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GABRIELLE VIEIRA
Dissertação apresentada ao
Instituto de Biociências do Campus
de Rio Claro, Universidade
Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências Biológicas
(Microbiologia Aplicada).
Rio Claro - SP
Abril - 2018
GABRIELLE VIEIRA
Rio
Claro
2018
589.2 Vieira, Gabrielle
V658m Metabólitos secundários de fungos da Antártica com
atividade antibacteriana em Xanthomonas spp. / Gabrielle
Vieira. - Rio Claro, 2018
73 f. : il., figs., gráfs., tabs.
APÊNDICE B
Figura 30 - Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas axonopodis pv.
passiflorae ................................................................................................................. 72
APÊNDICE C
Figura 31 - Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas euvesicatoria ........... 73
7
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 9
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 27
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 61
APÊNDICES ............................................................................................................. 70
9
1. INTRODUÇÃO
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. O gênero Xanthomonas
O gênero Xanthomonas (xanthos: amarelo e monas: entidade) compreende
27 espécies que coletivamente afetam aproximadamente 400 hospedeiros vegetais.
As espécies incluem diversos patovares e apresentam uma alta especificidade
hospedeiro-planta, em alguns casos exibindo especificidade de tecido (RYAN et al.,
2011).
As espécies que fazem parte desse gênero são em sua maioria bactérias
associadas a plantas e comumente não encontradas em outros ambientes. As
bactérias desse grupo não são invariavelmente patógenos, alguns isolados foram
encontrados em associação assintomática com tecidos vegetais ou como epífitos
(HAYWARD, 1993). Infecções por Xanthomonas ocorrem em pelo menos 124
monocotiledôneas e 268 espécies de dicotiledôneas (LEYNS et al., 1984).
As bactérias desse gênero são bastonentes, Gram-negativas, aeróbias
obrigatórias, não formadoras de esporos, e apresentam um flagelo polar. As
Xanthomonas são distribuídas mundialmente e os danos causados nos vegetais são
normalmente suficientes para causar perdas no rendimento. No Brasil muitas
doenças causadas por bactérias fitopatogênicas do gênero Xanthomonas afetam
culturas de grande importância econômica e social tais como: citros, mandioca,
tomate, feijão, maracujá, cana-de-açúcar (RYAN et al., 2011; RODRIGUEZ et al.,
2012).
11
O cancro cítrico, causado pela X. citri subsp. citri (X. citri - XaC), é uma
doença que ataca todas as espécies e variedades de citros de importância
comercial. Regiões com clima favorável, como o Brasil, Índia, Japão, países do
sudeste asiático e algumas áreas dos Estados Unidos da América sofrem grandes
perdas econômicas por conta da doença (Figura 1). A doença ocorre
endemicamente em países da América do Sul como Argentina, Bolívia, Brasil,
Paraguai e Uruguai. No Brasil, o cancro cítrico é considerado um dos principais
problemas fitossanitários na cultura de citros no Brasil (SANCHES et al., 2014; CABI,
2017; EPPO, 2017).
Figura 1 - Distribuição mundial de Xanthomonas citri subsp. citri.
3. OBJETIVOS
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Reativação dos fungos filamentosos
Os trinta e três fungos filamentosos utilizados no projeto foram isolados de
solo abaixo de madeira em decomposição, coletados na Ilha de Deception na
Antártica por Alysson Wagner Fernandes Duarte sob orientação da Prof.ª Dr.ª Lara
Durães Sette (UNESP, Rio Claro) durante expedição PROANTAR (OPERANTAR
XXXII) realizada em novembro/dezembro de 2013 no âmbito do projeto INCT
Criosfera (Coordenado pelo Prof. Jefferson Simões, UFRGS).
Esses isolados fazem parte do acervo de fungos da coleção de pesquisa da
Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP) e encontram-se
preservados à -80 ºC. Os isolados foram reativados em placas de Petri contendo
meio de cultura Agar Malte 2% (MA) e incubados em estufa tipo BOD durante 10
28
dias a 15 ºC. Os fungos filamentosos foram examinados quanto à sua pureza para a
produção dos extratos, e preservados pelo método de Castellani (CASTELLANI,
1939).
4.2. Produção de extratos metabólicos brutos fúngicos
4.2.1. Cultivo microbiano
Após o período de incubação em placa de Petri, três quadrados de
aproximadamente 5 mm x 5 mm de área contendo ágar e micélio foram transferidos
para erlenmeyers de 250 mL contendo 180 mL de caldo malte 2%. Os erlenmeyers
foram mantidos em incubadora shaker durante 20 dias à 15 ºC e 150 rpm para
produção de metabólitos secundários (Figura 14). O cultivo foi realizado em triplicata
para todos os isolados.
