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5.1. Replicación de retrovirus defectuosos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . 181 5.2. Adenovirus con replicación defectuosa. . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 5.3. Condicionalmente replicar virus
oncolíticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 6. Ventajas
únicas de GDEPT basado en P450. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 182 6.1. Uso de genes humanos P450. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182 6.2. Compatibilidad con profármacos contra el cáncer
establecidos e investigativos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182 7. Entrega de
profármacos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 183 8. Ensayos clínicos de GDEPT basado en P450. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 9. Trabajo futuro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 Agradecimientos . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 183 1. Introducción Muchos medicamentos quimioterapéuticos
convencionales para el cáncer tienen un bajo índice terapéutico debido a la falta de
especificidad hacia tejido tumoral, junto con la toxicidad limitante de la dosis hacia uno o
más tejidos del huésped. En la última década, intensivo se han realizado esfuerzos de
investigación para superar estas dificultades vínculos mediante el desarrollo de nuevos
enfoques terapéuticos de genes utilizando genes supresores de tumores, citoquinas y
linfoquinas para inmunoterapia y genes que codifican la activación de profármaco enzimas
( McCormick, 2001 ). Introducción de un profármaco el gen de activación en las células
tumorales ha demostrado ser un efecto forma efectiva de sensibilizar los tumores hacia la
citotoxicidad contra el cáncer profármacos. Esta terapia profármaco de enzimas dirigida a
genes (GDEPT) hace uso de una enzima de activación de profármaco gen cide para
estimular la bioactivación in situ de profármacos que de otra manera son inactivos ( Dachs
et al., 2005; Aghi et al., 2000; Kirn y otros, 2002 ) La terapia génica de activación de
profármaco es par- muy efectivo cuando la droga activada ejerce una fuerte '' espectador ''
efecto citotóxico, según el cual el metabolito activo es suficientemente lipofílico para
difundirse desde el sitio de su forma- ción, es decir, lejos de las células tumorales que
expresan la pro- gen de activación de drogas, y se extendió por todo el sólido masa
tumoral, lo que amplifica la quimioterapia localizada respuesta peutic ( Denny, 2003 ).
Otras estrategias de terapia génica tegias, como el reemplazo del gen supresor tumoral o
La inactivación de oncogenes usando métodos antisentido, no son típicamente
caracterizado por fuertes efectos espectadores, y por lo tanto, requieren la transferencia
de genes en una fracción muy alta de las células tumorales de un paciente, lo cual es
imposible de lograr utilizando tecnologías de entrega de genes actuales o las que puedan
desarrollarse en los próximos años. Muchos anticancerosos profármacos se han
introducido con el objetivo de aumentar biodisponibilidad o mejora de la administración
local de medicamentos ( Roose- boom et al., 2004 ), y algunos de estos agentes han sido
investigado para su uso en tratamientos GDEPT para el cáncer. Se activa una clase
importante de profármacos contra el cáncer por las enzimas del citocromo P450 (CYP),
que constituyen un gran familia de hemeprotein monooxygenases y jugar un papel clave
en el metabolismo de los fármacos hepáticos. Las enzimas P450 son esencial para la
activación de varios anti- profármacos contra el cáncer, en particular los oxazafosforinas
ciclofosfamida (CPA) e ifosfamida (IFA) ( Sladek, 1988 ), y son particularmente efectivos
cuando se incorporan a una terapia genética suicida para el tratamiento del cáncer ( Wei
et al., 1994; Chen y Waxman, 1995a ) Este artículo revisa estudios recientes sobre el
desarrollo de una activación de profármaco terapia génica basada en el uso de la
activación del profármaco P450 enzimas. El lector también se refiere a varios anteriores
revisiones del trabajo en este campo ( Waxman et al., 1999; Jouna- idi, 2002; Chen y
Waxman, 2002; Chiocca y Waxman, 2004 ). 2. Activación de oxazafosforinas por enzimas
P450 CPA e IFA son agentes alquilantes isoméricos de la oxa- clase de zafosphorine.
