COMPARACIÓN DE MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE CÉLULAS BIOFILM

PARA SISTEMAS DE DISTRIBUCIÓN DE AGUA POTABLE

TABLA DE CONTENIDO

Abstracto.............................................................................................................................. 5

1. Introducción................................................ .................................................. 6

2 Material y métodos.............................................. .................................................. ......11

2.1 Configuración experimental............................................... ..............................11

2.1.1 Dispositivos de muestreo de lazo de tubería........................................... ................11

2.1.2 Recogida de muestras............................................. ............................................ 17

2.1.3 Control y Replica............................................ ...................................... 17

3 Método analítico............................................... .................................................. ...........18

4 Replicar análisis por cupón............................................. ............................................... 18

4.1 Métodos analíticos............................................... .................................................. 18

4.1.1 Desprendimiento del biofilm............................................. .........................................19

4.1.2 Biofilm HPC............................................. .................................................. ... 19

4.1.3 Biofilm Biovolume, Thickness and Roughness por CLSM ........................... 20

4.1.4 Recuento de células totales de biofilm por FCM ......................................... .............22

5 Resultados................................................ .................................................. .....................23

5.1 Biofilm HPC ............................................... .................................................. .......... 26

5.1.1 Controles .............................................. .................................................. ......... 26

5.1.2 Rango de datos ............................................. .................................................. ..... 27

5.1.3 Relación de señal a fondo ......................................... ................................. 27

5.2 Biofilm Biovolume por CLSM ............................................. ................................... 29

5.2.1 Controles .............................................. .................................................. ......... 29

5.2.2 Rango de datos ............................................. .................................................. ..... 29

5.2.3 Relación de señal a fondo ......................................... ................................. 29

5.2.4 Desafíos metodológicos ............................................. .............................. 30

5.3 Recuento de células totales de biofilm por citometría de flujo

.......................................... .............. 31

5.3.1 Controles .............................................. .................................................. ......... 31

5.3.2 Rango de datos ............................................. .................................................. ..... 31

5.3.3 Relación de señal a fondo ......................................... ................................ 31

5.3.4 Retos metodológicos ............................................. .............................. 37

5.4 Resumen de resultados .............................................. .................................................40

6 Discusión ................................................ .................................................. ......................42

7. Conclusiones ................................................ .................................................. ............... 43

7.1.1 Conclusiones HPC............................................. ............................................. 43

7.1.2 Conclusiones CLSM............................................. .......................................... 44

7.1.3 Conclusiones de FCM............................................. ............................................. 44

7.1.4 Conclusiones generales............................................. ......................................... 45

Agradecimientos.................................................................................................. ............47

Referencias.................................................................................................. ......................47
ABSTRACTO

Las biopelículas se encuentran en las superficies internas de las tuberías de agua potable
y, por lo tanto, es esencial comprender los procesos de biopelícula para controlar su
formación. La hidrodinámica juega un papel crucial en la formación de biofilms. Por lo
tanto, saber cómo se forman las biopelículas, desarrollarse y dispersarse bajo diferentes
condiciones de flujo es fundamental para el manejo exitoso de estos sistemas. Aquí, el
desarrollo de biofilms después de 4 semanas, la formación inicial de biopelículas dentro
de las 10 horas y, finalmente, la respuesta de biofilms ya establecidos dentro de intervalos
de 24 horas en los que se modificó el régimen de flujo, se estudiaron utilizando un reactor
anular giratorio en tres diferentes regímenes de flujo: turbulento, de transición y laminar.
Usando microscopía de fluorescencia, se obtuvo información sobre el número de
microcolonias en los portaobjetos del reactor, el área de superficie de las biopelículas y de
las sustancias poliméricas extracelulares y las estructuras de biopelícula. Se realizaron
mediciones gravimétricas para caracterizar el espesor y la densidad de las biopelículas, y
se usaron estadísticas espaciales para caracterizar la heterogeneidad y la correlación
espacial de las estructuras de biopelícula. Contrariamente a la visión predominante, se
demostró que el flujo turbulento no se correlacionaba con una reducción en las
biopelículas; se descubrió que la turbulencia mejora tanto la formación inicial como el
desarrollo de biopelículas en las superficies accesibles. Además, después de los cambios
de 24 horas en el régimen de flujo, se indicó que los biofilms respondían a los cambios
rápidos del régimen de flujo. En general, este trabajo sugiere que diferentes condiciones
de flujo pueden causar cambios sustanciales en la morfología y el crecimiento de la
biopelícula, y específicamente que el flujo turbulento puede acelerar el crecimiento de
biopelículas en el agua potable.

