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“RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS Y SEPARACIÓN DE

AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA”

I. INTRODUCCION:

La hidrólisis de proteínas es la ruptura de la estructura primaria, es decir la ruptura


de la secuencia de una proteína. (Fernando Carrillo)

La hidrólisis de las proteínas termina por fragmentar las proteínas enaminoácidos.

Existen 3 tipos de hidrólisis:

· Hidrólisis ácida: Se basa en la ebullición prolongada de la proteína con


soluciones ácidas fuertes (HCl y H2SO4). Este método destruye completamente
el triptófano y parte de la serina y la treonina. (Fernando Carrillo)

· Hidrólisis básica: Respeta los aminoácidos que se destruyen por la hidrólisis


anterior, pero con gran facilidad, forma racematos. Normalmente se utiliza (NaOH
e BaOH). (Fernando Carrillo)

· Hidrólisis enzimática: Se utilizan enzimas proteolíticas cuya actividad es lenta y


a menudo incompleta, sin embargo no se produce racemización y no se destruyen
los aminoácidos; por lo tanto es muy específica. (Fernando Carrillo)
El uso de la cromatografía en papel para la separación e identificación de
aminoácidos es de gran importancia, la fase móvil empleada generalmente es una
mezcla de n‐butanol/ácido acético/agua. La separación implica que los
aminoácidos cuya cadena lateral (R) tenga un carácter más apolar, tendrán
tendencia a desplazarse con la fase móvil, mientras que lo aminoácidos que sean
polares, ya sean con carga o sin carga, serán retenidos por la fase estacionaria.
Ello es así, porque la fase móvil está formada por solventes que son más apolares
que el agua, que es el solvente de la fase estacionaria. (Jhoana Parreño)

En esta práctica se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación
de aminoácidos que fue la combinación de la cromatografía en capa fina con la
reacción de la ninhidrina con la cual se pueden identificar los aminoácidos por la
tinción color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina
la cual, da un tono amarillo al reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce
amonio al reaccionar con ella, lo que indica que los demás aminoácidos si
presentan esta reacción. (Coralía Aguiar T.)

El papel que se utiliza para la cromatografía está fabricado con celulosa pura y
fibras de celulosa para intercambio iónico. Este papel permite separaciones
eficientes y rápidas de sustancias orgánicas o inorgánicas cargadas. Entre los
diferentes tipos de papel se encuentra el tipo DE81 que es un papel delgado (0,20
mm) con grupos funcionales de dietil aminoetilo (DEAE) celulosa. La velocidad de
flujo es de 95 mm/30 min (en agua), actúa como un intercambiador de aniones
débilmente básico para separación de aniones, nucleótidos y aminoácidos,
también se lo usa para ensayos enzimáticos y aplicación de la técnica de la huella
dactilar. (Sandra Díaz)

La cromatografía en capa fina de aminoácidos que presentan diferentes


solubilidades como por ejemplo: glicina (Gly), leucina (Leu), ácido aspártico (Asp)
y lisina (Lys), se van a separar en función de sus diferentes solubilidades. (Sandra
Díaz)

La cromatografía se engloba dentro de las llamadas técnicas de separación y


permite el análisis de mezclas complejas de compuestos muy estrechamente
relacionados químicamente. La separación se lleva a cabo según la distinta
interacción que presenta cada uno de los componentes de una muestra respecto
a dos fases: una estacionaria y otra móvil que fluye sobre ella. Esta interacción
puede ser de varios tipos que a su vez dan lugar a distintas subclases de
cromatografía: de absorción, de reparto, de cambio iónico, de afinidad, etc. (Luis
Vallejo)
El uso de la cromatografía en papel para la separación e identificación de
aminoácidos es de gran importancia desde que fue introducida por Martin en 1944,
la fase móvil empleada generalmente es una mezcla de n‐butanol/ácido
acético/agua o dilución acuosa de fenol (polar y ácida), estas combinaciones de
fases móviles poseen densidad mayor que otros sistemas de solventes y
requiere de por lo menos de 2 a 3 horas para que el frente del solvente alcance
una distancia prudente en una placa relativamente larga. Los procesos
cromatográficos tanto instrumentales como no instrumentales (en cualquiera de
sus variantes), son receptivos a nuevas alternativas metodológicas y
continuamente sufren cambios que beneficien en aspectos como resolución,
separación, empleo de recursos y tiempo por mencionar algunos. (Luis Vallejo)
II. OBJETIVOS:

 Reconocer el manejo de la cromatografía en papel.


 Analizar el Rf de los aminoácidos en la práctica.

III. PROCEDIMIENTO:

Después de colocarse unos guantes, cortamos con tijeras un rectángulo de


papel filtro (10 x 14) luego sumergimos en agua en inmediatamente pasamos
por ácido acético a 1N por 10 minutos, enjuagamos y sumergimos en agua y
sacamos rápidamente y secamos. Se trazó tiras de 1,5 cm del borde inferior
y sobre ella trazar cuatro puntos 2,4,6,8 centímetros y señalamos con las
letras Le, L y T, y se aplicó con una micro pipeta 3 uL de cada una de las
respectivas soluciones mencionadas y de forma que apareció una mancha de
1,5 mm de diámetro, y lo secamos a 50ºC por 10 minutos. Después lo
llevamos a la cámara cromatografía y marcamos el rastro del recorrido del
solvente y rociamos el papel con solución ninhidrina y secamos el papel en la
estufa a 60ºC hasta la aparición de manchas violacias o azuladas. Esto
consituye el revelado.

IV. RESULTADOS:

Soluciones RF

4
Solvente
4/1
Leucina

1.6/2.5
Lisina

2.5/1.6
Tirosina
V. DISCUSION:

VI. CONCLUSIÓN:

Se logró practicar y aprender el método de cromatografía en papel y ademas


logramos hallar el Rf de cada solvente solvente usado, además entendimos
porque actúa de manera distinta en cada uno de ellos.