Ambos medicamentos son ampliamente utilizados en combinación quimioterapia nacional
para tratar una variedad de neoplasmas. CPA e IFA son profármacos terapéuticamente
inactivos; ambos someterse a una activación metabólica catalizada por hígado específico
enzimas del citocromo P450 (CYP) ( Clarke y Waxman, 1989 ), que convierte los
profármacos inactivos en bioactivos, metabolitos citotóxicos ( Sladek, 1988) ) Ambos
profármacos son metabolizado por las enzimas P450 para producir un derivado 4-hidroxi
tivo, que se equilibra con el aldofos- phamide. Este aldehído, a su vez, se somete a
químicos descomposición para producir una mostaza bifuncional (phosphora- mostaza
mide o ifosphoramida) y acroleína. La mostaza genera una especie de aziridinio altamente
electrofílica que forma enlaces cruzados de ADN, propuestos para ser la clave citotóxica
lesión inducida en tumores tratados con oxazafosforinas ( Sladek, 1988, Fleming, 1997 ).
Alternativamente, el 4-hidroxi metabolito puede ser desactivado por aldehído
deshidrogenasa enzimas para producir carboxifosfamida, una terapéutica metabolito
inactivo ( Sladek, 1999 ). Expresión de células tumorales de estos aldehídos
deshidroactivantes de la oxazafosforina la genasa es un mecanismo importante de
resistencia a esta clase de drogas ( Bunting y Townsend, 1996a, b ). Estudios con
microsomas hepáticos aislados y cDNA- las enzimas P450 expresadas han establecido
que CPA y IFA se activan por múltiples subconjuntos superpuestos de hígado P450s.
Ambas oxazafosforinas son metabolizadas por enzimas constitutivas P450 pertenecientes
al subgrupo CYP2C familia, y por enzimas inducibles por drogas que pertenecen a P450
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subfamilias CYP2B y CYP3A. Estos P450 metabólicos patrones se ven en el modelo de

rata ( Clarke y Waxman, 1989; Weber y Waxman, 1993 ) y en humanos ( Chang et al.,
1993 ) CYP2B1 es el catalizador más activo de CPA 4-hidroxilación en hígado de rata,
mientras que el correspondiente enzima humana, CYP2B6, es el CPA más activo 4-
hidroxilasa en hígado humano. Por el contrario, el hígado humano IFA La 4-hidroxilación
es catalizada principalmente por las enzimas CYP3A, con contribuciones menores hechas
por varios otros CYP enzimas, incluido CYP2B6 ( Roy et al., 1999a ) CYP2B6 y CYP3A4
aparentemente corresponden a la alta K mcom componentes de CPA e IFA 4-
hidroxilación, respectivamente, visto en microsomas hepáticos humanos ( Chang et al.,
1993 ). Siete Las enzimas CYP2C catalizan estas reacciones con una disminución K m
que las enzimas CYP2B y CYP3A ( Chang et al., 1997; Ren et al., 1997 ) y pueden
contribuir a la baja K m actividad oxazafosforina 4-hidroxilasa observada en el hígado
demandar. Ciertas enzimas CYP2B también pueden activar CPA y IFA con un bajo K m ,
como se mostró recientemente para el hígado de perro enzima CYP2B11 ( Chen et al.,
2004) ) Cytochrome P450 catalizar las vías metabólicas para la ciclofosfamida y
ifosfamida se muestran en la Fig. 1 . Aunque CPA e IFA son isómeros químicos, cada
fármaco exhibe un espectro único de actividad antitumoral, toxinas icity y resistencia a los
medicamentos. El CPA se usa comúnmente en tratamiento del cáncer de mama, cáncer
de endometrio, cáncer de pulmón y varias leucemias y linfomas, mientras que IFA es a
menudo se prescribe para el tratamiento de sarcomas de tejidos blandos, cáncer de