INTRODUCCIÓN

La provisión de agua potable es una prioridad en todas las sociedades. La gestión de

biofilms que se forman en la superficie interior de las tuberías de agua potable es una
preocupación de las empresas de agua en todo el mundo, ya que estas biopelículas
pueden afectar la estética del agua potable [1, 2, 3]. La hidrodinámica ejerce una
influencia significativa sobre las biopelículas [4, 5, 6, 7, 8, 9] y, en particular, sobre la
distribución espacial de las bacterias [10]. Por lo tanto, este estudio fue creado para
observar cómo las biopelículas crecen bajo tres regímenes de flujo distintos: turbulento,
de transición y flujo laminar.

Existe una gran cantidad de literatura que apoya el hecho de que la estructura del biofilm
está íntimamente relacionada con la hidrodinámica [11, 12, 13, 14, 15]. Estos estudios se
han centrado principalmente en el crecimiento y desprendimiento de bacterias bajo un
régimen de flujo constante. En los flujos laminares, se encuentra que las biopelículas
crean estructuras irregulares [13], mientras que en los flujos turbulentos, las biopelículas
crean esquirlas alargadas [16]. Se ha sugerido que la formación de serpentinas causa una
adhesión más firme de las bacterias a las superficies disponibles y promueve la formación
de microcolonias. Las serpentinas pueden consistir principalmente en sustancias
poliméricas extracelulares (EPS) y se encuentra que mejoran la resistencia de la
biopelícula a la cizalladura externa [6]. La estructura de las biopelículas puede afectar el
desarrollo de biofilm, los procesos de transferencia de masa, la distribución de oxígeno y
la resistencia a la fricción en las tuberías [17, 18, 19] y, por lo tanto, es importante para los
investigadores ampliar el conocimiento existente.

Se encuentra que la hidrodinámica afecta el espesor y la densidad del biofilm. Se ha

demostrado que las altas fuerzas de desprendimiento, causadas por el aumento de las
tensiones de corte, conducen a biopelículas más densas que son mecánicamente más
estables [4, 20]. En cuanto al efecto de la hidrodinámica sobre el espesor de la biopelícula,
existe un conocimiento limitado sobre las biopelículas en los sistemas de agua potable. La
opinión predominante es que el desarrollo de la biopelícula se ve obstaculizado por
mayores tensiones de corte debido a las mayores fuerzas de desprendimiento, que se
aplican a la biopelícula [6, 11, 21]. Sin embargo, también se ha descubierto que la
turbulencia promueve el desarrollo de biofilms gruesos [4] probablemente debido al
mayor transporte de nutrientes y oxígeno a la superficie del biofilm [6]. También se ha
propuesto que las biopelículas responden al estrés por corte regulando las vías
metabólicas y se vuelven más fuertes [22].

Este inesperado resultado del desarrollo de biofilms gruesos en el flujo turbulento podría
atribuirse a varios otros factores. El cambio en el flujo del sustrato es uno de esos
factores. Se encuentra que las condiciones de alto esfuerzo de corte causan un doble
efecto en las propiedades de transferencia de masa; por un lado, la turbulencia facilita
una alta difusión del sustrato en las biopelículas y, por otro lado, el biofilm más denso
resultante reduce la difusividad del sustrato [11]. Otro factor es el papel de la
hidrodinámica en la agregación bacteriana en el agua a granel. La agregación bacteriana
es un proceso biológico importante entre las bacterias bajo el cual se juntan en el agua a
granel antes de que se adhieran a las superficies expuestas como biofilms [23]. La
evidencia de muestras de agua dulce [21, 24] sugiere que existe una fuerte relación entre
la agregación y el régimen de flujo. En el entorno fluvial, se ha demostrado que los
agregados multiespecíficos en el flujo a granel presentan distintas dinámicas de
crecimiento dependientes de la cizalladura [25].
Poco se sabe sobre la colonización inicial de las bacterias, que es un precursor de la
formación de biopelículas [26, 27], y cómo se ve afectado por el régimen de flujo [10]. En
el presente estudio, se estudió la influencia de diferentes regímenes de flujo en
biopelículas cultivadas durante 4 semanas en agua potable con la hipótesis de que el flujo
turbulento es más probable que mejore su crecimiento. La formación inicial de biofilms se
caracterizó como una función del régimen de flujo con la hipótesis de que se pueden
establecer biofilms en las superficies incluso después de un corto período de tiempo de 10
h. Finalmente, se estudió la robustez de los biofilms ya establecidos que se cultivaron
durante 4 semanas bajo un régimen de flujo constante a los cambios en el régimen de
flujo, cada uno de los cuales duró 24 h, suponiendo que los biofilms podrían responder a
esos cambios.

