta inmune mínima [1,2]. Para los órganos complejos,
tales como el hígado, la opción del andamio se limita a los materiales descelulares, en donde el retiro de
la célula del entero-órgano rinde una matriz extracelular tridimensional (ECM) [1,3].

La descelularización del hígado de la rata fue realizada inicialmente usando concentraciones de

aumento del sulfato del dodecil del sodio (SDS), seguida por Tritón-X 100 (TX100) [4]. Esto fue sucedido

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 Hígado Descelularización Protocolo Optimizado

por métodos usando el aumento de concentraciones de TX100, seguido por el SDS [5], una combinación
de tripsina, EDTA y TX100 [6], y una combinación de TX100 e hidróxido de amonio [7]. La inclusión de
agentes quelantes de iones, como EDTA y EGTA, se deriva de su uso rutinario para el aislamiento de
hepatocitos. La metodología general basada en detergentes como TX100 y SDS ha sido duplicada en
muchos laboratorios con ligeras variaciones [8–12]. La descelularización basada en SDS y TX100 también
se ha escalado-para arriba a animales más grandes [13–16]. Sin embargo, los protocolos actuales de
descelularización causan un daño sustancial al ECM y pueden hacer que la vasculatura sea demasiado
porosa para el trasplante exitoso. Esto se demuestra con eficacia en imágenes vasculares del bastidor en
los hígados de la rata descelulares por el 1% SDS y el 1% TX100 que demuestran la destrucción de la red
del vaso sanguíneo [9].

Hemos descelulardo previamente el intestino, el pulmón y el esófago [17–20] usando el agua

desionizada (DH2O), una baja concentración de un detergente suave (desoxicolato sódico; COSUDE) y
una enzima para remover restos de ADN. Este tratamiento enzimático detergente (det) [21] preserva la
microarquitectura del andamio y la red microvascular y ha permitido el trasplante clínico acertado de las
tráqueas humanas [22].

El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo de descelularización para el hígado de rata,
que preservará la microarquitectura y los componentes de ECM. Nuestro objetivo es examinar la
interacción entre las proteínas estructurales del andamio y los químicos det y EDTA para crear un
andamio que permita el trasplante a largo plazo.

Materiales y métodos cosecha de órganos

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones del animal (Scientific

Procedimientos) Ley 1986. El Ministerio del interior aprobó el protocolo de estudio (número de licencia
70/2716). 250 – 300 g ratas Sprague-Dawley (n = 100) fueron sacrificadas por Co 2 Inhalación. El abdomen
fue esterilizado con el etanol del 70% y una incisión en forma de "U" fue realizada para exponer la
cavidad abdominopelvic. La vena cava inferior abdominal (intravenoso) y la vena porta (picovoltio)
fueron identificadas y el picovoltio era Cannulated con una cánula 24G (BD, Reino Unido), que fue
asegurada en lugar con una sutura de seda 3 – 0 (Ethicon, Reino Unido). La endovenosa abdominal fue
ligada usando las suturas de seda próximas a la vena renal correcta y el intravenoso fue seccionado. El
diafragma fue utilizado como punto de la tenencia para soltar el hígado entero del tejido de soporte.
Todo el procedimiento se realizó con especial cautela para no dañar la cápsula del Glisson, que rodea el
órgano.

Descelularización

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Para el tratamiento del det, el picovoltio fue conectado con una bomba peristáltica (MASTERFLEX, Reino
Unido) y perfundido con DH2O (18,2 Mo/cm) por 36 horas a 4 ° c. Para el tratamiento con EDTA-det, los
hígados de rata fueron perfundidos con EDTA de 2mm (Sigma, UK) durante 15 minutos seguidos de DH 2O
por 36 horas a 4 ° c. Tanto det y EDTA-det hígados de rata fueron transferidos a temperatura ambiente y
perfundidocon el 4% SDC (Sigma, Reino Unido) por 6 horas seguida por la perfusión de 500 Ku/ml
ADNsa-I (Sigma, Reino Unido) en el cloruro de sodio del 1m (NaCl; Sigma, UK) durante 3 horas. El caudal
fue de 4,5 ml/min (DH2O) y 6,5 ml/min (SDC y ADNsa).

Histología
Las muestras fueron fijadas en paraformaldehido del 4% (PFA; Sigma, Reino Unido), deshidratado en
alcohol graduado, parafina encajada y seccionada en 5μm. Las diapositivas del tejido fueron manchadas
con haematoxylin y eosina (H&E; Leica, Alemania), trichrome de Masson (TA; Leica, Raymond un
cordero, BDH Chemicals Ltd), Picrosirio rojo (PR; Polisciences Inc., Alemania), elastina van Gieson (EVG;
VWR, Leica, Raymond un cordero), y Alcian azul (AB; BDH Chemicals Ltd, Cellpath Ltd) manchas. Los
controles positivos apropiados fueron utilizados para asegurar que las manchas histológicas fueron
realizadas correctamente (el pequeño intestino para el MT, el PR y el AB, piel para el EVG). Para todas las
muestras histológicas se evaluaron tres repeticiones biológicas y técnicas utilizando H&E estándar antes
de cualquier tinción especial para asegurar la homogeneidad. Todas las imágenes mostradas son
muestras representativas.

Immuno histochemistry
Después de la rehidratación de las diapositivas parafina-encajadas, y del amortiguamiento de la
actividad endógena de la peroxidasa usando el 1% H2O2 (Sigma, UK), la recuperación de antígenos se
realizó utilizando pepsina (Sigma, UK) a una concentración de 1 mg/ml en 1N HCl (Sigma, Reino Unido), a
37 ° c durante 60 minutos. Las diapositivas eran entonces permeabilized con 0,2% Tritón X-100 (Sigma,
Reino Unido) por 60 minutos y bloqueado en 1% BSA (Sigma, Reino Unido) por 30 minutos. Los
anticuerpos primarios fueron utilizados contra fibronectina (Abcam, Reino Unido), laminin (Abcam,
Reino Unido), colágeno I (Abcam, Reino Unido), colágeno III (Abcam, Reino Unido), y colágeno IV
(Abcam, Reino Unido) en las diluciones de 1:100, en BSA el 1% durante la noche. La tinción se ha
visualizado mediante el sistema de detección de ImmPRESS (vector Laboratories, CA, USA). Una vez que
diaminobencidina (DAB sustrato kit, BD Pharmingen) tinción se desarrolló, las secciones fueron
deshidratadas y montadas en Eukitt medio de montaje (Fluka, Sigma, Reino Unido). El tejido fresco
apropiado y ningunos controles primarios del anticuerpo fueron utilizados para asegurar positividad
apropiada del tejido. Se evaluaron tres repeticiones biológicas y técnicas. Todas las imágenes mostradas
son muestras representativas.