mama, ovario y cáncer de mama ( Sladek, 1988; Peters y otros, 1993; Ayash et al., 1992 )
IFA tiene mayor actividad que CPA en varios modelos de tumores experimentales,
produce menos mielosupresión y exhibe poca resistencia en comparación con CPA (
Goldin, 1982) ) Algunos pacientes tratados con IFA desarrollan neurotoxicidad severa (
Thigpen, 1991; Goren et al., 1986 ) y urotoxicidad ( Skinner et al., 1993 ), que han sido
asociados con la formación del cloroacetaldehído vía N- decloroetilación, una alternativa
vía metabólica catalizada por P450 nativa ( Goren et al., 1986; Norpoth, 1976; Lind et al.,
1990 ) ( Fig. 1 ) En el caso de IFA, esta vía alternativa desactiva el medicamento a través
de oxidación de la cadena lateral que produce el inactivo, monofuncional metabolitos
alquilantes 2- y 3-declooetil-IFA, y en al mismo tiempo produce el cloro subproducto
neurotóxico acetaldehído ( Kaijser et al., 1993) ) Este último camino puede consumir hasta
50% de la dosis terapéutica de IFA, mientras que en el caso de CPA generalmente es un
metabolismo menor vía, con solo el 10% del profármaco sometido a N - dechloroethylation
para producir chloroacetaldehyde. Estudios in vitro con microsomas hepáticos humanos
demostraron que CYP3A4 es un importante catalizador de CPA e IFA N- decloroetilación (
Walker et al., 1994 ); sin embargo, CYP2B6 también media una porción sustancial de esta
meta- vía bólica, particularmente en hígados que son altos en CYP2B6 contenido ( Roy et
al., 1999a; Huang et al., 2000a; Roy et al., 1999b ) Experimentos de cultivo celular (
Bruggemann et al., 1997 ) y estudios in vivo ( Borner et al., 2000 ) sugieren que
cloroacetaldehído liberado con N- decloroetilación de IFA puede contribuir a la actividad
terapéutica. los las citotoxicidades de 4-OH-IFA y cloroacetaldehído pueden ser aditivo,
un hallazgo que puede ayudar a explicar la falta de resistencia cruzada entre IFA y CPA y
lo observado diferencias en la respuesta de algunos tumores a estas iso- profármacos
meric ( Brade et al., 1986; Bramwell et al., 1987 ) El metabolismo de los fármacos en el
hígado conduce a la forma sistémica de: mación y distribución de altos niveles de
metalatos alquilantes bolites en pacientes tratados con CPA e IFA. Esto puede llevar a
efectos secundarios graves, incluida cardiotoxicidad, hueso supresión de la médula,
nefrotoxicidad y neurotoxicidad. Otra limitación del tratamiento con oxazafosforina es la
incapacidad inherente de la mostaza fosforamida, la clave metabolito citotóxico
terapéuticamente activo, para cruzar la célula membranas. Dada la corta vida media
intrínseca de 4- CPA / IFA 4-OH-CPA / IFA Phosphoramide Mostaza (citotóxico)
Dechloroethyl-CPA / IFA + Cloroacetaldehído (inactivo) (citotóxico / neurotóxico) +
Acrolein (citotóxico) Carboxifosfamida (inactiva) Inactivación de drogas Activación de
Drogas 4-OH: CPA: CYP2B6 (principal); CYP3A4 (menor) IFA: CYP3A4 (principal);
CYP2B6 (menor) N-deCl: CPA: CYP3A4 (principal); IFA: CYP2B6, CYP3A4 (mayor)
Hidroxilación N-dechloroethylation Fig. 1. P450 cataliza las vías metabólicas de CPA e
IFA. 178 P. Roy, DJ Waxman / Toxicology in Vitro 20 (2006) 176-186

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hidroxiciclofosfamida en plasma ( t 1/2 = 5.2 min) ( Hong et al., 1991 ), una fracción
importante del 4-hidroxi metabolito formado en el hígado es probable que se