Desde el punto de vista de la ingeniería, el estudio de las condiciones de flujo puede

contribuir a la gestión y control exitosos de la formación de biopelículas para evitar la
biocorrosión que conduce al deterioro del material de la tubería y la subsiguiente vida
reducida de la tubería [28, 29]. Por lo tanto, este estudio se centró en el efecto de
diferentes condiciones de flujo sobre el crecimiento de biopelículas en el agua potable con
el objetivo de comprender si el control de las condiciones de flujo podría desempeñar un
papel importante en el crecimiento de biopelículas en las tuberías de agua potable.
Específicamente, aquí se hipotetizó que el flujo turbulento era el régimen de flujo bajo el
cual las biopelículas podrían crecer más en el agua potable. En general, este estudio
permitirá la comparación de la formación inicial de biofilm, el desarrollo de biofilms y sus
estructuras entre tres regímenes de flujo muy distintos: el turbulento, el de transición y el
laminar. El conocimiento de que la turbulencia podría promover la formación de
biopelículas en el agua potable será útil para las compañías de agua, que podrían buscar
formas de controlar las condiciones de alto cizallamiento y mezcla en partes específicas de
los sistemas de distribución de agua potable (DWDS).

MATERIALES Y MÉTODOS

Condiciones del reactor

Las biopelículas se cultivaron en un reactor anular giratorio con camisa (modelo 1320 LJ,
BioSurface Technologies, EE. UU.). La principal ventaja de este reactor es que las
condiciones de esfuerzo cortante pueden controlarse fácilmente mediante su dispositivo
motor, y el caudal puede controlarse independientemente del esfuerzo cortante. Se ha
sugerido que los reactores no pueden simular con precisión las condiciones de flujo de los
sistemas de distribución de agua potable debido a su geometría [30, 31]. Sin embargo, las
relaciones genéricas entre los biofilms y los regímenes de flujo fueron el foco de este
estudio y esos regímenes de flujo se crearon con confianza en este reactor.
El reactor contenía 20 portaobjetos de policarbonato removibles que estaban unidos a su
tambor interno. El material de policarbonato fue elegido como uno de los materiales
plásticos utilizados en los sistemas de agua potable, que no tiene una superficie rugosa de
material corroído [20, 32]. La camisa del reactor permitió mantener la temperatura en el
sistema a través de agua calentada desde un circulador de baño (Isotemp Bath Circulator,
Fisher Scientific, Inglaterra, Reino Unido). La temperatura se eligió a 16 ° C como la
temperatura representativa de DWDS en el Reino Unido para la primavera y el verano [1].
El reactor se cubrió con papel de aluminio para lograr condiciones oscuras para el
crecimiento de la biopelícula.

Este reactor se usó para simular condiciones de flujo similares a las de una tubería con un
radio igual al espacio entre los dos cilindros del reactor, y una velocidad media igual a la
velocidad media del reactor. El tambor interno del reactor se hizo girar a tres velocidades
diferentes para inducir flujos de Taylor-Couette [33, 34, 35]; a 30 rpm (el número de
Reynolds, Re = 960 y el número de Taylor, Ta = 233), que corresponde al flujo laminar; a
57 rpm (Re = 1800 y Ta = 439), que corresponde al flujo de transición; a 217 rpm (Re =
6800 y Ta = 1682), que corresponde al flujo turbulento. Estas tres velocidades del reactor
se usaron para simular tres condiciones de flujo diferentes en una tubería de 30,3 mm de
diámetro con velocidad promedio de 0,03 m / sy esfuerzo de cizalladura en la pared de
0,007 N / m2 en flujo laminar, velocidad promedio de 0,07 m / sy tensión de cizalladura en
la pared de 0.02 N / m2 en flujo de transición, y velocidad promedio de 0.25 m / sy
esfuerzo cortante en la pared de 0.07 N / m2 en flujo turbulento [36, 37, 38].

