Las modificaciones covalentes de polisacáridos

en micobacterias
Micobacterias producir hidratos de carbono de las estructuras excepcionales que
son modificados de forma covalente con sustituyentes únicas, cuya
caracterización funcional podría ampliar nuestra comprensión de cómo las
micobacterias se adaptan a su medio ambiente.

Los procariotas producen una variedad de glicanos envoltura celular que juegan
importante
papeles en su fisiología, su adaptación al entorno y sus interacciones con el
huésped. En concordancia con el papel de estos glicanos en la formación y
conservación de la integridad de las membranas interior y exterior, la estructura de
núcleo de la fracción de lípido A (endotoxina) de los lipopolisacáridos (LPS) en
bacterias Gram-negativas y la de los tensioactivos aniónicos a base de
carbohidratos polímeros que se encuentran en una amplia gama de bacterias
Gram-positivas (ácidos pared teicoicos y ácidos lipoteicoicos) son relativamente
bien conserved1-3. Estos elementos estructurales fundamentales, sin embargo,
pueden ser modificados por la adición o eliminación de diversos azúcares,
aminoácidos, fosfatos, o grupos acilo para permitir la adaptación bacteriana y la
supervivencia en diversas condiciones de estrés. Aunque no es necesario para el
crecimiento per se, y variable a partir de una especie a otra,
a los antibióticos y peptides1-3 antimicrobiana. El género Mycobacterium incluye
patógenos humanos primordiales incluyendo Mycobacterium tuberculosis, el
agente etiológico de la tuberculosis y el agente infeccioso más mortal en el mundo;
Mycobacterium leprae (lepra); Mycobacterium ulcerans (úlcera de Buruli); y una
serie de otros patógenos de Mycobacterium no tuberculosas.
Reflectante de la composición única y la estructura de su envoltura celular (Fig. 1),
micobacterias carecen de los LPS canónicas y (lipo) ácidos teicoicos se
encuentran en otros procariotas. Ellos, sin embargo, producen una matriz distinta
de polisacáridos (lipo)
y (glico) lípidos con estructuras únicas que juegan papeles esenciales en su
fisiología y pathogenesis4,5, incluyendo tres envoltura celular dominante
polysaccharides-
arabinogalactano (AG), lipomannan (LM), y lipoarabinomanano (LAM) -que son
el enfoque de este Comentario (Fig. 2). Debido a su importancia para la integridad
estructural de la célula, AG, LM, y LAM han sido ampliamente estudiados desde la
perspectiva de descubrimiento de fármacos. Esta fundamental, sin embargo
restrictiva, habida cuenta de su papel en la fisiología de micobacterias, sin
embargo, ha demasiado a menudo ignorado el hecho de que los sustituyentes
covalentes discretas pueden conferir a estos glicanos funciones adicionales de
ajuste que contribuyen a la capacidad de las micobacterias a adaptarse a su
entorno. aumento de la evidencia apunta ahora a modificaciones químicas que
afectan la resistencia para alojar los mecanismos de defensa y de las
interacciones huésped-patógeno, apoyando así la idea de que las micobacterias, a
su manera, han desarrollado estrategias para explotar la adaptación de
sustituyentes de polisacáridos para promover su supervivencia en diferentes
entornos. Nuevos detalles sobre la naturaleza y el origen de biosíntesis de estas
modificaciones químicas están proporcionando oportunidades para explorar su
significado biológico. Este comentario se describen algunas de las modificaciones
químicas únicas que se encuentran más bien en AG, LM, y LAM, así como lo que
se conoce de su importancia biológica. Se destaca aún más los desarrollos
recientes en la biología química y de imágenes de células que podrían
complementar los enfoques bioquímica, genética e inmunología tradicionales para
ayudar a modificaciones funcionalmente characterizethese.

arabinogalactano
Dos heteropolisacáridos unidos covalentemente, peptidoglicano (PG) y AG,
constituyen la mayor parte del núcleo de la pared celular micobacteriana (Fig. 1).