descomponga en el torrente sanguíneo a la mostaza fosforamida, que no no ingrese las
células tumorales de manera eficiente. P450 GDEPT apunta a superar estas limitaciones
apuntando a la activación de profármacos P450 genes a las células tumorales, con el
objetivo de inducir local- activación del profármaco intratumoral ( Figura 2 ) 3. Muerte de la
célula tumoral y el efecto espectador En la práctica, solo una pequeña fracción de la
célula tumoral objetivo la población se transduce en una típica transferencia génica in vivo
estudiar. Un fuerte efecto citotóxico espectador es por lo tanto requerido si la regresión
tumoral significativa y las clínicas duraderas las respuestas cal se deben lograr. En el
caso de GDEPT utilizando la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV- TK) gen y
el profármaco ganciclovir, el fármaco activo metabolito es un análogo de nucleósido
fosforilado, que no cruza fácilmente las membranas celulares. En consecuencia, el el
efecto espectador es bastante limitado, y depende de contacto directo, mediado por
uniones gap entre HSV- Célula donante que expresa TK y el transeúnte (receptor) célula
tumoral ( Nicholas et al., 2003 ). Por el contrario, en el caso de P450 GDEPT usando CPA
e IFA, hay un fuerte efecto espectador mediado por células permeables, citotóxicas 4-
metabolitos hidroxi generados por la expresión de P450 células tumorales ( Chen y
Waxman, 1995a ). Esto permite metabolitos activos de CPA e IFA para difundir dentro de
un masa de células tumorales y para alquilar tanto en división como en reposo Células
cancerígenas. IFA y CPA exhiben actividades citotóxicas únicas. 4-OH- IFA muestra una
citotoxicidad intrínseca mucho más baja que 4-OH-CPA en muchas líneas de células
tumorales ( Jounaidi y otros, 1998; Jounaidi y Waxman, 2004 ). Esto puede estar
relacionado a la naturaleza distinta de los enlaces cruzados de ADN inducidos por cada
droga: enlaces cruzados de siete átomos están formados por IFA vs. enlaces cruzados de
cinco átomos por CPA. Otra diferencia puede se relacionan con el mecanismo de muerte
celular desencadenado por cada droga. 4-OH-CPA induce la apoptosis ( Schwartz y Wax-
hombre, 2001 ), mientras que se informa que 4-OH-IFA induce necrosis Karle et al., 2001
) o apoptosis ( Schwartz y Waxman, 2001 ) Es probable que estas respuestas no afecten
solo la citotoxicidad inherente de cada medicamento, pero también la efecto de
espectador y respuestas inmunes antitumorales. Tumor la muerte celular por necrosis
puede desencadenar inflamación local y respuesta inmune rápida, mientras que la
apoptosis puede inducir la formación de cuerpos apoptóticos encerrados en la membrana
que son fagocitados por macrófagos o células espectadores y son no inmunogénico
Muerte celular tumoral apoptótica mediada por CPA activado por P450 se modula por el
equilibrio entre la expresión de factores apoptóticos y antiapoptóticos como Bcl-2, que
puede ser un factor determinante nante de la respuesta tumoral tanto en terapia y en
GDEPT mediado por P450 usando CPA ( Sch- Wartz y Waxman, 2001 ). Como se indicó
anteriormente, el efecto espectador de P450-activado CPA e IFA no involucran los
metabolitos de mostaza, que no se difunden fácilmente a través de las membranas
celulares, pero es mediado por otros metabolitos, como 4-OH-CPA y 4- OH-IFA,
aldofosfamida y tal vez el citotóxico subproductos de cloroacetaldehído y acroleína.
