El daño tisular y la senescencia proporcionan

señales críticas para la reprogramación celular in

vivo

Para la reprogramación celular, el contexto importa

Las células diferenciadas en un plato de cultivo pueden asumir una nueva identidad cuando se
manipulan para expresar cuatro factores de transcripción. Este proceso de "reprogramación" ha
suscitado interés porque posiblemente podría ser aprovechado como una estrategia terapéutica
para la regeneración tisular.Mosteiro et al. usó un modelo de ratón para estudiar las señales que
promueven la reprogramación celular in vivo. Descubrieron que los factores que desencadenan la
reprogramación in vitro hacen lo mismo in vivo; sin embargo, también infligen daño celular. Las
células dañadas entran en un estado de senescencia y comienzan a secretar ciertos factores que
promueven la reprogramación, incluida una citocina inflamatoria llamada interleucina-6. Por lo tanto,
en el entorno fisiológico, la senescencia celular puede crear un contexto tisular que favorezca la
reprogramación de las células vecinas.

Resumen estructurado
INTRODUCCIÓN
La expresión ectópica de los factores de transcripción OCT4, SOX2, KLF4 y cMYC (OSKM) permite
la reprogramación de células adultas diferenciadas en células pluripotentes, conocidas como células
madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que son funcionalmente equivalentes a las células madre
embrionarias. La expresión de OSKM in vivo conduce a una desdiferenciación y reprogramación
celulares diseminadas dentro de los tejidos y, finalmente, a la formación de teratomas (tumores que
surgen de iPSCs). Los mecanismos moleculares que operan durante la reprogramación impulsada
por OSKM in vitro se han caracterizado ampliamente;sin embargo, se sabe poco sobre la
reprogramación in vivo.

RAZÓN FUNDAMENTAL
El proceso de reprogramación de OSKM es ineficiente tanto in vitro como in vivo. Se han
identificado varias barreras celulares intrínsecas in vitro, la mayoría de las cuales se activan por
daño celular y son particularmente prominentes en células envejecidas.Mecánicamente, estas
barreras intrínsecas a la célula para la reprogramación están principalmente mediadas por los
supresores tumorales p53, p16 INK4a y ARF (los dos últimos están codificados por el locus del
gen Ink4a / Arf ). En este trabajo, hemos investigado el efecto de estos supresores tumorales, daño
celular y envejecimiento en la reprogramación in vivo.

RESULTADOS

1
Descubrimos que la expresión de OSKM in vivo no solo desencadena la reprogramación de algunas
células sino que también inflige un daño extensivo en muchas otras células, conduciéndolas a un
estado conocido como senescencia celular.Las células senescentes se caracterizan por su
incapacidad para proliferar y por su secreción de citoquinas inflamatorias. Hemos observado una
correlación positiva entre la senescencia y la reprogramación impulsada por OSKM. Por ejemplo,
los tejidos que carecen de p16 INK4a / ARF no experimentan senescencia, y su capacidad de
reprogramar se ve seriamente comprometida. Por el contrario, en los tejidos que carecen de p53, el
daño es desenfrenado; esto conduce a niveles máximos de senescencia, producción de citocina
exacerbada y aumento de la reprogramación in vivo.

Para explorar la conexión entre la senescencia y la reprogramación, manipulamos estos procesos in

vivo a través de intervenciones farmacológicas. En particular, un aumento en la senescencia
producido por palbociclib (un medicamento que imita funcionalmente p16 INK4a ) da como resultado
niveles más altos de reprogramación. A la inversa, una reducción en la senescencia lograda por
navitoclax (un fármaco proapoptótico con selectividad contra células senescentes) conduce a una
disminución de la reprogramación in vivo. Encontramos que la diafonía entre la senescencia y la
reprogramación está mediada por el microambiente rico en citoquinas asociado con las células
senescentes. Esto se basa, entre otras pruebas, en la observación de que la inhibición
farmacológica de NFκB, un importante impulsor de la producción de citoquinas, reduce la
reprogramación in vivo. El análisis de las citocinas inflamatorias producidas por las células
senescentes, tanto in vivo como in vitro, nos llevó a identificar la interleucina-6 (IL-6) como un factor
secretado crítico responsable de la capacidad de las células senescentes para promover la
reprogramación. En apoyo de esto, el bloqueo de IL-6 o su einapsis de quinasa en sentido
descendente PIM redujo potencialmente la reprogramación in vivo. Estas observaciones pueden
recapitularse in vitro, donde la eficacia de la reprogramación se ve reforzada por la presencia de
células dañadas o por el medio condicionado derivado de las células dañadas. Además, la
inmunodepleción de IL-6 del medio condicionado abolió la reprogramación.

Habiendo establecido que la senescencia promueve la reprogramación, estudiamos si la lesión del

tejido que conduce a la senescencia tiene un efecto positivo en la reprogramación impulsada por
OSKM. En particular, mostramos que el daño tisular inducido por bleomicina promueve fuertemente
la reprogramación en el pulmón. Finalmente, el envejecimiento, que se asocia con niveles más altos
de senescencia celular, también favorece la reprogramación impulsada por OSKM tanto en ratones
progericos como fisiológicamente envejecidos.

CONCLUSIÓN
La expresión de OSKM in vivo desencadena dos resultados celulares diferentes: la reprogramación
en una pequeña fracción de células y el daño y la senescencia en muchas otras células. Existe una
fuerte asociación positiva entre estos dos procesos, debido al hecho de que la senescencia celular
crea un contexto tisular que favorece la reprogramación impulsada por OSKM en las células

2
 vecinas. El efecto positivo de la senescencia en la reprogramación está mediado por factores
secretados, de los cuales IL-6 es un jugador clave. Esto también se aplica a las lesiones y el
envejecimiento de los tejidos, donde hay una acumulación de células senescentes que envían
señales a las células circundantes para promover la desdiferenciación y la reprogramación
impulsadas por OSKM. Una interacción conceptual similar puede ocurrir en condiciones fisiológicas,
donde la senescencia desencadenada por daño podría inducir la desdiferenciación celular para
promover la reparación del tejido.

Interacción entre senescencia celular y reprogramación impulsada por OSKM.

La expresión de OSKM in vivo, además de inducir la reprogramación de una pequeña población de

células, también induce daño y senescencia en muchas otras células. Las células senescentes
liberan factores que promueven la reprogramación de las células vecinas, siendo IL-6 un mediador
crítico. La lesión tisular y el envejecimiento, a través de la acumulación de células senescentes,
favorecen la reprogramación in vivo.

Abstracto
La reprogramación de células diferenciadas en células pluripotentes puede ocurrir in vivo, pero los
mecanismos implicados aún no se han dilucidado. La senescencia es una respuesta celular al daño,
que se caracteriza por la producción abundante de citocinas y otros factores secretados que, junto
con el reclutamiento de células inflamatorias, dan como resultado la remodelación tisular. Aquí,
mostramos que la expresión in vivo de los factores de reprogramación OCT4, SOX2, KLF4 y cMYC
(OSKM) en ratones conduce a la senectud y la reprogramación, ambos coexisten en las
proximidades. Los análisis genéticos y farmacológicos indican que la senescencia inducida por
OSKM requiere el locus Ink4a / Arf y, a través de la producción de la citoquina interleuquina-6, crea
un ambiente de tejido permisivo para la reprogramación in vivo. Las condiciones biológicas
relacionadas con la senescencia, como la lesión tisular o el envejecimiento, favorecen la
reprogramación in vivo por OSKM. Estas observaciones pueden ser relevantes para la reparación
de tejidos.