Ellos proporcionan una estructura rígida fuera de la membrana plasmática que es
esencial para la integridad estructural de las células y sirve como un andamio para
el resto de la envoltura celular.
El dominio arabinano de AG está hecho de tramos de a-1,5-ligado arabinofuranosil
(Araf) residuos con precisamente posicionados a-3,5-rama sitios (Fig. 2a). La
posición C2 de una porción de la interna a-3,5- ramificado residuos Araf pueden
modificarse con galactosamina (ad-GalN) o substituents4 succinil (Fig. 2a). Hasta
el momento, el sustituyente GalN sólo se ha encontrado en M. tuberculosis y un
número de otras micobacterias patógenas de crecimiento lento, pero la
conservación de los genes responsables de la biosíntesis de este motivo en
algunas especies de crecimiento rápido tales como Mycobacterium abscessus
sugiere que GalN puede modificar el
AG de una mayor diversidad de especies de Mycobacterium que se pensaba
anteriormente. succinil sustituyentes se han reportado en tanto species4 lenta y de
rápido crecimiento. GalN se estima que ocurre en el nivel de alrededor de un
residuo por AG molécula y succinilo sustituyentes en el nivel de uno a tres motivos
por molécula AG.
El origen biosintético del sustituyente GalN de AG en M. tuberculosis ha sido
reported6 y, al igual que de los sustituyentes glicosilo de LM y LAM (ver a
continuación), se encontró que recuerda a las vías que conducen a la modificación
de lípido A con GalN o residuos de aminoarabinosa en Francisella y Escherichia
coli6. La enzima responsable de la adición de sustituyentes succinilo aún no ha
sido identificado. Nuevas evidencias sugieren que el sustituyente GalN de AG
desempeña un papel en la fisiología y la patogénesis de micobacterias. Se
encontró una M. tuberculosis GalN deficientes en transposón mutante a ser
atenuada para la virulencia en spleen7 ratón. Los estudios con GalN deficientes en
M. tuberculosis mutantes knockout reveló además que la presencia de este
sustituyente abroga la maduración completa y la activación de células dendríticas
humanas (DC), aumenta la afinidad a la superficie bacilos para una sonda de DC-
SIGN soluble (dendrítica específica de la célula intercelular molécula-3-asir la no-
integrina), estimula el aumento de la secreción de IL-10, y disminuye mediada por
Toll-like receptor-2 NF-kB activation8. Debido purificó AG ya sea de tipo salvaje o
GalN deficientes mutantes no alteró la maduración DC humana,
se postuló que la presencia de un residuo de GalN protonada en AG, a través de
sus interacciones con los componentes aniónicos de la membrana externa tales
como el ancla lipídica de glycerophospho lípidos (glico), puede alterar la topología
de la superficie de la célula, modulando con ello las interacciones con anfitrión
receptores de células beta y que resulta en la regulación por disminución de la
response8 inmune inicial. Aunque la disminución de la unión de DC-SIGN a la
superficie celular de GalN puntos mutantes a los cambios en la cantidad y / o la
accesibilidad de sus ligandos, el mecanismo subyacente a través de los que un
sustituyente minutos enterrado en la envoltura celular puede ejercer tales cambios
dramáticos en la célula superficie queda por determinar. La importancia biológica
de los sustituyentes succinilo aún no ha sido definida. Se ha propuesto que los
residuos succinilo cargados negativamente interactúan con el protonada GalN, lo
que lleva a un structure4 AG más apretado y rígido. La observación de que
mycolylated arabinano cadenas están desprovistos de sustituyentes succinilo ha
llevado además a la sugerencia de que succinilación puede controlar
negativamente mycolylation4 (Fig. 2a). Lipomannan y lipoarabinomannan Dos
lipoglycans abundantes, LM y LAM, pueblan las membranas interior y exterior de
todas las micobacterias. polisacáridos 'capsulares' conocidos como dmannan y D-
arabino-dmannan poblar las membranas interior y exterior de todas las
micobacterias. polisacáridos 'capsulares' conocidos como dmannan y D-arabino-
dmannan poblar las membranas interior y exterior de todas las micobacterias.