La elección del diámetro de la tubería en 30,3 mm corresponde a los extremos de las

tuberías de agua potable donde comienzan las líneas de servicio [39, 40, 41]. En aquellas
partes de los sistemas de agua potable, el control de las condiciones de flujo es muy
importante ya que el desinfectante residual se ha agotado y las actividades microbianas
son mucho más altas que en la red [42]. Además, las condiciones en las líneas de servicio
se caracterizan por tiempos de residencia más largos, períodos de estancamiento más
altos, caudales reducidos y temperaturas más altas en comparación con la red [43].

Reactor medium

El medio que rellenó el reactor consistió en 150 ml de medio nutriente y 850 ml de agua
potable que se tomaron muestras de un grifo doméstico en Glasgow. El agua potable, que
se usaba para alimentar el reactor, se tomó de un grifo que se alimentaba desde un
sistema de tuberías interno. La planta de tratamiento de agua potable, que suministra
agua a la ubicación desde la que se tomaron muestras del agua, utiliza agua superficial
como fuente. Los pasos de tratamiento que se siguen en esta planta de tratamiento son:
coagulación, filtración rápida por gravedad, desinfección con cloro y dosificación de
ortofosfato. Las concentraciones de sales minerales del medio del reactor fueron: sulfato
de amonio (1,2 mg / l), cloruro de amonio (0,9 mg / l), heptahidrato de sulfato de
magnesio (0,3 mg / l), tetrahidrato de cloruro de manganeso (0,003 mg / l), cobre sulfato
pentahidratado (0.002 mg / l), sulfato de cobalto heptahidrato (0.001 mg / l), molibdato
de sodio deshidratado (0.001 mg / l), sulfato de zinc heptahidrato (0.01 mg / l) y ácido
bórico (0.75 mg / l) [44 ], y la concentración para glucosa del medio del reactor fue de 1,5
mg / l. Estas concentraciones mantuvieron las condiciones de agua a granel en el reactor
oligotrófico y fueron realistas para las condiciones de flujo de la tubería de agua potable
[2]. Los compuestos utilizados aquí probablemente aumentarían ligeramente cualquier
posibilidad de crecimiento de biopelícula en las superficies accesibles del reactor dentro
de un período de tiempo limitado. Se utilizaron dado que en sistemas reales existen
condiciones más favorables para el crecimiento de biopelículas que en sistemas de reactor
bien controlados, que se esterilizan al inicio de los experimentos [1, 4, 7, 45].

La concentración de cloro total del agua potable, que se tomó como muestra del grifo, se
midió inmediatamente después de su muestreo utilizando el Método USEPA DPD 8167
[46] y un colorímetro (DR 900 Hach Colorado, EE. UU.) Y se encontró a 0,36 mg / l. El
carbono orgánico total del medio del reactor se controló durante la operación del reactor
usando un analizador TOC-L (Shimadzu, Japón, Asia) como la diferencia entre el carbono
total y el carbono inorgánico total y se encontró que era de 1,59 ± 0,88 mg / l. Finalmente,
se determinó la concentración de células y microcolonias en el agua a granel del reactor
usando microscopía de fluorescencia y se encontró que era (5,8 ± 0,5) × 105 células / ml y
(7,6 ± 0,1) × 103 microcolonias / ml, respectivamente [47 ]

Procesos experimentales

Se llevaron a cabo tres experimentos, que se describen aquí como experimentos "A", "B" y
"C". En cada experimento, se siguieron los mismos procesos. El primer proceso, que se
describe aquí como "desarrollo", es el proceso en el que se estudió el desarrollo de la
biopelícula después de 4 semanas de operación del reactor (Tabla 1). Durante estas 4
semanas, el reactor estaba operando en modo batch (tasa de flujo cero) como un sistema
cerrado para retener la biomasa y asegurar que se establecieran biofilms en sus
superficies. En cada experimento, el medio se añadió manualmente al reactor e
inmediatamente después, el reactor comenzó a funcionar a la velocidad de rotación
específica asociada con el experimento A, B o C. Se sacrificaron 10 de las 20 diapositivas
del reactor para el muestreo al final de este proceso.