3
La identidad celular puede manipularse in vitro, y esto ha abierto nuevas posibilidades terapéuticas
( 1 ). Un logro importante en este campo fue el descubrimiento de que cuatro factores de
transcripción-OCT4, SOX2, KLF4 y cMYC (OSKM) -pueden transformar células diferenciadas en
células pluripotentes, conocidas como células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) ( 2 ). Estas
células tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tipos de células del organismo
adulto.Estudios recientes han demostrado que la sobreexpresión de OSKM en ratones da como
resultado la desdiferenciación celular en múltiples tipos de tejidos y la reprogramación en iPSCs in
vivo ( 3 , 4 ). Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos moleculares o contextos celulares
que regulan la reprogramación in vivo.

Ink4a / Arf promueve la reprogramación in vivo

Para explorar los mecanismos implicados en la reprogramación in vivo, nos centramos en los
supresores tumorales p53 (codificados por Tp53), p16 INK4a y ARF (las dos últimas proteínas están
codificadas por el locus genético conocido como Cdkn2a o Ink4a / Arf ). Estas proteínas inhiben la
reprogramación in vitro, y su eliminación o disminución de la regulación aumenta la eficiencia del
proceso ( 5 - 11 ). Para investigar su papel en la reprogramación in vivo, generamos ratones
reprogramables (portadores de un transgén OSKM inducible por doxiciclina ubicuo , abreviado
como i4F para "cuatro factores inducibles") combinados con alelos nulos para p53 o Ink4a / Arf , y
confirmamos que el OSKM el transgén se indujo eficientemente en ratones de los tres genotipos
(figura S1A). Evaluamos p53 o ratones heterocigotos Ink4a / Arf , todos en el mismo fondo genético
endogámico puro C57BL6, para el desarrollo de teratomas impulsados por OSKM (un ensayo de
pluripotencia) después del tratamiento con doxiciclina (0,2 mg / ml en agua potable durante 8
dias). Usamos ratones heterocigotos porque la duración de la vida de los ratones homocigotos era
demasiado corta para medir la formación de teratomas. Inesperadamente, los ratones heterocigotos
I4F; Ink4a / Arffueron altamente resistentes a la formación de teratoma en comparación con los
ratones de control i4F ( figura 1A ). Esto contrastaba con los ratones heterocigotos i4F; p53 , que
tenían una mayor tasa de formación de teratoma en comparación con los controles. La distribución
de los órganos de los teratomas fue similar en las tres cepas de ratones i4F (figura
S1B). Notablemente, la cinética del desarrollo tumoral espontáneo (no teratoma) característico
de p53 yratones heterocigotos Ink4a / Arf no se vio afectada por la inducción de OSKM (figura S1C).

4
Loslímites de la Fig. 1p53 e Ink4a / Arf promueven la reprogramación in vivo.

( A ) Incidencia de teratomas en ratones de los genotipos indicados. Los ratones se trataron con
doxiciclina (0,2 mg / ml en el agua de bebida) durante 8 días, a las 20 a 28 semanas de
edad. Tiempo (semanas) se refiere a la edad.Solo se consideraron los ratones que murieron con
teratomas; los ratones que murieron sin teratomas o que estaban vivos aparecen censurados e
indicados con garrapatas. Las cohortes fueron las siguientes: i4F , n = 33; i4F; p53 -het, n = 58; i4F;
Ink4a / Arf -het, n = 40. La significancia estadística se evaluó usando la prueba de log-rank:
*** P <0.001. ( B ) inmunohistoquímica de NANOG y tinción de hematoxilina y eosina (H & E) del
páncreas de los genotipos indicados. Los ratones se trataron con doxiciclina (0,2 mg / ml) durante 7
días y se analizaron al final del tratamiento. Las imágenes son representativas de al menos cinco
ratones ( n ≥ 5). ( C ) Número relativo (por mil) de células NANOG en los tejidos de ratones i4F de
+

los genotipos indicados tratados con doxiciclina como en (B). Las cuantificaciones se realizaron de
forma completamente automática. El gráfico representa el promedio ± DE ( n = 5 para el
páncreas, n = 4 para el estómago, n = 3 para el riñón); la significación estadística relativa al control
( i4F ) se evaluó mediante la prueba t de Student de dos colasimpar con la corrección de Welch:
* P <0,05. ( D ) Formación de teratoma en el riñón de ratones C57BL6 singénicos WT inyectados
con MEF i4F de los genotipos indicados e inducidos in vivo con doxiciclina (2 mg / ml) durante 14

5
días. Los teratomas aparecieron entre 6 y 8 semanas después del tratamiento. La significación
estadística relativa al control ( i4F ) se evaluó mediante la prueba exacta de Fisher de dos colas:
** P <0,01.

A continuación, investigamos qué paso de la formación, reprogramación, expansión o diferenciación

del teratoma se vio afectado por la ausencia de p53 o Ink4a / Arf . Primero evaluamos si la
expansión y diferenciación de iPSC eran diferentes entre los tres genotipos. La inyección
subcutánea de i4F , i4F; p53 -null e i4F; Ink4a / Arf -null iPSCs en ratones desnudos produjo
teratomas con una eficacia similar (figura S1D), lo que sugiere que las diferencias no se debieron a
una capacidad diferencial de los iPSCs del tres genotipos para formar teratomas. A continuación,
examinamos el proceso de reprogramación.Previamente, informamos la presencia de iPSCs en la
sangre de ratonesi4F después del tratamiento con doxiciclina ( 3 ). Usando este ensayo, se observó
la misma tendencia en la eficiencia de reprogramación como se observa para la generación de
teratomas, es decir, i4F; p53 -null> i4F > i4F; Ink4a / Arf -null (Fig. S1E). Luego nos enfocamos en la
reprogramación in situ estudiando ratones 7 días después del tratamiento con doxiciclina y
buscando la expresión del marcador de pluripotencia NANOG en tejidos. Encontramos que el tejido
pancreático de los ratones i4F; p53- null contenía más células NANOG + que el de los ratones i4F ,
mientras que los páncreas de los ratones i4F; Ink4a / Arf -null estaban esencialmente desprovistos
de células NANOG + ( Fig. 1 , B y DO). De acuerdo con estos hallazgos, la arquitectura tisular fue
globalmente displásica en el páncreas nulo de i4F; p53 , mientras que el páncreas
de ratones i4F mostró áreas focales de displasia. Por el contrario, la arquitectura tisular no se vio
afectada en gran medida eni4F; Ink4a / Arf -null páncreas ( Fig. 1B ). Se observaron diferencias
similares entre los tres genotipos en el estómago y el riñón ( Fig. 1C y Fig. S1, F y G). En conjunto,
estos resultados sugieren que la ausencia de p53 favorece la reprogramación in vivo, mientras que
la ausencia deInk4a / Arf limita la reprogramación.

La menor eficacia de la reprogramación in vivo de los ratones i4F; Ink4a / Arf -null contrasta con la
mayor eficacia de la reprogramación in vitro de células deficientes en Ink4a / Arf ( 6 - 10 ). Para
investigar más a fondo esto, obtuvimos fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de las tres cepas
i4F y comparamos su eficacia de reprogramación in vitro e in vivo. Como era de esperar, tanto I4F;
p53 - null e i4F; Ink4a / Arf -null MEF tuvieron una mayor eficacia de reprogramación in vitro en
comparación con los controles (figura S1H). Sin embargo, cuando se inyectó el mismo conjunto de
MEFs reprogramables en el riñón de los ratones de tipo salvaje (WT), la eficiencia de la formación
de teratoma después del tratamiento doxiciclina era i4F; p53 -null> i4F > i4F; Ink4a / Arf -null ( Fig.
1D y la figura S1, I y J), que es el mismo patrón observado en ratones reprogramables de todo el
cuerpo ( Fig. 1 , A a C). Cuando los MEFs reprogramables se inyectaron en huéspedes
inmunocomprometidos, como ratones atímicos desnudos (que carecen de linfocitos T) y ratones
NSG (que carecen de T, B y linfocitos asesinos naturales), la cinética del desarrollo de teratoma
mantuvo la misma tendencia que en ratones C57BL6 inmunocompetentes ( fig. S1I). Por lo tanto, el
sistema inmune adaptativo no es un determinante crítico de las diferencias en la reprogramación
6
entre genotipos. Estos resultados, usando el mismo conjunto de MEFs reprogramables, indican que
ellocus Ink4a / Arf juega un doble papel durante la reprogramación, actuando como una barrera in
vitro pero como un promotor in vivo.