polisacáridos 'capsulares' conocidos como dmannan y D-arabino-dmannan
(AM), que tienen manano y arabinomanano dominios estructuralmente idénticos a
los de LM y LAM, se encuentran además en la superficie celular de M. tuberculosis
y en un número de otros slowand rápido crecimiento species5 Mycobacterium
(Figura 1). El dominio arabinano de LAM y AM es muy similar a la de AG (Fig. 2b)
y, correspondientemente, alberga un grupo succinato sustituyendo la posición C2
de una porción de los residuos de a-3,5-Araf interiores. Succinatos ocurren en el
nivel de 1-4 por molécula entera LAM o 2-3 motivos por molécula AM. Los
informes adicionales de grupos succinilo en lipoglycans micobacterianas incluyen
aquellas en las
Mycobacterium kansasii, En el que se encontraron succinatos de sustituir la
posición C3 de lineal residuos de a-1,5-Araf en lugar de la posición C2 del residuo
Araf ramificación de LAM (Fig. 2b), y Mycobacterium smegmatis, en la que se
propusieron succinatos para acilar el manano columna vertebral de LM (aunque su
sitio de unión no se ha definido). La presencia de grupos de lactato asociados con
el dominio de arabinomanano de LAM también se informó en M. tuberculosis, M.
smegmatis y M. leprae, pero se definió ni la existencia de un enlace covalente ni
su sitio de unión, aumentando la posibilidad de que el corto ácidos de cadena
surgieron de un contaminante desconocida. El extremo no reductor arabinano de
microheterogeneidad estructural LAM y AM de visualización específico de la
especie que es clave para la actividad biológica de estas moléculas. En m.
LAM (conocido como ManLAM) 4 (Fig. 2b). Las tapas de manósido de ManLAM en
M. tuberculosis pueden estar sustituidos adicionalmente con un-metiltio d-xilosa
residue9 a-1,4-ligado (MTX) (Fig. 2b). Este motivo se produce a nivel de una
molécula por molécula entera de ManLAM. Se trata de una modificación química
inusual, ya que es uno de los pocos informes de un azúcar xilo-configurado fuera
del reino vegetal y el primer informe de un tioazúcar en un polisacárido bacteriano.
En M. kansasii, MTX parece sustituir la cadena principal de manano en lugar de
las tapas de manósido de ManLAM9 (Fig. 2b). Las rutas biosintéticas que
conducen a la síntesis de los manósido y MTX tapas de ManLAM en M.
tuberculosis han sido elucidated4,10. Los sustituyentes succinilo son susceptibles
de ser añadida por el mismo, hasta ahora desconocido, enzima que modifica AG.
Las tapas de manósido de ManLAM se unen al receptor de manosa de los
macrófagos y a DC-SIGN presente en países en desarrollo, jugando así un papel
importante en el reconocimiento de la célula huésped y la subsiguiente
supervivencia de los bacilos en el environment11-13 phagosomal. Conservación
del motivo de MTX ManLAM en toda M. tuberculosis cepas analizadas hasta la
fecha y su exposición en la superficie celular sugieren que puede jugar de manera
similar un papel beneficioso en la bacteria durante la infección. De acuerdo con
ello, los estudios in vitro han indicado que la presencia de MTX impide un
subconjunto de receptores mannosebinding que se expresan en la superficie de
las células inmunes innatas de la unión a las tapas de manósido de ManLAM13 y
que los miméticos de disacárido de este motivo regular por disminución la
producción de citocinas por macrophages9 humano activado . También se
propuso MTX para dar cuenta de las propiedades antioxidantes de todo el
molecule9,14. Cómo estos fenotipos se traducen en el contexto de bacilos intacta,
dada la baja abundancia del sustituyente MTX en la envoltura celular y la probable
existencia de constituyentes de la superficie con las funciones que se superponen
parcialmente, espera estudios de infección con mutantes knockout que carecen
específicamente el motivo MTX. En línea con la función propuesta de MTX en la
resistencia al estrés oxidativo y la virulencia, el gen de perfiles de expresión
experiments15 han indicado que los genes implicados en la biosíntesis de este
motivo se inducen más de dos veces en M. tuberculosis cultivado en ácidos
grasos de acogida, en el interior macrófagos, y bajo condiciones de hipoxia. La
presencia de los cinco genes principales de la vía de MTX en una serie de
micobacterias, incluyendo especies tales como M.