NOMBRE DEL EXPERIMENTO PROCESO DE DESARROLLO DEL TIEMPO TOTAL (SEMANAS)

RÉGIMEN DE FLUJO
A Flujo turbulento 4
 B Flujo de transición 4
C Flujo laminar 4
Tabla 1.

El segundo proceso, que se describe aquí como "formación", es el proceso en el que se

estudió la formación inicial de la biopelícula después de 10 h (Tabla 2). El reactor estaba
funcionando de nuevo en modo discontinuo, sin cambiar el medio del reactor después de
las 4 semanas de funcionamiento del reactor, a la misma velocidad de rotación que en el
proceso de desarrollo. Es evidente que durante las 4 semanas en que se establecieron las
biopelículas habría habido "formación" de biofilms en las superficies, pero se pensó que
podría tratarse de una formación atípica porque tanto el entorno de agua a granel como
las superficies adyacentes no habrían estado condicionados por el presencia de biofilms.
En un sistema real, cualquier superficie no colonizada nueva se colocaría en un sistema de
distribución donde las biopelículas ya estaban establecidas arriba y abajo. Es por esta
razón que se estudió el proceso de formación en portaobjetos limpios después de las 4
semanas en las que se habían establecido biofilms en las superficies del biorreactor. La
razón para mantener el medio del reactor inalterado para los procesos de desarrollo y
formación es asegurarse de que cualquier cambio en el crecimiento y la estructura de las
biopelículas sea consecuencia únicamente de las condiciones de flujo. Las 10 diapositivas
que se sacrificaron en el proceso de desarrollo fueron reemplazadas por 10 diapositivas
nuevas y estériles al comienzo del proceso de formación. Estos se eliminaron para el
análisis en parejas a intervalos de 2 h.

NOMBRE DEL EXPERIMENTO PROCESO DE DESARROLLO DEL TIEMPO TOTAL (HORAS)

RÉGIMEN DE FLUJO
A Flujo turbulento 10
B Flujo de transición 10
C Flujo laminar 10
Tabla 1.

El último proceso, que se describe aquí como "cambios de régimen de flujo", duró 72 h
para los experimentos A y C y 96 h para el experimento B. El objetivo de este proceso fue
probar cómo las biopelículas ya establecidas después de las 4 semanas de la operación del
reactor respondieron a los cambios en las condiciones de esfuerzo cortante, cada una de
las cuales duró solo 24 horas. Durante este proceso, el reactor estaba operando en modo
de recirculación. Un litro de un medio similar que inicialmente llenó el reactor fue
reciclado; las diferencias radican en que se utilizó agua destilada en lugar de agua potable
y el medio de reciclaje se diluyó 10 veces más. Esto significaba que el líquido a granel
inicialmente contenía pocas bacterias planctónicas y que las bacterias que aparecían se
derivaban principalmente de la erosión de biofilms en las superficies. Ese medio se
recirculó con una velocidad de flujo de 22 ml / min y un tiempo de retención a los 45
minutos, para minimizar el crecimiento celular suspendido y mejorar el crecimiento de la
biopelícula en las superficies del reactor [4]. Durante este proceso, la velocidad de
rotación del reactor se cambió cada 24 h para cambiar a uno de los tres regímenes de flujo
distintos: turbulento, de transición y laminar.

En la Tabla 3 hay una descripción de los cambios en el régimen de flujo que se impusieron
para cada uno de los tres experimentos realizados. El razonamiento detrás de la decisión
sobre el régimen de flujo en cada intervalo de 24 h fue el siguiente: el primer régimen de
flujo fue el mismo que el de los procesos de desarrollo y formación. Esto nos permitió
establecer si había diferencias en el crecimiento del biofilm debido al cambio del modo de
flujo desde el lote hasta la recirculación. Después de 24 h, el régimen de flujo se redujo
para el experimento A, aumentó para el experimento C y se estableció más alto que más
bajo para el experimento B. Finalmente, para los cambios del proceso de régimen de flujo,
las 10 diapositivas que permanecieron intactas desde el principio de cada experimento
fueron utilizados.