Para obtener información sobre el papel de Ink4a / Arf durante la reprogramación in vivo, perfilamos
el transcriptoma del páncreas después del tratamiento con doxiciclina (0,2 mg / ml durante 7 días)
en ratones de los tres genotipos [Acceso a la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO)
número GSE77722]. Notablemente, la mayoría de las vías que siguieron el patrón i4F; p53 -
null > i4F > i4F; Ink4a / Arf -null (figura S1K) estaban relacionadas con el sistema inmune y la
remodelación de la matriz extracelular, ambos característicamente asociados con la senescencia
celular ( 12 - 16 ).Dada la participación bien establecida del locus Ink4a / Arf en la senescencia
celular ( 17 ), planteamos la hipótesis de que el locusInk4a / Arf puede contribuir a la
reprogramación in vivo de una manera extrínseca a través de la generación de un entorno de tejido
senescente.

La reprogramación in vivo coexiste con la senescencia

Para explorar la posible asociación entre la reprogramación in vivo y la senescencia, examinamos si
ambos procesos coexisten dentro del mismo contexto tisular. Realizamos tinciones dobles para
NANOG junto con indicadores de senescencia, como la β-galactosidasa asociada a la senescencia
(SAβG) o el inhibidor del ciclo celular p21 ( 18 ).Encontramos que, tras la inducción de la
reprogramación, las célulasNANOG + en el estómago ( Figura 2A ) y el páncreas (Figura S2A)
generalmente aparecían muy cerca de grupos de células SAβG + o p21 +. Además, hubo una
correlación positiva entre el grado de senescencia y el número de células
reprogramadas. Específicamente, el páncreas i4F; p53- null mostró tinción SAβG + generalizada ,
mientras que el páncreasi4F tenía grupos SAβG + focales , y el páncreas i4F; Ink4a / Arf-null tenía
pocas células SAβG + ( Fig. 2B ). Esta tendencia ( i4F; p53 -null > i4F >i4F; Ink4a / Arf -null) también
se observó para p21, infiltración de macrófagos (F4 / 80), proliferación [incorporación de
bromodesoxiuridina (BrdU)], daño del ADN (γH2AX), y apoptosis (caspasa-3 activa) ( figura
2B ). Estómago y riñón también presentaron el mismo patrón (figuras S2, B y C).

7
Fig. 2La senescencia y la reprogramación coexisten.

( A ) (Superior) Doble tinción de NANOG (marrón oscuro) y SAβG (azul claro) en el estómago de
los ratones i4F .(Abajo) Doble tinción de NANOG (magenta) y p21 (marrón oscuro) en el estómago
de los ratones i4F . Los ratones se trataron con doxiciclina (1 mg / ml en el agua de bebida) durante
7 días y se analizaron al final del tratamiento. ( B ) Tinción del páncreas. Los ratones se trataron con
doxiciclina (0,2 mg / ml) durante 7 días y se analizaron al final del tratamiento. Todas las
cuantificaciones se realizaron de forma completamente automática y corresponden al porcentaje
relativo de superficie teñida (SAβG, F4 / 80, γH2AX y caspasa-3) o al porcentaje relativo de células
positivas (p21 y BrdU). Los valores corresponden al promedio ± SD ( n = 3 a 5 ratones por
grupo). La significancia estadística con respecto alcontrol de i4F se evaluó usando la prueba t de
Student de dos colas impar con la corrección de Welch: * P <0,05; ** P<0.01; *** P <0.001. ( C )
Tinción del páncreas, como en (B). La tinción de p65 (NFκB) se cuantifica como porcentaje relativo
de superficie positiva, y la tinción de pSTAT3 y pSMAD2 se cuantifica como porcentaje relativo de
8
células positivas. ( D ) los niveles de ARNm de las citocinas indicadas en el páncreas. Los ratones
se trataron con doxiciclina como en (B). Los valores son relativos a WT. Las barras corresponden al
promedio ± SD;la significación estadística se evaluó usando la prueba tde Student de dos colas
impar con la corrección de Welch.La comparación de cada genotipo i4F con su
propiocontrol no i4F se indica de la siguiente manera:
* P <0,05;** P <0.01; *** P <0.001; **** P <0.0001. Las comparaciones de i4F; p53 -null o i4F; Ink4a
/ Arf -null coni4F se indican de la misma manera pero utilizando el símbolo "#."

Además, los factores de transcripción responsables de la producción de citocinas tras el daño

tisular, como NFκB (p65RelA), STAT3 (fosfo-STAT3) y SMAD2 (fosfo-SMAD2), también siguieron el
mismo patrón que la reprogramación, el daño y la senescencia ( i4F; p53 -null > i4F >i4F; Ink4a /
Arf -null) ( Fig. 2C ). En línea con esto, los niveles de expresión de ARNm correspondientes
a Ink4a y Arf y un panel de citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y proteínas de tejido
remodelación fueron consistentes con una senescencia fuerte y la respuesta inflamatoria después
de la inducción de reprogramación eni4F; p53 páncreas-null , una respuesta moderada
en i4F páncreas, y una respuesta mínima en i4F; Ink4a / Arf -null páncreas ( Fig. 2D ). Además, los
niveles séricos de citoquinas interleucina-6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral-α (TNFα) aumentaron
tras la activación de OSKM, y este aumento fue más prominente en ratones n4-p53- null (figura
S2D).

Creemos que, en ausencia de p53 , las células no pueden protegerse de los efectos de la
sobreexpresión de OSKM, lo que conduce a una proliferación celular desenfrenada, daño en el
ADN, senescencia, inflamación y altos niveles de factores secretados. Por otra parte, se ha
informado de que la actividad secretora de las células senescentes [conocida como fenotipo
secretor asociado a la senescencia (SASP)] se ve exacerbada en ausencia de p53 ( 14 ). Por el
contrario, en ausencia de Ink4a / Arf , OSKM no induce senescencia celular, lo que se traduce en
niveles más bajos de factores secretados e inflamación. Por lo tanto, OSKM desencadena dos
resultados celulares divergentes, la senescencia celular inducida por el daño y la reprogramación
celular, que coexisten en las proximidades de los tejidos.

La senescencia promueve la reprogramación in vivo

Para explorar el vínculo entre la senescencia y la reprogramación in vivo, utilizamos moléculas
pequeñas para disminuir o aumentar el número de células senescentes. Para eliminar las células
senescentes, aprovechamos la hipersensibilidad de las células senescentes a la inhibición de las
proteínas de la familia Bcl ( 19 - 21 ). El tratamiento simultáneo de ratones i4F con doxiciclina y el
potente inhibidor de Bcl-2 / Bcl-xL / Bcl-w navitoclax (también conocido como ABT263) redujo la
cantidad de células senescentes y sus factores secretados asociados en tejido pancreático
sometido a reprogramación ( Fig. 3 , A y B). La reducción en el número de células senescentes
estuvo acompañada por una disminución en la reprogramación, medida por el número

9
decélulas NANOG + ( Fig. 3A ). Por el contrario, para aumentar la senescencia, usamos el inhibidor
(CDK4 / CDK6) palbociclib (también conocido como PD0332991), que se puede considerar como
unmimético funcional p16 INK4a ( 22 ). El tratamiento con palbociclib aumentó la cantidad de células
senescentes, la producción de sus citocinas asociadas y la reprogramación en el páncreas (figuras
S3, A y B). Estas observaciones sugieren que la senescencia regula positivamente la
reprogramación in vivo.