Otras variaciones en las estructuras de LM y LAM, incluyendo el grado de
acilación de su ancla fosfatidil-mio-inositol, la extensión de la a-1,2-manP
ramificación de su columna vertebral manano, y la longitud de las cadenas de
manano y arabinano (Fig . 2b), se ha demostrado que un impacto en la interacción
de estos lipoglycans con los receptores de la célula huésped, así como sus
properties4,12,16 inmunomoduladores.
La comprensión de modificaciones químicas de los polisacáridos de micobacterias
Es claro a partir de los ejemplos anteriores que las micobacterias han
evolucionado para modificar sus glicanos la envuelta celular con una matriz
distinta de sustituyentes estratégicamente colocados cuyos aceptor moléculas y
colocación específica en el aceptor es probable que se adaptada a la
Mycobacterium spp. bajo consideración, sus composiciones particulares de la
envoltura celular y estilos de vida únicos. Nuestra comprensión de la importancia
biológica de estas modificaciones, sin embargo, sigue siendo rudimentario, y
muchas otras cuestiones fundamentales permanecen abiertas. En este contexto,
las nuevas herramientas químicas y enfoques adaptados al estudio de los
glicanos-Mycobacterium específica será un complemento valioso a biochemistry-
tradicional, la genética-, y 'metodologías basadas en omics'.
¿Nos hemos perdido algo? No menos importante entre preguntas abiertas es si
cualquier otras modificaciones químicas importantes de glicanos podrían haber
sido perdidas dadas las incógnitas restantes en su structure4 en general, la baja
abundancia y el potencial de naturaleza transitoria de algunos de estos
sustituyentes, y los procedimientos relativamente duras de tratamientos ácidos y
de bases típicamente usada para purificar glicanos de la envoltura celular
micobacteriana. LAM no albergan ningún sustituyente lactato? Si no se añade a
ManLAM, en lo aceptor sustrato (s) es el residuo MTX producida por M.
smegmatis10 transferido? Crítico para la caracterización funcional de la succinilo,
sustituyentes MTX, y GalN serán una investigación a fondo de su promiscuidad en
la célula; es decir, hacen otras moléculas aparte de LM, LAM, y AG servir como
aceptores para estos motivos? Las cantidades de miligramos de glicanos puros
necesarios para una detección precisa y la determinación estructural de estos
sustituyentes raras todavía representa un obstáculo importante para la progresión
en el campo. Los posibles enfoques para abordar estas limitaciones que sería no
requirepurification de las moléculas aceptoras de interés pueden incluir ángulo
mágico-alta resolution- girar (HR-MAS) RMN para caracterizar el contenido de
glicoconjugados de toda cells17 micobacterias en vivo, así como la digestión
enzimática selectiva de glicanos presentes en la superficie de los bacilos seguido
de caracterización de fragmentos liberados por espectrometría de masas y / o
RMN (Fig. 3a). Otro enfoque consiste en ampliar la utilidad de metabólica y
etiquetado chemoenzymatic con reporteros químicos bioorthogonal para estudiar
glycans18-20 Mycobacterium. Específicamente, el refinamiento de los
sustituyentes no naturales azidecontaining que de manera eficiente se pueden
incorporar en glicanos en lugar de MTX, GalN, y otros motivos de interés y,
posteriormente, ser conjugado con colorantes fluorescentes permita su detección
sensible y específica en bacilos vivos o en lisados celulares crudos, y permitir la
