Apostila Pratica Qualidade Da Água

Universidade Federal de Viçosa
Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas

Departamento de Engenharia Civil
CIV442 - QUALIDADE DA ÁGUA

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS
Organizada por:
Ann H. Mounteer
Luís Eduardo do Nascimento
VIÇOSA
2015
INDICE
CONCEITOS DE QUÍMICA QUANTITATIVA .......................................................................................... 1

REQUISITOS PARA PRESERVAÇÃO DE AMOSTRAS ........................................................................... 9
I - SÓLIDOS ................................................................................................................................................. 10
II - TURBIDEZ ............................................................................................................................................. 13
III - COR....................................................................................................................................................... 14
IV - PH .......................................................................................................................................................... 16
V - ALCALINIDADE ................................................................................................................................... 18
VI - DUREZA, CÁLCIO E MAGNÉSIO ..................................................................................................... 20
VII - CONDUTIVIDADE ............................................................................................................................. 22
VIII - CLORETOS ....................................................................................................................................... 23
IX - FERRO TOTAL .................................................................................................................................... 25
X - NITROGÊNIO KJELDAHL TOTAL .................................................................................................... 27
XI - FÓSFORO TOTAL ............................................................................................................................... 29
XII - CLOROFILA A ................................................................................................................................... 31
XIII - COLIFORMES TOTAIS, TERMOTOLERANTES E ESCHERICHIA COLI................................. 34
XIV - CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS TOTAIS..................................................... 41
XV - DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO (DBO) E OXIGÊNIO DISSOVIDO (OD)................... 43
XVI - DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO (DQO) ............................................................................... 47
APÊNDICE - PREPARO DE REAGENTES ............................................................................................... 49
CONCEITOS DE QUÍMICA QUANTITATIVA
I. FORMAS DE EXPRESSÃO DE CONCENTRAÇÃO
Os diferentes métodos tradicionais de expressar concentração nas diversas análises de qualidade de água
se diferem da forma recomendada no Sistema Internacional (SI), e, portanto, merecem uma discussão
mais aprofundada. O texto a seguir é uma tradução livre de material encontrado no livro Water
Chemistry (Snoeyink e Jenkins, 1980).
1. Concentração em massa
Massa de soluto por unidade de volume da solução (p/v) – ex. mg/L

Massa de soluto por unidade de massa da solução (p/p) – ex. mg/kg
Sabendo que densidade () = massa da solução (kg) ,

volume da solução (L)
segue que a concentração em mg kg-1 (ppm) = concentração em mg (l )-1. Quando  = 1 kg/L, mg kg-1
= mg/L. Para a maioria das águas naturais e residuárias (exceto água do mar ou muito salobra),
assumimos que a densidade  = 1 kg/L. O componente de massa pode ter várias formas, conforme
ilustrado no exemplo a seguir.
Exemplo: Uma solução de nitrato de amônio (NH 4NO3) foi analisada para determinar as concentrações
dos íons nitrato (NO3-) e amônio (NH4-). Foram encontrados 36 mg de NH4- e 124 mg de NO3- em 100
mL da amostra. Portanto, a solução contém:
124 mg NO3- x 1000 mL = 1240 mg/L NO3-, e

100 mL L
36 mg NH4+ x 1000 mL = 360 mg/L NH4+

100 mL L
Podemos também expressar os constituintes em termos de nitrogênio:
mg/L N-NH4+ = 360 mg/L NH4+ x 14 mg N = 280 mg/L N-NH4+

18 mg NH4+
mg/L N-NO3- = 1240 mg/L NO3- x 14 mg N = 280 mg/L N-NO3-

62 mg NO3-
2. Concentração molar
Molaridade = mols de soluto por volume de solução, em litros (M)
Exemplo: Determinar a molaridade de uma solução contendo 36 mg de NH4- e 124 mg de NO3- em 100
mL da amostra.
360 mg/L NH4+ x 1 mol NH4+ = 0,02M NH4+

+
18.000 mg NH4 /mol
1240 mg/L NO3- x 1 mol NO3- = 0,02M NO3-

62.000 mg NO3-/mol
1
3. Equivalentes e concentração normal
A concentração em equivalentes por litro (N) ou normalidade (N) depende do tipo de reação da qual os
constituintes em solução participam. A vantagem do uso da normalidade é que quando duas substâncias
reagem, o número de equivalentes de cada espécie que reage é igual ao número de equivalentes do
produto. O número de equivalentes depende do peso equivalente da substância de interesse. Existem
casos em que uma única substância apresenta dois pesos equivalentes diferentes, porque participa de
dois tipos de reação diferentes. Uma solução 1 normal = 1 eq/L:
normalidade, N = massa da substância/L

peso equivalente
Existem três definições comumente encontradas de peso equivalente:
i. Peso equivalente baseado na valência dos íons, utilizado para reações de precipitação e dissolução:
peso equivalente = peso molar ,
|valência do íon|
sendo que uma unidade de carga por mol de substância = 1 equivalente por mol (eq/mol).
Exemplos:
a. Determinar a normalidade de uma solução de 80 mg/L CO32-, dado que CO32- participa da seguinte
reação de precipitação:
Ca2+ + CO32-  CaCO3(s)
cada mol contém 2 cargas positivas (Ca 2+) e 2 cargas negativas (CO32-)
peso molar CO32- = 60 g/mol
peso equivalente = peso molar = 60 g/mol = 30 g/eq = 30 mg/meq

valência 2 eq/mol
normalidade = 80 mg/L = 2,67 mN

30 mg/meq
b. Determinar a normalidade de uma solução de 155 mg/L Ca3(PO4)2, dado que o Ca3(PO4)2 participa
da seguinte reação de dissolução:
Ca3(PO4)2(s)  3Ca2+ + 2PO43-
peso molar Ca3(PO4)2 = 310 g/mol,
cada mol forma 6 cargas positivas (3Ca2+) e 6 cargas negativas (2PO43-),
peso equivalente = 310 g/mol = 51,67 g/eq = 51,67 mg/meq

6 g/eq
normalidade = 155 mg/L = 3 mN

51,67 mg/meq
ii. Peso equivalente baseado no número de íons de hidrogênio ou hidróxido envolvidos numa reação
ácido-base
peso equivalente = peso molar,
n
onde n = número de H+ ou OH- que reage,
2
sendo que 1H+ ou 1 OH- por mol de substância = 1 equivalente por mol (eq/mol).
Exemplo: Determinar a normalidade das seguintes soluções:
1. 36,5 mg/L HCl, considerando a reação: HCl + NaOH  NaCl + H2O

2. 45 mg/L CO32-, considerando a reação: CO32- + H2O  HCO3- + OH-
3. 45 mg/L CO32-, considerando a reação: CO32- + 2H+  H2CO3
1ª reação: 1H+ reage por mol de HCl, portanto:
peso equivalente = 36,5 g/mol HCl = 36,5 g/eq = 36,5 mg/meq

1 eq/mol
normalidade = 36,5 mg/L = 1 mN

36,5 mg/meq
2ª reação: 1OH- é formado por cada mol de CO32- que reage, portanto:
peso equivalente = 60 g/mol CO32- = 60 g/eq = 60 mg/meq

1 eq/mol

60 mg/meq
3ª reação: 2H+ reagem com cada mol de CO32-, portanto:
peso equivalente = 60 g/mol = 30 g/eq= 30 mg/meq

2 eq/mol

30 mg/meq
iii. Peso equivalente baseado no número de elétrons (e-) transferido numa reação redox.
peso equivalente = peso molar ,

número de e- transferidos
sendo que 1 e- transferido por mol de substância = 1 equivalente por mol (eq/mol).
Exemplo: Considerar a reação redox:
4Fe2+ + O2 + 4H+  4Fe3+ + 2H2O
Para determinar o peso equivalente dos reagentes, é necessário separar a reação em duas reações, uma
de oxidação e uma de redução:
oxidação: 4Fe2+  4Fe3+ + 4e-

redução: O2 + 4H+ + 4e-  2H2O
Baseado na reação de redução, o peso equivalente de oxigênio é: 32 g/mol O2 = 8 g/eq

4 eq/mol
Baseado na reação de oxidação, o peso equivalente do ferro é: 56 g/mol Fe = 56 g/eq

1 eq/mol
3
4. Concentração equivalente de O2
Os resultados das análises de demanda bioquímica (DBO) e química (DQO) de oxigênio são expressos
como oxigênio, assumindo que cada mol de O2 pode aceitar 4 mols de elétrons (O2 + 4e-  2O2-). Por
exemplo, na determinação de DBO, se 0,25 x 10-3 mols O2 reagem com a matéria orgânica em 300 mL
de água, a concentração de matéria orgânica, expressa como DBO, é:
0,25 x 10-3 mol x 4 eq x 8000 mg = 26,7 mg/L como O2

0,3 L mol eq
Na determinação de DQO, o agente oxidante é o dicromato (Cr 2O72-). Durante o teste, determina-se o
número de equivalentes por litro de Cr2O72- utilizado para oxidar a matéria orgânica. Pressupõe-se que
se O2 tivesse sido utilizado, o mesmo número de equivalentes de O 2 teriam reagido. Portanto,
N Cr2O72- x 8000 mg/eq O2,
resultará na concentração de matéria orgânica (DQO), em mg/L como O2.
5. Concentração equivalente de CaCO3
O sistema de carbonato de cálcio (CaCO3) é amplamente empregado para expressar dureza (Ca e Mg) e
alcalinidade (HCO3-, CO32- e OH-). Neste sistema, a concentração de uma substância em mg/L como
equivalente de CaCO3 é calculada pela equação:
eq da substância x 50.000 mg CaCO3

L eq CaCO3
Por exemplo, para dureza o peso equivalente de CaCO3 é definido baseado na valência (reação de
dissolução):
CaCO3(s)  Ca2+ + CO32-
e cada mol de CaCO3 produz 1 mol, ou 2 equivalentes, de Ca2+. Portanto, em relação a Ca2+:
peso equivalente de CaCO3 = 100g/mol = 50 g/eq

2 eq carga/mol
Para a reação de alcalinidade total, o que importa é o CO32-, e o peso equivalente de CaCO3 é definido
baseado no número de íons de hidrogênio que reage (reação ácido-base):
CaCO3(s) + 2H+  H2CO3 + Ca2+
Uma vez que 2H+ reagem com cada mol de CaCO3, para CO32-:
peso equivalente de CaCO3 = 100g/mol = 50 g/eq

2 eq H+/mol
4
II. ANÁLISES VOLUMÉTRICAS E COLORIMÉTRICAS
Análises volumétricas e colorimétricas estão dentre as mais frequentemente empregadas na análise da

qualidade de águas naturais e residuárias. Alguns conceitos fundamentais e importantes para obter
resultados exatos com estes tipos de análises estão discutidos a seguir, com base no disposto no livro
Chemistry for Environmental Engineering and Science (Sawyer et al., 2003).
1. Análises Volumétricas
Exemplos de análises volumétricas incluem os métodos usados na determinação de alcalinidade, dureza,

cloretos, nitrogênio, e DBO. A análise volumétrica se baseia na quantificação do volume da solução
titulante necessário para completar uma determinada reação nas amostras analisadas, e se faz por
titulometria. O titulante é uma solução com concentração bem definida. Para se realizar uma análise
volumétrica precisa-se de:
i. equipamento para medir a quantidade de amostra com exatidão – balança analítica ou vidraria
volumétrica
ii. solução titulante padronizada
iii. indicador do ponto final estequiométrico da reação (ponto de equivalência)
iv. bureta calibrada para medir o volume da solução titulante necessário para atingir o ponto de
equivalência
É imprescindível o uso de vidraria calibrada nas análises volumétricas. A vidraria calibrada é de dois
tipos:
1) contém um volume definido de líquido (ex. balão volumétrico e proveta), e
2) entrega um volume definido de líquido (ex. pipeta volumétrica e bureta).
Não se deve substituir o segundo tipo pelo primeiro, uma vez que uma porção do líquido sempre
permanecerá no balão / proveta e a quantidade entregue sempre será menor do que a quantidade
calibrada.
A transformação dos dados obtidos durante a titulação é feita utilizando a seguinte equação fundamental:
CamVam = CtitVtit
onde: Cam = concentração da amostra
Vam = volume da amostra, mL
Ctit = concentração da solução titulante
Vtit = volume da solução titulante, mL
Quando a concentração é expressa como normalidade, tem-se: NamVam = NtitVtit
onde: Nam = normalidade de substância ativa na amostra

Ntit = normalidade de substância ativa no titulante
Rearranjando, tem-se:
N de substância ativa na amostra = volume titulante (mL) x N (eq/L),

volume da amostra (mL)
mg/L de substância ativa na amostra = volume titulante (mL) x N (eq/L) x Peq (mg/eq),
volume da amostra (mL)
Exemplo: Numa análise de cloretos, gastaram-se 13 mL da solução titulante AgNO3 0,0141 N para a
titulação de 100 mL de uma amostra de água. Determinar a concentração de cloretos na amostra.
13 mL x 0,0141 eq/L x 35.400 mg Cl-/eq = 64,9 mg/L Cl-
100 mL
A padronização, ou determinação da concentração exata da solução titulante, depende do uso de um

material padrão de pureza conhecida, denominado padrão primário. Padrões primários são tipicamente
5
sais de alta pureza, passíveis de secagem sem se decompor, e de pesagem com elevada exatidão.
Exemplos incluem o carbonato de sódio e o ftalato ácido de potássio, utilizados para padronizar soluções
ácidas e básicas, respectivamente.
O procedimento de padronização de titulantes com um padrão primário é:
1. Pesar três ou quatro amostras do padrão primário, previamente seco, em quantidade suficiente
para gastar aproximadamente 20 mL da solução titulante. As pesagens devem ser exatas e
correções feitas se a pureza do padrão difere significativamente de 100%.
2. Adicionar água desionizada suficiente, e demais reagentes necessários, a cada amostra do padrão
primário para ajustar sua concentração à da solução titulante a ser padronizada. Titular as amostras
do padrão primário com o titulante, até o ponto final.
3. O valor real da normalidade (N) da solução titulante é obtido através do fator de correção, FC.
Pela equação fundamental das análises volumétricas:
NppVpp = NtitVtit
Vpp
N tit  N pp
Vtit
Vpp
FC 
Vtit
onde: Vpp = volume do padrão primário, mL

Vtit = volume da solução titulante gasto na titulação, mL
Dessa forma, a normalidade real da solução titulante = normalidade nominal x FC.
Exemplo: Preparou-se o titulante HCl 0,01N. Gastaram-se 19,3 mL de uma solução de Na2CO3 0,01N
para padronizar 20 mL dessa solução. Qual é a normalidade real da solução titulante?
FC = 19,3 mL = 0,965
20 mL
normalidade = 0,01N x 0,965 = 0,00965N
2. Análises Colorimétricas
Os métodos colorimétricos são mais frequentemente aplicados na análise de soluções diluídas, e,

portanto, são frequentemente utilizados em análises de água (ex: na determinação de cor, ferro,
manganês, fósforo, DQO, entre outras). Para ser quantitativo, o método colorimétrico depende da
formação de um composto colorido e a intensidade da cor desenvolvida deve ser diretamente
proporcional à concentração da substância sendo quantificada. Isto é, as soluções do composto ou
complexo colorido formado devem possuir propriedades em conformidade com a lei de Lambert-Beer.
A Lei de Lambert-Beer demonstra que a quantidade de um feixe de luz monocromática incidente que é
transmitida através de uma solução colorida decresce de forma exponencial com o aumento da distância
percorrida dentro da solução e com o aumento da concentração da substância que absorve a luz:
T = I/Io = 10-acl ou A = log Io/I= acl ,
onde: T = transmitância da solução

Io = intensidade da luz incidente
I = intensidade da luz transmitida
a = constante de absortividade
A = absorbância da solução
c = concentração da solução
l = comprimento do percurso de luz na solução
Assim, se conhecermos os valores de a (valores tabelados para muitas substâncias) e l (espessura do
recipiente contendo a solução, geralmente uma cubeta transparente de dimensões exatas e conhecidas),
e medimos a absorbância, A, podemos calcular a concentração, c, da solução:
6
c=A
al
Análises colorimétricas podem ser realizadas utilizando diferentes equipamentos, incluindo os tubos de
comparação de cor (tubos Nessler), o colorímetro fotoelétrico e o espectrofotômetro. Os colorímetros
e espectrofotômetros precisam ser calibrados para cada tipo de análise efetuada. A calibração é feita
preparando uma série de padrões de concentrações conhecidas, seguindo o mesmo procedimento
empregado para a análise das amostras. A absorbância dos padrões, no comprimento de onda () de
máxima absorção, é lida, e o gráfico de absorbância versus concentração é elaborado (curva padrão). A
absorbância das amostras, lida no mesmo comprimento de onda, é convertida em concentração por
interpolação da curva.
Exemplo: Considerar os seguintes dados obtidos para a análise de DQO pelo método colorimétrico:
Solução padrão de DQO A curva padrão obtida é:

mg/L O2 Abs. 600 nm y = 0,000445x + 0,006710
0,5
0 0,002 R2 = 0,998383
Abs 600 nm
0,4
180 0,085 0,3
0,2
360 0,17
0,1
510 0,242 0
720 0,330 0 300 600 900
-1
DQO, mg l O2
900 0,399
Foram analisadas duas amostras, com os seguintes resultados:

