célula unica alcalina en electroforesis microgel Ensayo (comet)

El ensayo de la versión de la célula única alcalina en electroforesis micro gel es para determinar roturas de la cadena única
(SSB), sitios álcali lábiles y sitios de reparación de la escisión fue utilizado como descrita por Tice et al. (Tice et al. 2000) y
posteriormente demostrado por nuestro (grupo Kleinsasser et al. 2004; Kleinsasser et al. 2006; Ginzkey et al. 2009). En
resumen, diapositivas (Langenbrinck, Emmendingen, Alemania) se recubrieron con un 1,5% Normal De fusión Agarosa
(Biozym, Hameln, Alemania) y secadas a temperatura ambiente. Las muestras de la célula con una viabilidad de más del 80%
se resuspendieron en 0,5% bajo punto de fusión Agarosa (Biozym) y se aplica a las diapositivas preparadas. Después de un
período de lisis de 1,5 h en un tampón de lisis alcalina (10% DMSO, 1% Triton-X, 2,5 M NaCl, 10 mM Tris, 100 mM Na2EDTA,
pH 10), las diapositivas fueron colocados en una cámara horizontal de electroforesis en gel de (Renner, Dannstadt, Alemania) y
cubiertos con tampón alcalino (5 mM NaOH y 200 mM Na2EDTA) a pH> 13. Después de un ADN de 20 minutos
"desarticulación" período, la electroforesis se llevó a cabo en condiciones estándar (25 V, 300 mA, 30 cm distancia
interelectrodo) durante 20 minutos. Seguido de una neutralización a un pH de 7,5 (Trisma de base, Merck, Darmstadt,
Alemania), las células fueron teñidos con bromuro de etidio (20 mg / ml, Sigma-Aldrich) y almacenadas a 4 ° C hasta el SIS
Analy. Todos los pasos de preparación se realiza bajo luz roja o amarilla para evitar daños en el ADN por la luz UV. Uso de
Komet 4.0 software (Kinetic Imaging Ltd., Nottingham, Reino Unido), la distribución del ADN se analizados con base en el
porcentaje de ADN en la cola (DT), la longitud de la cola (TL) y de la Olive Tail Moment (OTM).

Prueba de micronúcleos

El ensayo de micronúcleos es una técnica eficaz para la detección de defectos durante la división de la celula. Fragmentos de
cromosomas, o cromosomas completos que no sean objeto de la mitosis normal, se pueden identificar por la formación de un
micronúcleo. Tales micronúcleos son partículas cromosoma en el citoplasma de las células que no son parte de los núcleos.
Tras la tinción, los micronúcleos pueden ser detectados y contados microscópicamente como un indicador de daño en el ADN.

Para este ensayo, las membranas transwell con las células epiteliales nasales se reincubaron durante 48 horas después de la
exposición. Para detener la división celular, las células fueron incubadas con citocalasinas (sigma-aldrich) a una concentración
de 4 mg/ml. Así, las células que se habían sometido a la mitosis puede ser detectado por sus núcleos se duplicó. Después de
48 h de incubación, las células fueron separadas de las membranas y por tripsinización centrifuga en láminas de vidrio. Las
células fueron fijadas en las diapositivas mediante incubación durante 2 h en metanol a -20 ° C. Después, las diapositivas se
mancha ed mediante incubación durante 5 min en de naranja acridina solución de tinción (15 mmol / l Na2HPO4 x 2H2O; 15
mmol / l x KH2PO4 H2O, 6,25 mg / ml de naranja acridina (Serva, Heidelberg, Alemania) y se lavaron dos veces en Tampón
Sorensen (15mmol/Na2HPO4 x 2H2O, 15mmol/KH2PO4 x H2O).

Las células fueron contadas usando un microscopio de fluorescencia Zeiss (Axiolab, Zeiss, Göttingen, Alemania) en la que el
ADN apareció rojo y el verde citoplasma. Durante el análisis, se contaron 1000 células y el número de células con núcleo
doble, múltiples células nucleadas, las células de apoptosis, las células durante la mitosis y células necróticas se
determinado. Una vista microscópica mostró la fragmentación de los núcleos como un signo de la apotosis y la
destrucción de la membrana, así como la decoloración de la célula vinculada a la necrosis. Las células con estas
características se cuentan y se comparan con los controles. Estos resultados proporcionan información acerca de la
proliferación de las células y los efectos citotóxicos.

Segundo conteo, se determino, el número de micronúcleos en 500 celulas doblenucledas . Durante este segundo recuento, el
numero de micronúcleos se determinó sólo en las células en crecimiento como marcador de genotoxicidad.