Medidas gravimétricas

Tres diapositivas del reactor se utilizaron para caracterizar el espesor y la densidad de las
biopelículas en cada uno de los tres experimentos al final del proceso de desarrollo [48].
En resumen, los portaobjetos se retiraron del reactor, se drenaron durante 5 minutos en
posición vertical y se pesaron para la determinación de la masa húmeda. Luego, los
portaobjetos se secaron durante 24 horas a 65 ° C en un horno y se pesaron de nuevo.
Después de eso, la biopelícula seca se eliminó por lavado de los portaobjetos con agua
destilada y tejidos de laboratorio. Los portaobjetos limpios se secaron de nuevo durante
24 horas a 65 ° C y luego se pesaron de nuevo. La masa seca se determinó por la diferencia
de peso de los portaobjetos con y sin biopelícula seca. Después de calcular el espesor del
biofilm y la densidad del biofilm volumétrico, se calculó la densidad del biofilm del área
como el producto del espesor del biofilm y la densidad del biofilm volumétrico.
Finalmente, las mediciones gravimétricas se realizaron antes del inicio de cada uno de los
tres experimentos, en el que todos los portaobjetos estériles se pesaron para determinar
su peso sin ningún biofilm unido a ellos. Para estas mediciones, se utilizó Fisherbrand ™
Analytical Balance MH-214 (Fisher Scientific, Inglaterra, Reino Unido) con una precisión de
0.0001 g.

Mediciones de recuento de microcolonias

Se usaron dos portaobjetos para contar las microcolonias en los portaobjetos del reactor
de cada uno de los tres experimentos en cada uno de los tres procesos. El biomaterial
unido a cada portaobjetos del reactor se raspó suavemente con un raspador celular estéril
(ThermoFisher Scientific, Inglaterra, RU) y se diluyó en 5 ml de agua destilada. Luego, las
muestras de 5 ml se fijaron con 0,5 ml de formaldehído al 2% [49] y se filtraron en filtros
de membrana Whatman® de 0,2 μm (Sigma-Aldrich, Irvine, Reino Unido). Se usó una
solución de 1 μl de 10 μg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ThermoFisher
Scientific, Inglaterra, RU) para teñir las microcolonias durante 20 minutos en la oscuridad.
Después de eso, la solución se filtró y luego el filtro de membrana se secó y se preparó
para la visualización. Los campos de visión se obtuvieron utilizando el microscopio de
fluorescencia Olympus IX71 (Japón, Asia) con la lente objetivo UPlanFLN (Japón, Asia) con
10 aumentos / apertura numérica de 0,30. El filtro utilizado fue el filtro DAPI con
excitación a 358 nm y emisión a 461 nm. Las microcolonias visualizadas tenían un
diámetro de aproximadamente 10 μm y consistían en aproximadamente 10 células. Se
obtuvieron campos de visión microscópicos en cada filtro de membrana para calcular la
concentración de microcolonias de modo que el coeficiente de variación de las
mediciones fuera menor que 0,30 [47, 50, 51].

La concentración de células en los portaobjetos del reactor también se calculó siguiendo

el mismo proceso que el descrito para el cálculo de la concentración de microcolonias. La
única diferencia es que después de que el biomaterial unido a los portaobjetos del reactor
se raspó de ellos, se homogeneizó en un agitador vórtex durante 2 minutos en 5 ml de
agua destilada. Además, los filtros de membrana se cubrieron con 1 ml de solución de
Triton X-100 al 0,1% (ThermoFisher Scientific, Inglaterra, Reino Unido) para dispersar
uniformemente las células antes de aplicar la tinción DAPI. Las células se visualizaron
finalmente utilizando la lente de objetivo UPlanFLN de inmersión en aceite (Japón, Asia)
con 100 aumentos / apertura numérica de 1,30 y su concentración se calculó a (5,4 ± 0,6)
× 105 células / cm2. Finalmente, las mediciones para el cálculo de la concentración de
microcolonias y células en los portaobjetos del reactor también se realizaron antes del
inicio de cada uno de los tres experimentos para asegurar que los portaobjetos del reactor
fueran estériles.