identificación de nuevas moléculas aceptoras, si son polisacáridos, glicolípidos o
proteínas (Fig. 3A). Conjugación a las etiquetas de biotina para desplegable a
partir de lisados complexcell o extractos parcialmente purificados seguido por
digestión enzimática de la molécula (s) aceptor puede facilitar aún más la
caracterización estructural de motivos enriquecido por espectrometría de masas
(Fig. 3a). y otros motivos de interés y posteriormente conjugarse con colorantes
fluorescentes permita su detección sensible y específica en bacilos vivos o en
lisados celulares crudos, y permitir la identificación de nuevas moléculas
aceptoras, si son polisacáridos, glicolípidos o proteínas (Fig. 3A) . Conjugación a
las etiquetas de biotina para desplegable a partir de lisados complexcell o
extractos parcialmente purificados seguido por digestión enzimática de la molécula
(s) aceptor puede facilitar aún más la caracterización estructural de motivos
enriquecido por espectrometría de masas (Fig. 3a). y otros motivos de interés y
posteriormente conjugarse con colorantes fluorescentes permita su detección
sensible y específica en bacilos vivos o en lisados celulares crudos, y permitir la
identificación de nuevas moléculas aceptoras, si son polisacáridos, glicolípidos o
proteínas (Fig. 3A) . Conjugación a las etiquetas de biotina para desplegable a
partir de lisados complexcell o extractos parcialmente purificados seguido por
digestión enzimática de la molécula (s) aceptor puede facilitar aún más la
caracterización estructural de motivos enriquecido por espectrometría de masas
(Fig. 3a).
¿En qué etapa de la biosíntesis se introducen las modificaciones y se lo
transitorio?No se sabe nada de la regulación y la reversibilidad potencial deEl
modificaciones químicas de AG, LM, y LAM. Sin embargo, la introducción oportuna
de estos motivos en las estructuras de glicano, y su reversibilidad, es probable que
sea clave para su función. Aparte de permitir micobacterias para remodelar su
envoltura celular in situ en respuesta al cambio de environmentalconditions,
modificaciones transitorios pueden servir señales biosintéticas como críticos. Por
ejemplo, la elongación y ramificación de AG, LM, y LAM parecen ser fuertemente
regulated4. En caso de que se encuentran los sustituyentes GalN y succinilo para
ser introducido durante la polimerización del dominio arabinano, esto sugeriría que
pueden actuar como firmas moleculares que regulan la elongación y ramificación,
como se describe con otra substituents21 polisacárido bacteriano.
existe precedente en corynebacterineae, en el que una modificación química
transitoria de glicolípidos sirve como una señal para export22.
Estudios detallados en la adición y la eliminación potencial de estos motivos
esperan el diseño de ensayos de transferencia funcionales utilizando aceptores de
neoglucolípido sintéticos que imitan a los detalles de las estructuras de AG, LM, y
LAM, como se hizo para estudiar la manosa tapado de LAM23 (Fig. 3b). Estos
aceptores serán igualmente importante en la definición de los mecanismos
mediante los cuales glicosiltransferasas ortólogos y succinyltransferases de
diferentes especies de Mycobacterium puede transferir MTX y succinilo
sustituyentes todifferent posiciones de LM y LAM (Fig. 2b) y para la comprensión
de la importancia funcional de esta regioselectividad. Definición de importancia
biológica.