Amostra Abs 600 nm
1 0,277
2 0,408
Baseada na curva padrão, a DQO das amostras será calculada pela equação:
Abs600 nm  0,00671
DQO 
0,000445
A DQO da amostra 1 = 607 mg/L O2
A DQO da amostra 2 não pode ser calculada, porque sua absorbância está fora da curva padrão. Nesse
caso seria necessário diluir a amostra e analisá-la de novo.
7
III. MÉTODOS PADRONIZADOS
Métodos padronizados para determinação da maioria dos parâmetros de qualidade de águas naturais e
residuárias estão coletados no livro de referência Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater, editado, em conjunto, pela American Public Health Association (APHA), American Water
Works Association (AWWA) e Water Environment Federation (WEF). A padronização dos métodos de
análise é de fundamental importância uma vez que permite comparar dados obtidos em diferentes épocas
e locais. Os métodos descritos nesta apostila se baseiam no disposto na 22ª Edição do Standard Methods,
publicada em 2012. Para maiores detalhes dos métodos descritos, deve-se consultar esse compêndio.
Os métodos contemplados nesta apostila seguem.
Parâmetro Standard method Descrição

Alcalinidade 2320 B Titulometria
Cloretos 4500-Cl- Titulometria (argentométrica)
Clorofila a 10200 H Espectrofotometria
Tubos múltiplos ou membrana filtrante,
Coliformes 9221, 9222
substrato cromogênico
Condutividade 2510 B Condutância
Contagem de bactérias 9215 B - D
Contagem em placa, membrana filtrante
heterotróficas
Cor 2120 C Espectrofotometria
Demanda bioquímica de
5210 B 5 dias
oxigênio (DBO)
Demanda química de
5220 D Refluxo fechado, colorimetria
oxigênio (DQO)
Dureza, Cálcio, Magnésio 2340 C Titulometria
Ferro 3500-Fe B Fenantrolina, colorimetria
Fósforo 4500-P D Cloreto estanoso, colorimetria
Nitrogênio 4500-NH3 B e C Kjeldahl destilação, titulometria
Winkler (iodométrico) modificado pela
Oxigênio dissolvido 4500-O C
azida
pH 4500-H+ B Potenciometria
Série de sólidos 2540 B a F Gravimetria
Turbidez 2130 B Nefelometria
IV. REFERÊNCIAS
RICE, E.W.; BAIRD, R. B.; EATON, A.D.; CLESCERI, L.S. (Eds.) Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater, 22 ed. Washington: APHA-AWWA-WEF, 2012.
SAWYER, C.N.; McCARTY, P.L.; PARKIN, F.F., Chemistry for Environmental Engineering and
Science, Boston: McGraw-Hill 2003.
SNOEYNIK, V.L.; JENKINS, D. Water Chemistry, New York: John Wiley & Sons, 1980.
8
REQUISITOS PARA PRESERVAÇÃO DE AMOSTRAS
É de fundamental importância respeitar os procedimentos e prazos para a preservação de amostras, para

garantir a qualidade dos resultados analíticos. Os requisitos para os parâmetros analisados mais
frequentemente estão listados a seguir (do Standard Methods).
Tempo máximo de
Volume
1 2 armazenagem
Parâmetro Frasco mínimo de Forma de Preservação
recomendado /
amostra, mL
permitido
Alcalinidade P, V(B) 200 Refrigerar 24 h / 14 d
DBO P, V 1000 Refrigerar 6 h / 48 h
DQO P, G 100 H2SO4 até pH < 2 e refrigerar 7 d / 28 d
Cloretos P, V 50 Nenhuma 28 d
Clorofila P, V 500 30 d no escuro 30 d
Cor P, V 500 Refrigerar 48 h / 48 h
Condutividade P, V 500 Refrigerar 28 d / 28 d
Dureza, Ca, Mg P, V 100 HNO3 até pH < 2 6 meses / 6 meses
Fosfato dissolvido – filtrar
Fosfato V(A) 100 48 h
imediatamente; refrigerar
P(A), Metal dissolvido – filtrar
Metais (Fe) 500 6 meses / 6 meses
V(A) imediatamente; HNO3 até pH < 2
Nitrogênio
Kjeldahl Total P, V 500 H2SO4 até pH < 2 e refrigerar 7 d / 28 d
Nitrato + Nitrito P, V 200 H2SO4 até pH < 2 e refrigerar 48 h / 48 h
Oxigênio
V 300 Analisar imediatamente 8h/8h
dissolvido
pH P, V 50 Analisar imediatamente 2h
Sólidos P, V 200 Refrigerar 7d
Sólidos
1000
sedimentáveis
Turbidez P, V 100 Refrigerar 24 h / 48 h
1
Frasco: P – plástico (polietileno ou equivalente); V – vidro; P(A) ou V(A) – enxaguado com HNO3 50%; V(B)
– borossilicato
2
Refrigerar = estocar a 4ºC, no escuro
9
I - SÓLIDOS
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Gravimetria)

A série de sólidos é determinada pelos pesos dos resíduos secos sob condições específicas. Para sólidos
totais, uma amostra homogênea é evaporada em um cadinho previamente pesado e seca até peso
constante a uma temperatura de 103 a 105C. A amostra pode ser filtrada em filtro seco e pesado, com
poro de diâmetro ≤ 1,2 µm, antes da evaporação. Neste caso, o material retido no filtro é seco a 103 a
105C, enquanto o material filtrado é evaporado e seco a 180C, para determinar os sólidos em
suspensão e dissolvidos, respectivamente. Qualquer uma das amostras acima (sólidos totais, em
suspensão ou dissolvidos) mencionadas pode ser depois calcinada a 550C, resfriada e pesada para
determinar os sólidos fixos, e por diferença, os sólidos voláteis.
Sólidos sedimentáveis são quantificados como o volume que ocupam, após sedimentação por 1 h em
vidraria específica, o cone Imhoff.
2- INTERFERÊNCIAS
Águas com concentrações elevadas de cálcio, magnésio, cloreto e/ou sulfato são higroscópicas e,
portanto, devem ser submetidas a secagem prolongada e pesagem rápida. Material flutuante ou
submerso não-homogêneo pode ser retirado da amostra antes da análise de sólidos, se desejado. Óleos
e graxas flutuantes devem ser dispersos em liquidificador antes da análise. Amostras contendo altas
concentrações de bicarbonato dissolvido podem necessitar de secagem a 180C, para garantir a
conversão completa de bicarbonato a carbonato. O peso total do resíduo seco deve ser menor que 200
mg, para evitar a formação de crostas que impedem a evaporação da água.
3- COLETA E PRESERVAÇÃO DA AMOSTRA

As amostras podem ser coletadas em frascos tipo pirex ou plástico, após verificar que o material em
suspensão não adere às paredes do frasco. As amostras devem ser mantidas a 4 °C para evitar
decomposição microbiológica dos sólidos até a análise. As análises devem ser realizadas, dentro de 24
horas, preferencialmente. Nunca guarda amostras para análise por mais de sete dias. As amostras devem
ser analisadas a temperatura ambiente.
4- MATERIAL
 Aparato de filtração a vácuo
 Balança analítica
 Banho-maria
 Cadinhos de porcelana com capacidade de 100 mL
 Cone Imhoff
 Dessecador provido de dessecante com indicador de umidade
 Estufas de secagem, uma a 103-105C e a outra a 180±2C
 Filtros de fibra de vidro, sem resina ligante e com poro < 2μm (tipo Whatman 934AH, Gelman
A/E, Millipore AP40, ou equivalente)
 Mufla a 550C
 Provetas de 100 mL
 Pipetas de 10 mL
5- METODOLOGIA
 Secar filtros de fibra de vidro a por uma hora a 103-105C e calcinar cadinhos de porcelana a
550C por 20 min. Manter filtros e cadinhos em dessecador e pesá-los logo antes do uso. Pesar
imediatamente antes do uso.
10
5.1. Sólidos totais (ST)
 Transferir um volume conhecido da amostra bem homogeneizada para um cadinho calcinado e
previamente pesado. Escolher um volume de amostra que fornecerá de 10 a 200 mg de resíduo
seco. Evaporar a amostra em banho-maria. Se necessário, adicionar alíquotas sucessivas da
amostra ao mesmo cadinho após a evaporação. Levar o cadinho até a estufa a 103-105ºC e secar
até peso constante (diferença de peso entre pesagens sucessivas < 4 % ou 0,5 mg, o que for
menor). Réplicas devem apresentar valores que se diferem < 5 % de sua média.
 Cálculo:
mg/L sólidos totais = (A – B) ,
volume amostra, L
onde: A = peso seco do resíduo + cadinho, mg

B = peso seco do cadinho, mg
5.2. Sólidos em suspensão totais (SST)

 Transferir um volume conhecido da amostra homogeneizada para o aparelho de filtração, provido
de filtro de fibra de vidro seco, previamente pesado, e filtrar a vácuo.
 Após completar a filtração, lavar o material retido com três porções de 10 mL de água destilada,
permitindo drenagem completa após cada lavagem.
 Transferir o filtro de fibra de vidro para um cadinho calcinado previamente pesado e secar em
estufa a 103-105C até peso constante (diferença de peso entre pesagens sucessivas < 4% ou 0,5
mg, o que for menor). Réplicas devem apresentar valores que se diferem <5% de sua média.
 Cálculo:
mg/L SST = (C – D) ,
volume amostra, L
onde: C = peso seco do resíduo + filtro, mg

D = peso seco do filtro, mg
5.3. Sólidos dissolvidos totais (SDT)

 Transferir o filtrado total (da amostra e das lavagens), obtido na etapa anterior, para um cadinho
calcinado previamente pesado e evaporar em banho-maria. Secar a amostra evaporada em estufa
a 180±2C até peso constante (diferença de peso entre pesagens sucessivas < 4% ou 0,5 mg, o
que for menor). Réplicas devem apresentar valores que se diferem <5% de sua média.
 Cálculo:
mg/L SDT = (E – F) ,
volume amostra, L
onde: E = peso seco do filtrado + cadinho, mg

F = peso seco do cadinho, mg
Em análises expeditas, mas menos precisas, os sólidos dissolvidos podem ser determinados por
diferença entre os sólidos totais e em suspensão: mg/L SDT = ST – SST. Da mesma forma, em
amostras com poucos sólidos em suspensão, esses podem ser determinados paro diferença entre
sólidos totais e dissolvidos: mg/L SST = ST – SDT.
5.4. Sólidos fixos (SF) e voláteis (SV)

 Calcinar o resíduo produzido na análise de sólidos totais, em suspensão ou dissolvidos, a 550C
por 15 a 20 min. Deixar o cadinho resfriar parcialmente ao ar livre e depois em dessecador. Pesar
assim que atingir a temperatura ambiente.
 Cálculos:
mg/L sólidos totais voláteis (STV) = (A – G) ,
volume amostra, L
onde: A = peso seco do resíduo + cadinho, mg
G = peso seco do resíduo + cadinho após a calcinação, mg
11
e por diferença, mg/L sólidos totais fixos (STF) = ST – STV.
mg/L sólidos em suspensão voláteis (SSV) = (C – H) ,

volume amostra, L
onde: C = peso seco do resíduo + filtro, mg

H = peso seco do resíduo + filtro, após a calcinação, mg
e por diferença, mg/L sólidos em suspensão fixos (SSF) = SST – SSV.
5.4. Sólidos sedimentáveis

 Encher o cone Imhoff até a marca de 1 L com amostra homogeneizada. Deixar sedimentar por
45 min e agitar suavemente para deslocar os sólidos aderidos às paredes do cone. Deixar
sedimentar mais 15 min e anotar o volume de sólidos sedimentáveis no cone, em mL/L. Se o
material sedimentado estiver com bolsões de líquido entre as partículas, estimar o volume do
líquido e descontá-lo do volume de sólidos sedimentáveis. Não considerar material flutuante
como sedimentável.
12
II - TURBIDEZ
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Nefelometria)

A turbidez é determinada pelo princípio da nefelometria, em célula fotoelétrica. Mede-se a quantidade
de luz que emerge perpendicularmente a um feixe luminoso que atravessa a amostra, acondicionada
dentro de uma cubeta incolor e transparente. Em aparelhos de laboratório, os padrões de comparação
são preparados a partir de suspensões de formazina ou de “micro-esferas” e a turbidez é expressa em
unidades nefelométricas de turbidez (UNT).

Deve-se coletar a amostra em frasco de vidro ou polietileno. A conservação se faz pela refrigeração a
4ºC no escuro. O prazo para análise é de 48 horas.
3- MATERIAL
 Nefelômetro
 Piseta com água destilada
 Papel absorvente
4- REAGENTES
 Padrão primário de turbidez
5- METODOLOGIA
5.1. Considerações gerais
 Medir a turbidez imediatamente para evitar alteração de temperatura da amostra e floculação e
sedimentação de partículas.
 Recomenda-se desgaseificar a amostra antes de se medir a turbidez. (A desgaseificação pode ser
efetuada pela aplicação de um vácuo parcial, de calor ou por ultra-sonografia).
 Remover qualquer condensação nas paredes da cubeta antes de colocá-la no nefelômetro. Evitar
usar cubetas sujas ou arranhadas.
5.2. Calibração do nefelômetro

 Preparar suspensões diluídas de turbidez em água destilada a partir da suspensão primária,
imediatamente antes do uso e descartar após o uso.
 Seguir o manual de instruções do aparelho. Utilizar pelo menos um padrão para cada faixa de
turbidez a ser avaliada.
5.3. Medição de turbidez

 Agitar suavemente a amostra, evitando formar bolhas de ar e transferir à cubeta.
 Reportar a turbidez com a precisão a seguir:
Turbidez, UNT Precisão, UNT

0,1-1,0 0,05
1-10 0,1
10-40 1
40-100 5
100-400 10
400-1.000 50
>1.000 100
13
III - COR
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (espectrofotmetria)

A cor natural da água se deve a uma variedade grande de substâncias e tem-se adotado como padrão
uma mistura de cloroplatinato de potássio (K 2PtCl6) e cloreto de cobalto (CoCl2) que resulta numa
solução de cor parecida com a produzida pelas substâncias naturais dissolvidas na água. A cor produzida
por 1 mg/L Pt, na forma de K2PtCl6, é definida como uma unidade de cor, ou unidade Hazen (UH). A
tonalidade da cor é ajustada pela adição de CoCl2. De uma solução padrão estoque de 500 UH, prepara-
se uma série de diluições, em tubos iguais (conhecidos como tubos Nessler). A cor das amostras pode
ser quantificada por comparação visual com esses padrões de trabalho, ou para um trabalho mais preciso,
a cor pode ser lida em espectrofotômetro, a 465 nm.
Algumas águas residuárias industriais apresentam uma cor de tonalidade muito diferente da de águas
naturais. Nesse caso, o Standard Methods recomenda determinar a transmitância da amostra em
diferentes comprimentos de onda, variando de 400 a 700 nm. Os valores de transmitância são utilizados
em conjunto com uma tabela de cor para expressar a cor em termos do comprimento de onda dominante,
luminescência e pureza. Para maiores detalhes da análise de cor em amostras contendo cor não-natural,
consulte o Standard Methods.
2-INTERFERÊNCIAS
Qualquer turbidez aumenta consideravelmente a cor verdadeira da amostra. A turbidez pode ser
eliminada pela centrifugação (30 min a 3000 rpm) ou filtração (membrana de 0,8 µm) da amostra. A
cor também aumenta com o pH, e o pH da amostra deve ser especificado. Para fins de pesquisa, deve-
se ajustar o pH das amostras para 7,6 antes de se prosseguir com as análises, ou analisar a cor numa
ampla faixa de valores de pH.

Deve-se coletar 500 mL da amostra em frasco de vidro ou polietileno e conservá-la sob refrigeração a
4ºC. O prazo para análise é de 48 horas.
4- MATERIAL
 Espectrofotômetro a 465 nm
 Cubetas de vidro
5- REAGENTES (veja preparo no Apêndice)

 Solução padrão de cloroplatinato de potássio e cloreto de cobalto, 500 uH
 Ácido sulfúrico
 Hidróxido de sódio
6- METODOLOGIA
 Medir o pH da amostra. Ajustar o pH a 7,6 pela adição de ácido sulfúrico (H2SO4) ou hidróxido de
sódio (NaOH), em concentração suficiente para evitar um aumento de mais de 3% no volume da
amostra.
 Curva de calibração - Para a comparação espectrofotométrica, preparar uma série de pelo menos
cinco diluições em balões volumétricos, conforme segue (sugestão):
14
mL solução padrão mL H2O
UH
estoque (500 UH) destilada
5 0,5 49,5
10 1,0 49,0
15 1,5 48,5
20 2,0 48,0
25 2,5 47,5
50 5,0 45,0
100 10,0 40,0
250 25,0 25,0
500 50,0 -
 Zerar o espectrofotômetro, ajustado a 465 nm, com água destilada (branco).

