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Siembra masiva
Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski. En este
caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del medio de
cultivo sólido imprimiéndo un movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede
realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo liquido, procediendo a su deslizamiento
sobre toda la superficie de una placa de agar.
2. PRÁCTICA # 5
“TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA
Y ESTUDIO DE BACTERIAS”
INTRODUCCIÓN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos
métodos que permiten cultivarlos bajocondicione artificiales, en los que es posible
cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo
demicroorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de
microbiología consiste en transferir unamuestra microbiológica de un
ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener
cultivosmicrobianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que
en el área de trabajo, existen muchosotros microorganismos; debido a esto,
es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren
ycontaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el
aspecto nutricional, sino también lasc o n d i c i o n e s a m b i e n t a l e s d e s u
hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar
e l p H y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la
temperatura, aireación la luminosidad.La aplicación de estos procedimientos ha
permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así comosu
aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio,
caracterización, aplicación ycontrol de los mismos. La forma de sembrarlos
y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del
estudio.
OBJETIVOS:
ξ
Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar
contaminaciones.
ξ
Organizar el material para su fácil manejo e identificación.
ξ
Manipular adecuadamente los cultivos puros.
ξ
Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos
específicos.
ξ
Identificar y describir correctamente las características culturales y microscópicas
de algunas bacterias.
ξ
Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscópico y microscópico de
bacterias.
MARCO TEÓRICO:
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el
desarrollo de éste en medios de cultivo ycondiciones de laboratorio
controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se
denominacultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se
denomina
cultivo puro
o
axénico
, cuandocontiene más de una especie de microorganismos se denomina
cultivo mixto
. Un cultivo tipo contiene una especieconocida de microorganismos y es
conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.Un cultivo
axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula.
Los cultivos axénicosson muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por
ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En
un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta.
Un cultivoaxénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora
de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya
que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio
ye n l o s i n s t r u m e n t o s y r e c i p i e n t e s u s a d o s e n l o s e x p e r i m e n t o s .
E s t o s m i c r o o r g a n i s m o s n o d e s e a d o s o contaminantes
deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. E l
segundo paso paraobtener un cultivo axénico es inocular o introducir,
una sola célula de un microorganismo en un medio sólido oliquido,
esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo
microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un
clon
está constituido por una población de células descendientes de unsolo
microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser
visible sobre la superficiede un medio sólido.Un cultivo microbiano que ha estado
creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferidoa un
medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia
no pueden continuar. En estatransferencia se deben considerar dos aspectos
básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables(contaminantes) y
concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.
Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena
conciencia de la ubicuidad de losm i c r o o r g a n i s m o s , l o q u e d e t e r m i n a
que el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas
p o r microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra
microbiológica a otro recipiente, se debentener una serie de cuidados
que eliminen los riesgos de contaminación. Es tos incluyen el área de
trabajo, ell a v a d o d e l a s m a n o s , l a e s t e r i l i z a c i ó n d e t o d o s l o s
u t e n s i l i o s y m e d i o s d e c u l t i v o a e m p l e a r y r e a l i z a r l a transferencia
del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la
flama del mechero.Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar
la contaminación se le llama técnica aséptica; elseguimiento cuidadoso y detallado
de la misma evita accidentes tales como:
o
La contaminación y pérdida del cultivo en estudio
o
La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la
contaminación de utensilios,productos y del personal. Este último aspecto
es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de
microorganismos patógenos.Con relación a la concentración del inóculo, un
error frecuente del principiante consiste en tomar muestrasgrandes, lo
que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza
de un alfiler contiene variosmillones de microorganismos, es obvio que con
una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa,será más que
suficiente para efectuar una transferencia exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:
hisopo, pipeta (para uso microbiológico sonterminales y la parte superior o boquilla
debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolleo portasa
con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.En
la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asa s de
inoculación, hisopos, pipetas o pipetaspasteur que deberán esterilizarse
previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los
diferentesmedios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por
ejemplo: los medios líquidos se preparan en tu bos omatraces que se
cubren con tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser
transferidomediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta
pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo
de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se
manifiestaen la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que
presenta este tipo de cultivo se refiere a laposibilidad de agitarlos acelerando la
velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo decultivos,
las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo
que permite estandarizar laconcentración del inóculo. La desventaja que
presentan, e que en ellos e difícil detectar contaminación a simplevista.Los medios
semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o
pipeta pasteur; eneste último caso es necesario calentar el medio y cuando se
encuentra en estado líquido y a una temperatura deaproximadamente 42ºC se
agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean
paraestudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación
de microorganismos con diferentesrequerimientos de oxígeno.Los medios sólidos
e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades,
despuésde esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La
siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha
suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman
agregadosq u e s e h a c e n v i s i b l e s a s i m p l e v i s t a ; a e s t o s a g r e g a d o s
s e l e s d e n o m i n a n c o l o n i a s , l a s q u e p r e s e n t a n características que
varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.En
cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya
que aún cuando la mayoría de losmicroorganismos crecen mejor en pH
neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH
adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la
obtención del cultivo. Con estemismo propósito durante la incubación se deben
proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismoen estudio. El
crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas
que la mayoría de lasveces están relacionadas con la de su hábitat
natural.Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren
temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) yalgunos hasta 80ºC. Para alcanzar y
mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológicao un
baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que
presentan su crecimientoóptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden
incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperaturaambiente.En general
las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a
los rangos de temperaturarequeridas por los microorganismos. La desventaja
que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, loque determina la
deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de
cualquier cultivo
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experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más
de nueve días. Con relación a lasnecesidades gaseosas, no todos los
microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólocrecen
en presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo crecen
en ausencia de oxígeno sedenominan anaerobios obligados o estrictos,
un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conocecomo
facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que
requieren oxígeno, pero sólo loutilizan cuando éste existe en concentraciones
reducidas; a estos se les llama microaerofílicos. El desarrollo deestos diferentes
grupos e favorece mediante la agitación de los cultivos o mediante la exclusión de
oxígeno paralo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales.Las
bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente distribuidas
en la naturaleza, habitan enel agua, el suelo, en la superficie o en el interior
de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en f o r m a
libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como
p a r á s i t o s , c o m e n s a l e s o m u t u a l i s t a s . Fisiológicamente este
grupo presenta características muy variables, hay bacterias
m ó v i l e s e i n m ó v i l e s fotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas;
se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura,pH y condiciones
gaseosas.En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios
que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular,
forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas,
movilidad,presencia de inclusiones de reserva y características culturales en
medios líquidos y sólidos en los que presentanpatrones de desarrollo en cuanto a
la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
Técnicas de siembra:El método de siembra por estría en placa
Es el
método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un
asa de siembra se tomauna muestra de la población mixta y a continuación
se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una
placa Petri
o en
baños de agua
,
ambos controladostermostáticamente. Los incubadores, o estufas, son
cámaras con aire adecuados para el crecimiento tanto decultivos sólidos
como líquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas
Petri, tubos de ensayo, omatraces. Los medios líquidos, distribuidos en
tubos o matraces, también pueden ser incubados en baños de a g u a
caliente. Estos baños resultan cómodos para incubar los cultivos
q u e t i e n e n q u e m a n i p u l a r s e c o n frecuencia, en la misma mesa de trabajo.
pH
El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en
un intervalo de pH relativamenteestrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a
valores de pH próximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a7,5. Sin embargo,
los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0.Aunque el pH de un medio sea el
adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento
microbiano lomodifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan
selectivamente algún componente ácido o básicodel medio; o bien, porque algún
producto de su metabolismo es un ácido o una base. Para disminuir los
cambiosde pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones. En
los medios complejos no suele ser esencial,porque sus materiales
naturales actúan como tampones débiles. Los tampones más eficaces
para valoresneutros de pH son los fosfatos y el carbonato cálcico. Ambos se
añaden normalmente como nutrientes (fuente defósforo y calcio); pero si se desea
que actúen como tampones se precisarán cantidades mayores.