10
Fig. 3La senescencia mejora la reprogramación in vivo.

( A ) Tinción del páncreas de ratones i4F tratados con doxiciclina (1 mg / ml en el agua de bebida) y,
cuando se indique, con navitoclax (25 mg / kg al día mediante sonda oral) o BAY 11-7082 (20 mg /
kg diariamente por inyección intraperitoneal). Los ratones se analizaron al final del tratamiento (7
días). Las cuantificaciones se realizaron como se explica en la figura 2B . Los valores para SAβG
indican el porcentaje relativo de la superficie teñida, y los del NANOG indican un ‰ relativo de
células positivas (el NANOG se mide por el número de células positivas por mil). Las imágenes son
representativas de al menos tres ratones ( n ≥ 3). ( B ) los niveles de ARNm de los genes indicados
en el páncreas de los mismos ratones que en (A). ( C ) Tinción del páncreas de ratones i4Ftratados
con doxiciclina (1 mg / ml en el agua de bebida) y, cuando esté indicado, con anti-IL-6 (1 mg, tres
veces por semana, intraperitonealmente) o inhibidor de PIM (PIMi ) (50 mg / kg diariamente por
sonda oral). Los ratones se analizaron al final del tratamiento (7 días). Las cuantificaciones se
realizaron como se explica en la figura 2B . Los valores para SAβG indican el porcentaje relativo de
superficie teñida, y los de NANOG indican relativa ‰ de células positivas. Las imágenes son
representativas de al menos cinco ratones ( n ≥ 5). ( D ) niveles de ARNm de los genes indicados en
el páncreas de los mismos ratones que en (C). Los valores en todos los paneles corresponden al
promedio ± SD. La significación estadística relativa al control se evaluó mediante la prueba t de
Student de dos colas impar con la corrección de Welch:
* P <0,05; ** P<0.01; *** P <0.001; **** P <0.0001.

El factor de transcripción principal NFκB juega un papel crítico en la promoción de la actividad

secretora de las células senescentes ( 16 , 23, 24 ). Para evaluar el posible papel del NFκB como un
enlace entre la senescencia y la reprogramación, los ratones i4F se trataron simultáneamente con
doxiciclina y con un inhibidor de las quinasas IKK activadoras de NFκB (BAY 11-7082) ( 25 ). BAY
11-7082 disminuyó la expresión de factores SASP, lo que condujo a una disminución de la
reprogramación in vivo ( Fig. 3 , A y B). BAY 11-7082 también redujo la extensión de la senescencia
( Fig. 3A ), probablemente reflejando la pérdida de senescencia paracrina mediada por SASP ( 26 ).

A continuación investigamos cuáles de los factores SASP desempeñan un papel dominante durante
la reprogramación in vivo. Recientemente se informó que la IL-6 mejora la reprogramación in vitro y
puede reemplazar al factor inhibidor de la leucemia (LIF), una citoquina relacionada que a menudo
se utiliza para la reprogramación in vitro (27 ). Encontramos que entre los factores SASP probados,
IL-6 mostró la regulación al alza más marcada sobre la inducción de OSKM y una buena correlación
con el grado de reprogramación (~ 300 veces enratones i4F; p53 - null , ~ 20 veces en i4F ratones,
y ~ 4 veces en i4F; Ink4a / Arf -null ratones) (ver Fig. 2D ). Por lo tanto, probamos el papel de IL-6
tratando ratones reprogramables simultáneamente con doxiciclina y anticuerpos anti-IL-
6. Encontramos que los anticuerpos anti-IL-6 abolieron el aumento en los niveles séricos de IL-6
característicos de la activación de OSKM (figura S3C). El bloqueo de IL-6 in vivo redujo no solo la
reprogramación, medida por la abundancia de células NANOG + , sino también la senescencia y la

11
expresión de factores SASP ( Fig. 3 , C y D). La reducción de la senescencia en anti-IL-6 es
consistente con el conocido papel paracrino de IL-6 en la senescencia ( 15 ). Recíprocamente, la
inyección de IL-6 recombinante (rIL-6) en ratones i4F aumentó el grado de reprogramación
( figuras S3, C y D). Además, el tratamiento de ratones sin i4F; p53 con anticuerpos anti-IL-6
también redujo la reprogramación, la senescencia y el SASP (figuras S3, E a G). Estos resultados
indican que la IL-6 es una de las citocinas críticas que vinculan la senescencia y la reprogramación.

Para reforzar el papel de IL-6, probamos la participación de las quinasas PIM, que son activadas por
IL-6 a través de la vía JAK / STAT ( 28 ) y refuerzan la actividad de NFκB a través de la fosforilación
de p65RELA ( 29 , 30 ). Además, se sabe que PIM1 media en los efectos de IL-6 durante la
reprogramación in vitro ( 27 ). El tratamiento simultáneo de ratones i4F con doxiciclina y con un
inhibidor de PIM (ETP-995, abreviado como PIMi) (figuras S3, H a J y texto suplementario) dio como
resultado una reducción profunda de la senescencia, factores SASP y reprogramación ( Fig. 3 , C y
D).Concluimos que la senescencia promueve la reprogramación in vivo a través del SASP, siendo
IL-6 un mediador crítico.

Ink4a / Arf promueve la producción de citocinas

Para investigar el mecanismo que une la senescencia con la reprogramación, examinamos el
impacto de las células senescentes y su secretoma en la reprogramación in vitro. Usamos
irradiación γ (20 Gy) para inducir una respuesta de senescencia robusta en fibroblastos primarios
( 14 ). El cocultivo de I4F MEFs reprogramados con γ-irradiados WT o p53- nulo MEFs aumentó la
reprogramación in vitro, mientras que el cocultivo con γ-irradiados γ- Ink4a / Arf- nulo MEFs no tuvo
ningún efecto ( Fig. 4A ). Para determinar si el efecto positivo de los MEF irradiados en la
reprogramación estaba mediado por factores secretados, añadimos el medio condicionado (CM) de
los MEF irradiados con γ a los MEF de i4F reprogramables . Encontramos que el CM de los MEF de
WT irradiados con γ aumentaba la reprogramación y que el CM de las células de p53 no irradiadas
con radiación γ era aún más potente para promover la reprogramación. Por el contrario, el CM de
los MEF nulos Ink4a / Arf irradiados con γ tuvo poco efecto ( figura 4B ).