Mediciones de la estructura del biofilm

Para las mediciones de la estructura del biofilm se usaron dos portaobjetos para el
proceso de desarrollo, se usaron tres portaobjetos para el proceso de formación y se
usaron tres portaobjetos para los cambios del proceso del régimen de flujo de cada uno
de los tres experimentos. Las biopelículas en los portaobjetos del reactor se fijaron en
primer lugar con 0,5 ml de paraformaldehído al 4% [52]. Las muestras se cubrieron en
primer lugar con 1 ml de lectina de fluoresceína Aleuria aurantia 10 μg / ml (Vector
laboratories, Inglaterra, Reino Unido) durante 10 minutos en la oscuridad para teñir los
glicoconjugados EPS específicos de lectina, que constituyen la mayor parte del EPS [18 ,
20]. Luego, las muestras se cubrieron con 1 ml de 10 μg / ml de DAPI durante 20 minutos
en la oscuridad para teñir las células. Las estructuras de biofilm se visualizaron usando
microscopía de fluorescencia con la lente de objetivo UPlanFLN de inmersión en aceite
con 100 aumentos / apertura numérica de 1,30.

El área superficial de ambas células y glicoconjugados EPS en las superficies del reactor se
calculó a continuación. Además, se calculó el área superficial que solo los glicoconjugados
EPS ocupaban en las superficies del reactor. Estas áreas de superficie se calcularon en
Matlab procesando los campos de visión microscópicos obtenidos. Nuevamente, el
coeficiente de variación de las medidas fue menor a 0,30. Las imágenes compuestas
microscópicas de biofilms (de las células y glicoconjugados EPS) se crearon utilizando el
comando Matlab llamado "imfuse". Las imágenes microscópicas originales se convirtieron
primero a imágenes en escala de grises usando el comando Matlab llamado "rgb2gray" y
luego a imágenes binarias usando el comando Matlab llamado "im2bw" para separar el
biomaterial (las biopelículas en un caso y solo los glicoconjugados EPS en el otro caso) )
desde el fondo de la imagen microscópica. Después de que se calculó el área superficial
para todas las imágenes microscópicas obtenidas, se dividió en el área superficial total de
la imagen microscópica para finalmente calcular el porcentaje del área superficial (%). Las
mediciones para el cálculo del área superficial de biofilms en los portaobjetos del reactor
también se realizaron utilizando microscopía de contraste de fase y los porcentajes de
área de superficie de biofilms se encontraron en concordancia con los encontrados en las
imágenes obtenidas usando microscopía de fluorescencia que se describieron aquí

Análisis estadístico

Todas las medidas se analizaron en IBM SPSS Statistics utilizando una de las siguientes
pruebas: (1) la prueba de ANOVA de un factor junto con las pruebas de Tukey y Duncan-
Waller, (2) la prueba de Kruskal-Wallis por rangos, (3) la prueba de Jonckheere-Terpstra y,
finalmente, (4) la prueba de chi-cuadrado de Pearson junto con la prueba de Phi y Cramer,
dependiendo de la idoneidad de los datos en comparación con las suposiciones de las
pruebas. Todos los cálculos estadísticos se basaron en el nivel de confianza del 95%, lo que
significa que un valor de P inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Cuando los conjuntos de datos se distribuyeron normalmente y hubo homogeneidad de

varianzas, se analizaron las diferencias significativas entre los datos usando ANOVA de una
vía junto con las pruebas de Post hoc Tukey y Duncan-Waller que validarían aún más el
resultado estadístico del ANOVA de un factor . Las comparaciones del área de superficie
de las biopelículas entre el modo de flujo por lotes y recirculación se probaron usando un
ANOVA de una vía junto con las pruebas de Tukey y Duncan-Waller.

Cuando los conjuntos de datos no se distribuyeron normalmente, se utilizó la prueba de

Kruskal-Wallis, en la que las varianzas de las poblaciones deberían ser iguales en todas las
muestras. Las comparaciones del área de superficie de las biopelículas entre los diferentes
regímenes de flujo para los cambios del proceso del régimen de flujo se realizaron usando
esta prueba.