Difusión de estos metabolitos reactivos de su sitio de formación dentro de las células
tumorales puede, sin embargo, estar seriamente limitado por la expresión de enzimas y
otros factores que inactivan estos metabolitos y confieren resistencia a los medicamentos,
incluidos ciertas aldehído deshidrogenasas ( Sladek, 1999 ), glutatión una S-transferasas
y glutatión ( Chen y Waxman, 1995b ), que puede metabolizar y, por lo tanto, inactivar
estos metabolitos citotóxicos. La resistencia a oxazafosforina puede ser minimizado por el
tratamiento con inhibidores de molécula pequeña de aldehído deshidrogenasas ( Sladek,
1999; Quash y otros, 2002 ) o dirigiéndose a la aldehído deshidrogenasa utilizando anti-
secuencias de sentido ( Moreb et al., 2000 ) Si esta inhibición se puede lograr de manera
selectiva de células tumorales in vivo, la exposición efectiva de las células tumorales a
metabocitos citotóxicos las lites se incrementarían y un efecto espectador más fuerte se
obtendría Muerte de células tumorales inducida por P450-acti- el CPA cerrado es un
proceso relativamente lento, que requiere 2- 3 días para manifestarse completamente (
Schwartz y Waxman, 2001 ) Durante este tiempo, la producción de transeúntes citotóxicos
metabolitos continúa, aunque a un ritmo reducido como las células entrar en apoptosis (
Schwartz et al., 2003 ). 4. Estrategias para mejorar P450 GDEPT Se han investigado
varias estrategias para mejorar la efectividad de P450 GDEPT. En un enfoque, NADPH-
La reductasa P450 se coexpresa con el gen P450 para aumentar actividad metabólica
P450. En un segundo enfoque, el el equilibrio de la activación del profármaco se desplaza
del hígado a el tumor, en un esfuerzo por aumentar la activación del profármaco in situ y
de ese modo aumentar la muerte celular tumoral, mientras que al mismo tiempo
disminuyendo la producción hepática y la liberación sistémica de los metabolitos tóxicos
de la célula huésped. Finalmente, en un tercer enfoque, CPA Hígado (P450) Metabolitos
citotóxicos (Circulación sistemica) Células huésped Células tumorales Células huésped
Tumor P450 / RED Replicación del virus oncolítico CPA Citotoxicidad del espectador
Aumento de la eficacia Localizado entrega P450 + ROJO Entrega sistémica Eficacia
reducida Aumento de la toxicidad Toxicidad reducida Quimioterapia convencional GDEPT
basado en P450 Profármaco portador de virus activar genes P450 TUMOR Fig. 2.
Beneficio terapéutico propuesto de GDEPT basado en P450 comparado a la
quimioterapia convencional. RED, P450 reductasa. P. Roy, DJ Waxman / Toxicology in
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un factor anti-apoptótico que retrasa, pero no bloquea la apoptosis de células tumorales

se puede introducir junto con la gen terapéutico P450 para aumentar la producción de los
metabolitos citotóxicos espectadores. 4.1. NADPH-P450 reductasa como adyuvante para
la terapia génica P450 Todas las reacciones de monooxigenasa P450 microsomal
requieren dos componentes distintos de la enzima, la flavoproteína NADPH-citocromo
P450 reductasa (reductasa P450) y el citocromo P450 que contiene hemo. Reducción
P450 tase, una flavoenzima que contiene FAD y FMN, cataliza la transferencia de dos
electrones de NADPH al P450 hemoproteína, y es un componente limitante de la reacción
monooxigenasa global. Estudios iniciales usando GDEPT basado en P450 se basaba en
la premisa de que P450 la transferencia del gen de la reductasa es innecesaria, ya que la
reducción del P450 tse es ubicuo en casi todos los tipos de células de mamíferos,
incluyendo ing un amplio rango de células tumorales humanas ( Yu et al., 2001 ) Estudios