12
Fig. 4La senescencia mejora la reprogramación in vitro.

( A ) Reprogramación de la eficacia de los MEF de i4Fcocultivados con MEF irradiados con γ (ratio,
1: 3) de los genotipos indicados. ( B ) Reprogramación de la eficacia de MEF i4F tratados con CM
de MEF irradiados con γ de los genotipos indicados. CM se recogió todos los días durante 3 días
después de la irradiación γ. ( C ) Perfil de citoquinas del CM a partir de MEF irradiados con γ de los
genotipos indicados. Todas las citoquinas se detectan por duplicado. IL-6 y TNFα están marcados
con rectángulos rojos. ( D ) Tnf y IL6 niveles de mRNA en MEFs no irradiados y gamma-irradiado de
los genotipos indicados en el día 3 después de γ-irradiación. ( E ) Eficiencia dereprogramación
de MEF i4F tratados con CM de MEF de WT irradiados con γ en ausencia o presencia de
cantidades crecientes de anti-IL-6 (+, 0,03 mg de anticuerpos por mililitro de CM; ++, 0,1 mg de
anticuerpos por mililitro de CM). En (A) a (E), los gráficos representan el promedio ± SD; la
significación estadística relativa al control se evaluó mediante la prueba t de Student de dos
colas con la corrección de Welch. Se realizaron un total de tres réplicas biológicas, cada una con
aislados de MEF independientes ( n = 3). En (A) y (B), las comparaciones de cada genotipo de MEF
irradiados con γ para el control no irradiado con γ se indican de la siguiente manera:
* P<0,05; ** P <0.01. Las comparaciones de p53 - null o in -Ink4a / Arf - null irradiadas con γ-
irradiados con WT-MEF irradiados con γ se indican de la misma manera pero utilizando el símbolo
"#." En (D), comparaciones de cada genotipo con su propio El control irradiado con γ se indica de la
siguiente manera: * P <0,05; ** P <0.01. En (E), las comparaciones de cada condición con el control
sin CM se indican de la siguiente manera: * P <0,05; ** P <0.01.Las comparaciones de cada
condición con el control sin anti-IL-6 se indican de la misma manera pero usando el símbolo "#".
13
Para identificar los mediadores candidatos, analizamos los CM del experimento anterior en una
matriz con anticuerpos inmovilizados para 40 citocinas. Dos citocinas presentes en el CM
de las células WT o p53 no irradiadas con γ fueron notablemente ausentes en el CM de los MEF
nulos Ink4a / Arf irradiados con γ , es decir, IL-6 y TNFα ( Figura 4C ). El análisis de los niveles de
ARNm confirmó que un locus Ink4a / Arf funcional es necesario para la expresión de los mRNA
Il6 y Tnf tras la irradiación γ ( figura 4D ). A continuación, añadimos anticuerpos anti-IL-6 al CM a
partir de células WT irradiadas con γ y descubrimos que suprimían el efecto del CM y evitaban casi
por completo la reprogramación ( figura 4E ). Este resultado respalda la idea de que IL-6 tiene un
papel fundamental en la reprogramación. Finalmente, exploramos si el requerimiento de Ink4a /
Arf para la producción de IL-6 tras la irradiación γ se debe a Ink4a o Arf . Infectamos WT MEF con
retrovirus que codifican ARN de horquilla corta (shRNA) contra Ink4a oArf . Encontramos que
sh Arf -MEFs conservaron la inducción normal deIl6 mRNA, mientras que sh Ink4a -MEFs no
lograron regular a Il6 luego de la irradiación γ (figura S4). Estas observaciones recapitulan in vitro el
concepto de que las células senescentes promueven la reprogramación a través del locus Ink4a /
Arf y la producción de IL-6.

La lesión tisular y el envejecimiento promueven la

reprogramación
Dado el vínculo entre la senescencia y la reprogramación, nos preguntamos si las afecciones
biológicas caracterizadas por niveles más altos de senescencia, como la lesión tisular, también
promoverían la reprogramación in vivo. Para abordar esto, nos centramos en el pulmón porque, a
pesar de la expresión del transgén OSKM ( 3 ), nunca hemos observado la reprogramación in vivo
en el pulmón en nuestras condiciones experimentales. Para inducir la senescencia celular en el
pulmón, elegimos el agente dañino para el ADN bleomicina, que es un modelo bien conocido de
lesión pulmonar y fibrosis ( 31 , 32 ). Dos semanas después del tratamiento con bleomicina, los
pulmones de ratones WT mostraron signos de fibrosis y senescencia ( Fig. 5A y Fig.
S5A). Notablemente, los pulmones de ratones i4F tratados con bleomicina y posteriormente
inducidos con doxiciclina mostraron un número abundante de células senescentes, expresión
potenciada de p21, agrupaciones de células NANOG + y focos displásicos ( Fig. 5A y Fig.
S5B). También mostraron un aumento en los niveles de ARNm de factores SASP, que
incluyen Il6 ( Fig. 5B ). De acuerdo con nuestras observaciones previas, los ratones i4F tratados
con doxiciclina que no se habían tratado con bleomicina no mostraron evidencia de reprogramación
o senescencia en los pulmones ( Fig. 5A ) y mostraron solo una modesta regulación al alza de
SASP ( Fig. 5B ). Este experimento indica que la imposición de daño tisular por un factor exógeno
hace que el pulmón sea permisivo para la reprogramación in vivo inducida por OSKM.

14
Fig. 5El daño tisular favorece la reprogramación in vivo.

( A ) Tinción de los pulmones de los ratones indicados tratados con una única dosis intratraqueal de
bleomicina o con PBS. Después de 1 día, los ratones se trataron con doxiciclina (0,2 mg / ml en el
agua de bebida) durante 14 días y se analizaron al final del tratamiento. Las cuantificaciones se
realizaron como se explica en la figura 2B . Los valores de SAβG indican el porcentaje relativo de
superficie teñida, los de NANOG indican el relativo ‰ de células positivas, y los de p21 indican el
porcentaje relativo de células positivas. La significancia estadística (n ≥ 3) con respecto a
los controles i4F se evaluó mediante la prueba t de Student de dos colas impar con la corrección de
Welch: * P <0,05; P <0.001. ( B ) niveles de ARNm de los genes indicados en los pulmones de los
&

mismos ratones que en (A). El análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la prueba post hoc de
Bonferroni indicaron diferencias significativas en Il6 y Pai1 entre los ratones i4F+ bleo y WT:
* P <0,05.

Siguiendo con el concepto de que la lesión tisular facilita la reprogramación inducida por OSKM,
examinamos si el envejecimiento, una afección caracterizada por acumulación sistémica de daño
celular y senescencia ( 17 ), también promueve la reprogramación impulsada por OSKM. Primero
analizamos la reprogramación in vivo en un modelo de ratón de progeria ( Terc -null mice de la
segunda generación o G2Terc -null ). El fenotipo de envejecimiento prematuro en estos ratones se
debe a la ausencia de actividad telomerasa que conduce a una longitud de los telómeros
críticamente corta ( 33 , 34 ). Tras la activación de OSKM, el páncreas de los ratones i4F; G2Terc-
null mostró niveles sustancialmente más altos de senescencia, factores SASP y reprogramación, en
comparación con los ratones control i4F derivados de las mismas cepas parentales ( Fig. 6 , A y
B). Estos resultados son consistentes con la hipótesis de que el daño tisular, en este caso debido a

15
los telómeros cortos en un modelo murino de envejecimiento prematuro, promueve la
reprogramación in vivo inducida por OSKM.

Fig. 6 Elenvejecimiento promueve la reprogramación in vivo.

( A ) los niveles de ARNm de los genes indicados en el páncreas de los ratones i4F e i4F; G2Terc-
null tratados con doxiciclina (0,2 mg / ml en el agua potable) durante 14 días y se analizaron al final
del tratamiento. La significación estadística relativa al control se evaluó mediante la prueba t de
Student de dos colas impar con la corrección de Welch: * P <0,05; ** P <0.01; **** P<0.0001. ( B )
Tinciones del páncreas de los mismos ratones que se muestran en (A). Las cuantificaciones se
realizaron como se explica en la figura 2B . Las imágenes son representativas de al menos cuatro
ratones ( n ≥ 4). (C ) Tinciones del páncreas de ratones jóvenes (de 7 a 9 semanas) y viejos (> 65
semanas) i4F tratados con doxiciclina (0,2 mg / ml en el agua de bebida) durante 7 días y
analizados al final del tratamiento. Las imágenes son representativas de al menos tres ratones ( n ≥
16
3). ( D ) niveles de ARNm de los genes indicados en el páncreas de los mismos ratones mostrados
en (C). La significación estadística se evaluó usando ANOVA de una vía y prueba post hoc de
Bonferroni. Las comparaciones de cadagenotipo i4F con su propio control se indican como * P<0.05
y ** P <0.01. Las comparaciones de edad i4F al joven i4F se indican de la misma manera pero con
el símbolo “#”. Los valores en (A) a (D) corresponden al promedio ± SD. En (B) y (C), los valores de
SAβG indican el porcentaje relativo de la superficie teñida, y los de NANOG indican el relativo ‰ de
las células positivas.