Cuantificación de ADN
El ADN fue aislado usando un kit de aislamiento de ADN tisular (PureLink genomic DNA MiniKit,
Invitrogen, UK) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, las muestras fueron digeridas
durante la noche usando proteinasa K y un buffer de digestión. Las muestras de ADN fueron purificadas
usando lavados de alcohol y medidos por espectrofotometría (nanogotas, termo-científicos, EE. Se
utilizaron densidades ópticas en 260nm y 280 nm para estimar la pureza y el rendimiento de los ácidos
nucleicos. Para todas las cuantificaciones se obtuvieron al menos tres repeticiones biológicas y técnicas.

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Cuantificación de colágeno
El contenido de colágeno de los tejidos nativos y descelulares fue cuantificado utilizando el kit de ensayo
de colágeno total (QuickZyme biociencias, Países Bajos). Brevemente para el colágeno, las muestras
fueron hidrolizadas en 6N HCl a 95 ° c durante 20 horas, los hidrolizados se mezclaron con una solución
de cromógeno que tiñeba residuos hidroxiprolina y el color se desarrolló a 60 ° c durante 1 hora. La
absorbancia para cada muestra se determinó a 555 nm utilizando un lector de microplacas 200 Pro
infinito (TECAN, Estados Unidos) y la cantidad de colágeno se calculó a partir de una curva estándar de
concentraciones conocidas de hidrolizados de colágeno puro. Para todas las cuantificaciones se
obtuvieron al menos tres repeticiones biológicas y técnicas.

Cuantificación de elastina
El contenido de elastina de los tejidos nativos y descelulares fue cuantificado utilizando el ensayo de
elastina Fasten (Biocolor, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las muestras
fueron homogeneizadas, y la elastina fue solubilizada en el ácido oxálico 0,25 M. Dos incubaciones
consecutivas fueron realizadas en 95 ° c para asegurar la extracción completa de la elastina. Los
extractos fueron incubados con 5, 10, 15, 20-tetrafenilborato-21H, el tinte de tetrasulfonate 23h-
porphine (TPP), y la absorbancia fue determinada en 555 nanómetro espectrofotometally (el infinito de
TECAN, los e.e.u.u.). Se utilizaron concentraciones de elastina de una curva estándar para calcular el
contenido de elastina del tejido. Para todas las cuantificaciones se obtuvieron al menos tres repeticiones
biológicas y técnicas.

Cuantificación de glycosaminoglycan (gag)

El contenido de la mordaza del tejido nativo y descelular fue cuantificado usando el kit del análisis de la
mordaza de Blyscan (Biocolor, Reino Unido). Brevemente, los tejidos fueron digeridos con papaína en 65
° c por 18 horas y las alícuotas de cada muestra fueron mezcladas con el tinte azul del 1, 9-dimethyl-
metileno y los reactivo del kit del análisis de la mordaza. La absorbancia a 656 Nm se midió por
espectrofotometría (TECAN Infinity, US) y se comparó con las normas hechas de condroitina-4-sulfato de
la tráquea bovina para determinar el contenido de la mordaza. Para todas las cuantificaciones se
obtuvieron al menos tres repeticiones biológicas y técnicas.

Microscopía electrónica de barrido (SEM) y cuantificación

Las muestras se fijaron en 2,5% de glutaraldehído en tampón de fosfato de 0,1 M (PBS; Sigma, UK) y se
fue por 24 horas a 4 ° c. Después del lavado con PBS de 0,1 M, fueron cortados en segmentos de
aproximadamente 1 cm de longitud y cryoprotected en 25% de sacarosa (Sigma, UK), 10% de glicerol en
0,05 M PBS (pH 7,4) durante 2 horas, luego congelados rápidamente en nitrógeno granizado y
fracturados a aproximadamente-160 ° c. Las muestras fueron colocadas nuevamente en el crioprotector
a temperatura ambiente y permitieron descongelarse. Después del lavado en PBS de 0,1 M (pH 7,4), el
material fue fijado en OsO del 1%4 /0,1 m PBS (pH 7,3) a 3 ° c durante 1 ½ horas y se lava de nuevo en
graduada del etanol-agua al etanol del 100%, punto crítico secado usando el Co 2 y finalmente montado
sobre los talones de aluminio usando golpecitos pegajosos del carbón. El material fue montado para
presentar las superficies fracturadas a través del parénquima a la viga y revestida con una capa delgada
de au/PD (aproximadamente 2nm gruesa) usando un recubridor de haz de iones Gatan. Las imágenes se
registraron con un microscopio electrónico de barrido 7401 FEG (JEOL, US). Para fines de cuantificación,
un observador cegado evaluó las imágenes tomadas en 200x utilizando la herramienta Measure en

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ImageJ (NIH, EE. Para todas las muestras examinadas con SEM se evaluaron tres repeticiones biológicas y
técnicas. Antes del análisis del SEM la homogeneidad del tejido fue determinada usando la histología
estándar.

Imágenes de contraste de fase de rayos x (XPCI) basadas en sincrotrón

Las mediciones se realizaron en el Beamline biomédico (i17) de la instalación de radiación de sincrotrón
Europea en Grenoble, Francia. Las muestras fueron colocadas aproximadamente a 150 m de la fuente
(un ondulador de 21 polos, 15 cm de período), para asegurar una iluminación espacialmente coherente.
El haz fue monocromado por una salida fija de silicio Laue/Laue (111) de cristal doble a 26 keV (ΔE/E ~
0.02%) y filtrado con 0,8 mm de cobre y 3 mm de aluminio. La muestra había sido colocada en una etapa
de rotación de PI micos (PI mi-cos GmbH, Eschbach, Alemania) para permitir adquisiciones tomográficas.
Las imágenes fueron grabadas por una cámara CCD FReLoN acoplada a una GD de 47 μm de
espesor3Ga5O12Scintillator. El tamaño efectivo del pixel era 3.5 x 3.5 micrones 2. 2000 proyecciones sobre
360 ° fueron adquiridas, con un paso angular de 0,18 °. Las imágenes se recuperaron mediante el
método "de una sola distancia" desarrollado por Paganinet al, y las reconstrucciones 3D realizadas
mediante proyecciones de retroproyección estándar [23]. Para todas las muestras examinadas con XPCI
se evaluaron dos repeticiones biológicas y técnicas. Antes del análisis XPCI la homogeneidad tisular se
evaluó mediante histología estándar.