 Transferir uma alíquota de cada padrão para a cubeta de vidro limpa. Verificar a ausência de bolhas
de ar e ler a absorbância a 465 nm (A465).
 Construir a curva de calibração de concentração dos padrões de cor versus A465 nm.
 Encher a cubeta com as amostras, evitando a introdução de bolhas de ar. Ler a A465 e converter a
cor, por interpolação da curva padrão.
 Reportar resultados de cor em números integrais, com a precisão a seguir:
UH Precisão, unidades
1-50 1
51-100 5
101-250 10
251-500 20
15
IV - pH
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Potenciometria)

O padrão absoluto para a determinação de pH é o eletrodo de hidrogênio, mas o eletrodo de vidro é o
mais comumente utilizado, devido à maior facilidade de uso e manutenção. Existe também uma série
de indicadores que foram calibrados contra o eletrodo de hidrogênio para determinar suas características
de cor em diferentes níveis de pH, permitindo assim estimar o pH por colorimetria.
A força eletromotriz (emf) produzida entre o eletrodo de vidro e o eletrodo de referência (tipicamente o
de calomelano) varia linearmente com o pH. A ampliação da diferença de potencial gerado entre os
eletrodos é traduzida pela calibração direta do eletrodo de vidro com tampões-padrão. A escala
operacional de pH é definida como:
𝐹(𝐸𝑥 − 𝐸𝑥 )
𝑝𝐻𝑥 = 𝑝𝐻𝐵 ±
2,303𝑅𝑇
onde:
pHx = pH medido potenciometricamente
pHB = pH nominal do tampão-padrão
Ex = emf da amostra
Es = emf do tampão-padrão
R = constante do gás, 8,314 joule/mol.K
F = Faraday, 9,649 coulomb/mol
T = temperatura absoluta, K
2- INTERFÊNCIA
A temperatura afeta o pH de duas maneiras; o efeito mecânico resultante de alterações das propriedades
dos eletrodos e o efeito químico devido ao deslocamento do equilíbrio. Portanto, sempre reportar a
temperatura da amostra na hora de medir o pH. Muitos medidores de pH vêm equipados com um
compensador de temperatura para corrigir o pH para 25ºC.

Deve-se coletar a amostra em frasco de vidro ou polietileno e a analisá-la imediatamente.
4- MATERIAL
 Medidor de pH equipado com eletrodos de vidro e de referência
 Béqueres de 100 mL
5- REAGENTES
 Soluções de tampões-padrão (pH 4, 7 e 10)
6- METODOLOGIA
 Seguir o manual de instruções do medidor de pH e de armazenagem e preparo dos eletrodos.
 O medidor de pH é calibrado utilizando as soluções de tampões-padrão, na faixa de pH desejada.
Geralmente existem dois controles: o do coeficiente linear e o do coeficiente angular do medidor.
O controle do coeficiente linear desloca a curva de resposta lateralmente para cruzar o ponto
isopotencial (0 mV), sem modificar a inclinação, e é ajustado com o tampão padrão pH 7,0. O
controle do coeficiente angular gira a curva emf/pH ao redor do ponto isopotencial e é ajustado
com tampão padrão ácido (ex. pH 4,0) ou alcalino (ex. pH 10,0). Após a calibração, o medidor
indicará a mudança correta de mV por unidades de pH na temperatura do ensaio.
 Para calibrar o aparelho, enxaguar o eletrodo combinado com água destilada em excesso, secar com
papel absorvente e imergi-los na solução tampão padrão pH 7,0. Deixar equilibrar e ajustar o
16
controle do coeficiente linear. Remover o eletrodo, enxaguá-lo com água destilada em excesso,
secar com papel absorvente e imergi-los na solução tampão pH 4,0 ou 10,0. Deixar equilibrar, e
ajustar o controle do coeficiente angular. Repetir o ajuste de controles até que a leitura do aparelho
acusa uma diferença menor que ± 0,1 unidade de pH do valor da solução tampão.
 Leitura da amostra: Imergir o eletrodo limpo e seco na amostra e deixar equilibrar por
aproximadamente um minuto e depois ler o pH. Deve-se manter a amostra sob agitação suave para
garantir sua homogeneidade.
 Reportar o valor de pH até uma casa decimal (0,1 unidade).
17
V - ALCALINIDADE
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Titulometria)

A amostra é titulada com ácido sulfúrico diluído (H2SO4 0,02N). O resultado é expresso como
equivalentes de CaCO3. Para amostras com pH inicial > 8,3, a titulação se faz em duas etapas, conforme
ilustrada na Figura 1. Na primeira etapa, a titulação é efetuada até pH 8,3, o ponto de viragem do
indicador fenolftaleína (rosa  incolor), que corresponde ao ponto de equivalência da conversão de
carbonato em bicarbonato. Na segunda etapa, a titulação prossegue até pH 4,5, o ponto de viragem do
indicador verde de bromocresol (azul  verde), que corresponde ao ponto de equivalência da conversão
de bicarbonato em ácido carbônico. Maior exatidão pode ser conseguida por titulação potenciométrica.
A: OH- + H+  H2O
B: CO32- + H+  HCO3-
C: HCO3- + H+  H2CO3
ponto de
8,3 inflexão
pH
4,5
A B C
0
mL ácido
Figura 1 - Curva de titulação para uma mistura hidróxido-carbonato (Sawyer et al. 2003).

Deve-se coletar 200 mL da amostra em frasco de polietileno e conservá-la sob refrigeração a 4ºC. O
prazo para análise é de 24 horas.
3- MATERIAL
 Pipeta volumétrica de 100 mL
 Erlenmeyer de 250 mL
 Bureta de 25 mL ou 50 mL
 Béquer de 50 mL

 Solução de ácido sulfúrico (H 2SO4) 0,02 N, padronizada
 Solução indicadora de fenolftaleína (pH 8,3)
 Solução indicadora de verde de bromocresol (pH 4,5)
5- METODOLOGIA
 Pipetar 100 mL da amostra, transferir para um erlenmeyer de 250 mL e adicionar 3 a 5 gotas de
fenolftaleína.
 Caso a amostra apresente coloração rósea, a mesma deve ser titulada com H2SO4 0,02N até a
descoloração. Anotar o volume gasto de ácido como “F”.
18
 Adicionar a seguir 3 a 5 gotas de verde de bromocresol e seguir com a titulação até o ponto de
viragem da cor azul para uma cor esverdeada. Anotar o volume gasto como “B”. Deve-se analisar
uma prova em branco (usando água destilada e indicador), adicionando H2SO4 0,02N até o ponto
de viragem, para servir como controle.
 Anotar o volume total de H2SO4 0,02N gasto nas duas titulações como “T”. Logo:
F = Volume em mL de solução de H 2SO4 0,02N necessário para titulação da amostra, até o

ponto de viragem da fenolftaleína.
B = Volume em mL de solução de H 2SO4 0,02N necessário para titulação da amostra, até o
ponto de viragem do verde de bromocresol.
T = F+ B = Volume total de solução de H2SO4 0,02N consumido na titulação.
 Cálculo:
Alcalinidade total, mg/L CaCO3 = T x 0,02 N x FC x 50.000 mg/eq CaCO3

100 mL amostra
onde: FC = fator de correção para o titulante H2SO4.
5.2 Formas de Alcalinidade
Uma estimativa da proporção das diferentes formas de alcalinidade presentes numa amostra pode ser
obtida diretamente da determinação de alcalinidade, conforme descrita a seguir:
Resultado da Formas de alcalinidade

Titulação (mL) Hidróxido Carbonato Bicarbonato
F = 0 0 0 T
F < ½.T 0 2.F T – 2.F
F = ½.T 0 2.F 0
F > ½.T 2.F - T 2.(T – F) 0
F = T T 0 0
19
VI - DUREZA, CÁLCIO E MAGNÉSIO
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Titulometria)

O método de determinação de dureza de maior exatidão se baseia na análise individual dos cátions
bivalentes Ca2+ e Mg2+ (por absorção atômica, cromatografia de íons, etc.). A dureza é calculada como:
Dureza, mg/L equivalente CaCO3 = 2,497 [Ca, mg/L] + 4,118[Mg2+, mg/L]
Para análises de rotina, utiliza-se o método volumétrico, no qual uma solução do ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) ou seu sal dissódico (Na 2EDTA) é utilizada como solução titulante.
O EDTA forma um complexo extremamente estável, quando adicionado a certos cátions, especialmente
o Ca2+ e Mg2+, conforme a reação:
HOOC-CH2 CH2-COOH HOOC-CH2 CH2-COOH

N-CH2CH2-N + Ca2+ N-CH2CH2-N + 2Na+
NaOOC-CH2 CH2-COONa OOC-CH2 CH2-COO
Ca
Usa-se a tintura negro de eriocromo (Erio.T) como indicador da reação. Esse indicador forma
complexos de cor vermelho-vinho com os íons responsáveis pela dureza (a solução de Erio.T é de cor
azul):
OH Mg
OH O
O
SO3H -N=N-
+ Mg2+ SO3H -N=N-
O2N
O2N
Tintura negro de eriocromo T (Erio.T) Complexo [Erio.T-Mg2+]

azul vermelho
O EDTA adicionado como titulante formará complexos com os íons metálicos livres na amostra.
Quando todo íon metálico livre estiver complexado, uma gota a mais da solução de EDTA deslocará o
metal complexado com o indicador, provocando o aparecimento da coloração azul do indicador livre, o
que assinala o ponto final da titulação. Para que esse processo ocorra na prática, é necessário que a
estabilidade do complexo metal-indicador seja menor do que a estabilidade do complexo metal-EDTA.
Caso contrário, o EDTA não conseguirá deslocar o metal do complexo com o indicador.
Usando o indicador negro de eriocromo em solução tamponada em pH 10, determina-se a soma de cálcio
e magnésio (dureza total). Em outra alíquota determina-se o cálcio, separadamente. Para tanto é
necessário mascarar o magnésio, o que é feito elevando-se o pH para 12, valor suficiente para precipitar
o magnésio quantitativamente:
Mg2+ + 2OH-  Mg(OH)2(S)
O cálcio é então determinado pela titulação com EDTA, usando como indicador a murexida:
H O O H H O O H
N N N N
N O Ca2+ N O
+ Ca2+
N N N N
H O O- H O O-
NH4+ NH4+
Murexida Complexo [murexida-Ca2+]
púrpura rosa
A dureza magnésio é obtida pela diferença entre a dureza total e a dureza cálcio. Em virtude do alto pH
com que se trabalha, é recomendável que o tempo de titulação não ultrapasse cinco minutos, a fim de
diminuir o erro por perda de CaCO3 por precipitação.
2- INTERFERÊNCIA
20
Alguns íons metálicos dificultam a observação do ponto de viragem da titulação. Essa interferência pode
ser minimizada acrescentando inibidores apropriados antes da titulação da amostra. Para a maioria das
águas de abastecimento o uso de inibidores é desnecessário.

Amostras de 300 mL podem ser coletadas em frascos de vidro ou plástico. Amostras não analisadas
imediatamente podem ser preservadas por até sete dias, pela adição de ácido nítrico concentrado até pH
< 2 e refrigeração a 4ºC.
4- MATERIAL
 Béquer 50 mL
 Pipetas 50 mL, 2 mL
 Bureta 25 mL e suporte
 Erlenmeyers 250 mL
 Piseta de água destilada

 Solução de EDTA (Na2-EDTA) 0,02N (0,01M), padronizada
 Solução tampão cloreto de amônio/hidróxido de amônio (NH4Cl/NH4OH) (pH 10 ± 0,1)
 Hidróxido de sódio (NaOH) 1,0N
 Indicador sólido negro de eriocromo T (Erio.T)
 Indicador sólido murexida
6- METODOLOGIA
6.1. Dureza total
 Pipete 50 mL da amostra e transfira para um erlenmeyer de 250 mL. Adicione 2 mL de solução
tampão NH4Cl/NH4OH e cerca de 0,05 g do indicador Erio.T.
 Titule lentamente com a solução padronizada de EDTA 0,02N até que a cor vermelha desapareça
e surja uma cor azul persistente por 30 s.
Obs.: Deve-se ter o cuidado de adicionar as últimas gotas da solução titulante em intervalos de 3 a 5 s.
A titulação não deve demorar mais que 5 min, a partir do momento que se adiciona a solução tampão.
 Cálculo:
Dureza total, mg/L CaCO3 = V titulante (mL) x 0,02N x FC x 50.000 mg/eq CaCO3
V amostra (mL)
6.2. Dureza Cálcio e Magnésio
 Pipete 50 mL da amostra e transfira para um erlenmeyer de 250 mL. Adicione 2 mL de NaOH 1,0
M e cerca de 0,05g do indicador sólido murexida.
 Titule lentamente com a solução padronizada de EDTA 0,02N até que a cor rosa desapareça e surja
a cor púrpura (violeta) persistente por 30 s.
Obs.: Em face do pH elevado usado neste método, é imperativo titular imediatamente após a adição
do hidróxido de sódio, para evitar precipitação de CaCO3.
 Cálculos:
Dureza cálcio, mg/L CaCO3 = V EDTA (mL) x 0,02N x FC x 50.000 mg CaCO3/eq ,
V amostra (mL)
mg/L Ca = Dureza cálcio x 40,08 mg Ca

100 mg CaCO3
Dureza magnésio, mg/L CaCO3 = Dureza total – Dureza cálcio
mg/L Mg = (Dureza total – Dureza cálcio) x 24,3 mg Mg .

100 mg CaCO3
21
VII - CONDUTIVIDADE
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO
A condutância (G) de uma solução, a recíproca de sua resistência (R), é medida entre dois eletrodos,
quimicamente inertes, e separados por uma distância fixa:
G = k (A/L),
onde: A = área superficial dos eletrodos, cm2

L = distância entre eletrodos, cm
k = condutividade, constante de proporcionalidade característica da solução,
µSiemens cm-1
Na prática, calcula-se o valor do constante da célula de condutividade, C, pela determinação da

condutância de uma solução padrão, GS, de condutividade conhecida, kS:
C = k/G.
Uma vez determinada o valor de C, a condutividade (k) da amostra pode ser determinada:
k = C.G
A calibração da célula de condutividade é geralmente efetuada com uma solução padrão de KCl 0,01M
(k = 1412 µS cm-1). Na maioria das células de condutividade comerciais modernos, os valores de
condutividade são corrigidos para a temperatura de 25ºC por um compensador de temperatura acoplado
à célula de condutividade.
2- MATERIAL
 Célula de condutividade
 Béqueres de 100 mL

 Solução padrão de cloreto de potássio (KCl) 0,0100M (1412 µS cm-1)
4- METODOLOGIA
 Seguir as instruções da célula de condutividade para a leitura da solução padrão. A célula de
condutividade deve ser lavada com água destilada e seca com papel macio e absorvente, sempre
que imerso em uma solução diferente.
 A calibração deve ser realizada sempre ao se iniciar o trabalho.
 Após a calibração, ler a condutividade das amostras, lavando a célula com água destilada após cada
amostra.
22
VIII - CLORETOS
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Mohr – titulometria)

O método Mohr para determinação de cloretos consiste na titulação da amostra com nitrato de prata
(AgNO3), na presença do indicador cromato de potássio (K 2CrO4). A reação entre o AgNO3 e o cloreto
presente na amostra leva à formação do precipitado branco cloreto de prata (AgCl):
Ag+ + Cl-  AgCl(s) cor branca
Não havendo mais cloreto, o AgNO3 passa a reagir com K2CrO4 (cor amarela) formando o precipitado
avermelhado cromato de prata (Ag2CrO4), indicando o ponto final da titulação:
2Ag+ + CrO42-  Ag2CrO4(s) cor avermelhada
Deve-se realizar uma prova em branco para corrigir possíveis erros na determinação do ponto de
viragem, devido à possível contaminação da água destilada usada para a lavagem das vidrarias e preparo
de reagentes.
2- INTERFERÊNCIA
As substâncias normalmente encontradas em águas potáveis não causam interferência. Brometo, iodeto
e cianeto são quantificados como cloreto. O nitrato de prata reage preferencialmente com os sulfetos
presentes na amostra, formando um precipitado preto (Ag 2S):
2AgNO3 + H2S  Ag2S + 2HNO3

2AgNO3 + Na2S  Ag2S + 2NaNO3
Utiliza-se o H2O2, que reage com os sulfetos em meio básico, para eliminar esta interferência:
2H2O2 + H2S + 4OH-  H2SO4 + 4H2O

2H2O2 + Na2S + 4OH-  Na2SO4 + 4H2O
Os produtos dessa reação se dissolvem no meio e estabilizam a reação. Posteriormente, faz-se necessária
a correção do pH do meio, que deve estar entre 6,5 e 10,5.
Em meio ácido, o cromato de potássio reagirá com o H + presente na amostra e dará origem ao cromato
ácido que não atua como indicador:
CrO42- + H+  (HCrO4)-
Em meio básico a prata reagirá preferencialmente com o OH- presente na amostra e dará origem ao
hidróxido de prata de acordo com a reação:
Ag+ + OH-  AgOH
Quando a amostra apresentar cor e turbidez que podem interferir de modo a não se conseguir detectar o
ponto de viragem, adiciona-se uma suspensão de Al(OH)3, que é posteriormente removido por de
filtração.
O ortofosfato em concentração maior que 25 mg/L precipita como fosfato de prata. Ferro em
concentração maior que 10 mg/L pode mascarar o ponto final da titulação.