Figura 14 - Produção de metabólitos secundários.
A B C
DMSO 1%. Nas colunas de 2 a 9, exceto na primeira linha (linha A), foram
adicionados 90 µL de meio NYG. Os extratos a serem testados foram adicionados
na linha A (200 µL) e seguiu-se uma diluição seriada e então a adição do inóculo
bacteriano.
O inóculo bacteriano (IB) contendo X. citri subsp. citri, X. euvesicatoria ou X.
axonopodis pv. passiflorae foi feito transferindo uma alçada de bactéria cultivada
previamente em meio sólido NYG e incubada por 2 dias à 29 ºC em estufa BOD para
frasco coletor contendo 30 mL de meio líquido NYG. O frasco coletor foi incubado a
200 rpm e 29 ºC até D.O600 = 0,8. O inóculo foi cultivado a 29 ºC e 200 rpm em
incubadora SHAKER por aproximadamente 14h, onde a Densidade Óptica medida a
600nm é de 0,8 (D.O.600 = 0,8). Após atingir a D.O.600 desejada o inóculo foi diluído
1:10 em meio NYG e 10 µL foram adicionados nos poços da placa, exceto nas
colunas 1 e 12, assim temos padronizado que a concentração de células por poço é
de 105 UFC para os três fitopatógenos.
A placa foi incubada a 29 ºC por 18h, em seguida 15 µL de uma solução de
resazurina 0,01% (w/v) foi adicionada e a placa novamente levada para incubação à
29 ºC por 1 h e trinta minutos. A Figura 16 mostra um esquema de placa de 96
poços utilizada para o teste de inibição antes da adição de resazurina.
Figura 16 - Esquema de placa 96 poços para REMA com extratos brutos.
Figura 18 - Repicador de colônias utilizado para inoculação em placas de Petri com meio
NYG para determinação da CBM.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
MAFFT v.7 (KATOH e STANDLEY, 2013). A análise filogenética foi feita usando o
programa MEGA v. 7 (TAMURA et al., 2013). O modelo Kimura 2-parâmetros The
Kimura 2-parameter model (KIMURA, 1980) foi utilizado para estimar a distância
evolucionária para Máxima Parcimônia. O Branch support foi calculado por bootstrap
com 1000 corridas repetidas.
Frações que apresentaram atividade inibitória foram enviadas para análise via
espectrometria de massas para verificar a purificação das mesmas e determinar a
massa molecular do composto bioativo.
38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Produção de extratos metabólicos brutos
Os 33 fungos filamentosos foram reativados com sucesso em meio de cultura
malte 2%. A Figura 20 mostra os isolados após 14 dias de cultivo à 15 ºC.
Após o período de cultivo em agitação para produção de metabólitos
secundários e posterior filtragem, o meio metabólico e a biomassa foram submetidos
aos processos de extração obtendo-se ao final um total de 66 extratos (33
extracelulares e 33 intracelulares). Os extratos secos foram pesados e armazenados
em microtubos e preservados em geladeira a 10 ºC.
Conforme pode ser observado na Tabela 1, houve uma diferença na obtenção
de extratos extracelulares e intracelulares. Na extração extracelular foi obtido uma
massa média de extrato de 37 mg. A extração intracelular apresentou maior
rendimento, com média de extratos intracelulares obtida de 113 mg. A diferença
entre massa obtida deve-se, provavelmente, ao método de extração e ao solvente
empregado na extração.
O metanol, empregado na extração intracelular, é um solvente altamente
polar e capaz de extrair um maior número de moléculas quando comparado ao
acetato de etila utilizado na extração extracelular. Como resultado, o número de
impurezas presentes no extrato intracelular também deve ser maior.
Como a quantidade obtida de alguns extratos foi relativamente baixa para
realização de algumas etapas do projeto (principalmente de purificação) e para
serem armazenados na extratoteca, vários destes extratos foram produzidos em
maior quantidade.
39
Xanthomonas
Xanthomonas Xanthomonas citri
Fungo axonopodis pv.
euvesicatoria subsp. citri
passiflorae
3MP - - +
5MP + + +
6MP - - +
10MP - - +
10.1MP + + +
10.4MP - - +
10.5MP - - +
10.8MP + + +
CMP + + +
2MA + - +
(+): Positivo para inibição do crescimento celular a 2,1 mg/mL.(-): Negativo para inibição do
crescimento celular a 2,1 mg/mL. Valor de corte: 90%.