Imágenes de redes vasculares

La imagen de la red vascular se llevó a cabo en los andamios descritos anteriormente [18]. Para la
visualización del árbol vascular, el 1% azul de Trypan (Sigma, Reino Unido) fue perfundido en el andamio
en un índice de 2 ml/min. Un iPhone 4S (Apple, US) se usó para filmar la infusión e iMovie para separar
los tiros aún. Las películas fueron subidas en Fiji (NIH, los e.e.u.u.), los bordes de los andamios
delineados, y siguiendo una colocación del umbral para el fondo blanco, la intensidad y el área cubrieron
por el tinte infundido medido a través del stillshots. Para todas las imágenes de la red vascular se
obtuvieron al menos tres repeticiones biológicas y técnicas. Los análisis mostrados en las figuras son
muestras representativas.

Extracción de proteínas, separación y digestión de proteínas en gel

Se realizó un análisis de Proteómica de prueba de concepto que comparó el hígado fresco, los andamios
det y EDTA-det (n = 1). Antes del análisis de proteómica, una biopsia de punzón y una histología estándar
confirmaron la descelularización apropiada. Proteínas extraídas de muestras de hígado fresco,

Las muestras de hígado tratada con EDTA-det y det fueron separadas por 12% SDS-PAGE, bajo
condiciones de reducción. Las proteínas fueron visualizadas por tinción plateada (ProteoSilver Plus,
Sigma, UK), y bandas (32 rebanadas horizontales para cada muestra) suprimidas del carril de gel y
decoloradas utilizando una solución que contenía 100 mm de sodio tiosulfato y 30 mm de potasio
ferricianuro en proporción 1:1. las muestras se redujeron en TDT de 10 mm y se alquilaron con
iodoacetamide de 100 mm utilizando el instrumento de investigación progresivo (DigiLab, Genomics
Solutions, Cambs, UK) según el protocolo establecido [24]. Finalmente, cada pieza de gel seco fue
rehidratada en 30 μl de solución de bicarbonato de amonio de 50 mm que contenía 250 ng de tripsina
de oro, grado de espectrometría de masas (Promega, Madison, USA), e incubada a 37 ° c durante la

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noche. El trypsinolysis fue parado con el ácido fórmico 0,1% (FA), y los péptidos tríptico fueron
enjuagados, secado al vacío, y disueltos en 0,1% FA para LC − MS/MS.

Espectrometría de masas
Se realizó un análisis LC − MS/MS con un espectrómetro de masas LTQ-velos (Thermo Fisher

Scientific, UK). Las muestras del péptido fueron cargadas usando un UPLC de la nanoabsolver (aguas, UK)
con la simetría C18 180 μm × 20 milímetro (número de parte de las aguas 186006527) columna de la
interceptación para la desalación y después introducida en el MS vía una columna capilar fundida de la
silicona (100 μm i.d.; 360 μm o.d.; longitud de 15 centímetros; 5 μm Partículas C18, NikkyoTechnos Co,
Tokio, Japón) y una fuente de iones nanoelectrospray a un caudal de 0,42 μl/min. La fase móvil abarcó
H2O con 0,1% FA (buffer a) y 100% acetonitrilo con 0,1% FA (buffer B). El gradiente varió de 1% a 30% de
tampón b en 95 min seguido de 30% a 60% b en 15 min y un gradiente de paso a 80% b por 5 min con un
flujo de 0,42 μl/min. En el analizador velos-Orbitrap se adquirieron los espectros ms del precursor de la
gammagrafía (400 − 1600 m/z) con una resolución de r = 60 000. Esto fue seguida por la fragmentación
dependiente del MS/MS de los datos en el modo centroide del ion más intenso de la exploración de la
encuesta usando la disociación inducida colisión (CID) en la trampa linear del ion: energía normalizada
35% de la colisión; activación Q 0,25; voltaje 1,4 kilovoltio del aerosol; temperatura capilar 200 ° c; y el
aislamiento anchura 2,00. Los iones apuntados fueron excluidos dinámicamente para 30 s, y este
acontecimiento de la exploración de MS/MS fue repetido para los 20 picos superiores en la exploración
de la encuesta de MS. Los iones cargados por separado fueron excluidos del análisis de MS/MS, y la
versión del software de XCalibur 2.0.7 (Thermo Fisher Scientific, UK) fue utilizada para la adquisición de
datos.

Identificación de proteínas
96 RAW archivos MS (32 para cada condición experimental probada) fueron cargados y montados por
MaxQuant (versión 1.4.1.2) y visualizado por Perseus (versión 1.4.1.3) plataforma de software. La lista de
picos generada por Quant. exe (la primera parte de MaxQuant) fue buscada usando el motor de
búsqueda de Andrómeda contra los archivos de rata rapida (Rat. FASTA. gz) descargados del sitio web de
UniProt: FTP://ftp.UniProt.org/pub/Databases/UniProt/current_release/Knowledgebase/ proteomas,
última modificación 19/2/2014. Los parámetros seleccionados para el análisis máximo-Quant incluyeron
la especificidad enzimática de la tripsina, 2 hendiduras tríptico faltadas, la oxidación de la metionina y la
acetilo de la proteína N-terminal como modificaciones variables y la cisteína carbamidomethylation
como modificación fija . Además, se aplicaron los siguientes parámetros para realizar la búsqueda de la
base de datos: una longitud mínima de péptidos de 6 aminoácidos, un mínimo de 1 péptido identificado,
un mínimo de 1 navaja + péptido único y un mínimo de 1 péptido único, Top 6 MS/MS picos por 100 da ,
una tolerancia de la masa del péptido de 10 ppm para los iones del precursor, y una tolerancia de 0,5 da
para los picos de MS/MS. Todas las proteínas se filtraron de acuerdo a una tasa de descubrimiento falso
(FDR) de 0,01% aplicada a niveles de péptido y proteína y una probabilidad de error posterior del
péptido máximo (PEP) de 1. Los archivos de la salida de MaxQuant fueron subidos posteriormente en
Perseus para visualizar y para combinar en una matriz los resultados obtenidos para las 3 diversas
condiciones experimentales así como para agregar van la Asociación del término para cada grupo de la
proteína y para obtener los datos para el Venn Diagrama.