Finalmente, examinamos el efecto del envejecimiento fisiológico en la reprogramación. Se han

comparado lado a lado el impacto de la expresión OSKM de edad (> 65 semanas de edad) y
jóvenes (7 a 9 semanas de edad) i4F ratones. De acuerdo con nuestras observaciones en Terc -
nuevos ratones progericos , la activación de OSKM en ratones viejos dio como resultado niveles
más altos de células senescentes en el páncreas y niveles aumentados de células NANOG + y
formación de teratoma, en comparación con ratones jóvenes tratados en paralelo (Fig. 6C). y fig.
S6A). Como se esperaba ( 35 ), los niveles de ARNm deInk4a fueron mayores en ratones WT viejos
que en ratones WT jóvenes (Fig. 6D ). Además, tras la inducción de OSKM, los niveles de ARNm
deInk4a y factores relacionados con SASP fueron mayores en ratones i4Fviejos que en los
controles jóvenes correspondientes ( Fig. 6D ). Para fortalecer aún más el efecto del envejecimiento
en la reprogramación, inyectamos i4F MEF en los riñones de ratones WT viejos (> 95 semanas de
edad), y esto dio como resultado una formación de teratoma mayor y más rápida después del
tratamiento con doxiciclina, en comparación con i4F MEF inyectados. en ratones WT jóvenes (10
semanas de edad) (figura S6B). En conjunto, estos resultados indican que los entornos de tejido
senescente, como los asociados con el daño tisular inducido exógenamente o con el
envejecimiento, favorecen la reprogramación in vivo.

Discusión
Aquí, proporcionamos información sobre el mecanismo de la reprogramación in vivo. Mostramos
que, además de inducir la reprogramación celular, OSKM produce daños y senescencia en muchas
otras células. Las células dañadas secretan señales que promueven fuertemente la reprogramación
in vivo en las células vecinas. Este proceso está mediado por la inducción de la senescencia celular
y la consiguiente producción de citocinas, siendo la IL-6 de especial relevancia. Está bien
17
establecido que Ink4a / Arf , el daño al ADN y los telómeros cortos son barreras intrínsecas para la
reprogramación in vitro y, en consecuencia, la eficacia de la reprogramación in vitro disminuye en
las células envejecidas ( 7 , 8 , 36). In vivo, sin embargo, Ink4a / Arf , daño del ADN y telómeros
cortos desempeñan un papel extrínseco positivo y dominante adicional en la reprogramación al
crear un contexto de tejido senescente que promueve fuertemente la reprogramación a través de la
producción de factores, tales como IL-6. En ausencia de p53, el daño inducido por OSKM no está
restringido y la actividad secretora de las células dañadas se ve notablemente exacerbada. Por lo
tanto, p53 es una barrera fuerte para la reprogramación a través de mecanismos intrínsecos y
extrínsecos.También hemos descubierto una serie de objetivos farmacológicamente accionables
que pueden modular la reprogramación in vivo. Finalmente, existe un creciente apoyo a la hipótesis
de que el daño tisular puede provocar plasticidad celular que conduzca a la reparación de los tejidos
( 37 ). En este contexto, nuestros resultados sugieren que la senescencia puede contribuir a la
reprogramación, como la plasticidad celular sobre el daño tisular.

materiales y métodos

Ratones reprogramables
Para generar ratones reprogramables combinados con alelos nulos parap53 , Ink4a / Arf o Terc ,
utilizamos la línea de ratón reprogramable conocida como i4F- B, que transporta
un transgén OSKM ubicuo inducible por doxiciclina , abreviado como i4F , e insertado en
el genPparg ( 3 ) Los ratones reprogramables i4F- B se cruzaron con ratones deficientes
en p53 ( 38 ), Ink4a / Arf ( 39 ) o Terc ( 33 ). Los ratones i4F; p53 -null e i4F; Ink4a / Arf -null están
en un fondo genético puro C57BL / 6J.Ola.Hsd y se compararon con ratones i4F del mismo fondo
genético;los ratones i4F; Terc -null están en un fondo genético mixto enriquecido para C57BL /
6J.Ola.Hsd y se compararon con ratones i4F del mismo fondo genético mixto derivado de los
mismos ratones parentales.

Procedimientos animales
La experimentación animal en el CNIO, Madrid, se realizó de acuerdo con los protocolos aprobados
por el Comité de Ética CNIO-ISCIII para la Investigación y el Bienestar Animal (CEIyBA). Para
verificar la correcta inducción del transgén OSKM , se inyectaron por vía intraperitonealratones de
los tres genotipos, i4F , i4F, p53 - null e i4F; Ink4a / Arf-null , con 500 μl de doxiciclina (4 mg / ml;
Sigma) disuelta en suero fisiológico (NaCl al 0,9% p / v). Después de 9 horas, se sacrificaron los
ratones y se tomaron muestras para su análisis. En general, los ratones de 10-13 semanas de edad
de ambos sexos se trataron con 0,2 mg / ml de doxiciclina en el agua de bebida (suplementada con
7,5% de sacarosa) durante 7 días. Para el tratamiento simultáneo con productos químicos (excepto
en el caso de palbociclib), los ratones se trataron con el inhibidor correspondiente (ver Tratamientos
químicos ) y con 1 mg / ml de doxiciclina en el agua de bebida durante 7 días. En el caso de
palbociclib, la doxiciclina se administró por inyección intraperitoneal (500 μl de doxiciclina 2 mg / ml
18
disueltos en suero fisiológico cada dos días durante 5 días) para evitar una displasia grave en el
colon. En el caso de los ratones i4F; G2Terc-null y ratones tratados con bleomicina, junto con sus
controles correspondientes, el tratamiento con 0,2 mg / ml de doxiciclina se realizó durante 2
semanas. Para el experimento de reprogramación en ratones
viejos, utilizamos ratones i4F viejos que tenían más de 65 semanas y ratones i4F jóvenes que
tenían 7-9 semanas de edad. Para el análisis de proliferación, la bromodesoxiuridina (5-bromo-2'-
desoxiruridina), adquirida de Sigma # B5002, se inyectó diariamente por vía intraperitoneal a 50 μg /
g durante los primeros 5 días de tratamiento. Para los análisis de supervivencia (muerte por
teratomas y muerte por tumores), los ratones i4F, i4F; p53 -het e i4F; Ink4a / Arf -het, junto con sus
respectivos controles no reprogramables, se trataron con 0,2 mg / ml de doxiciclina durante 8 días, a
la edad de 20-28 semanas. Los ratones fueron monitoreados y sacrificados y la causa de la muerte
fue determinada por análisis histológico.