A coleta deve ser feita em frasco de vidro, polietileno ou polipropileno sem necessidade de preservação.
O prazo para a análise é de sete dias.
23
4- MATERIAL
 Bastão de vidro
 Béquer 250 mL
 Bureta 25 mL
 Erlenmeyer 250 mL
 Funil
 Papel de filtro
 Pipeta volumétrica 100 mL

 Solução de nitrato de prata (AgNO3) 0,0141N, padronizada
 Solução indicadora de fenolftaleína
 Solução indicadora de cromato de potássio
 Suspensão de hidróxido de alumínio
 Ácido sulfúrico 0,1 N
 Hidróxido de sódio 0,1 N
6- METODOLOGIA
 Caso a amostra apresente cor e/ou turbidez, adicionar 3 mL da suspensão de hidróxido de alumínio
para cada 100 mL da amostra, agitar vigorosamente e filtrar.
 Transferir 100 mL da amostra clarificada para um béquer de 250 mL.
 Gotejar 3 a 4 gotas de fenolftaleína e adicionar NaOH 0,1N até ligeira coloração rósea. Adicionar
1 mL de H2O2 30% e agitar.
 Ajustar o pH da amostra para uma faixa de 6,5 a 10,5 usando NaOH 0,1N ou H2SO4 0,1N (gotejar
NaOH 0,1N até ligeira coloração rósea e a seguir H2SO4 0,1N até o descoramento).
 Adicionar 1 mL de cromato de potássio e titular com a solução de AgNO 3 0,0141N até que surja a
primeira cor avermelhada persistente.
 Analisar uma prova em branco (100 mL de água destilada mais indicador).
 Cálculo:
mg/L Cl- = (A – B) x 0,0141N x FC x 35.450 mg/eq Cl-,
mL amostra
onde: A = volume (mL) de AgNO3 gasto na titulação da amostra

B = volume (mL) de AgNO3 gasto na titulação do branco
FC = fator de correção da solução titulante AgNO3
24
IX - FERRO TOTAL
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Colorimetria)

O ferro pode ser quantificado por espectrometria de absorção ou emissão atômica, como os demais
metais. O método colorimétrico com 1,10-fenantrolina, descrito aqui, é mais simples e apresenta limites
de detecção e sensibilidade parecidos com os demais métodos espectrométricos.
O ferro trivalente, Fe(III), é reduzido a ferro bivalente, Fe(II) com cloridrato de hidroxilamina em meio
ácido, sendo a seguir tratado com 1,10-fenantrolina em meio tamponado. O Fe(II) forma um complexo
vermelho-alaranjado com a 1,10-fenantrolina que exibe absorbância máxima a 510nm. O complexo é
formado em uma faixa de pH entre 3 a 9, entretanto o desenvolvimento da cor é mais rápido em presença
de excesso de 1,10-fenantrolina, na faixa de pH entre 2,9 e 3,5.
Redução do ferro(III) com hidroxilamina:
4Fe(III) + 2NH2OH  4Fe(II) + N2O + H2O + 4H+
Formação do complexo entre ferro(II) – fenantrolina
N N
+ Fe+2
N N N Fe+2 N
1,10-fenantrolina
N N
Complexo vermelho-alaranjado
2- INTERFERÊNCIA
A adição de um excesso de fenantrolina elimina a interferência causada por agentes oxidantes fortes (ex.
cianeto, nitrito, cromo, zinco). Alguns metais (bismuto, cádmio, mercúrio, molibdênio e prata)
precipitam a fenantrolina, e devem ser eliminados pela extração da amostra. Se houver presença de uma
quantidade grande de matéria orgânica ou cor, a mesma deve ser removida pela evaporação e
mineralização da amostra, seguido de sua re-solubilização em solução ácida.

A amostra deve ser coletada e armazenada em frasco de polietileno, sendo conservada pela adição de
HCl concentrado até pH < 2.
4- MATERIAL
 Chapa aquecedora
 Espectrofotômetro (510nm)-
 Erlenmeyers de 250 mL
 Balões volumétricos de 50 mL (com tampas)
 Funis de vidro (com suporte)
 Pipetas graduadas de 5 mL e 10 mL
Obs.: Toda vidraria que entrar em contato direto com a amostra deverá ser lavada com HCl 1:1 e
enxaguada várias vezes com água destilada.
25
 Solução padrão de ferro, preparo diário (1 mg/L; 1,00 mL = 1,00 µg Fe)
 Ácido clorídrico concentrado (HCl)
 Solução de hidroxilamina, 10% (NH2OH.HCl)
 Solução de 1,10-fenantrolina (C12H8N2.H2O)
 Tampão acetato de amônio/ácido acético (NH4C2H3O2/CH3COOH)
6- METODOLOGIA
Curva padrão:
 Preparar os padrões de ferro a partir da solução padrão (1 mg/L) conforme indicado a seguir:
mL solução padrão mL água
mg/LFe
(1 mg/L Fe) destilada
0,0 0,0 50
0,1 5,0 45
0,2 10,0 40
0,3 15,0 35
0,4 20,0 30
0,5 25,0 25
 Transferir os padrões para erlenmeyers e seguir a mesma metodologia descrita para as amostras.
Procedimento para as amostras:

 Agitar vigorosamente a amostra e com pipeta volumétrica transferir 50 mL para um erlenmeyer de
250 mL. Caso esse volume da amostra contenha mais que 200 g de ferro, deve-se adicionar um
volume menor diluído em 50 mL.
 Adicionar 2 mL de ácido clorídrico concentrado e 1 mL de hidroxilamina. Levar o erlenmeyer à
chapa aquecedora até redução do volume a aproximadamente 20 mL.
 Após o resfriamento, transferir quantitativamente o conteúdo do erlenmeyer para um balão
volumétrico de 50 mL. Adicionar 10 mL do tampão acetato de amônio/ácido acético e 4 mL da
solução de fenantrolina e completar o volume do balão com água destilada.
 Agitar vigorosamente o balão e realizar a leitura em espectrofotômetro a 510nm (A510), após um
intervalo de 10 a 15 min.
 Determinar a concentração de ferro na amostra, por interpolação da curva padrão.
26
X - NITROGÊNIO KJELDAHL TOTAL
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Destilação – Titulometria)

O nitrogênio kjeldahl total (NKT) é a soma do nitrogênio orgânico (Norg) e amoniacal (N-NH4+).
Quando se deseja quantificar apenas a amônia, adiciona-se o tampão borato (pH 9,5) à amostra para
converter o íon amônio a amônia e minimizar a hidrólise de cianetos e compostos orgânicos
nitrogenados. Para a quantificação do nitrogênio orgânico, a amostra é submetida a uma digestão em
meio ácido, na presença de sulfato de cobre e sulfato de mercúrio, para a conversão de todo o nitrogênio
orgânico a N-NH4+. Na sequência, o pH da amostra é elevado para converter o íon amônio a amônia,
segunda a reação:
NH4+ + OH-  NH3 + H2O
Em ambos os casos, a amostra é então destilada. O condensador do destilador é ligado a um erlenmeyer

contendo ácido bórico (H3BO4) que reage com a amônia desprendida na destilação e produz o composto
borato de amônio. Na mesma amostra, pode-se fazer a destilação antes e após a digestão para separar a
amônia do nitrogênio orgânico.
NH3 + H2O  NH4+ + OH-
3NH4+ + 3OH- + H3BO3  (NH4)3BO3 + 3H2O
O borato de amônio é quantificado por titulação com ácido sulfúrico (H 2SO4) 0,02N quando a
concentração de nitrogênio presente na amostra excede 2 mg/L.
2 (NH4)3BO3 + 3H2SO4  2H3BO3 + 3(NH4)2SO4
2- INTERFERÊNCIA
Glicina, uréia, ácido glutâmico, cianatos e acetamida hidrolisam muito lentamente em solução, mas uréia
e cianatos serão hidrolisados durante a destilação a pH 9,5. Compostos voláteis alcalinos, como
hidrazinas e aminas influenciarão os resultados titulométricos. Cloro residual pode reagir com amônia
e deve ser removido mediante tratamento com um agente redutor, como Na2S2O3.

Resultados mais confiáveis são obtidos de amostras frescas. Se as amostras serão analisadas dentro de
24 horas após a coleta, é necessário apenas refrigerar a 4oC, sem adição de ácido. Para preservação por
até 28 dias, congele a -20oC sem adição de ácido, ou preserve a amostra com acidificação (pH<2) e
armazene a 4oC. Se a preservação ácida é utilizada, neutralize as amostras com NaOH ou KOH
imediatamente antes de proceder a determinação.
ATENÇÃO: embora a acidificação seja satisfatória para certos tipos de amostras, a adição de ácido
produz interferência quando amônia trocável está presente nos sólidos suspensos.
4- MATERIAL
 Destilador de nitrogênio
 Balão Kjeldahl – 800 mL
 Proveta – 500 mL
 Erlenmeyers - 250 mL
 Balão volumétrico - 500 mL
 Pipetas – 50 mL, 25, 10, 2 mL
 Béquer – 100 mL
 Bureta de 25 mL
27
4.2. REAGENTES (veja preparo no Apêndice)
 Tampão borato (pH 9,5)
 Solução de hidróxido de sódio/tiossulfato de sódio (NaOH/Na2S2O3)
 Solução digestora (K2SO4, CuSO4 e H2SO4)
 Ácido sulfúrico 0,04N
 Solução de ácido bórico e indicador
 Solução titulante de ácido sulfúrico 0,02N, padronizada
4.3. METODOLOGIA
 Selecionar o volume da amostra com base na quantidade de NKT esperado, conforme segue:
mg/L NH4+ Volume da amostra, mL

5 - 10 250,0
10 - 20 100,0
20 - 50 50,0
50 - 100 25,0
Método (NKT > 2mg/L)

Nitrogênio amoniacal
 Transferir uma alíquota de 500 mL da amostra para um balão kjeldahl de 800 mL e conectá-lo ao
destilador. Adicionar 50 mL de solução de tampão borato ao copo dosador e 50 mL de ácido
bórico/indicador em um erlenmeyer de 250 mL conectando-o ao condensador. Abrir a torneira do
copo dosador e ligar o aquecimento (verificar sempre o volume de água da caldeira). Enxaguar o
copo dosador com uma pequena alíquota de água destilada e fechar a torneira.
 Destilar aproximadamente 250 mL e titular o conteúdo do erlenmeyer utilizando-se uma solução de
H2SO4 0,02N até que a solução verde do erlenmeyer tornar-se violeta.
 Cálculo:
mg/L N = (A – B) x 0,02N x FC x 14.000 mg/eq N
mL amostra
onde: A = mL de H2SO4 0,02N gastos na titulação da amostra

B = mL de H2SO4 0,02N gastos na titulação do branco
FC = fator de correção de normalidade do H2SO4
Nitrogênio orgânico
 Transferir uma alíquota da amostra (se necessário diluir para 300 mL e neutralizar o pH) para um
balão kjeldahl e adicionar 50 mL da solução digestora. Levar a mistura à ebulição até que o volume
seja reduzido a 25-50 mL. Fazer uma prova em branco com água destilada.
 Após o resfriamento da amostra digerida (a ponto de se manusear), conectar o balão ao destilador.
Adicionar 50 mL de solução de NaOH/Na2S2O3 ao copo dosador e 50 mL da solução de ácido
bórico/indicador em um erlenmeyer de 250 mL conectando-o ao condensador. Abrir a torneira do
copo dosador e ligar o aquecimento (verificar sempre o volume de água da caldeira). Enxaguar o
copo dosador com uma pequena alíquota de água destilada e fechar a torneira.
 Destilar aproximadamente 250 mL e titular o conteúdo do erlenmeyer utilizando-se uma solução
de H2SO4 0,02N até que a solução verde do erlenmeyer tornar-se violeta.
 Proceder com o cálculo de NKT da mesma forma que o de nitrogênio amoniacal. O nitrogênio
orgânico é determinado como a diferença entre o total e o amoniacal:
Norg = NKT – N-NH4+
28
XI - FÓSFORO TOTAL
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Colorimetria)

O fósforo pode ocorrer combinado com a matéria orgânica, portanto, faz-se necessária a digestão ácida
da amostra para que todas as formas de fósforo possam ser convertidas a ortofosfatos (PO43-). A adição
de molibdato de amônio em meio ácido promove a formação do complexo molibdofosfato que é então
reduzido pela adição de cloreto estanoso, dando origem ao intensamente colorido azul de molibdênio,
que é quantificado em espectrofotômetro a 690 nm.
PO43- + 12(NH4)2MoO4 + 24H+  (NH4)3PO4.12MoO3 + 21NH4+ + 12 H2O

(NH4)3PO4.12MoO3 + Sn2+  [azul de molibdênio] + Sn4+
A concentração mínima detectada pelo método colorimétrico utilizando cloreto estanoso é de 0,003 mg
P/L.

A amostra deve ser coletada e armazenada em frasco de vidro, previamente lavado com HCl 1:1. A
conservação pode ser feita pela adição de 1mL de HCl por litro de amostra ou por congelamento. O
prazo para a execução da análise é de sete dias.
3- MATERIAL
 Chapa aquecedora
 Espectrofotômetro (690nm)
 Pipetas volumétricas de 1 mL e 10 mL
 Balões volumétricos de 100 mL (com tampa)
 Erlenmeyers de 250 mL
 Funis de vidro (com suportes)
Obs.: Toda vidraria que entrar em contato direto com a amostra deverá ser lavada com HCl 1:1 e
enxaguada várias vezes com água destilada. Não se deve usar detergente para a lavagem da
vidraria destinada a análise de fósforo.

 Ácido nítrico conc. (HNO3)
 Ácido sulfúrico conc. (H2SO4)
 Solução de ácido sulfúrico/nítrico (solução ácida forte)
 Solução de molibdato de amônio
 Solução de cloreto estanoso
 Solução de hidróxido de sódio (NaOH), 6 N
 Solução padrão de fosfato, 1, 00 mL = 2,5 µg PO43-
 Solução indicadora de fenolftaleína
5- METODOLOGIA
Procedimento com as amostras
 Selecionar o volume de amostra em função da concentração de fósforo esperada, conforme segue:
mg/L P Volume da amostra (mL)

0,2 - 1,5 100
1,5 - 3,0 50
3,0 – 6,0 25
6,0 – 15 10
15 – 30 5
29
 Digestão ácida: Transferir uma alíquota da amostra para um erlenmeyer, adicionar 1 mL de ácido
sulfúrico concentrado e 5 mL de ácido nítrico concentrado. Levar a ebulição em chapa de
aquecimento (em capela de exaustão) até o desprendimento de fumaças brancas (secura).
 Após o resfriamento adicionar aproximadamente 20 mL de água destilada e uma gota de
fenolftaleína. Na seqüência, adicionar NaOH 6N, gota a gota, até o aparecimento de uma coloração
rósea. Descorar a solução com gotas de solução de ácido sulfúrico/nítrico. É importante que esta
viragem ocorra com a adição de uma única gota de ácido.
 Usando funil, transferir quantitativamente a solução para um balão volumétrico de 100 mL
adicionando água destilada até um volume de aproximadamente 80 mL. Adicionar em cada balão 4
mL de solução de molibdato de amônio e 0,5 mL de cloreto estanoso, agitando vigorosamente após
cada adição. Completar o volume do balão até a marca de aferição.
 Fazer a leitura em espectrofotômetro a 690nm após 10 min (mas antes de 12 min), nos mesmos
intervalos de tempos para amostras e padrões. Calcular o fósforo na amostra por comparação com
a curva de calibração.
Curva de calibração
 Preparar os padrões de fósforo utilizando-se da solução padrão (2,5mg/L P) conforme os valores
mostrados a seguir:
mL da solução mL H2O
mg/L P
padrão (2,5 mg/L) destilada
0,0(branco) 0,0 100
0,05 2,0 98,0
0,15 6,0 94,0
0,25 10,0 90,0
0,35 14,0 86,0
0,45 18,0 82,0
0,55 22,0 78,0
 Transferir os padrões para erlenmeyers e seguir a mesma metodologia descrita para as amostras.
30
XII - CLOROFILA a
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Espectroscopia)

Métodos disponíveis para a determinação de clorofila a em fitoplâncton são a espectroscopia no visível
ou de fluorescência e a cromatografia líquida de alto desempenho. Na análise por espectroscopia no
visível, a clorofila a é extraída da biomassa e sua concentração determinada em espectrofotômetro, após
o ajuste dos resultados para minimizar a interferência devido à feoftina a, um produto de degradação da
clorofila a.