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Cultivo celular y siembra de andamios
Las células de HepG2 fueron cultivadas usando DMEM/F12 (tecnologías de la vida, Reino Unido) suplidas
con el FCS del 10% (Sigma, Reino Unido) y tripsinaed y contado antes de sembrar. Los andamios
hepáticos det (n = 3) se dividieron en lóbulos (n = 15) y se colocaron en placas de Petri individuales con
alta glucosa DMEM y 1% penicilina/estreptomicina (Sigma, Reino Unido). Las células fueron
resuspendidas en 1106concentración de/ml y 2106 inyectado por lóbulo multifocal (~ 30
inyecciones/lóbulo) usando una aguja 33G (laboratorio de PS, Japón). Los andamios sembrados se
mantuvieron en medio de hepatocitos en un ambiente humidificado a 37 ° c con un 5% Co 2 hasta 14 días.
El medio fue cambiado cada 2 días. En los días 1, 4 y 14 siguientes a la siembra, los andamios se
colocaron en PFA al 4% y se evaluaron por histología e inmunofluorescencia.

Inmunofluorescencia
Los andamios sembrados fueron fijados en el 4% PFA durante la noche, parafina encajada y seccionada
en 5μm. Las secciones fueron rehidratadas, permeabilized (0,2% TX100, 30 min) y la recuperación de
antígeno mediada por calor se realizó usando un tampón de citrato. Se utilizaron anticuerpos primarios
contra Ki67 (Abcam, UK) y separadores-caspasa 3 (señalización celular, Reino Unido) (dilución 1:100)
durante la noche a 4 ° c.

Las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado Alexa-488 (tecnologías de la vida)
(dilución 1:100) a temperatura ambiente durante 1 hora. Los núcleos fueron contrateñidos con DAPI
(dilución 1:1000) y el negro de Sudán se usó para apagar la fluorescencia automática. Para la
cuantificación, se contabilizaron un mínimo de 500 células de más de 8 a 10 campos de visión a x63
aumento para cada punto de tiempo en un experimento cegado. Para todas las cuantificaciones se
evaluaron tres repeticiones biológicas y técnicas.

Resultados
Después del primer paso de la det (DH 2O), los hígados adquirieron una apariencia blanqueada. El
tratamiento con SDC y ADNsa llevó a la translucidez con los vasos visibles internamente. No se
observaron diferencias macroscópicas entre los hígados de rata tratados previamente con EDTA y los
tratados con det (Fig 1A y 1B). La ausencia de células se observó en las secciones teñidas con H&E (Fig
1C), mientras que la cuantificación de ADN reveló una reducción significativa en la cantidad de ADN
entre el hígado fresco y el hígado sometido a cualquier tratamiento de descelularización (p < 0.001; Fig
1D). La adición de EDTA redujo aún más la cantidad de ADN en comparación con el tratamiento det (p <
0.001). La proteómica cuantitativa de escopeta confirmó la descelularización que muestra la ausencia de
marcadores nucleares (Ntf2, H2A) y citoplásmicos (Rpl39, Tim9) seleccionados de las muestras de hígado
tratadas con EDTA-det y det (Fig 1E y 1f). Por otra parte, el tratamiento con EDTA-det fue más eficiente
en la eliminación de proteínas celulares como la proteína nuclear Sub1 y la proteína citoplásmica Tim13
podría identificarse en la muestra det (Fig 1E y 1f).

Los componentes del ECM fueron evaluados por medio de tinción y cuantificación. La tinción de MT
demostró que el componente celular era detectable sólo en el tejido fresco (Fig 2A). La tinción de RP
mostró que el tejido conectivo estaba compuesto principalmente por fibras de colágeno y era más
compacto más cerca de los vasos sanguíneos en el tejido fresco y descelular (Fig 2B). EVG tinción
confirmó el mantenimiento de las fibras de elastina en la superficie interna de los vasos sanguíneos en

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los hígados frescos y descelulares (Fig 2C). La coloración del AB confirmó la presencia de mordaza en las
fibras de los andamios det y EDTA-det (Fig 2D). La cuantificación de colágeno de los andamios det no
demostró cambios significativos en comparación con el tejido fresco (Fig 2E). Los andamios EDTA-det
habían aumentado el colágeno en comparación con el tejido fresco (p < 0.05) y los andamios det (p <
0.01; Fig 2E). La cuantificación de la elastina demostró una disminución en los andamios det (p < 0.001) y
EDTA-det (p < 0.01) a aproximadamente el 20 – 40% del tejido fresco (Fig 2F). De manera similar al
colágeno, el contenido de elastina de los andamios EDTA-det fue mayor que los andamios det (p < 0.05;
Fig 2F). El contenido de la mordaza de los andamios det y det-EDTA se redujo significativamente en
comparación con el tejido fresco (p < 0.001; Fig 2g); sin embargo, no hubo diferencias en el contenido
entre los andamios det y det-EDTA. La inmunotinción demostró colágeno I en el hígado fresco como
hebras finas en el espacio parenquimal, así como alrededor de los vasos sanguíneos (Fig 3A). Esto fue
preservado después de la descelularización con una señal fuerte de las estructuras vasculares en det y
los andamios de EDTA-det. La inmunotinción contra el colágeno III y IV demostró una distribución similar
en los tejidos frescos y descelulares (Fig 3B y 3C). La coloración parenquimal débil fue observada, con
una señal fuerte que rodeaba las estructuras vasculares y biliares. La coloración fuerte del fibronectina
fue observada alrededor de los vasos sanguíneos principales en tejido fresco con un patrón más
distribuido de la señal en los andamios descelulares (Fig 3D). La inmunotinción contra la laminina fue
positiva sólo alrededor de los vasos sanguíneos principales en los tejidos frescos y descelulares (Fig 3e).
El análisis de la proteómica reveló 679 proteínas en común entre el tejido fresco, det y EDTA--

DET andamios, mientras que 231 proteínas fueron identificadas únicamente en los andamios
descelulares (Fig 2H). Los componentes principales del ECM fueron identificados en las muestras
descelulares y no pudieron ser detectados en tejido fresco. Por ejemplo, las proteínas pertenecientes a
la familia de colágeno (IV, VIα2 y XVIII), glicoproteínas como fibulin (Fb5), Nidogen (ND1) y la familia
laminina de glicoproteínas se detectaron en los andamios det y EDTA-det, pero no fueron detectables en
la muestra fresca (Fig 4a – 4C). La misma tendencia se observó en las proteínas del ECM (Fig 4D). Una
lista completa de las proteínas identificadas con la indicación de la intensidad medida en cada muestra
se resume en la información complementaria (Tabla S1).