Para los datos en los que no se cumplió la condición para las varianzas de la prueba de
Kruskal-Wallis, se implementó la prueba de Jonckheere-Terpstra, en la cual debe haber un
orden a priori de las poblaciones. Entonces, las comparaciones de las microcolonias que se
unieron a los portaobjetos del reactor entre los diferentes regímenes de flujo para el
proceso de desarrollo se realizaron usando esta prueba. La misma prueba se usó para las
comparaciones del área de superficie de los glicoconjugados de EPS entre los diferentes
regímenes de flujo para el proceso de formación.

En el caso en que los conjuntos de datos no validaron las suposiciones de ninguna de las
pruebas anteriores, la prueba de chi cuadrado de Pearson en conjunto con la prueba de
Phi y Cramer se realizaron para muestras de gran tamaño e independientes.

Estadísticas espaciales
La entropía textural fue una de las medidas utilizadas en este estudio para caracterizar las
estructuras del biofilm. Se usa para describir la aleatoriedad de los componentes de una
imagen en escala de grises mediante la comparación de la intensidad de los píxeles de la
imagen. Cuanto mayor sea el valor de la entropía, más heterogénea será la biopelícula.
Esto significa que las estructuras de biofilm más complejas se muestran en la imagen [53,
54]. La entropía se calculó usando la función de Matlab llamada "entropía".

Los semiovariogramas se usaron aquí como otra medida para caracterizar la varianza
espacial de las estructuras de biofilm dentro de las imágenes en escala de grises y
cuantificar las dependencias espaciales en los conjuntos de datos. Su función relaciona la
semi-varianza de los puntos de datos con la distancia que los separa. La gran distancia de
los puntos de datos significa más pares de datos para la estimación de la semi-varianza,
pero menos cantidad de detalles en el semi-variograma. En otras palabras, los
semivariogramas son una forma de capturar gráficamente la varianza espacial de puntos
en un paisaje en función de su distancia. Todas las combinaciones de puntos a una
distancia se clasifican y su varianza se determina para todas las distancias de separación
posibles [55, 56].
Una parte importante de un semi-variograma es el "origen"; los puntos más cercanos del
diagrama. Cuando los valores se ubican conjuntamente, por ejemplo, en clusters, las
varianzas en distancias cortas son bajas ya que los valores son similares. En la longitud del
grupo característico, la varianza aumentará rápidamente. Otra parte importante de un
semi-variograma es el "alféizar"; el límite superior del variograma que es igual a la
varianza del conjunto de datos y refleja la cantidad de variabilidad. El alféizar suele estar a
grandes distancias donde no hay gradiente en el diagrama [57, 58]. En total, se usaron
12,000 puntos para el cálculo de cada semi-variograma. Se calcularon utilizando la función
Matlab llamada "variogram.m" y se crearon solo para las imágenes más representativas
obtenidas a partir de microscopía de fluorescencia. Estas imágenes fueron aquellas en las
que la entropía era igual a la entropía promedio de todas las imágenes obtenidas.

Los diagramas de la función de autocorrelación (ACF) se usaron como la última medida

para caracterizar las estructuras del biofilm. Los diagramas ACF son, en esencia, una
extensión bidimensional de los semi-variogramas. Nos permiten evaluar cómo la
autocorrelación espacial cambia con la distancia. Correlacionan las intensidades de píxeles
dentro de las imágenes en escala de grises y detectan las estructuras repetitivas dentro de
las imágenes consideradas al combinar todas las partes de ellas. Los diagramas de ACF son
imágenes de espacio real, de modo que sus dimensiones tienen el mismo significado que
en las imágenes originales [59].

En estos diagramas, representados aquí como gráficos de contorno, el elemento central

proporciona una medida del tamaño y la forma del elemento básico que domina las
imágenes originales. El resto de las líneas de contorno reflejan el tamaño y la forma de los
elementos del vecindario de las imágenes originales. Finalmente, la barra en el lado
derecho de los diagramas proporciona una medida de la autocorrelación. Cuanto más
oscuro sea el color de la barra, menor será el valor de autocorrelación con su valor más
bajo para ser cero y el valor más alto para ser uno [60]. Los diagramas de ACF se
calcularon utilizando la función Matlab llamada "autocorr2d.m" y nuevamente se creó
solo para las imágenes más representativas