Deve-se usar somente vidraria opaca ou envolvida em papel de alumínio para coleta e estocagem de
amostras. Recomenda-se concentrar amostras por centrifugação ou filtração logo após a coleta. Se isso
não for possível, mantenha as amostras a 4ºC, no escuro. Amostras filtradas oriundas de água com pH
> 7 podem ser acondicionadas em sacos de plástico fechados hermeticamente, e estocados a -20ºC por
até 3 semanas. Amostras filtradas oriundas de água com pH ácido, devem ser extraídas imediatamente
para evitar a degradação da clorofila a. As amostras extraídas podem ser estocadas por até 4 dias a 10ºC.
3- MATERIAL
 Espectrofotômetro (664, 665 e 750 nm)
 Tubos de centrífuga com tampas rosqueáveis
 Cubetas de vidro, largura 1 cm ou 5 cm (para amostras muito diluídas)
 Banho-maria a 75ºC
 Membranas de fibra de vidro com poro < 1,2 m
 Aparato de filtração e bomba a vácuo
 Proveta de 100 mL
 Pipeta de 0,05 mL

 Ácido clorídrico (HCl) 0,1 mol/L
 Solução saturada de carbonato de magnésio (MgCO3) – adicionar 1 g MgCO3 a 100 mL de água
destilada
 Acetona 90% - misturar 90 mL de acetona e 10 mL da solução saturada de MgCO3
5- METODOLOGIA
Extração da clorofila a
 Realizar o procedimento em ambiente com luz indireta e de baixa intensidade, uma vez que a luz
induz a degradação rápida de clorofila a. Todos os recipientes de amostras devem ser opacos ou
envolvidos em papel de alumínio.
 Após anotar o volume inicial da amostra, concentrar a fitoplâncton por filtração (filtro de fibra de
vidro, Millipore AP40 ou equivalente). Filtrar de modo contínuo e não permitir que o filtro seque
durante a filtração de uma amostra. Os filtros devem ser acondicionados individualmente em sacos
(dobrar filtros ao meio, com as células por dentro), ou placas de Petri, identificados e estocados a
-20ºC no escuro até extraí-las.
 Transferir o filtro de fibra de vidro para um tubo de centrífuga envolvido em papel de alumínio e
contendo 10 mL de acetona 90%, previamente aquecido a 75ºC. Colocar o tubo com filtro em banho-
maria a 75ºC por 5 min; transferir para um banho de gelo e deixar por mais 5 min, par promover um
choque térmico que degradará a parede/membrana celular do fitoplâncton. Macerar o filtro com
bastão de vidro ou picar com tesoura lavada com acetona. Deixar em repouso a 4ºC por 6 a 24 para
completar a extração da clorofila. Agitar pelo menos duas vezes durante esse período.
 Centrifugar em tubos fechados a 500g por 20 min para sedimentar o filtro. O extrato pode também
ser clarificado por filtração, forçando 1 a 2 mL de ar através do filtro após passagem do extrato
para minimizar a retenção do extrato no filtro.
31
 Transferir 3 mL do extrato para uma cubeta de vidro e proceder com as leituras no
espectrofotômetro.
Leitura no espectrofotômetro
 Ler a absorbância a 664 e 750 nm (A664, A750), zerando o espectrofotômetro com água destilada,
antes de realizar as leituras em cada comprimento de onda.
 Adicionar 0,1 mL de HCl 0,1 mol/L ao extrato e agitar suavemente por 1 min. Ler a A665 e A750,
90s após a adição do HCl. (Lembrar de zerar o espectrofotômetro com água destilada). A
acidificação da amostra libera o íon de magnésio na clorofila a, que é transformada assim em
feoftina a.
Cálculos
 Fazer a correção da turbidez, subtraindo os valores de absorbância a 750 nm (A750) dos valores de
absorbância a 664 e 665 nm (A664, A665), para calcular clorofila a e feofitina a:
26,7 ((A664 − A750)antes − (A665 − A750)após ) × V1

Clorofila 𝑎 (mg⁄m3 ou μg/L) =
V2
26,7 [1,7(𝐴665 − A750)𝑎𝑝ó𝑠 ) − (A664 − A750)𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 )] × V1

Feofitina 𝑎 (mg⁄m3 ou μg/L)) =
V2
onde: V1 = Volume do extrato (mL)

V2 = Volume da amostra filtrada (L)
26,7 = fator de correção (específico para extrato em acetona 90%)
1,7 = relação entre coeficientes de absorção de clorofila a e feoftina a
antes/após = antes ou após a acidificação do extrato
32
33
XIII - COLIFORMES TOTAIS, TERMOTOLERANTES e Escherichia coli
1- PRINCÍPIOS DOS MÉTODOS

Os coliformes podem ser quantificados pelas técnicas do número mais provável (NMP) em tubos
múltiplos de fermentação e da membrana filtrante. Na técnica da membrana filtrante, uma amostra é
filtrada através uma membrana que retém as bactérias (poro  0,45 m). A membrana, contendo as
bactérias retidas, é colocada em meio de cultivo adequado e então incubada. Pela uso de meios de cultivo
diferenciais, as unidades formadoras de colônias (UFC) que crescem têm aparências distintas e as UFC
de coliformes podem ser contadas. Repicagem de colônias com aparência típica dos coliformes em
meios seletivos serve para confirmar a presença de coliformes totais, termotolerantes e E. coli.
A técnica do NMP é um método estatístico de estimativa baseado no fato que quanto maior o número
de bactérias em uma amostra, maior será a diluição da amostra original necessária para reduzir sua
densidade até o ponto em que nenhuma bactéria permanece para crescer. O resultado é dado como o
índice NMP e os limites de confiança de 95% correspondentes.
Ambos os métodos consiste de testes presuntivo e confirmativo. Quando necessário, pode-se realizar o
teste completo para coliformes totais. Determina-se o número de organismos na amostra de água que
são Gram-negativos, que fermentam lactose com a produção de gás e que hidrolisam triptofano. Na
primeira etapa, diluições decimais da amostra são inoculadas em tubos contendo caldo lactosado (NMP
por tubos múltiplos) ou a membrana é inoculada em meio m-Endo (membrana filtrante). A presença de
coliformes é indicada pelo crescimento (turvação do meio) e, ou produção de gás devido à fermentação
da lactose no caldo lactosado e pela formação de colônias avermelhadas com brilho metálico no meio
m-Endo. Resultados positivos no teste presuntivo são confirmados por repicagem em caldo bile lactose
verde brilhante (coliformes totais), caldo EC (coliformes termotolerantes) e caldo triptonado (E. coli).
A produção de gás no caldo lactose verde brilhante confirma presença de coliformes totais e no caldo
EC a presença de coliformes termotolerantes. O desenvolvimento de uma cor vermelha devida à reação
de indol, o produto da hidrólise de triptofano, com o reagente de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldeído)
no caldo triptonado confirma a presença de E. coli:
NH 2
O
CH 2 –CHCOOH
+ CH 3 –CCOOH + NH 3
N triptofanase N
H H
triptofano indol ácido pirúvico
N(CH 3 )2
+ produto vermelho
N
H CHO
indol p-dimetilaminobenzadeído
reagente de Kovacs
Para facilitar as análises foram desenvolvidos testes cromogênicos para a detecção de coliformes totais
e E. coli. Os testes cromogênicos se baseiam no uso de substratos para enzimas encontradas nos grupos
de interesse. Cada substrato é acoplado a um radical cromogênico ou fluorogênico. Assim, quando a
enzima bacteriana hidrolisa o substrato, um produto colorido ou fluorescente é liberado. Os produtos
coloridos são visíveis ao olho nu, enquanto os produtos fluorescentes só são detectados sob luz
ultravioleta (366 nm). Para os coliformes totais, utiliza-se o β-galactopiranosídeo, substrato da enzima
β-D-galactosidase. Radicais cromogênicos utilizados com o β-galactopiranosídeo incluem o
ortonitrofenil- (ONP) e o 5-bromo-4-cloro-3-indolil- (x-GAL). Para a detecção da E. coli, utiliza-se o
β-glicuronida, substrato da enzima β-D-glicuronidase, acoplado ao radical fluorogênico 4-
metilumbeliferil- (MUG):
34
COOH
O OH
OH
HO
CH 3 OH
ácido glicurônico
-glicuronidase
COOH
O +
O O
O
OH CH 3
HO
OH
4-metilumbeliferil--D-glicuronida (MUG)
O
O
HO
4-metilumbeliferil
produto fluorescente
2- INTERFERÊNCIAS
Amostras contendo grande quantidade de material coloidal ou de sólidos em suspensão (ex. manganês,
flocos de alumina, argila ou algas) podem entupir os poros da membrana e dificultar ou impedir a
filtração. Amostras industriais podem conter metais pesados que absorvam na superfície da membrana
e interferem com o crescimento bacteriano. A técnica de membrana filtrante não deve ser utilizada para
tais amostras.

Amostras devem ser coletadas em frascos lavados, enxaguados com água destilada, e esterilizados.
Acrescentar um agente redutor (ex. tiossulfato de sódio a uma concentração final de 100 mg/L) para
coletar amostras contendo cloro residual. Para amostras com altos teores de metais pesados, acrescentar
um agente quelante (ex. EDTA) para reduzir sua toxicidade. O agente redutor e quelante devem ser
adicionados antes da esterilização do frasco. Amostras podem ser mantidas a 10ºC até sua análise. O
prazo para a execução da análise é de 24 horas.
4- MATERIAL
Geral
 Incubadoras ou banhos-maria a 35ºC e a 44,5ºC
 Autoclave
 Bico de Bunsen
 Tubos de ensaio com tampas, para preparar diluições seriadas
 Pipetas estéreis – 1, 10 mL
 Placas de Petri estéreis
Método NMP
 Tubos de cultivo com tampas, contendo tubos de Durham invertidos
 Suporte para tubos de cultivo
 Alça de repicagem
Método da Membrana Filtrante
 Pinça metálica com pontas arredondadas, imersa em etanol 70%
 Unidade de filtração com membrana estéril
 Kitassato para acoplar à unidade de filtração
 Bomba a vácuo e frasco armadilha com mangueiras adequadas
 Membranas de filtração reticuladas, estéreis (poros  0,45m)
 Filtros absorventes (se meio líquido for usado)
 Provetas 50, 100 mL, tampadas com papel de alumínio
35
 Meios de cultivo
 Tampão fosfato estoque
 Solução de cloreto de magnésio (MgCl2
 Água de diluição tamponada
6- METODOLOGIA
6.1. Técnica da membrana filtrante
Preparo de vidraria e unidade de filtração
 Esterilizar a unidade de filtração, kitassato, provetas, pipetas, e placas de Petri
 Montar a unidade de filtração evitando sua contaminação (i.e. deixar as partes abertas tampadas
com papel de alumínio até serem encaixadas no seu lugar).
 Identificar as placas de Petri estéreis (amostra, volume filtrado).
 O procedimento pode ser feito com meio líquido (caldo) ou sólido (agar). Para a quantificação de
coliformes totais, utilizar meio M-Endo. Para a quantificação de coliformes termotolerantes, utilizar
o meio M-FC.
 Se utilizar o meio líquido, colocar filtros absorventes estéreis no fundo de cada placa de Petri e
pipetar dois mL do caldo no filtro de forma a saturá-lo, utilizando técnica asséptica. Se utilizar o
meio sólido, preparar o ágar, pela adição de 15 g de ágar por litro de caldo. Deixar resfriar e verter
o ágar nas placas de Petri, até uma profundidade de 2 a 3 mm e deixar solidificar.
Filtração e incubação
 Por meio da pinça estéril (flambada), colocar uma membrana estéril no suporte com a retícula para
cima e conectar o funil à base da unidade de filtração.
 Agitar a amostra e medir o volume desejado, que dependerá do tipo de amostra. O Quadro 1 lista
os volumes sugeridos para amostras de diferentes origens. Para volumes pequenas, preparar
diluições da amostra original em água de diluição tamponada, de modo a ter um volume mínimo de
10 mL para filtrar.
 Ligar a bomba a vácuo e filtrar a amostra. Manter o vácuo ligado e enxaguar as laterais do funil um
mínimo de duas vezes com 20 a 30 mL de água de diluição estéril.
 Desligar a bomba a e remover o funil da base. Assepticamente (com pinça flambada), retirar a
membrana da base e colocá-la no filtro absorvente, ou meio ágar, evitando a formação de bolhas
entre a membrana e o meio. Reassentar a membrana, deslizando a sobre a superfície se houver
presença de bolhas.
 Incluir como controles negativos uma membrana sem amostra e um branco da água de diluição
(filtrar 100 mL da água).
 Preparar duplicatas de cada diluição de cada amostra.
 Inverter as placas e incubar a 35ºC por 24 h.
 Repicar pelo menos 10 colônias vermelhas com metálico para tubos contendo caldo bile lactose
verde brilhante para coliformes totais, ou a 44,5ºC por 24h para coliformes termotolerantes.
Quadro 1 – Volumes sugeridos para amostras de água de diferentes fontes.

Volume a filtrar, mL
Fonte da água
Coliformes totais Coliformes termotolerantes
Água bruta 10 1, 10, 50
Água tratada 100 -
Poços 10, 50, 100 50, 100
Lagoas, represas 10, 50, 100 50, 100
Rios 0,001; 0,01; 0,1; 1,0 -
Praias 0,1; 1,0; 10 1, 10, 50
Piscina 100 -
Esgoto bruto 0,0001; 0,001; 0,01; 0,1 0,001; 0,01; 0,1
Esgoto tratado - 0,1; 1,0; 10
36
Contagem e interpretação dos resultados
 Após a incubação, contar as UFC nas membranas contendo de 20 a 80 colônias róseas a vermelhas
escuras e com brilho metálico (os coliformes), mas com menos que 200 colônias bacterianas totais.
Reportar como:
Coliformes / 100 mL = nº de colônias de coliformes x 100

volume de amostra filtrado, mL
 A colônia coliforme típica no meio M-Endo é cor de rosa a vermelha escura com um brilho metálico
na sua superfície, que pode variar de tamanho. Colônias sem brilho podem ser róseas, vermelhas,
brancas ou incolores, e são consideradas não-coliformes.
 É preciso verificar os resultados positivos para toda amostra de água tratada. A verificação é feita
pela transferência de 10 colônias vermelhas e com brilho metálico, que estão bem isoladas na placa
para tubos contendo:
 caldo bile verde brilhante - incubar a 35ºC por 48 h, produção de gás confirma presença de
coliformes totais;
 caldo EC - incubar a 44,5ºC por 24 h, produção de gás confirma presença de coliformes
termotolerantes;
 água triptonada - incubar a 44,5ºC por 24 h, produção de indol confirma presença de E. coli.
A Figura 1 ilustra o fluxograma de verificação de coliformes totais ou termotolerantes pela técnica da

membrana filtrante.
Filtrar amostra em membrana estéril.
Transferir membrana para placa
contendo meio M-Endo.
Incubar 22 - 24 h, 350,5C
Repicar 10 colônias com brilho metálico

bem isolados para os meios:
Caldo bile lactose verde brilhante Caldo EC Caldo triptonado. Incubar

Incubar 48 h, 35 o C Incubar 24 h, 44,5 o C 242h a 44,50,2ºC
Gás + Gás - Gás + Gás - Desenvolvimento Incolor

cor
Coliformes Teste Coliformes Teste E. coli Teste negativo

totais negativo termotolerantes negativo confirmado
confirmados confirmados
Figura 1 – Fluxograma da verificação de coliformes totais, termotolerantes e Escherichia coli pela

técnica da membrana filtrante.
6.2. Técnica do Número Mais Provável (NMP)

Teste presuntivo
 Organizar e identificar três séries de cinco tubos contendo 10 mL de caldo lactosado em um suporte
de tubos.
 Agitar a amostra e diluições (se preparadas). Inocular cada série de cinco tubos com volumes
predeterminados da amostra, em diluições decimais crescentes (ex. alíquotas de 10, 1,0 e 0,1 mL)
 Incubar a 35ºC por 24 h. Se não houver produção de gás, incubar por mais 24 h a 35ºC.
37
Teste confirmativo
 Agitar, cuidadosamente, cada tubo positivo do teste presuntivo. Com uma alça de repicagem estéril,
transferir um pouco da cultura de cada tubo para tubos contendo caldo Esse meio contém agentes
seletivos e inibidores que suprimem o crescimento de todas as bactérias não coliformes. Transferir
também um pouco da cultura de cada tubo positivo para tubos contendo água triptonada. Esse meio
contém triptofano e o indicador de Kovacs, para acusar a formação de indol.
 Após 24 ou 48 h, examinar os tubos para a produção de gás (caldos bile lactose verde brilhante e
EC) e indol (água triptonada).
 Em geral, a análise termina após o teste confirmativo, mas deve-se confirmar aproximadamente 5%
dos testes confirmativos para coliformes totais pelo teste completo.
Teste completo
 Assepticamente, inocular placas contendo ágar Eosina Metileno Azul (EMB) com as culturas nos
tubos positivos do teste confirmativo, fazendo estrias com a alça de repicagem. Incubar a 35C por
24 h.
 Colônias de coliformes são róseas a vermelhas escuras e apresentam um brilho metálico verde
superficial. De cada placa repicar dez colônias típicas e transferir para tubos inclinados contendo
ágar nutriente.
 Examinar microscopicamente lâminas após coloração de Gram de culturas dos tubos de ágar
nutriente após 24 h de crescimento. O resultado positivo para o teste completo para coliformes totais
é a presença de bastonetes Gram-negativos.
Cálculo do índice NMP

 Consultar a tabela do NMP (Quadro 2) para converter os resultados obtidos em número mais
provável de coliformes em 100 mL. (NMP/100mL).
A Figura 2 apresenta um fluxograma completo da técnica NMP para coliformes totais e termotolerantes.
Teste Cromogênico
 Substratos cromogênicos podem ser utilizados para a determinação de coliformes totais e E. coli
pelas duas técnicas descritas, membrana filtrante e número mais provável (NMP). Alguns meios
cromogênicos comerciais estão disponíveis em diferentes formatos. Em alguns, uma quantidade
adequada de meio vem dentro do recipiente (frasco, tubo ou bolsa) estéril, a qual se adiciona o
volume indicado da amostra. Em outros, prepara-se o meio cromogênico e distribui-o nos frascos
ou tubos contendo o volume adequado da amostra. Siga as instruções do fabricante para preparar as
diluições da amostra a serem utilizadas.
 A presença de coliformes totais é determinada pela atividade da enzima B-galactosidase, sendo
evidenciada pela cor amarela (ex. COLILERT da IDEXX), quando o substrato é o ONPG, e azul
esverdeada (ex. Fluorocult-LMX da Merck) quando o substrato é o x-GAL.
 A presença de E. coli é determinada pela atividade da enzima B-glicuronidase, sendo evidenciada
pela fluorescência azul do meio ou das colônias, quando o frasco, tubo ou placa é exposto à luz
ultravioleta (366 nm).
38
Quadro 2 - Quantificação estatística de coliformes: número mais provável por 100 mL
0-:1-:0,1 NMP 10:1:0,1 NMP 10:1:0,1 NMP 10:1:0,1 NMP 10:1:0,1 NMP 10:1:0,1 NMP
0-0-0 <1,8 1-0-0 2 2-0-0 4.5 3-0-0 7.8 4-0-0 13 5-0-0 23