SEM confirmó más lejos la ausencia completa de células, mientras que los andamios consistieron en
una red tridimensional de fibras del tejido conectivo dispuestas en a panal-como la estructura. La
estructura de la tríada del portal fue identificada claramente en la ampliación baja en fresco, det y

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Fig 1. La descelularización del hígado de la rata se alcanza después de un ciclo de los tratamientos det y EDTA-det. (A) plazo e infusión de
soluciones para los protocolos det y EDTA-det. (B) la apariencia macroscópica de los andamios hepáticos no mostró diferencias entre los
andamios det y EDTA-det. Siguiente DH2O además, los hígados se blanquearon, con la COSUDE y la adición de ADNsa resultando en la
transparencia de los hígados. (C) la coloración H&E demostró la ausencia de células en secciones de los andamios det y EDTA-det. (D) la
cuantificación del ADN redujo el ADN en los andamios det y EDTA-det en comparación con el tejido fresco (p < 0.001). (E-F) Histogramas que
muestran las intensidades de la señal, asociadas a las proteínas nucleares relevantes (e) y a las proteínas citoplásmicas (F); ‡: p < 0.001, en
comparación con el tejido fresco, #: p < 0.001, en comparación con el andamio det, barra de escala en imágenes macroscópicas: 2cm, barra de
escala en la histología: 100 μm.

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Fig 2. La descelularización preserva los componentes del ECM, con una mayor cantidad de colágeno y elastina presentes en el andamio EDTA-
det. (a) la coloración de MT demostró acellularity en ambos andamios, demostrando la composición solamente por el tejido fino conectivo. (B)
la coloración de RP demostró la composición sobre todo por las fibras del colágeno. (C) la coloración EVG reveló el mantenimiento de las fibras
de la elastina en la superficie interna de los vasos sanguíneos. (D) la tinción AB confirmó la presencia de mordaza en ambos andamios. (E) el
colágeno se incrementó significativamente en los andamios con EDTA-det (p < 0.01) en comparación con el tejido fresco. (F) la elastina
disminuyó significativamente en los andamios det (p < 0.001) y EDTA-det (p < 0.01) en comparación con el tejido fresco. La elastina fue mayor en
los andamios con EDTA-det en comparación con los andamios det (p < 0.05). (G) la cuantificación de la mordaza mostró que mientras que los
andamios det y EDTA-det habían reducido significativamente la cantidad de mordaza, los andamios EDTA-det tenían significativamente menos
en comparación con los andamios det (p < 0.001). (H) diagrama de Venn que muestra el número y la distribución sobre los tipos de muestras de
proteínas identificadas en los tejidos hepáticos tratados frescos, det y EDTA-det; *: p < 0.05, †: p < 0.01, ‡: p < 0.001, en comparación con el
tejido fresco, §: p < 0.05, | |: p < 0.01, en comparación con det andamio, barra de escala: 100 μm.

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Hígados EDTA-det (Fig 5a – 5C, asterisco). Curiosamente, los andamios preparados con EDTA-det fueron
empacados más estrechamente en comparación con los andamios det, ya que la estructura porosa
parecía comprimirse (Fig 5C). La cuantificación confirmó el cambio en la microarquitectura, demostrando
una reducción del bolsillo del hepatocito de 20.9 ± 0.5 μm a 11.3 ± 0.3 μm (p < 0.001; Fig 5D). Los XPCI
basados en sincrotrón también mostraron un tejido más denso en los andamios EDTA-det en

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comparación con det (Fig 5e y 5F). Mientras que los recipientes principales se pueden ver claramente en
ambos andamios, el

Fig 3. La inmunotinción demuestra la preservación de las proteínas ECM en los andamios descelulares. (a) el colágeno I que manchaba en tejido
fresco era positivo como filamentos finos en el espacio parenquimal así como alrededor de los vasos sanguíneos (asterisco). Esto fue preservado
después de la descelularización con una señal fuerte de las estructuras vasculares en det y los andamios de EDTA-det. (B, C) El colágeno III y la
coloración IV del colágeno demostraron una distribución y una preservación similares en tejido fresco y los andamios descelulares. La coloración
parenquimal débil fue observada, y una señal fuerte que rodeaba las estructuras vasculares y biliares. Los andamios EDTA-det demostraron una
coloración ligeramente mayor en el espacio parenquimal en comparación con los andamios det. (D) el fibronectina demostró la coloración
fuerte alrededor de los vasos sanguíneos principales en tejido fresco con un patrón más distribuido de la señal en andamios descelulares. (E)

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laminina mostró fuerte tinción alrededor de los vasos sanguíneos principales en tejido fresco con un patrón de señal más distribuido en
andamios descelulares; barra de escala: 100 μm.

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Fig 4. La proteómica demuestra la preservación de los componentes de ECM en los andamios descelulares. Histogramas que muestran las
intensidades de la señal, basándose en los conteos de iones extraídos, medidos para cada péptido identificado y asociados a proteínas
pertenecientes, en consecuencia a la clasificación GOCC, a la clase de colágenos (a), glicoproteínas (B), laminina ( C) y proteínas de matriz
extracelular (D).

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la naturaleza más compacta del tejido hace que la sombra de gris en la imagen del andamio EDTA-det en
general sea más intensa, lo que, en una imagen recuperada en fase, se correlaciona directamente con
una mayor densidad (S1 Y S2 Videos).