Oxígeno
o los
anaerobios aerotolerantes,
que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estéril. Sumergir el
asa en el líquido y agitar paradesprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recién
sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperaturaóptima de
crecimiento.b)
Siembra en medio semisólido:
La siembra en este tipo de medio,que contiene una proporción menor de
agar que los medios sólidos yq u e s e e n v a s a e n t u b o s , s e l l e v a a
c a b o c o n u n h i l o d e s i e m b r a esterilizado, con el cual se toma la muestra. El
medio queda inoculadoal introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo,
retirándoloposteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar
Técnicas de estriado:
a)
estriado simple:
estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la
cajade petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cercas del mechero
espera que se enfríe el asa ytoma una colonia de la placa. Regresa la caja
a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estéril (donde se vaya a
sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de
laplaca y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy
juntas), oscilando el asade siembra sobre la superficie de una porción
pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.
b)
estriado en cuadrantes:
la mayor parte del inóculo e descarga en los cuadrantes 1y 2, lo que
permiteobtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra,
previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de
microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la
placacon medio, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no
dañar el medio. Se flamea elasa, se enfría y después de rozar la siembra realizada
previamente, se extiende de nuevo por otra zonade la placa haciendo nuevas
estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando
elasa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa
a incubar, a la temperaturaadecuada, siempre en posición invertida. Mediante
esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir deuna muestra que contenga un
elevado número de bacterias.
Guía de observación:
o
Observe las características culturales de las colonias formadas para cada
sembrado en los diferentes mediosde cultivo.
o
Describa las observaciones en la tabla correspondiente.
o
De cada microorganismo hacer un frote y teñir mediante la técnica de gram.
o
Observe al microscopio describir las características de las diferentes
bacterias en estudio en la tablacorrespondiente.
o
Compare el desarrollo de las bacterias inoculadas en los diferentes medios para
anaerobios.
o
Con base en los resultados obtenidos, indicar cuál bacteria es aerobia,
anaerobia, anaerobia facultativa omicroaerofílica.
Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio
sólido:
10
RESULTADOS:
Tabla de las características de cultivos bacterianos:
CULTURALESBacteria
E.FaecallisStaphylococc us AureusBacillusSubtillisStaphylococcu s
EpidermisE s c h e r i c h i a
c o l i P s e u d o m o n a Aureginosa1) En medio
líquido:Crecimient osuperficial
AnaerobiofacultativoAnaerobiofacultativoa e r
o b i o a n a
e r o b i o -
-
Opacidad
m e d i a n
a n u l a m
e d i a n a
n u l a - -
Sedimento
g r u m o s o c o
m p a c t o C o m
p a c t o v i s c
o s o - -
2) En medio semi-sólidoForma dela línea dela picadura
Papilar m ó
v i l
- - -
P a p i l a r m ó v i l V e l l o s a móvil
3) Colonias en placaMedio
Mc Conkey - S a l
M a n i t o l -
M c
C o n k e y E M B
E M B
Forma
F u s i f o r m e -
f u s i f o r m e -
C i r c u l a r C i r c
u l a r C i r c u l a r
Elevación
P l a n a -
c o n v e x a -
C o n v e x a C o
n v e x a C o n v e
x a
Bordes
Filamentoso- O n d u l a d o -
O n d u l a d o O n d u l a d o
O n d u l a d a
Textura
P l a n a -
M e m b r a n o s o-
M e m b r a n o s omembranosoButirosa
Color
r o s a d o -
m o r a d o -
r o j i z o m o r
a d o M e t a l i
c o
MICROSCÓPICAS
Forma
C o c o s C o c o s
B a c i l o s C o c
o s B a c i l o s b
a c i l o s
Agrupación
C a d e n a s R a c i m o s E n p a r e s
y en
cadenaR a c i m o s C a d e
n a s C a d e n a s
Gram
G r a m
+ G r a m
+ G r a m
+ G r a m
+ G r a m -
G r a m - DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
45ºC.
Medios semisólidos:
T i e n e n u n a c o n s i s t e n c i a i n t e r m e d i a e n t r e l a d e l o s a n t e r i o r e s . Suelen
contener una concentración de agar del 0,7 %.Tal como hemos apuntado, la mayoría
de los medios de cultivo se compran hoy en día y a p r e p a r a d o s . U n o s
llegan para su uso en distintas presentaciones, y
o t r o s deshidratados. La ventaja de los primeros es su comodidad y la desventaja, que su
plazode conservación es corto. Los deshidratados, en cambio, pueden
conservarse bastantemás tiempo, pero hay que prepararlos antes de usarlos.
https://es.scribd.com/doc/29302476/Medios-de-Cultivo