0-0-1 1.8 1-0-1 4 2-0-1 6.8 3-0-1 11 4-0-1 17 5-0-1 31
0-0-2 3.6 1-0-2 6 2-0-2 9.1 3-0-2 13 4-0-2 21 5-0-2 43
0-0-3 5.4 1-0-3 8 2-0-3 12 3-0-3 16 4-0-3 25 5-0-3 58
0-0-4 7.2 1-0-4 10 2-0-4 14 3-0-4 20 4-0-4 30 5-0-4 76
0-0-5 9 1-0-5 12 2-0-5 16 3-0-5 23 4-0-5 36 5-0-5 95
0-1-0 1.8 1-1-0 4 2-1-0 6.8 3-1-0 11 4-1-0 17 5-1-0 33

0-1-1 3.6 1-1-1 6.1 2-1-1 9.2 3-1-1 14 4-1-1 21 5-1-1 46
0-1-2 5.5 1-1-2 8.1 2-1-2 12 3-1-2 17 4-1-2 26 5-1-2 64
0-1-3 7.3 1-1-3 10 2-1-3 14 3-1-3 20 4-1-3 31 5-1-3 84
0-1-4 9.1 1-1-4 12 2-1-4 17 3-1-4 23 4-1-4 36 5-1-4 110
0-1-5 11 1-1-5 14 2-1-5 19 3-1-5 27 4-1-5 42 5-1-5 130
0-2-0 3.7 1-2-0 6.1 2-2-0 9.3 3-2-0 14 4-2-0 22 5-2-0 49

0-2-1 5.5 1-2-1 8.2 2-2-1 12 3-2-1 17 4-2-1 26 5-2-1 70
0-2-2 7.4 1-2-2 10 2-2-2 14 3-2-2 20 4-2-2 32 5-2-2 95
0-2-3 9.2 1-2-3 12 2-2-3 17 3-2-3 24 4-2-3 38 5-2-3 120
0-2-4 11 1-2-4 15 2-2-4 19 3-2-4 27 4-2-4 44 5-2-4 150
0-2-5 13 1-2-5 17 2-2-5 22 3-2-5 31 4-2-5 50 5-2-5 180
0-3-0 5.6 1-3-0 8.3 2-3-0 12 3-3-0 17 4-3-0 27 5-3-0 79

0-3-1 7.4 1-3-1 10 2-3-1 14 3-3-1 21 4-3-1 33 5-3-1 110
0-3-2 9.3 1-3-2 13 2-3-2- 17 3-3-2 24 4-3-2 39 5-3-2 140
0-3-3 11 1-3-3 15 2-3-3 20 3-3-3 28 4-3-3 45 5-3-3 180
0-3-4- 13 1-3-4 17 2-3-4 22 3-3-4 31 4-3-4 52 5-3-4 210
0-3-5 15 1-3-5 19 2-3-5 25 3-3-5 35 4-3-5 59 5-3-5 250
0-4-0 7.5 1-4-0 11 2-4-0 15 3-4-0 21 4-4-0 34 5-4-0 130

0-4-1- 9.4 1-4-1 13 2-4-1 17 3-4-1 24 4-4-1 40 5-4-1 170
0-4-2 11 1-4-2 15 2-4-2 20 3-4-2 28 4-4-2 47 5-4-2 220
0-4-3 13 1-4-3 17 2-4-3 23 3-4-3 32 4-4-3 54 5-4-3 280
0-4-4 15 1-4-4 19 2-4-4 25 3-4-4 36 4-4-4 62 5-4-4 350
0-4-5 17 1-4-5 22 2-4-5 28 3-4-5 40 4-4-5 69 5-4-5 430
0-5-0 9.4 1-5-0 13 2-5-0 17 3-5-0 25 4-5-0 41 5-5-0 240

0-5-1 11 1-5-1 15 2-5-1 20 3-5-1 29 4-5-1 48 5-5-1 350
0-5-2 13 1-5-2 17 2-5-2 23 3-5-2 32 4-5-2 56 5-5-2 540
0-5-3 15 1-5-3 19 2-5-3 26 3-5-3 37 4-5-3 64 5-5-3 920
0-5-4 17 1-5-4 22 2-5-4 29 3-5-4 41 4-5-4 72 5-5-4 1600
0-5-5 19 1-5-5 24 2-5-5 32 3-5-5 45 4-5-5 81 5-5-5 >1600
39
Amostra
Inocular 3 diluições decimais crescentes em tubos contendo caldo lactosado.

Incubar 242h, 350,5oC
Produção de gás e/ou ácido Gás –

Incubar mais 24 h
Teste (total 48 3h)
presuntivo
Produção de gás (e ácido) Sem produção de gás (e ácido)

Teste negativo
Transferir alçada de culturas para Transferir alçada de culturas para Transferir para caldo triptonado.
tubos contendo caldo bile lactose tubos contendo caldo EC. Incubar 242h a 44,50,2ºC
verde brilhante. Incubar 48 3h, Incubar 24 h, 44,5oC
350,5oC
Teste Gás + Gás - Gás + Gás - Produção de indol. Sem indol

confirmativo E. coli presente Teste negativo
Teste Coliformes Teste

Coliformes totais Calcular índice NMP
negativo termotolerantes negativo
presentes de E. coli
presentes
Calcular índice NMP de

coliformes totais Calcular índice NMP
de coliformes
termotolerantes
Repicar alçada de culturas de tubos
positivos para placas contendo meio
Eosina Metileno Azul
Teste Repicar colônias isoladas com

completo brilho verde metálico
coliformes superficial para tubo
totais inclinado de ágar nutriente
Verificar presença de
bastonetes Gram-negativos
no microscópio
Figura 2 – Fluxograma da verificação de coliformes totais ou termotolerantes pela técnica do número

mais provável (NMP) em tubos múltiplos.
40
XIV - CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS TOTAIS
1- PRINCIPIO DO MÉTODO
Colônias originam a partir de células individuais, filamentos, ou aglomerados de células, sendo todos
esses contemplados pelo termo unidade formadora de colônias (UFC). Duas técnicas de enumeração das
UFC existem: a técnica de mistura (“pour plate”) e a de espalhamento (“spread plate”) em placa. Na
técnica de mistura, uma alíquota da amostra ou sua diluição é transferida para uma placa de Petri estéril,
o meio ágar fundido (44 a 46ºC) é adicionado, resfriado e solidificado. Na técnica por espalhamento,
0,1 a 0,5 mL da amostra ou sua diluição é transferida para a superfície de uma placa contendo o meio
ágar solidificado. O inóculo é espalhado uniformemente sobre a superfície por meio de uma alça de
vidro estéril. Nos dois casos, a placa é então incubada sob condições controladas e as UFCs contadas.
A técnica de mistura é mais simples e permite incluir alíquotas maiores de amostra na placa, mas as
bactérias são submetidas a um choque térmico que pode afetar seu crescimento. A técnica de
espalhamento não causa choque térmico e, uma vez que as colônias crescem na superfície, permite sua
transferência de maneira simples e rápida, mas a alíquota da amostra plaqueada é limitada a um volume
de 0,1 a 0,5 mL.

Recomenda-se iniciar a análise dentro de 8 h após a coleta, para minimizar alterações na população
bacteriana. Se necessário, as amostras podem ser mantidas a uma temperatura a 4ºC por até 24 h.
3- MATERIAL
 Autoclave
 Incubadora que mantém a temperatura estável, a 35ºC
 Placas de Petri estéreis
 Pipetas estéreis, tipo bacteriológico ou de Mohr
 Tubos de cultivo, 20 mL, estéreis
 Bico de gás
 Banho-maria a 44-46ºC para manter ágar fundido (técnica de mistura)
 Alça de Drigalsky (técnica de espalhamento)

 Água de diluição tamponada, estéril
 Agar R2A
5- METODOLOGIA
O preparo das diluições e placas deve ser realizado utilizando técnica asséptica, dentro da capela
laminar, ou perto do bico de Bunsen aceso.
Preparo das diluições seriadas decimais:

 Tubos de cultivo contendo 9 mL de água de diluição tamponada estéril devem ser identificados
com as diluições a serem preparadas. Para a maioria de amostras de água potável, diluições de 10 o
a 10-5 são geralmente suficientes.
 Pipetar, assepticamente, 1 mL da amostra para o primeiro tubo da série (diluição 1/10 = 10-1).
 Agitar completamente o tubo e então pipetar 1 mL do conteúdo desse tubo para o segundo tubo da
série (diluição da amostra original 1/100 = 10-2).
 Continuar com a agitação e transferência de 1 mL de cada tubo para o tubo seguinte até preparar
todas as diluições desejadas.
41
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Amostra
original
Tubos contendo 9
mL de água de
diluição tamponada
Diluição: 1:10 1:100 1:1.000 1:10.000 1:100.000

= 10-1 = 10-2 = 10-3 = 10-4 = 10-5
Técnica de mistura na placa

 Fundir o meio ágar, aquecendo-o em banho-maria fervente. Colocar o ágar fundido no banho-maria
a 44-46ºC para evitar que solidifique.
 Identificar (amostra, diluição, repetição) e organizar as placas de Petri e os tubos com as diluições
dentro da capela, antes de começar o plaqueamento.
 Agitar os tubos com as diluições imediatamente antes de retirar uma alíquota para plaqueamento.
 Pipetar 1 mL de cada diluição para placas de Petri, em triplicata.
 Verter 12 a 15 mL de ágar fundido (verificar a temperatura antes utilizar o ágar) em cada placa e
rodar a placa suavemente para misturar o inóculo ao ágar.
 Deixar o ágar solidificar (aproximadamente 10 min), inverter as placas e incubá-las a 35ºC por 48
h.
Técnica de espalhamento na placa

 Preparo das placas: Fundir o ágar de contagem e verter 15 a 20 mL em cada placa de Petri,
verificando que o ágar recobre o fundo da placa. Deixar o ágar solidificar antes de mover as placas.
Deixar as placas entreabertas para permitir a evaporação de água em excesso, durante 15 a 30 min.
Quando a superfície do ágar secar, tampar as placas.
 Identificar e organizar as placas e os tubos com as diluições dentro da capela antes de começar o
plaqueamento.
 Agitar os tubos com as diluições imediatamente antes de retirar uma alíquota para plaqueamento.
 Pipetar 0,1 a 0,5 mL de cada diluição na superfície da placa contendo ágar solidificado, e
devidamente identificado.
 Espalhar o inóculo sobre a superfície do meio utilizando uma alça de Drigalsky (bastão de vidro
especial).
 Deixar o inóculo ser absorvido no meio, inverter as placas e incubá-las a 35ºC por 48 h.
Contagem de UFC/mL
 Contar colônias apenas nas placas que apresentam de 30 a 300 UFC. Calcular UFC/mL da amostra
pela equação:
nº médio de UFC nas 3 placas x fator de diluição da placa / alíquota plaqueada
 Se nenhuma placa apresentar colônias, calcular as UFC/mL como menor que a menor diluição
plaqueada, e reportar como UFC/mL estimada. Por exemplo, se a menor diluição plaqueada for
de 10-2, e esta não apresentar colônias, o valor estimado é <100 UFC/mL.
42
XV - DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO (DBO) e OXIGÊNIO DISSOVIDO (OD)
1- PRINCÍPIO DOS MÉTODOS (OD pelo Método Winkler modificado pela azida)
A análise de DBO consiste em incubar as amostras em frascos especialmente utilizados para a DBO, à
temperatura de 20±1ºC no escuro por um período de cinco dias. No início e ao final do quinto dia mede-
se a concentração de oxigênio dissolvido (OD) presente na amostra e obtém-se por diferença, a demanda
requerida pelos microrganismos para a oxidação da matéria orgânica presente na amostra.
É possível converter valores de DBO obtidos sob condições de tempo e/ou temperatura diferentes das
do método padrão, assim como estimar a DBOúltima do 1º estágio, pelo uso de fatores de correção.
A quantificação de OD pelo método Winkler, ou método iodométrico, é baseado na adição de uma
solução de manganês reduzido (Mn2+) seguida de uma solução contendo uma solução alcalina de íons
iodeto(I-) e azida (N3-), o que resulta na produção de um hidróxido gelatinoso de manganês II.
Mn2+ + 2OH-  Mn(OH)2 (precipitado branco)
A presença do precipitado branco no frasco evidencia a ausência de OD. No entanto, se presente, o

oxigênio dissolvido oxida rapidamente uma quantidade equivalente do precipitado de hidróxido de
manganês para uma valência mais elevada (Mn4+).
Mn2+ + 2OH- + ½O2  MnO2 (precipitado marrom) + H2O
Com a adição de ácido sulfúrico, o Mn4+ será reduzido e os íons iodeto oxidados, levando à liberação
de iodo (I2) na mesma proporção da concentração inicial de OD.
MnO2 + 2I- + 4H+  Mn2+ + I2 + 2H2O
O iodo é então titulado com uma solução padronizada de tiossulfato de sódio, formando tetrationato de
sódio, utilizando amido como indicador da viragem.
2Na2S2O3 + I2  Na2S4O6 + 2NaI
A modificação pela azida tem como objetivo a eliminação da interferência provocada pelo nitrito (NO 2-
), possível de ser encontrado em esgotos e águas ribeirinhas. Os íons nitrito têm poder oxidante sobre
os íons iodeto e podem levar a superestimar a concentração final de OD.
2 NO2- + 2I- + 4H+  I2 + N2O2 + 2H2O

NaN3 + H+  HN3 + Na+
HN3 + NO2- + H+  N2 + N2O + H2O

A preservação pode ser realizada através de refrigeração da amostra a 4ºC, mas o prazo para a realização
da análise de DBO é de 24 horas. Para medição de OD, a preservação pode ser realizada pela adição de
2 mL de solução de sulfato manganoso, 2 mL de solução de iodeto e azida e 2 mL de ácido sulfúrico
concentrado no frasco de análise (frasco de DBO), desde que a amostra não apresente demanda de iodo.
3- MATERIAL
 Bomba de ar comprimido
 Estufa incubadora para DBO
 Medidor de pH
 Proveta 100 mL
 Béqueres de 100, 500 mL
 Frascos de DBO
43
 Pipeta graduada de 2, 5, 10 mL
 Bureta de 10 ou 25 mL

 Solução alcalina de iodeto-azida
 Solução de sulfato manganoso
 Solução de amido
 Solução de tiossulfato de sódio (Na 2S2O3) 0,0125N, padronizada
 Solução tampão fosfato
 Solução de ácido sulfúrico 1N
 Solução de hidróxido de sódio 1N
 Solução de cloreto de cálcio (CaCl2)
 Solução de cloreto férrico (FeCl3)
 Solução de sulfato de magnésio (MgSO4)
 Solução de sulfito de sódio (Na2SO3)
 Iodeto de potássio, 10%
 Ácido acético, 50%
5- METODOLOGIA
Preparo da amostra
 Deve-se neutralizar amostras muito ácidas ou básicas pela adição de hidróxido de sódio (NaOH) ou
ácido sulfúrico (H2SO4). Deve-se ter o cuidado de não diluir a amostra em mais de 0,5% com a
neutralização.
 Amostras contendo cloro residual devem ser tratadas com solução de sulfito de sódio (Na2SO3) para
a neutralização do cloro. O volume de Na 2SO3 de requerido para cada litro da amostra é obtido da
seguinte forma:
- A uma alíquota de 100 mL da amostra neutralizada, adicionar 10 mL de ácido acético 50% e 1 mL de
solução de iodeto de potássio 10% (p/v).
- Titular com solução de Na2SO3, utilizando a solução de amido como indicador.
- Desta forma: V (mL Na2SO3)/L (amostra) = mL Na2SO3 gastos na titulação x 10.
Limpeza de vidraria
 Toda a vidraria utilizada na análise deve ser lavada com solução sulfocrômica e enxaguada com
água destilada para eliminar quaisquer traços de matéria orgânica.
Diluição
 Diante do desconhecimento do teor de matéria orgânica presente em uma amostra, deve-se levar em
consideração a sua natureza tendo em vista que uma diluição inadequada da amostra pode provocar
um consumo total de oxigênio antes do quinto dia e no outro extremo, uma diluição exagerada pode
resultar em nenhum consumo de OD. Em ambos os casos o teste será inválido. Desta forma é
recomendável que, na medida do possível, reúnam-se informações prévias sobre o teor e a natureza
da matéria orgânica presente na amostra.
 Deve-se trabalhar com diluições que ao final do quinto dia garantam no frasco um residual de
oxigênio dissolvido de no mínimo 1 mg/L e um consumo total de no mínimo 2 mg/L. Na ausência
de qualquer outro indicativo, as diluições no quadro a seguir servem como referência. É
recomendável preparar três diluições diferentes de amostras desconhecidas.
mL de amostra
Tipo de Efluente Diluição (%)
(em 300 mL)
Esgoto bruto 0,1 - 1,0 0,3 – 3
Esgoto primário 1–5 3 – 15
Esgoto tratado 5 – 25 15 – 75
Rios ou lagoas poluídas 25 – 100 75 – 150
44
Água de Diluição
 As diluições devem ser feitas com água de diluição, preparada em volume determinado pelo número
de amostras, diluições e réplicas a serem analisadas. Borbulhe ar comprimido em volume adequado
de água destilada, por cerca de trinta minutos. Para cada litro de água, adicionar 1 das seguintes
soluções: CaCl2, FeCl3, MgSO4 e solução tampão fosfato. Devem-se esperar trinta min após o
término da aeração antes de se utilizar a água de diluição.
Amostras
 Para cada amostra devem-se realizar duas leituras de oxigênio dissolvido (OD), sendo uma no
primeiro dia (OD0), e outra após o período de cinco dias em estufa incubadora a 20 ±1ºC (OD5). As
análises devem ser realizadas em duplicata. Portanto, será necessário preparar quatro frascos para
cada diluição de cada amostra (dois para OD0 e dois para OD5). Deve-se ter cuidado de se evitar a
formação de bolhas de ar durante o manuseio da amostra e água de diluição na hora de encher os
frascos e durante a execução da análise.
 Deve-se ainda fazer uma prova em branco (apenas água de diluição) sendo a análise comprometida
em caso de a diferença entre OD0 e OD5 assumir valores maiores que 0,2 mg/L.
 Por ser um bioensaio, o resultado da determinação de DBO sofre fortemente a influência da presença
de substâncias tóxicas ou de um inoculo bacteriano de baixa atividade. Portanto é aconselhável
verificar a qualidade da água de diluição, do inoculo de microrganismos e da técnica analítica
periodicamente. Isto pode ser feito pela análise de uma amostra com DBO conhecida. Uma solução
comumente utilizada para esta finalidade é a de glicose / ácido glutâmico 2%, cuja DBO é de 200 ±
30 mg/L.
Oxigênio dissolvido (Método Winkler modificado pela azida):