La perfusión azul de Trypan a través del picovoltio demostró el mantenimiento de la red vascular sin la
salida del tinte al tejido circundante, pues el tinte fluyó a la vena cava (Higo 5g, S3 Y S4 Videos).
Macroscópico, los andamios del det parecían poseer una red vascular más compacta con el tinte que
difundía a través de los recipientes más fácilmente (Higo 5g). El análisis cuantitativo de la distribución del
tinte usando Fiji (NIH, los e.e.u.u., 1.47 h) confirmó esto. La intensidad de la infusión del tinte a través de
los andamios del det siguió una curva S-formada, alcanzando un punto máximo en aproximadamente 35
segundos (Fig 5h). La intensidad del tinte dentro del andamio del EDTA-det aumentó de una manera S-

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formada menos escarpada con la parte exponencial que duraba 45 segundos en vez de 15 (Fig 5h). La
intensidad máxima se alcanzó a 75 segundos. Estos resultados fueron paralelos por la cuantificación de
la superficie de distribución de tinte con el punto de cobertura de superficie máxima con una diferencia
de 40 segundos entre los dos andamios (Higo 5i). Esto está de acuerdo con los datos de SEM y de XPCI
que demuestran una apariencia más compacta del tejido después del tratamiento EDTADET.

Fig 5. La adición de EDTA al protocolo hace que la matriz sea más compacta en el parénquima y la vasculatura. (A-C) SEM confirmó acellularity
en los andamios, demostrando la composición por una red tridimensional de fibras del tejido conectivo dispuestas en un panal-como manera.
La estructura de las tríadas del portal fue identificada claramente en la ampliación baja (asterisco). (C) los andamios preparados con EDTA-det
fueron empacados más estrechamente en comparación con los andamios det, ya que la estructura porosa parecía comprimirse. (D) la
cuantificación de los bolsillos de hepatocitos en el andamio EDTA-det mostró una reducción de aproximadamente 50% del tamaño en los
andamios det. (E, F) Las imágenes de contraste de la fase de rayos x basadas en sincrotrón corroboraron estos resultados, demostrando un
andamio más denso en los andamios pretratados con EDTA. (G) la infusión del tinte azul de Trypan vía la vena porta demostró el mantenimiento

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de la arquitectura de la red vascular. No había ninguna salida del tinte a través de las paredes al tejido circundante; el tinte siguió el camino
regular del flujo a la vena cava. Macroscópico, los andamios del det fueron considerados para poseer una red vascular más densa con el tinte
que difundía a través de los recipientes más fácilmente. (H) la intensidad del colorante dentro de los andamios det siguió una curva en forma de
S, alcanzando un punto máximo en aproximadamente 35 segundos. La intensidad del tinte dentro del andamio del EDTA-det aumentó de una
manera S-formada menos escarpada con la parte exponencial que duraba 45 segundos en vez de 15. La intensidad máxima se alcanzó a 75
segundos. (I) estos resultados fueron paralelos por la cuantificación de la superficie de la distribución del tinte con el punto de la cobertura
máxima de la superficie que tenía una diferencia de 40 segundos entre los dos andamios; #: p < 0.001, en comparación con el andamio det,
barra de escala: 1 cm.

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Después de haber identificado los andamios det como una opción más adecuada para la ingeniería
tisular debido a una mejor preservación de la micro-arquitectura y componentes ECM, se evaluó la
biocompatibilidad del andamio con la siembra de una línea celular hepatocelular. Las células de HepG2
fueron microinyectadas de una manera multifocal en los andamios det y las construcciones sembradas
fueron cosechadas en el día 1, 4 y 14 (Fig 6A). La coloración H&E demostró una distribución amplia del
injerto celular a través del andamio en el día 1 y la repoblación completa en 2 semanas (Fig 6B). En un
aumento más alto, la histología demostró las células que repoblaban los espacios hepáticos vacíos y
formando colonias (Fig 6C). La inmunofluorescencia que manchaba contra Ki67 demostró altos números
de células de la proliferación en los primeros dos tiempo-puntos y solamente algunas células Ki67-
positivas en 14 días (Fig 6D). La cuantificación por un observador cegado mostró 6.4 ± 1%, 16.9 ± 1,3% y
7.7 ± 1.8% de células positivas Ki67 en los días 1, 4 y 14 respectivamente (Fig 6F). La tinción de CC-3
demostró unas pocas células de apoptosis en los tres puntos de tiempo (Fig 6E). La cuantificación de las
células CC-3-positivas mostró un aumento no significativo de 2,2 ± 0.8% a 4 ± 1% a 4,1 ± 0.8% en los días
1, 4 y 14 (Fig 6G).

Discusión
La ingeniería del tejido hepático hasta ahora ha tenido un éxito limitado en estudios de trasplante de
animales, en parte debido a la filtración vascular de los andamios descelulares. Describimos un andamio
hepático de la rata obtenido usando un proceso apacible de la descelularización que preserva la
microarquitectura, componentes del ECM, y mantiene un ambiente conveniente para el crecimiento de
células resembradas.

En primer lugar, hemos descrito una descelularización efectiva det en la tráquea porcina [25] y,
además de nuestra aplicación clínica exitosa de la tráquea descelular en un niño [22], hemos explorado
más recientemente este tratamiento simple en órganos más complejos como el pulmón y el intestino
[17–19]. El det utiliza agentes de descelularización suaves a concentraciones bajas, sin embargo, debido
a la naturaleza compacta y altamente celular del tejido hepático, más desafíos potencialmente podrían
estar presentes y por lo tanto los tratamientos adicionales pueden ser necesarios. Comparamos así la
descelularización usando nuestros agentes normales del det contra un protocolo en el cual el EDTA
también fue utilizado.