Los efectos de las modificaciones químicas en micobacterias, incluyendo su
adaptación a diversas tensiones y para el entorno de acogida, podrían cubrir un
amplio intervalo, y puede ser mediada directa o indirectamente por los cambios
que afectan a muchos aspectos diferentes de su fisiología, incluyendo la
composición sobre y permeabilidad, célula topología de la superficie, y la
susceptibilidad a los antibióticos y el estrés oxidativo, entre otros. Como se indicó
anteriormente, importante para la comprensión de la función de estos motivos será
la determinación de si se modifican más de un aceptor en la célula, ya sea que
ocurran constitutivamente como es el caso de algunos modifications2 LPS o si
están regulados, y si son reversibles, así como la naturaleza de las señales
ambientales que desencadenan su adición o eliminación. Agradecidamente,
muchas de las modificaciones químicas descritas en este Comentario no
repercutan negativamente en el estado físico de micobacterias in vitro, y el
creciente número de mutantes isogénicas con deficiencias en estas
modificaciones que se han reportado en los últimos diez años están
proporcionando finalmente la oportunidad de explorar su significado biológico de
vitro e in vivo. Como complemento de los enfoques de genes de perfiles de
expresión tradicionales, se espera que el uso de la prensa químicos bioorthogonal
específicos para sustituyentes de glicano micobacterianas para facilitar el estudio
de su distribución y dinámica bajo diversas condiciones de estrés, en el interior de
las células huésped e in vivo (Fig. 3c). La capacidad para detectar estos motivos
en sus ambientes nativos combinados con los avances en sondas de imagen y
microscopía de alta resolución de imágenes en vivo proporciona además
oportunidades para investigar aspectos espacio-temporales de su biosíntesis y el
impacto de abolir genéticamente su producción en la biosíntesis de la envoltura
celular, elongación celular, y division24 celular (figura 3c). Del mismo modo, la
aplicación de la proyección de imagen del ofthe- de estado basado en la fuerza
atómica-microscopía proporciona medios sin precedentes de explorar el impacto
de los sustituyentes de glicano en las características a nanoescala de la surface25
celular micobacteriana (Fig. 3c). Con respecto a las interacciones huésped-
patógeno,
Perspectivas Los papeles que las modificaciones que afectan a los glicanos de la
envuelta celular de micobacterias pueden desempeñar en la fisiología de estos
microorganismos, en su adaptación al medio ambiente, y en sus interacciones con
el huésped hacen hincapié en la importancia de los esfuerzos continuos para
entender su origen biosintético , la regulación y la importancia biológica. Ahora es
el momento adecuado para asumir este desafío mediante el refinado de la
creciente diversidad y la potencia de las herramientas de la biología y la química
celular de imagen a nuestra disposición para aprovechar los avances recientes en
nuestra comprensión del origen y funciones de estos sustituyentes biosintética. El
progreso en el campo requerirá enfoques multidisciplinarios y se espera que sea
muy dependiente de la biología sintética y química. A medida que avanza nuestra
comprensión de las funciones biológicas y origen biosintético de estas
modificaciones químicas, nuevas oportunidades de traslación continúan
emergiendo. pasos importantes en esta dirección se hicieron con el desarrollo de
mannodendrimers imitan los enlaces apéndices A-1,2- oligomanósido encontrado
en ManLAM como sintético innovador
inmunomoduladores para el tratamiento de pulmón diseases26 inflamatorias.
Otros perspectivas interesantes incluyen la identificación de nuevos y
Mycobacterium específica dianas terapéuticas dentro de la maquinaria biosintética
sustituyentes, cuya inhibición puede afectar a la aptitud de los agentes patógenos
micobacterianos durante la infección, y la posibilidad de orientación
específicamente bacilos micobacteria que expresa glicanos de superficie
etiquetados (sobre etiquetado con azide- que contiene azúcares) con
therapeutics20 covalente. Por último, la distribución restringida de algunas de
estas modificaciones a micobacterias patógenas, en particular, M. tuberculosis
(por ejemplo, el motivo de MTX del ManLAM), y su antigenicidad proporcionar
impulso para su estudio como posibles biomarcadores de infección. Aquí de
nuevo, la posibilidad de metabólicamente bacilos etiqueta con sustituyentes azido,
detección por microscopia o citometría de flujo, podría proporcionar una alternativa
más sensibles a en anticuerpos o la detección basada en lectina.