 Ao frasco de DBO contendo a amostra, adicionar 1 mL da solução de sulfato manganoso utilizando
uma pipeta graduada, mergulhando-a até o fundo do frasco. Da mesma forma, adicionar 1 mL da
solução de iodeto e azida.
 Fechar o frasco com o cuidado de não deixar bolhas de ar em seu interior, e agitar por meio de
inversões sucessivas. Deixar o precipitado sedimentar até aproximadamente metade do frasco e
agitar novamente. Caso o precipitado tenha uma coloração esbranquiçada, a análise é finalizada pois
não existe oxigênio dissolvido na amostra.
 Caso o precipitado apresente uma coloração marrom, após a precipitação adicionar 1 mL de ácido
sulfúrico concentrado (H2SO4) e agitar até a sua completa dissolução.
 Pipetar exatamente 100 mL (com pipeta volumétrica) da solução em um erlenmeyer de 250 mL e
titular com solução Na2S2O3 0,0125N.
 Quando a amostra apresentar uma coloração amarelo palha, adicionar amido como indicador de
viragem. Este procedimento irá produzir o complexo amido-I2 de cor azulada. A titulação deverá
prosseguir até que a amostra se torne incolor.
 Cálculos:
VNa 2S 2 O 3 ( mL).0,0125N mgO 2
OD, mg / L  8000 , ou
Vamostra (100mL) eq
OD, mg/L O2 = mL Na2S2O3 gastos na titulação,
isto é, 1 mL Na2S2O3 0,0125 N = 1 mg/L OD quando se titula uma alíquota de 100 mL da amostra.
Semeadura (Inóculo)
 A presença de uma população de microrganismos capaz de oxidar a matéria orgânica biodegradável
na amostra é necessária, mas algumas amostras não contêm uma população microbiana suficiente
(ex. águas residuárias industriais de pH extremo, esgotos após a desinfecção). Neste caso, faz-se
necessário semear a água de diluição com um inóculo de microrganismos. De preferência, utiliza-
se um inóculo do sistema de tratamento biológico que trata o esgoto sendo analisado. Quanto este
não estiver disponível, pode se utilizar o sobrenadante de esgoto doméstico, decantado a
temperatura ambiente por 1 a 36 h.
45
 Alguns efluentes podem conter materiais mais recalcitrantes, que só são degradados por
microrganismos adaptados. Um inóculo adaptado pode ser preparado pela adição de alíquotas
incrementais do efluente a um volume de esgoto doméstico decantado e sob aeração contínua.
Existem também inóculos comerciais disponíveis. O volume do inoculo a adicionar a água de
diluição deve ser escolhido para que produza uma DBO entre 0,6 e 1,0 mg/L O2.
 Deve-se determinar a DBO da água de diluição contendo o inoculo da mesma forma que as demais
amostras. Essa análise serve como de controle de inoculo (B).
 Cálculos
Água de diluição sem inóculo: Água de diluição com inóculo:

DBO, mg/L = (OD0 – OD5) DBO, mg/L = (OD0 – OD5) – (B0 – B5).f
P P
onde:
OD0 = OD da amostra diluída imediatamente após seu preparo, mg/L
OD5 = OD da amostra diluída após incubação por cinco dias a 20ºC, mg/L
P = fração decimal da amostra utilizada
B0 = OD do controle de inóculo antes da incubação, mg/L
B5 = OD do controle de inóculo após a incubação, mg/L
f = razão entre volume de inóculo na amostra diluída e o volume de inóculo no controle de
inóculo.
 Quando a DBO for determinada sob condições de tempo e/ou temperatura diferentes das do
método padrão, multiplicar pelo fator de correção apropriado (veja quadro a seguir) para
converter ao valor correspondente de DBO5,20.
Fatores de correção para a conversão de DBO a DBO5,20 (esgoto doméstico)

Temperatura,ºC
Dias
15 20 25 30
5 1,27 1,00 0,81 0,68
7 1,05 0,85 0,71 0,62
DBOúltima - 1º estágio 0,76 0,68 0,62 0,57
46
XVI - DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO (DQO)
1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Colorimetria após refluxo fechado)

O método consiste na oxidação da matéria orgânica na amostra em uma mistura fervente de ácidos
crômico e sulfúrico com um excesso conhecido do agente oxidante, o dicromato de potássio (K 2Cr2O7):
CnHaObNc + dCr2O72- + (8d + c)H+  nCO2 + (a + 8d - 3c).H2O + cNH4+ + 2dCr3+,

2
2n a b c
onde: d = 3 + 6 − 3 − 2
Para valores de DQO entre 100 e 900 mg/L, o aumento de Cr3+ na região de 600 nm é determinado. Para
valores de DQO abaixo de 100 mg/L, a diminuição de Cr2O72- a 420 nm pode é determinada. Dessa
forma, o cromato formado ou dicromato residual será quantificado colorimetricamente a 600nm ou 420
nm e comparado com uma curva padrão preparado a partir do padrão ftalato ácido de potássio.
Se a cor da amostra interferir na leitura de absorbância, o dicromato residual também pode ser
quantificado por titulação com sulfato ferroso amoniacal [Fe(NH 4)2(SO4) 2]:
6Fe2+ +Cr2O72- + 14H+  6Fe3+ + 2Cr3+ + 7H2O
Nos dois casos, o resultado é expresso em termos de oxigênio consumido.
2- INTERFERÊNCIAS
Ácidos orgânicos voláteis alifáticos não são oxidados, a menos que se adicione sulfato de prata (Ag2SO4)
como catalisador. No entanto o Ag2SO4 reage, formando precipitados, na presença de cloreto, brometo
e iodeto. A interferência dos haletos pode ser minimizada mediante adição de sulfato de mercúrio
(HgSO4), como agente complexante.
Ag2SO4+ 2Cl-  AgCl

6Cl- + Cr2O72- + 14 H+  3Cl2 + 2Cr3+ + 7H2O
Hg2+ + 2Cl-  HgCl2(aq)
Íons inorgânicos, na sua forma reduzida (ferro(II), sulfeto, manganês(II), etc.) são oxidados
quantitativamente pelo dicromato. Em amostras contendo quantidades significativas desses íons, deve-
se corrigir o resultado final, subtraindo o consumo de oxigênio devido a esses íons, assumindo sua
oxidação estequiométrica.

Deve-se coletar 200 mL da amostra em frasco de vidro ou polietileno e conservá-la através da adição
de ácido sulfúrico concentrado até pH < 2 e a 4ºC. O prazo para análise é de 7d.
4- MATERIAL
 Termoreator (150ºC)
 Pipetas de 5 mL
 Espectrofotômetro (c/ adaptação para tubos de 16mm e leitura a 600nm)
 Tubos de ensaio de 16x100mm com tampas rosqueáveis
47
 Solução padrão de ftalato ácido de potássio (HOOCC 6H4COOK), 1500 mg/L DQO
 Solução digestora (K2Cr2O7 / H2SO4 / HgSO4) para faixa baixa (0-100 mg/L) ou alta (100-900 mg/L)
 Solução de ácido sulfúrico / sulfato de prata (H2SO4 / Ag2SO4)
6- METODOLOGIA
Procedimento com as amostras
 Homogeneizar a amostra e com o auxílio de uma pipeta, transferir 2,5 mL para o tubo de ensaio
(resultado da análise depende de uma boa homogeneização).
 Adicionar 1,5 mL da solução digestora e, cuidadosamente, adicionar 3,5 mL da solução de ácido
sulfúrico / sulfato de prata.
 Tampar o tubo, inverter algumas vezes para homogeneização. Cuidado - este procedimento produz
calor é deve ser realizado longe dos olhos. Limpar o tubo externamente com papel macio e
absorvente (tubos riscados produzem alterações nas leituras e devem ser descartados).
 Inserir o tubo no termoreator mantido a 150 ± 2ºC por duas horas.
 Resfriar o tubo à temperatura ambiente, inverter algumas vezes e esperar a sedimentação de
quaisquer sólidos. Efetuar a leitura em espectrofotômetro a 420 (faixa baixa) ou 600nm (faixa alta)
e comparar com a curva de calibração previamente preparada.
Curva padrão
 Preparar, no mínimo, cinco padrões a partir da solução padrão de ftalato ácido de potássio para a
faixa de DQO desejada, de acordo com a tabela a seguir, e tratá-los da mesma forma que as amostras.
Faxia baixa (0 a 90 mg/L) Faixa alta (100 a 900 mg/L)

DQO mL solução mL H2O DQO mL solução mL H2O
(mg/L) padrão a 150mg/L destilada (mg/L) padrão a 1500mg/L destilada
0 0,0 2,5 0 0,0 2,5
18 0,3 2,2 180 0,3 2,2
36 0,6 1,9 360 0,6 1,9
54 0,9 1,6 540 0,9 1,6
72 1,2 1,3 720 1,2 1,3
90 1,5 1,0 900 1,5 1,0
 Preparar brancos (sem solução padrão), sem e com digestão. A 600 nm (faixa alta), zerar o
espectrofotômetro com o branco sem digestão e subtrair a DQO do branco após digestão da DQO
da amostra. A 420 nm (faixa baixa), zerar o espectrofotômetro com água destilada. Subtrair a
absorbância do branco digerido da absorbância de padrões e amostras.
48
APÊNDICE - PREPARO DE REAGENTES
O preparo e a padronização dos reagentes necessários para a análise dos parâmetros citados nesta
apostila estão descritos neste apêndice, organizados por ordem alfabética do parâmetro.
ALCALINIDADE
Ácido sulfúrico (H2SO4) 0,1N - Colocar cerca de 500 mL de água destilada em balão volumétrico de
1000 mL. Deixar cair de uma pipeta, gota a gota, 2,8mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado.
Resfriar, completar o volume e homogeneizar.
Ácido sulfúrico (H2SO4) 0,02N - Transferir 200 mL da solução de H2SO4 0,1 N para um balão
volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água destilada.
Padronização do H2SO4: Transferir 20 mL de Na2CO3 0,02 N para um erlenmeyer de 250 mL, adicionar
3 gotas de alaranjado de metila. Titular com a solução de H2SO4, aproximadamente 0,02 N até o ponto
de viragem, caracterizado pelo aparecimento de uma coloração vermelha.
Fator de correção (FC) = 20 mL .

Volume H2SO4 (mL)
Solução de carbonato de sódio (Na 2CO3), 0,02N - Secar de 3 a 5g de carbonato de sódio (Na 2CO3) à
250ºC por quatro horas e resfriar em dessecador. Pesar exatamente 1,060g e dissolver em balão de 1000
mL. Completar o volume com água destilada e homogeneizar.
Solução indicadora de fenolftaleína - Dissolver 1 g de fenoftaleína em 60 mL de etanol e diluir até 100

mL com água destilada.
Solução indicadora de verde de bromocresol – Dissolver 100 mg do sal sódico de verde de bromocresol
em 100 mL de água destilada.
CLORETOS
Ácido sulfúrico 0,1N – Diluir 2,8 mL de H2SO4 concentrado a 1000 mL com água destilada.
Hidróxido de sódio 0,1N – Dissolver 4 g de NaOH em 1000 mL de água destilada.
Solução indicadora de fenolftaleína – veja em alcalinidade
Peróxido de hidrogênio (água oxigenada, H2O2), 30% - solução comercial (300 g H2O2 em 1000 mL)
Solução de nitrato de prata (AgNO3) 0,0141N, padronizada - Dissolver 2,395 g de AgNO3 em água
destilada e diluir a 1000 mL.
Padronização de AgNO3: Titular 20 mL da solução padrão de NaCl 0,0141M com AgNO3. Analisar
um corpo de prova em branco, contendo 20 mL de água destilada em vez de NaCl.
Normalidade de AgNO3 = FC x 0,0141 N.
FC = 20 mL onde: A = mL AgNO3 gastos na titulação de NaCl

(A – B) B = mL AgNO3 gastos na titulação do branco
Solução padrão de cloreto de sódio (NaCl) 0,0141 M (0,0141N) – Dissolver 824,0 mg NaCl,
previamente seco a 140ºC, em água destilada e diluir a 1000 mL. Um mL da solução padrão = 500 µg
Cl-.
49
Solução indicadora de cromato de potássio - Dissolver 50 g K2CrO4 em água destilada. Adicionar
AgNO3 até formar um precipitado vermelho. Deixar em repouso por 12 h, filtrar e diluir a 1000 mL
com água destilada.
Suspensão de hidróxido de alumínio - Dissolver 125 g de AlK(SO4)2.12H2O ou AlNH4(SO4)2.12H2O

em 1000 mL de água destilada. Aquecer a 60ºC e adicionar 55 mL de hidróxido de amônia (NH4OH),
sob agitação suave. Deixar em repouso aproximadamente 1 h , transferir a um frasco grande e lavar o
precipitado, várias vezes, até ficar livre de cloreto, pela adição de água destilada, mistura e decantação.
CLOROFILA a
Ácido clorídrico (HCl) 0,1N – Diluir 83 mL de HCl concentrado a 1000 mL com água destilada.
Etanol (EtOH) 80% - Diluir 80 mL de etanol absoluto ou 83,3 mL de etanol 96% a 100 mL com água
destilada.
COLIFORMES TOTAIS, TERMOTOLERANTES e Escherichia coli
Meios de cultivo - meios desidratados disponíveis comercialmente devem ser utilizados para garantir
uniformidade de resultados. Siga as instruções do fabricante para a hidratação e esterilização dos meios.
Os meios podem estar na forma líquida (caldo) ou sólido (agar).
 DIFCO Caldo M-Endo MF, BBL Caldo M-coliforme (MC), ou equivalente
 DIFCO Caldo Laurel Tri ptose, BBL Caldo Laurel Sulfato, ou equivalente (caldo lactosado)
 BBL Caldo Bile Lactose Verde Brilhante (BGLB), ou equivalente
 DIFCO Meio EC, BBL Caldo EC, ou equivalente
 Agar Eosina Metileno Azul (EMB)
 Caldo triptonado com reagente de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldeído)
Tampão fosfato estoque – Adicionar 34 g KH2PO4 em 500 mL água destilada. Ajustar p pH 7,2 com
NaOH 1 N e completar a 1000 mL com água destilada. Esterilizar na autoclave por 15 min a 121º C.
Estocar na geladeira, e manusear assepticamente.
Solução de cloreto de magnésio (MgCl2) – Dissolver 81,1 g MgCl2.6H2O em 1000 mL de água

destilada. Esta solução é estável por 6 meses.
Água de diluição tamponada – Adicionar 1,25 mL do tampão fosfato estoque e 5,00 mL da solução de
MgCl2 e completar o volume a 1000 mL em balão volumétrico. Distribuir em frascos autoclaváveis,
esterilizar e estocar na geladeira. Manusear assepticamente.
CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS

Água de diluição tamponada, estéril (consulte roteiro de Coliformes para preparo)
Agar R2A - Preparar de acordo com as instruções do fabricante. Dispensar em tubos (15 a 20 mL por
tubo) ou in quantidades maiores em frascos tampados. Guardar na geladeira até utilizar.
CONDUTIVIDADE
Solução padrão KCl 0,0100N (1412 µS cm-1) – Dissolver 745,6 mg KCl anidro em água desionizada e
diluir a 1000 mL em balão volumétrico a 25C.
COR
Solução padrão – Dissolver 1,246 g K2PtCl6 (equivalente a 500 mg Pt) e 1,00 g CoCl2.6H2O (equivalente
a 250 mg Co) em água destilada e 100 mL de ácido clorídrico (HCl) concentrado e diluir até 1000 mL
com água destilada. Esta solução padrão estoque contém 500 unidades de cor (UH). Proteger os padrões
contra evaporação e contaminação quando não estão sendo utilizados.
50
DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXIGÊNIO / OXIGÊNIO DISSOLVIDO
Solução alcalina de iodeto-azida
Amostras saturadas ou insaturadas - Dissolver 500 g de NaOH (ou 700g de KOH) e 135 g de NaI (ou
150 g de KI) em água destilada e completar o volume para 1 L. Adicionar 10 g de azida sódica (NaN3)
dissolvidos em 40 mL de água destilada. Esta solução não deve ficar colorida na presença de amido
quando diluída e acidificada.
Amostras supersaturadas – Dissolver 10 g de NaN3 em 500 mL de água destilada. Adicionar 480 g de
NaOH e 750 g de NaI e agitar até dissolvidos. A solução ficará turva, devido à presença de carbonato
de sódio (Na2CO3), mas essa turbidez não interferirá na análise. Não acidificar esta solução para evitar
possível formação de gases tóxicos.
Solução de sulfato manganoso - Dissolver 480 g MnSO4.4H2O, 400 g de MnSO4.2H2O ou 364 g de