El protocolo de descelularización se modificó ligeramente en comparación con nuestro trabajo en la

tráquea, el esófago, el intestino y el pulmón. Usamos pasos de perfusión más largos de DH 2O y SDC, este
último está determinado por el tiempo requerido para alcanzar la transparencia. Para mantener el
hígado inflado completamente durante la perfusión, la velocidad de la perfusión fue aumentada a partir
de 4,5 ml/min (en el DH2O Step) a 6,5 ml/min (en los pasos SDC y ADNsa-I), con el protocolo completo

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que dura 45 horas. Los protocolos publicados hasta ahora han utilizado una variedad de velocidades de
perfusión con protocolos que duran de 2 a 52 horas [4–16,26,27]. Los principales factores de un
protocolo de descelularización que determinan su duración son los químicos utilizados, su concentración
y el caudal. La descelularización con la preservación de la microarquitectura debe implicar los productos
químicos suaves, en las concentraciones bajas y los índices de flujo correspondientemente bajos. Los
protocolos más cortos (2 – 3 horas) tenían altas tasas de perfusión (10 – 30 ml/min), altas
concentraciones de SDS y TX100, o ambos [5,8,11,12]. A las 45 horas logramos la descelularización
utilizando un caudal de 5 – 6,5 ml/min. Esto puede ser difícil para todas las especies, sin embargo,
recientemente hemos demostrado por primera vez que la descelularización completa de todo el hígado
humano con una arquitectura preservada todavía requiere SDS y TX100 [26]. La necesidad de
metodologías de descelularización más suaves que eviten el SDS y

TX100 llevó a nuestra comparación de los protocolos det y EDTA-det. En el hígado de rata, la adición de

El EDTA redujo aún más el contenido de ADN comparado con det solo. La concentración de

El EDTA que aplicamos (2m m) ha sido utilizado previamente por otros laboratorios [12,13,16]. Cheng

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Fig 6. La siembra de los andamios det por microinyección demuestra repoblación completa a los 14 días. (a) los andamios det fueron
microinyectados con células HepG2 de forma multifocal y las construcciones sembradas cosechadas en el día 1, 4 y 14. (b) la tinción de H&E
demostró una amplia distribución a través del andamio en el día 1 y una repoblación completa a los 14 días (B). En un aumento más alto, las
células fueron consideradas que repoblaban los espacios hepáticos, formando colonias y secretando su propio ECM en 14 días (C, asterisco). La
coloración Ki67 demostró la proliferación en los días 1 y 4, con solamente algunas células Ki67-positivas en 14 días (D).
Cuantificación de células Ki67 como porcentaje de células DAPI (F). La tinción para CC-3 mostró algunas células positivas a través de los tres
puntos de tiempo (E), con cuantificación que demostraba un aumento no significativo (G); barra de escala: 100 μm.

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et al utilizaron una mayor concentración al 0,2%, mientras que Soto-Guttierez et al prefirieron el uso de
EGTA, un compuesto similar que se une preferencialmente con iones de calcio [6,27]. A pesar de que la
descelularización con EDTA-det aún conserva aproximadamente el 10% del ADN, un valor ligeramente
más alto cuando se compara con los resultados publicados que demuestran reducción a 0,5 – 5%, la
evidencia histológica demuestra la eliminación de las células tanto en det como en EDTA-det
Andamios[4–16,26,27].

Después de la demostración de acellularity, intentamos evaluar el mantenimiento de los componentes

del ECM en los andamios det y EDTA-det. La examinación histológica usando la TA demostró la
preservación de la estructura porta y lobulada del tejido conectivo. La tinción de PR, EVG y AB demostró
la preservación de los componentes de colágeno, elastina y mordaza, respectivamente. Las manchas
histológicas no indicaron diferencias gruesas entre los dos andamios; sin embargo, investigamos los
componentes del ECM más lejos usando análisis cuantitativos. El colágeno fue mantenido al mismo nivel
que el tejido fresco después del tratamiento del det, como se ha demostrado para los protocolos del SDS
y del TX100 [4,11]. Curiosamente, la adición de EDTA aumentó el contenido de colágeno en un 300%. El
aumento en el contenido de colágeno en comparación con el tejido fresco es probablemente debido a la
normalización por el peso húmedo (que incluye el peso de los componentes celulares en el tejido fresco)
junto con la naturaleza más compacta de los andamios EDTA-det como se muestra por SEM, XPCI y
vascular Análisis de redes. Hemos demostrado previamente un aumento en el colágeno después del
proceso de descelularización [17,26]. Ningún protocolo que contiene EDTA ha cuantificado componentes
de ECM para comparar con [6,12,13,27]. Se observaron resultados similares con la cuantificación de la
elastina, con los tratamientos det y EDTA-det, reduciendo el contenido de elastina a 30% y 40%,
respectivamente, comparado con el tejido fresco, que también es comparable al 10 – 50% reportado en
otros trabajos publicados [11,26]. La cuantificación de la mordaza es más compleja ya que
aproximadamente el 30% de la mordaza está asociada con las membranas celulares [28,29], sugiriendo
que cualquier pérdida de la mordaza se asocia sobre todo al proceso de la descelularización y solamente
secundario con el retiro de la mordaza atado a las fibras del ECM. La mordaza es importante para las
matrices descelulares, ya que están asociadas con factores que estimulan el crecimiento celular y la
diferenciación que son esenciales para el exitoso trasplante de los andamios sembrados. Las
cuantificaciones de gag demostraron una reducción de alrededor del 20% de los valores de tejido fresco
con EDTA con un valor ligeramente menor. La mordaza en el andamio de EDTA-det puede ser más baja
que ésa en det debido a la descelularización mejorada que quita más remanente celulares de la
membrana y así cualquier mordaza asociada.

Puesto que la microarquitectura del andamio es dependiente en la presencia de colágeno y de

elastina investigamos estas proteínas usando immunohistochemistry y proteómica. La localización de las
proteínas específicas del ECM (colágenos I, III, IV, fibronectina y laminina) demostró la preservación
después de la descelularización sin diferencias perceptibles entre los andamios det y EDTA-det. Los
colágenos demostraron la coloración fuerte alrededor de los vasos sanguíneos principales y de la
coloración parenquimal débil. La coloración del laminin era solamente positiva alrededor de los vasos
sanguíneos principales, ambos en tejido fresco y descelulardo, según lo divulgado previamente
[7,8,12,15]. La coloración de fibronectina era también constante con la literatura, apareciendo alrededor