Formación de teratomas por MEF exógenos

El riñón fue el único lugar donde los MEF reprogramables inyectados produjeron teratomas con el
tratamiento con doxiciclina, lo que podría estar relacionado con la permisividad del riñón reportada
para el trasplante de iPSCs diferenciadas ( 40 ) (los otros lugares que probamos y no produjeron
teratomas fueron hígado , bazo, músculo, dermis e intraperitoneal). Para la formación de teratoma
en el riñón, MEFs de los tres genotipos ( i4F , i4F; p53 -null, y i4F; Ink4a / Arf -null) se tripsinizaron y
5 x 10 5 células, se resuspendieron en medio iPSC (ver más abajo), se inyectaron en el riñón de
ratones silvestres C57BL / 6J, desnudos (Hsd: atímico Desnudo / Desnudo de Harlan Ibérica) y
NSG (NOD.Cg- Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ de Charles River) de 10 semanas de edad, previamente
tratados para 10 días con 2 mg / ml de doxiciclina.Usamos ratones C57BL / 6J de> 95 semanas de
edad para la formación de teratoma en hospedadores antiguos. Después de la inyección, los
ratones fueron tratados durante 14 días con la misma dosis de doxiciclina. Los ratones se
sacrificaron cuando los teratomas eran palpables y los teratomas se procesaron para el análisis
histológico.

Formación de teratoma por iPSCs exógenos

Para teratomas subcutáneas, iPSCs se tripsinizaron y 1 x 10 6 células se inyectan por vía
subcutánea en los costados de ratones desnudos atímicos (Hsd: atímicos Nude / Nude; Harlan
Ibérica). Los teratomas se aislaron cuando el diámetro alcanzó> 1,5 cm y se procesaron para el
análisis histológico.

Aislamiento de iPSCs de la sangre

Toda la sangre periférica se recolectó directamente del corazón de losratones i4F , i4F, p53 -
null e i4F; Ink4a / Arf -null sin doxiciclina en el momento de la necropsia, y se sometió a dos rondas
de lisis de eritrocitos en solución de cloruro de amonio (Stem Cells ) Primera ronda de lisis con 10
ml, durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de centrifugación, y una segunda ronda de
19
lisis con 3 ml, durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de neutralización con 12 ml de
medio iPSC. Las células se resuspendieron, se plaquearon en alimentadores y se cultivaron en
medio iPSC en ausencia de doxiciclina.

Tratamientos químicos de los ratones

El tratamiento de ratones i4F con el inhibidor de Bcl-2 / Bcl-xL / Bcl-w navitoclax, también conocido
como ABT263 (Active Biochem, # A-100) (19 , 20 ), se realizó por sonda oral diaria durante 7 días a
25 mg / kg, disuelto en DMSO / PEG400 al 15%. El tratamiento con el inhibidor de CDK4 / CDK6
palbociclib, también conocido como PD033299 (Selleckchem # S1579) ( 22 ), se realizó por sonda
oral durante 5 días a 100 mg / kg, disuelto en lactato de sodio 50 mM. El tratamiento con el inhibidor
de quinasas IKK activadoras de NFκB, también conocido como BAY 11-7082 (Selleck Chemicals,
S2913) ( 25 ), se realizó mediante inyección intraperitoneal diaria durante una semana a 20 μg / g,
disuelto en DMSO al 10% / PBS . Para la inhibición de IL-6, inyectamos intraperitonealmente 1 mg
de un anticuerpo anti-IL-6 (BioXCell, BE0046) formulado en PBS, tres veces por semana a
losratones i4F y diariamente a los ratones i4F; p53-null , durante uno semana. Para el tratamiento
con IL-6 recombinante (ABYNTEK BIOPHARMA, SL, # AI081), a los ratones se les inyectó
intraperitonealmente 5 μg de rIL-6 cada dos días, en el transcurso de 6 días. El tratamiento con el
inhibidor de PIM se realizó por sonda oral diaria durante 7 días a 50 mg / kg, disuelto en 10% de
NMP (N-metilpirrolidona) / 90% de PEG300. PIMi fue desarrollado en CNIO; para una descripción
detallada, vea el texto suplementario. Los ratones de control se trataron con el vehículo
correspondiente. Todos los ratones fueron tratados simultáneamente con 1 mg / ml de doxiciclina en
el agua potable durante el tiempo indicado de tratamiento con los fármacos, excepto en el caso de
palbociclib, en el que a los ratones se les inyectaron intraperitonealmente 500 μl de doxiciclina (2
mg / ml) disuelto en suero fisiológico cada dos días durante 5 días. Para inducir daño pulmonar, se
inoculó bleomicina (Sigma # 15361) por vía intratraqueal en ratones i4F a 2 U / kg en machos y 1,5
U / kg en hembras y al día siguiente se trataron ratones con doxiciclina (0,2 mg / ml) durante 14
días.

Cultivo de células
Los MEF primarios se obtuvieron de embriones en E13.5 y se cultivaron en DMEM suplementado
con 10% de FBS y penicilina-estreptomicina.Los IPSC se cultivaron sobre células alimentadoras
inactivadas con mitomicina C en placas recubiertas de gelatina y en "medio iPSC": DMEM con alto
contenido de glucosa suplementado con KSR (15%, Invitrogen), LIF (1000 U ml -1 ), aminoácidos no
esenciales , penicilina-estreptomicina, Glutamax y β-mercaptoetanol. Las culturas se analizaron
rutinariamente para detectar micoplasmas y siempre fueron negativas. Para la transducción
retroviral, transfectadas HEK293T (5 × 10 6 ) células con vectores retrovirales que expresan ratón
shRNA contraInk4a , Arf y Ink4a / Arf , y la correspondiente LMP vector vacío, todo proporcionado
amablemente por Scott Lowe ( 41 ), y vectores de empaquetamiento utilizando Fugene HD
(Roche). Los sobrenadantes virales se recogieron dos veces al día en dos días consecutivos
20
comenzando 36 h después de la transfección y se usaron para infectar WT MEF, previamente
chapada a una densidad de 8 x 10 5 células por placas de 10 cm. Antes de la infección, se añadió
polibreno a los sobrenadantes virales a una concentración de 8 μg / ml. Para la reprogramación in
vitro, i4F , i4F; p53 - null e i4F; Ink4a / Arf -null MEFs se colocaron en placas a una densidad de 3 ×
10 5 células por pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina y se cultivaron en medio iPSC
con doxiciclina (1 μg / ml) El medio se cambió cada 48 h. Las placas de reprogramación se tiñeron
para actividad de fosfatasa alcalina (kit de detección AP, Sigma Aldrich) y se puntuaron las
coloniasAP + . Para experimentos de reprogramación de cocultivo, se sembraron3 × 10 5 MEF
irradiados con γ (20 Gy) en placas de 35 cm de diámetro y, sobre ellos, se plaquearon 1 ×
10 5 MEF i4F de los tres genotipos estudiados. Para la reprogramación in vitro con medio
condicionado (CM) de MEF irradiados con \ gamma, se cultivaron MEF i4F en medio iPSC o CM
con doxiciclina (1 \ mu g / ml) durante 14 días. Para producir el CM, 1,5 × 10 6 de MEFs gamma
irradiado (20 Gy) se sembraron en placas revestidas de gelatina 10 cm de diámetro, y se cultivaron
en 10 ml de medio iPSC. El medio se recogió y se filtró (0,22 μm) todos los días durante 3 días. Las
preparaciones de CM se usaron recientemente o se almacenaron congeladas a -20 ° C. Para
bloquear IL-6 durante la reprogramación in vitro, se añadieron al CM anticuerpos anti-IL-6 (BioXCell,
BE0046) o IgG de control (Santa Cruz Biotechnology sc-2027) a 0,1 mg / ml o 0,03 mg / ml.

Matriz de citocinas
Los niveles de citocina en medio acondicionado (CM) se analizaron usando la matriz de citoquinas
de ratón (panel A de matriz de citoquinas de ratón ProteomeProfiler de R & D Systems), siguiendo
las instrucciones del fabricante. La densidad de píxeles se determinó utilizando el software Image J.