MnSO4.H2O em água destilada, filtrar e completar o volume para 1 L. Esta solução não deve ficar
colorida quando misturada com uma solução acidificada de KI.
Solução de amido - Dissolver 2 g de amido solúvel e 0,2 g de ácido salicílico (conservante) em 100 mL
de água destilada quente.
Solução padrão de bi-iodato de potássio (KH(IO3)2) 0,00104M – Dissolver 0,4062 g de KH(IO 3)2 em
água destilada e diluir a 1 litro.
Solução de tiossulfato de sódio (Na2S2O3) 0,0125N - Dissolver 3,10 g de Na2S2O3.5H2O em água

destilada. Adicionar 1,5 mL de NaOH 6 N ou 0,4 g de NaOH sólido e completar o volume para 1 litro.
Padronização solução Na2S2O3: Dissolver aproximadamente 2 g de iodeto de potássio (KI), livre

de iodato, em 100 a 150 mL de água destilada em um erlenmeyer. Adicionar 1 mL de H2SO4 6 N
ou algumas gotas de H2SO4 concentrado e 20 mL da solução padrão de bi-iodato de potássio
(KH(IO3)2). Diluir a 200 mL e titular com solução de tiossulfato de sódio 0,0125 M usando solução
de amido como indicador.
Normalidade de Na2S2O3 = 0,0125 x FC
FC = 20 mL .
Vol Na2S2O3 (mL)
Solução tampão fosfato – Dissolver 8,5 g de KH2PO4, 21,75 g de K2HPO4, 33,4 g de Na2HPO4.7H2O e
1,7 g de NH4Cl em, aproximadamente, 500 mL de água destilada e completar o volume para 1 litro. O
pH deve ser 7,2, sem ajuste. Descartar a solução se apresentar sinais de crescimento biológico.
Solução de ácido sulfúrico 1N – Adicionar lentamente, sob agitação, 28 mL de H2SO4 concentrado a

500 mL de água destilada e completar o volume para 1 L.
Solução de hdróxido de sódio 1N – Dissolver 40 g de NaOH em água destilada e completar o volume

para 1 L.
Solução de cloreto de cálcio (CaCl2) – Dissolver 27,5 g de CaCl2 em água destilada e completar o volume
para 1 L.
Solução de cloreto férrico (FeCl3) – Dissolver 0,25 g de FeCl3.6H2O em água destilada e completar o
volume para 1 L.
Solução de sulfato de magnésio (MgSO4) – Dissolver 22,5 g de MgSO4.7H2O em água destilada e

completar o volume para 1 L.
Solução de sulfito de sódio (Na2SO3) – Dissolver 1,575 g de Na2SO3 em 1000 mL de água destilada.
Esta solução é instável e deve ser preparada diariamente.
51
DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO
Solução padrão de ftalato ácido de potássio (1500 mg/L DQO) - Dissolver 0,6375 g ftalato ácido de
potássio, previamente seco a 120ºC por uma hora, e diluir a 500 mL em balão volumétrico. A solução
é estável por 3 meses quando refrigerada, desde que não se observe crescimento biológico. (1 mg ftalato
ácido de potássio = 1,176 mg DQO). Para amostras com reduzido teor de DQO, diluir a solução padrão
1/10 (150 mg/L DQO) em água destilada antes de preparar a curva padrão.
Solução digestora
Faixa alta (100 a 900 mg/L) - A aproximadamente 500 mL de água destilada, adicionar 10,216 g de
dicromato de potássio (K2Cr2O7), previamente seco à 103ºC por duas horas; 167 mL de ácido sulfúrico
concentrado (H2SO4) e 33,3 g de sulfato de mercúrio (HgSO4). Dissolver, resfriar a temperatura
ambiente e diluir a 1000 mL em balão volumétrico.
Faixa baixa (0 a 900 mg/L) – Preparar conforme descrito anteriormente, mas usar apenas 1,022 g
K2Cr2O7.
Solução de ácido sulfúrico / sulfato de prata - Adicionar 2,53 g de sulfato de prata (Ag2SO4) a 250 mL
de ácido sulfúrico concentrado (H 2SO4). Deixar em repouso por 2 dias para total dissolução do Ag2SO4.
DUREZA
Solução de EDTA (Na2-EDTA) 0,01M (0,02N) - Pesar 3,723 g de sal dissódico do ácido
etilenodiaminotetracético (Na 2H2C10H12O8N2.2H2O), p.a., dissolver em água destilada, transferir para
um balão volumétrico de 1000 mL e completar o volume até a marca de aferição.
Padronização EDTA: Em erlenmeyer de 250 mL, diluir 20 mL de solução padrão de cálcio a 50 mL

com água destilada e adicionar 1-2 mL da solução tampão NH4Cl/NH4OH para ajustar o pH a 10,0 
0,1. Adicionar 0,05 g do indicador negro de eriocromo. Titular com a solução de EDTA a ser
padronizada, gota a gota e com agitação, até desaparecer a última coloração avermelhada e aparecer
a cor azul, indicadora do ponto final. As últimas gotas devem ser adicionadas em intervalos de 3-5
segundos. Guardar em frasco de polietileno, e repadronizar periodicamente.
FC = 20 mL ,
Volume EDTA gasto (mL)
Solução padrão de cálcio - CaCO3 0,01M (0,02N) - Pesar 1,000 g CaCO3 anidro, em pó, padrão, e
transferir para um erlenmeyer de 250 mL. Adicionar aos poucos, com auxílio de um funil, HCl 1:1 até
dissolver todo o CaCO3. Adicionar 200 mL de água destilada e ferver por alguns minutos para eliminar
CO2. Esfriar, adicionar algumas gotas de vermelho de metila, e ajustar à cor laranja intermediária, pela
adição de NH4OH 3 N ou HCl 1:1. Transferir toda a mistura para um balão de 1000 mL, e completar até
a marca com água destilada. 1,00 mL = 1,00 mg CaCO3.
Solução tampão cloreto de amônio/hidróxido de amônio (NH 4Cl/NH4OH) (pH 10 ± 0,1) - Dissolver
16,9g de cloreto de amônio (NH 4Cl) em 143 mL de hidróxido de amônio concentrado (NH 4OH).
Adicionar 1,179g de Na2EDTA e 0,780 g de sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) [ou 0,644 g de cloreto
de magnésio (MgCl2.6H2O)] e diluir a 250 mL com água destilada. Guardar, preferencialmente, em
frasco de polietileno, bem fechado para impedir perda de NH 3 e entrada de CO2. Descartar o tampão se
a adição de 1-2 mL à amostra não eleva o pH a 10,0 ,0,1. A solução é estável por 30 dias quando em
frasco freqüentemente aberto.
Hidróxido de sódio (NaOH) 1,0N - Dissolver 10,5 g de NaOH em um béquer de 100 mL com água
destilada e transferir para um balão de 250 mL. Após o resfriamento completar o volume e
homogeneizar.
52
Solução de hidróxido de amônio (NH4OH) 3N - Diluir 11,6 mL de hidróxido de amônio em água
destilada completando o volume para 100 mL em um balão volumétrico.
Solução de ácido clorídrico 1:1 - Acrescentar, lentamente, a um béquer de 1 L contendo

aproximadamente 300 mL de água destilada, 500 mL de ácido clorídrico concentrado. Transferir a
mistura para um balão de 1000 mL, completar o volume com água destilada e homogeneizar.
Indicador sólido negro de eriocromo T (Erio.T) - Misturar 0,5 g de negro de eriocromo com 100 g de
NaCl. Guardar em frasco bem fechado. Indicador deteriorado apresenta mudança de cor imprópria na
titulação.
Indicador sólido murexida - Misturar 0,5 g de negro de eriocromo com 100 g de NaCl. Guardar em
frasco bem fechado. Indicador deteriorado apresenta mudança de cor imprópria na titulação.
Indicador vermelho de metila - Em um béquer de 1 L aquecer aproximadamente 800 mL de água

destilada e, sob contínua agitação, dissolver 1 g de vermelho de metila. Alternativamente pode-se
dissolver o reagente em uma mistura de 600 mL de etanol e 400 mL de água destilada.
FERRO
Solução estoque de ferro (200 mg/L) - Adicionar lentamente 20 mL H2SO4 conc. a 50 mL de água
destilada e, em seguido, acrescentar 1,404 g sulfato ferroso amoniacal [Fe(NH 4)2(SO4)2.6H2O].
Adicionar permanganato de potássio (KMnO4) 0,1 N por gotejamento até o aparecimento de uma cor
rosa clara persistente. Diluir a 1000 mL com água destilada. 1,00 mL = 200 µg Fe.
Solução padrão de ferro (1 mg/L), preparo diário - Pipetar 5,0 mL da solução estoque para um balão
volumétrico de 1000 mL e completar o volume com água destilada. 1,00 mL = 1,00 µg Fe.
Solução de hidroxilamina, 10% (NH2OH.HCl) - Dissolver 10 g de NH2OH.HCl em 100 mL água

destilada.
Solução de 1,10-fenantrolina (C12H8N2.H2O) - Dissolver 100 mg C12H8N2.H2O em água destilada sob

agitação e aquecimento a 80º C. Não há necessidade de aquecer a solução se adicionar 2 gotas de HCl
conc.
Tampão acetato de amônio/ácido acético (NH4C2H3O2)/CH3COOH) - preparo diário. Dissolver 250 g

NH4C2H3O2 em 150 mL de água destilada. Adicionar 700 mL de ácido acético (CH3COOH) glacial.
Preparar novos padrões de referência cada vez que preparar o tampão.
FÓSFORO
Solução de ácido sulfúrico/nítrico (solução ácida forte) – Adicionar lentamente 300 mL de H2SO4 a
aproximadamente 600 mL de água destilada. Deixar resfriar e adicionar 4,0 mL de HNO3 conc. e diluir
a 1000 mL.
Solução de molibdato de amônio – Dissolver 25 g (NH4)6Mo7O24.4H2O em 175 mL de água destilada.

Adicionar, cuidadosamente, 280 mL H2SO4 conc. a 400 mL de água destilada. deixar resfriar , adicionar
a solução de molibdato e diluir a 1000 mL.
Solução de cloreto estanoso – Dissolver 2,5 g SnCl2.2H2O em 100 mL glicerol. Aquecer em banho-
maria e agitar com bastão de vidro.
Solução estoque de fosfato – Dissolver 219,5 mg KH2PO4 anidro em água destilada e completar a 1000
mL: 1,00 mL = 50 µg PO43-
53
Solução padrão de fosfato - Diluir 50,0 mL da solução estoque de fosfato a 1000 mL em água destilada:
1,00 mL = 2,5 µg PO43-
NITROGÊNIO KJELDAHL TOTAL

Preparar todos os reagentes em água destilada ou desionizada, livre de amônia.
Tampão borato (pH 9,5) – Adicionar 88 mL de NaOH 0,1 N a 500 mL de tetraborato de sódio 0,025
M (Na2B4O7) e diluir a 1000 mL.
Solução de NaOH/Na2S2O3 – Dissolver 500 g NaOH e 25 g Na2S2O3.5H2O em 1000 mL água.
Solução digestora – Dissolver 134 g K2SO4 e 7,3 g CuSO4 em 800 mL água. Adicionar cuidadosamente,
134 mL H2SO4 conc. Deixar resfriar e diluir a 1000 mL. Misturar bem e estocar à temperatura de 20º C
para evitar cristalização.
Solução de ácido bórico / indicador – Dissolver 20 g H3BO3 em água e adicionar 10 mL da solução

indicadora mista. Preparar mensalmente.
Solução indicadora mista – Dissolver 200 mg vermelha de metila em 100 mL etanol 95%. Dissolver
100 mg de azul de metileno em 50 mL etanol 95%. Combinar as soluções. Preparar mensalmente.
Solução titulante de ácido sulfúrico 0,02N, padronizada – veja em alcalinidade
pH
Soluções de tampões-padrão (tipicamente pH 4, 7 e 10) – disponíveis comercialmente.
TURBIDEZ
Solução I (sulfato de hidrazina) - Diluir 1,00 g de (NH2)2.H2SO4 em 100 mL de água destilada em balão
volumétrico. Atenção: Sulfato de hidrazina é um agente cancerígeno – evitar inalar, ingerir e contato
com a pele.
Solução II (hexametilenotetramina) - Diluir 10,00 g de (CH2)6N4 em 100 mL de água destilada em balão

volumétrico.
Suspensão do padrão primário - Misturar 5 mL da solução I e 5 mL da solução II e deixar em repouso

por 24 h, a temperatura ambiente. Esta mistura resulta em uma suspensão com turbidez equivalente a
4.000 UNT. A suspensão é estável por até um ano quando armazenado em frasco âmbar.
54

Apostila Pratica Qualidade Da Água

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Apostila Pratica Qualidade Da Água

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Universidade Federal de Viçosa

Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas

CIV442 - QUALIDADE DA ÁGUA

CONCEITOS DE QUÍMICA QUANTITATIVA .......................................................................................... 1

I. FORMAS DE EXPRESSÃO DE CONCENTRAÇÃO

Massa de soluto por unidade de volume da solução (p/v) – ex. mg/L

Sabendo que densidade () = massa da solução (kg) ,

124 mg NO3- x 1000 mL = 1240 mg/L NO3-, e

36 mg NH4+ x 1000 mL = 360 mg/L NH4+

Podemos também expressar os constituintes em termos de nitrogênio:

mg/L N-NH4+ = 360 mg/L NH4+ x 14 mg N = 280 mg/L N-NH4+

mg/L N-NO3- = 1240 mg/L NO3- x 14 mg N = 280 mg/L N-NO3-

Molaridade = mols de soluto por volume de solução, em litros (M)

360 mg/L NH4+ x 1 mol NH4+ = 0,02M NH4+

1240 mg/L NO3- x 1 mol NO3- = 0,02M NO3-

normalidade, N = massa da substância/L

Existem três definições comumente encontradas de peso equivalente:

peso molar CO32- = 60 g/mol

peso equivalente = peso molar = 60 g/mol = 30 g/eq = 30 mg/meq

normalidade = 80 mg/L = 2,67 mN

peso molar Ca3(PO4)2 = 310 g/mol,

cada mol forma 6 cargas positivas (3Ca2+) e 6 cargas negativas (2PO43-),

peso equivalente = 310 g/mol = 51,67 g/eq = 51,67 mg/meq

normalidade = 155 mg/L = 3 mN

Exemplo: Determinar a normalidade das seguintes soluções:

1. 36,5 mg/L HCl, considerando a reação: HCl + NaOH  NaCl + H2O

1ª reação: 1H+ reage por mol de HCl, portanto:

peso equivalente = 36,5 g/mol HCl = 36,5 g/eq = 36,5 mg/meq

normalidade = 36,5 mg/L = 1 mN

peso equivalente = 60 g/mol CO32- = 60 g/eq = 60 mg/meq

normalidade = 45 mg/L = 0,75 mN

3ª reação: 2H+ reagem com cada mol de CO32-, portanto:

peso equivalente = 60 g/mol = 30 g/eq= 30 mg/meq

normalidade = 45 mg/L = 1,5 mN

peso equivalente = peso molar ,

Exemplo: Considerar a reação redox:

4Fe2+ + O2 + 4H+  4Fe3+ + 2H2O

oxidação: 4Fe2+  4Fe3+ + 4e-

Baseado na reação de redução, o peso equivalente de oxigênio é: 32 g/mol O2 = 8 g/eq

Baseado na reação de oxidação, o peso equivalente do ferro é: 56 g/mol Fe = 56 g/eq

0,25 x 10-3 mol x 4 eq x 8000 mg = 26,7 mg/L como O2

N Cr2O72- x 8000 mg/eq O2,

resultará na concentração de matéria orgânica (DQO), em mg/L como O2.

5. Concentração equivalente de CaCO3

eq da substância x 50.000 mg CaCO3

peso equivalente de CaCO3 = 100g/mol = 50 g/eq

CaCO3(s) + 2H+  H2CO3 + Ca2+

peso equivalente de CaCO3 = 100g/mol = 50 g/eq

Análises volumétricas e colorimétricas estão dentre as mais frequentemente empregadas na análise da

Exemplos de análises volumétricas incluem os métodos usados na determinação de alcalinidade, dureza,

Quando a concentração é expressa como normalidade, tem-se: NamVam = NtitVtit

onde: Nam = normalidade de substância ativa na amostra

N de substância ativa na amostra = volume titulante (mL) x N (eq/L),

A padronização, ou determinação da concentração exata da solução titulante, depende do uso de um

onde: Vpp = volume do padrão primário, mL

Dessa forma, a normalidade real da solução titulante = normalidade nominal x FC.

Os métodos colorimétricos são mais frequentemente aplicados na análise de soluções diluídas, e,

onde: T = transmitância da solução

Solução padrão de DQO A curva padrão obtida é:

Foram analisadas duas amostras, com os seguintes resultados:

Parâmetro Standard method Descrição

É de fundamental importância respeitar os procedimentos e prazos para a preservação de amostras, para

1- PRINCÍPIO DO MÉTODO (Gravimetria)