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de los vasos sanguíneos y dentro de la parenquimia [7,8,12]. La proteómica confirmó la presencia de
colágenos, laminina y fibronectina detectados por la CCI pero no para el colágeno III. Esto puede deberse
a una baja abundancia, a una mala ionización o a una especificidad de anticuerpos. Trabajos previos que
demostraron la presencia de factores de crecimiento tras la descelularización se utilizaron ensayos
fluorométrico semi-cuantitativos [30]. No se detectaron factores de crecimiento mediante nuestro
análisis de espectrometría masivos de escopetas debido al uso de un gel SDS que limita la detección de
proteínas de bajo peso molecular. Los factores de crecimiento son también difíciles de detectar usando
un acercamiento de la proteómica de la escopeta debido a su concentración baja. La preservación de
laminines, fibronectina, Nidogen-1 y colágeno tipo IV sugiere que se mantiene la membrana basal de los
andamios descelulares. Sin embargo, la disminución de los niveles de laminin y Nidogen-1 en los
andamios EDTADET sugiere que la adición de EDTA puede degradar en parte la membrana basal. Un
número de proteínas del ECM no fueron detectados en tejido fresco. Esto es probablemente a una
combinación de razones [31,32]: (i) supresión de iones de péptidos originarios de ECM por péptidos
originarios de los componentes celulares más abundantes; (II) la digestión incompleta en gel de los
componentes de ECM en presencia de proteínas celulares; (III) limitaciones en la sensibilidad y
secuenciación del rendimiento de los instrumentos de la EM; (IV) identificación inadecuada de péptidos
en datos MS/MS; (v) pre-resolución insuficiente de los péptidos presentados a la secuenciación MS/MS.
Debe tenerse en cuenta que los métodos de proteómica permiten la identificación preferencial de
proteínas más abundantes, fácilmente digeridas y las proteínas ECM proporcionan un desafío particular
para la proteómica [33]. Nuestros resultados de proteómica están en consonancia con el trabajo reciente
de Li et al que demostraron proteínas ECM identificadas de forma única en hígados descelulares de rata
[34].

La microscopia electrónica y el XPCI demostraron ser útiles en la estructura reveladora del andamio,
según lo descrito previamente en intestino y pulmón [17,18]. La adición del EDTA produjo un andamio
más denso con el espacio reducido entre las fibras del colágeno, que explicarían los niveles crecientes
del colágeno y de la elastina en el tejido, puesto que la matriz es más compacta. Los andamios hepáticos
con una estructura más densa se han producido previamente, y aunque éstos pueden retener
componentes del ECM, pueden no ser óptimos para la repoblación debido al derrumbamiento de
espacios celulares [8,27,30]. El andamio resultante del tratamiento det retuvo la arquitectura de la zona
porta, así como los espacios de hepatocitos rodeados de fibras de colágeno. Esto se compara bien con el
trabajo realizado por otros grupos que encontraron que las fibras de colágeno son débiles y la
microarquitectura general está mal preservada después de la descelularización [9,13]. XPCI sobrepasa
una limitación básica de la proyección de imagen convencional de la radiografía, en la cual el contraste
suave del tejido está careciendo [35]. En este estudio, usamos el enfoque XPCI más simple, la
propagación del espacio libre [36] en su aplicación de sincrotrón estándar de oro, que ya ha sido validada
in vivo [37]. Posteriormente, se perseguirá la traducción a métodos más compactos basados en el
laboratorio [38].

La preservación de la red vascular es de importancia primordial para la ingeniería del tejido hepático,
ya que un ECM poroso o destruido podría resultar en que el tejido sea inaceptable para el trasplante.
Esto se ha determinado previamente por la infusión del tinte aunque el picovoltio/la vena venosa
[7,13,16,30], o mediante la creación de moldes vasculares [4,6,9]. Las altas concentraciones de TX100 y
de SDS llevaron a la destrucción de la red vascular [9]. Hemos demostrado la preservación de la red
capilar, que, curiosamente, difirió entre los andamios det y EDTA-det. La infusión del tinte fue

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cuantificada y fue demostrado que la intensidad del tinte junto con cobertura de área superficial fue
aumentada en andamios del det. Los andamios EDTA-det siguieron un aumento de dos etapas en la
cobertura del tinte. Esto puede deberse a los espacios vasculares colapsados debido al ECM más denso.
Después de la acumulación de suficiente presión, los vasos distales se abren, permitiendo el paso del
tinte.

Elegimos el andamio del det como el andamio óptimo para la siembra de la célula como aunque la
adición del EDTA aumentara levemente la eficacia de la descelularización, él empeoró la preservación de
la arquitectura según lo evaluado por SEM, XPCI, y análisis de la red vascular. Las metodologías de
siembra de células anteriores para el hígado se han centrado en la siembra intravascular de células
hepáticas y/o endoteliales [4,7,11,14,27]. Después de sembrar, las células fueron encontradas para
haber organizado alrededor de estructuras vasculares centrales. Sin embargo, el movimiento a través de
las paredes de los vasos sanguíneos requeriría extravasación a través de la membrana basal. Los
mecanismos sugeridos para dicha migración de células incluyen la digestión proteolítica, la fuerza
mecánica y la variabilidad en la composición de la membrana basal [39]. En los andamios donde no hay
células para reparar el ECM después de la degradación proteolítica y/o mecánica, los vasos sanguíneos
pueden perforarse y gotear, evitando su uso para el trasplante. Intentamos evitar esto realizando la
siembra usando la microinyección multifocal, permitiendo la distribución de célula ancha y homogénea,
el en injerto y la supervivencia en una condición tridimensional de la cultura de la matriz. Las células
estaban vivas y proliferando 2 semanas después de sembrar in vitro, repoblando totalmente el andamio,
semejantemente a los resultados publicados con la infusión intravascular de la célula [4,7,11,14,27]. La
arquitectura y composición del andamio permitían sembrar y adherir células que, junto con el
intercambio de oxígeno y nutrientes, permitían la expansión celular y la repoblación de andamios.
Apuntamos ampliar en esto realizando el sembrador intravascular concomitante de células endoteliales.

Conclusiones
El presente trabajo demuestra la producción de una matriz acelular natural que se puede obtener del
hígado de rata por descelularización det, preservando la microarquitectura y los componentes de ECM.
La adición de EDTA crea una matriz más densa y compacta, y disminuye el contenido de ADN residual. El
andamio det es biocompatible, permitiendo la adhesión y el crecimiento de las células hasta por 14 días.
La afinación del Protocolo, incluyendo la ampliación de la metodología, la optimización de los estudios
de resiembra y trasplante celulares son fundamentales para el objetivo a largo plazo de proporcionar
una alternativa terapéutica potencial al trasplante convencional.

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