Determinación de los niveles de citocinas en el suero

Los niveles de citocinas en suero se analizaron usando el kit de tampón maestro de proteínas
solubles en ratones BD Cytometric Bead Array (CBA) de BD (# 558266), siguiendo las instrucciones
del fabricante.Para la detección de IL-6 y TNF, se usaron conjuntos específicos de Flex Mouse de
BD (nº 558301 y nº 558299, respectivamente). La detección de las perlas de fluorescencia se
determinó mediante citometría de flujo usando el citómetro FACSCanto II.

Métodos RNA-seq
El ARN total del páncreas se extrajo de ratones i4F , i4F, p53 -null e i4F; Ink4a / Arf -null (n = 5 por
genotipo). Se usaron muestras de ARN total (1 μg / ml) con números de integridad de ARN en el
rango de 7.4 a 9.4 (Agilent 2100 Bioanalyzer). La fracción PolyA + se purificó y se fragmentó
aleatoriamente, se convirtió en ADNc bicatenario y se procesó mediante tratamientos enzimáticos
posteriores de reparación final, dA-tail y ligadura a adaptadores, siguiendo el protocolo "Preparación
de la muestra de TruSeq Stranded ARNm Parte # 15031047 Rev. D" de Illumina. La biblioteca
ligada al adaptador se completó mediante PCR con cebadores Illumina PE (8 ciclos). La biblioteca
de cDNA purificada resultante se aplicó a una celda de flujo Illumina para la generación de clúster y
21
 se secuenció en un Illumina HiSeq2000, siguiendo los protocolos del fabricante. El conjunto
completo de lecturas se ha depositado en el repositorio de GEO (número de acceso
GSE77722). Las lecturas se alinearon con el genoma del ratón (GRCm38 / mm10) con TopHat-
2.0.4 ( 42 ) usando Bowtie 0.12.7 ( 43 ) y Samtools 0.1.16 ( 44 ), lo que permitió dos
desemparejamientos y cinco multisitios. La estimación de las abundancias de transcripción y la
expresión diferencial se calcularon con Gemelos 1.3.0 ( 42 ) utilizando el conjunto de datos de
anotación de genoma de ratón GRCm38 / mm10 del explorador UCOM Genome.Se usó GSEA
( 45 ) para realizar un análisis de enriquecimiento del conjunto de genes de las vías Reactome, NCI
y KEGG. Se usó la lista de genes de RNA-seq preorganizada por estadística, estableciendo
'conjunto de genes' como el método de permutación y lo ejecutamos con 1000 permutaciones. Solo
se consideraron los conjuntos de genes con niveles de enriquecimiento significativos (valor q de
FDR <0.05).

Análisis de niveles de ARNm

El ARN total se extrajo de los MEF con Trizol (Invitrogen), siguiendo las recomendaciones del
proveedor. Para muestras de páncreas, se aisló el ARN total mediante extracción con ácido
guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo. Se transcribieron de forma inversa hasta 5 μg de ARN total
en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc avanzado iScript TM para RT-qPCR (BioRad # 172-
5038). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con GoTaq® qPCR Master Mix (Promega #
A6002) en un termociclador QuantStudio 6 Flex (Applied Biosystem). Los cebadores utilizados se
enumeran en la Tabla 1 . Para la normalización de entrada, utilizamos el gen de
mantenimiento Actin .

Tabla 1 Lista de cebadores usados para análisis de expresión de ARNm.

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Inmunohistoquímica
Las muestras de tejido se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% (formaldehído al 4% en
solución), se incrustaron en parafina y se cortaron en secciones de 3 μm, que se montaron en
portaobjetos superfrost®plus y se secaron. Para diferentes métodos de tinción, los portaobjetos se
desparafinaron en xileno y se rehidrataron a través de una serie de etanol graduado hasta
agua. Las secciones seriales se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) y la tinción con tricrómico de
Masson se utilizó para evaluar la presencia de áreas fibróticas en los pulmones. Para la
inmunohistoquímica, se utilizó una plataforma de inmunotinción automatizada (Ventana discovery
XT, Roche). La recuperación de antígenos se realizó primero con tampón de pH alto (CC1m,
Roche), se bloqueó la peroxidasa endógena y se incubaron los portaobjetos con los anticuerpos
primarios apropiados como se detalla: NANOG (Cell Signaling Technology, 8822); p65 (NFκB)
22
(Santa Cruz Biotechnology, sc-372); STAT3 fosforilado (Tyr705) (Cell Signaling Technology,
9145); SMAD2 fosforilado (fosfo-Ser465 y fosfo-Ser467) (Cell Signaling Technology, 3101); p21
(HUGO-291 CNIO); F4 / 80 (D10, CNIO); histona 2A.X fosforilada (Ser139) (Millipore, 05-
636); caspasa-3 activada (Cell Signaling Technology, 9661); MYC (Abcam, ab32072) y
bromodesoxiuridina (GE Healthcare, RPN202). Después del anticuerpo primario, los portaobjetos se
incubaron con los anticuerpos secundarios correspondientes y los sistemas de visualización
(OmniRabbit, Ventana, Roche) conjugados con peroxidasa de rábano picante (Chromomap,
Ventana, Roche). La reacción inmunohistoquímica se desarrolló usando 3,30-diaminobenzidine
tetrahydrochloride (DAB) como un cromógeno y los núcleos se contratiñeron con
hematoxilina. Finalmente, los portaobjetos se deshidrataron, aclararon y montaron con un medio de
montaje permanente para la evaluación microscópica. Las diapositivas digitales completas se
adquirieron con un escáner de diapositivas (Mirax Scan, Zeiss) e imágenes capturadas con el
software Pannoramic Viewer (3DHISTECH). El análisis y cuantificación de la imagen se realizó de
forma completamente automática utilizando el paquete de software AxioVision (Zeiss). Para cada
tinción, se cuantificaron varias diapositivas por ratón (al menos 3 ratones por grupo).

TABLA SAβG de secciones histológicas.

Para muestras de páncreas, se realizó tinción de SAβG en criosecciones de tejido conservadas en
medio de congelación OCT usando el kit de tinción Senescence β-Galactosidase (Cell Signaling, nº
9860).Brevemente, las criosecciones de tejido de 12 μm se fijaron a temperatura ambiente durante
5 minutos, con una solución que contenía formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2% en PBS, se
lavaron tres veces con PBS y se incubaron 48 horas a 37ºC con la solución de tinción que contenía
X -gal en NN-dimetilformamida (pH 6,0). Las secciones se contratiñeron con rojo rápido
nuclear. Para muestras de estómago, se realizó tinción de SAβG de montaje completo. Las
muestras de tejido se fijaron con la misma solución de fijación durante 45 minutos y luego se
lavaron e incubaron durante 24 horas a 37 ° C con la solución de tinción. Después de la incubación,
los tejidos se deshidrataron durante 30 minutos con etanol al 50% y durante la noche con etanol al
70%, después de lo cual se embebieron en parafina. El análisis y cuantificación de la imagen se
realizó de una manera completamente automática como se indicó anteriormente para la
inmunohistoquímica.
métodos de estadística
Las muestras (células o ratones) se asignaron a sus grupos experimentales de acuerdo con su tipo
predeterminado (tipo de célula o genotipo de ratón) y, por lo tanto, no hubo aleatorización. Los
investigadores no estaban cegados a los grupos experimentales (tipos de células o genotipos de
ratones). Los datos cuantitativos de PCR se obtuvieron de replicados biológicos independientes (n
valores corresponden a las réplicas biológicas, es decir, el número de ratones o el número de
preparaciones MEF independientes, las réplicas técnicas de la PCR no se consideraron en el valor
n). La significancia estadística se evaluó usando la prueba t de Student (dos colas, sin emparejar)

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con corrección de Welch, prueba exacta de Fisher (dos colas) o ANOVA de una vía con prueba post
hoc de Bonferroni, como se indica en las leyendas de la figura.

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