Los análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 16.0 (SPSS GmbH, Munich, Alemania). El test de Friedman
no paramétrico fue usado para muestras relacionadas. En el caso de significación con el test de Friedman, un análisis más
detallado se realizó mediante el el test no paramétrico de Wilcoxon para dos muestras relacionadas. Para el análisis estadístico
en el el ensayo de micronúcleos, el número de células doble nucleadas, células apoptóticas, células necróticas y de
micronúcleos se compararon. Para determinar la fragmentación del ADN, los momentos de cola de oliva de cada experimento
se analizaron en el ensayo cometa. Diagramas de caja se utilizaron para trazar los resultados. Una caja representa el 50% de
todos los valores y es bordeado por cuartiles superior e inferior. La mediana es representada por una línea en el cuadro y
divide el cuadro en dos partes con el 50% de los valores en cada cuadro. Los bigotes de las cajas muestran los valores fuera
de las cajas y se limita a una longitud de 1,5 distancias intercuartil. Los valores fuera de los bigotes se muestran por separado.
Los valores fuera de los bigotes con más de 1,5 distancias intercuartil y menos de 3 distancias intercuartil, a la caja se indican
con un círculo. Los valores con más de 3 distancias intercuartil a la caja se indican con un asterisco.
Resultados

La viabilidad celular

En todos los experimentos, el ensayo de azul tripán mostró una viabilidad de casi el 100%, sin las diferencias estadísticas entre
las diferentes concentraciones de NO2. No hay aumento de las tasas de apotosis y la necrosis se observaron en la evaluación
microscópica de el ensayo de micronúcleos, como se muestra en la Tabla 2. El número de las células doble-nucleadas no varió
significativamente (tabla 3), indicando en nuestros experimentos que la célula de no proliferación no fue influenciado por las
concentraciones de NO2 en el rango de 10 ppb - 10 ppm NO2 durante la exposición de 30 min.

Ensayo cometa

En todas las 10 muestras se podía ver, un aumento dependiente de la concentración en el momento de cola de oliva como un
indicador de los efectos genotóxicos (Figura 1). El aumento en el ADN la migración es significativa en el test de Friedman (p
<0,0001). Un análisis que utiliza el Prueba de Wilcoxon de las diluciones diferentes de NO2 en comparación con la exposición
al aire sintético mostró una diferencia significativa a partir de la concentración mínima de NO2 de 0,01 ppm (p = 0,037).

El control positivo de gases 100 ppm de butadieno-1, 3 mostraron menor migración de ADN que la mayor concentración de
NO2 de 10 ppm de NO2. La falta de control positivo de gases 500 μM MMS se utilizó en seis experimentos y mostró la
migración más alta de ADN.
Todos los datos que indican el porcentaje de ADN en la cola (DT), el ADN de cola Longitud (TL) y la Olive Tail Moment (OTM)
se presentan en la Tabla 1.

Ensayo de micronúcleos

En el primer análisis del ensayo de micronúcleos, las células doblenucleadas se contaron por 1000 células. No hubo cambios
significativos en la fracción de las células doblenucleadas en cualquiera de las concentraciones de NO2 (p = 0,317). El positivo
de control a 100 ppm de butadieno-1, 3 mostró una disminución en las células con núcleo doble (Figura 2). En el segundo
análisis, se contaron los micronúcleos por cada 500 celulas doble nucleadas y no se observó ningún cambio significativo
(p = 0,368) (Figura 3).

El control positivo, 100 ppm de butadieno-1, 3, no cambió el número de micronúcleos, pero no cambio la fracción de células
doblenucleadas. En todos nuestros ensayos, sólo tiene una incidencia menor de la mitosis y la apoptosis fue detectable
(Cuadro 2).

Todos los datos recogidos se presentan en los cuadros 2 y 3.

Discusión

La viabilidad celular

Parámetros para la viabilidad no fueron alterados, como se demostró en el ensayo de micronúcleos y el ensayo de viabilidad
tripán azul. Estos resultados se corresponden bien con los resultados reportados en la literatura, aunque un dispositivo
experimental similar a probar estas bajas. Las concentraciones de NO2 en las células epiteliales humanas no se ha publicado
hasta la fecha. Bakand et al. Tenga en cuenta que la viabilidad celular no se vea perturbada por la exposición a 2 h de aire
sintético, siempre y como el caudal de gas que se limita a 25 ml / min (Bakand et al. 2006a, b). Así, el gas caudal de 5 ml / min
utilizados en el presente estudio parece ser adecuado. La falta de efectos tóxicos con respecto a la citotoxicidad, la apoptosis y
la proliferación en nuestros experimentos indica una inspección más cercana de los ensayos de genotoxicidad.

Genotoxicidad

La prueba del cometa mostró la fragmentación del ADN, que debe ser considerado como efectos genotóxicos. El momento de
la cola de oliva alcanzó un valor medio de 2,11 la mayor concentración de NO2 a prueba, que es una cuadruplicación de la
mediana OTM para aire sintético.

En una configuración de cola pronunciada, la prueba del cometa puede detectar la fragmentación del ADN que también podría
atribuirse a la necrosis o apoptosis. Sin embargo, éste rara vez se ha visto en nuestros experimentos. Por otra parte, la prueba
del cometa no proporciona ninguna información sobre si la fragmentación del ADN es reversible mediante la reparación, unque
uno podría suponer que la fragmentación del ADN aumento probablemente reduce la probabilidad de de la reparación
adecuada. Por lo tanto, la fragmentación del ADN que se muestra en el ensayo cometa podría constituir una alteración
transitoria. Sin embargo, este ensayo es bien aceptado como un método cribado para la detección de posible inicio de tumor
y alteraciones del ADN.

Si bien el aumento de la fragmentación del ADN de concentración-dependiente, la cuestión de qué mecanismos son los
culpables deben ser discutidos. Es lógico suponer que las alteraciones del pH del medio podría conducir a ADN la
fragmentación. …..