42
Xanthomonas
Xanthomonas Xanthomonas citri
Fungo axonopodis pv.
euvesicatoria subsp. citri
passiflorae
3MP + + +
6MP + + +
10.4MP - + +
10.6MP + + -
CMP - - +
EMP + - +
FMP - - +
10MA - + -
(+): Positivo para inibição do crescimento celular a 2,1 mg/mL.(-): Negativo para inibição do
crescimento celular a 2,1 mg/mL. Valor de corte: 90%.
Inibição (%)
Xanthomonas citri Xanthomonas Xanthomonas
Isolado Extrato
subsp. citri euvesicatoria axonopodis pv.
passiflorae
I 97,25 ± 0,73 - -
3MP
E 94,22 ± 0,35 92,66 ± 4,58 96,88 ± 1,33
5MP I 96,58 ± 0,71 98,04 ± 0,12 98,23 ± 0,38
I 93,29 ± 3,08 - -
6MP
E 96,15 ± 0,37 97,71 ± 0,13 98,14 ± 0,59
10MP I 94,32 ± 3,42 -
10.1MP I 94,45 ± 1,96 98,20 ± 0,12 97,96 ± 0,78
I 89,41 ± 4,52 - -
10.4MP
E 95,02 ± 0,50 - 97,43 ± 0,74
10.5MP I 90,37 ± 7,67 -
10.6MP E - 93,62 ± 1,30 98,35 ± 0,27
10.8MP I 95,96 ± 0,61 97,68 ± 0,23 97,82 ± 0,75
I 96,02 ± 0,78 98,07 ± 0,16 98,32 ± 0,47
CMP
E 95,62 ± 1,70 - -
EMP E 96,37 ± 1,01 96,03 ±1,40 -
FMP E 92,54 ± 1,66 - -
2MA I 95,89 ± 0,53 95,66 ± 0,71 -
10MA E - - 90,32 ± 0,10
CP 90,65 ± 0,81 97,63 ± 0,87 98,15 ± 0,21
E: extracelular. I: intracelular. Dados apresentados como valores médios de inibição (n=3) ± desvio
padrão para cada um dos fitopatógenos. Valores referentes a 2,1 mg de extrato/mL.
A B
Leituras em tempo real em coluna preparativa HILIC com detector UV nos comprimentos
de onda de 250 nm e 350 nm. Fonte: Arquivo pessoal.
58
8.33
8.55 11.47 16.73
14.57 27.94
22.50
2.12 18.38 19.85 24.34
5.20
0 Time
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00
6. CONCLUSÃO
Como esperado, os micro-organismos adaptados à extremas condições como
os encontrados em solos da região da Antártica tem grande potencial biotecnológico
e são fonte de moléculas com propriedades antimicrobianas. Particularmente, os
representantes do gênero Pseudogymnoascus tem potencial como produtores de
compostos antibacterianos ativos em fitopatógenos como as bactérias do gênero
Xanthomonas, especialmente as bactérias causadoras do cancro cítrico, mancha-
bacteriana e bacteriose.
Os 14 isolados selecionados durante esse estudo, embora pertencentes ao
mesmo gênero comportamento diferentes de bioatividade, o que demonstra a
diversidade metabólica das linhagens testadas e reforça a necessidade de estudo
dos micro-organismos que compõem o gênero bem como seus metabólitos. A
aplicação de diferentes condições para o crescimento e produção de metabólitos
pelos fungos como temperatura, meio de cultivo e período de produção dos
metabólitos e o uso de solventes extratores com diferentes características são
variáveis que precisam ser consideradas de forma a otimizar a produção dos
metabólitos secundários ativos. A alteração dessas condições reflete na produção
de diferentes compostos do inicialmente observado, podendo levar a ausência ou
diminuição da quantidade de uma molécula bioativa ou ao aumento da produção de
um determinado composto ou a detecção de moléculas inéditas ou previamente não
observadas em um dado isolado.
62
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Figura 28 – Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas citri subsp. citri (I)
Dados apresentados como porcentagem da média de inibição (n=3) e desvio padrão. Para concentrações onde não ocorreu inibição os dados não são
apresentados.
70
APÊNDICE A
Figura 29 – Dose-resposta dos extratos contra Xanthomonas citri subsp. citri (II)
Dados apresentados como porcentagem da média de inibição (n=3) e desvio padrão. Para concentrações onde não ocorreu inibição os dados não são
apresentados.
71
APÊNDICE B
Dados apresentados como porcentagem da média de inibição (n=3) e desvio padrão. Para concentrações onde não ocorreu inibição os dados não são
apresentados.
72
APÊNDICE C
Dados apresentados como porcentagem da média de inibição (n=3) e desvio padrão. Para concentrações onde não ocorreu inibição os dados não são
apresentados.
73