posteriores revelaron, sin embargo, que la sobreexpresión de reducción de P450
reductasa conduce a un aumento sustancial en Chemosensitivity dependiente de P450 al
CPA, ambos in vitro e in vivo ( Chen et al., 1997 ) En células de gliosarcoma 9L de rata
transducido con cDNA que codifica CYP2B1 de rata ( Chen et al., 1997 ) o CYP2B6
humano ( Jounaidi et al., 1998) ), P450 la actividad metabólica y la citotoxicidad asociada
se aumentó de manera significativa con la coexpresión de la reductasa P450. La
reductasa P450 aumenta la producción y liberación de activos metabolitos de CPA con
bote, que conducen a un espectador más fuerte efecto. Esto se ejemplificó en un estudio
de escisión tumoral utilizando ing 9l gliosarcoma células, donde un 50-100 veces general
aumento en la muerte de células tumorales se observó por coexpresión de P450 con
reductasa P450 ( Chen et al., 1997) ) El efecto La efectividad de la coexpresión de la
reductasa P450 parece ser más fuerte cuando se expresa el cDNA para P450 reductasa
junto con el ADNc P450 como ARNm bicistrónico vinculado por un IRES (señal de entrada
interna del ribosoma) secuencia ( Jounaidi y Waxman, 2004) ) Por lo tanto, a pesar la
expresión ubicua de P450 reductasa en células tumorales, La activación y la citotoxicidad
del profármaco dependiente de P450 pueden ser aumentado por la suplementación de la
reductasa P450, proporcionando una forma simple de aumentar la eficacia de P450
GDEPT. los Las secuencias de ADN de P450 y P450 reductasa también pueden ser
expresado como una secuencia de codificación única que genera un Proteína de fusión
P450-P450 reductasa ( Tychopoulos y otros, 2005 ) 4.2. Inhibición selectiva del
profármaco catalizado por P450 del hígado activación Esfuerzos para suprimir el
metabolismo del P450 hepático en una manera de usar drogas antitiroideas, como
propiltioura- cil ( Ross et al., 1995 ) y metimazol ( Waxman et al., 1989 ), han sido
descritos. Estas drogas inhiben la hepática La transcripción de P450 reductasa y, por lo
tanto, disminuye la hepática La actividad y la proteína P450 reductasa, que a su vez
presiona la actividad metabólica general de P450. En estudios realizados en el modelo de
rata, el tratamiento con metimazol disminuyó expresión de la reductasa P450 hepática en
aproximadamente un 75% sin afectando el nivel de P450 reductasa expresada en 9L
gliosar- comas. Esto condujo a un aumento en el tumor inducido por CPA retraso del
crecimiento en xenoinjertos tumorales 9L que expresan CYP2B1 y P450 reductasa,
consistente con un aumento en la división del metabolismo del CPA del hígado al tumor (
Huang et al., 2000b ). Un beneficio adicional de esto enfoque es que el medicamento
antitiroideo metimazol moderado ates varias de las toxicidades sistémicas que
acompañan a CPA tratamiento. Además, el metimazol exhibe algunos intrínsecos
actividad contra el cáncer sic, independiente de CPA. En un enfoque alternativo para
suprimir el hígado pero no actividad de P450 asociada a células tumorales, 1-amino
benzotriazol (ABT), un sustrato suicida para múltiples P450 hepática enzimas, se examinó
por su capacidad para suprimir selectivamente hígado CPA 4-hidroxilación ( Huang y
Waxman, 2001) ) En ratas a las que se administró ABT in vivo, seguido de tratamiento
con CPA, ABT indujo una disminución de 4 veces en C max y un aumento de 7 veces en
la vida media aparente de 4-hidroxi-CPA, coherente con existiendo una inhibición
sustancial de la metaplasia hepática de CPA bolis Sin embargo, el área bajo la curva
(AUC) para 4- El OH-CPA solo se redujo en un 50%, lo que indica que fracción sustancial
de CPA todavía se metaboliza por el 4- vía de hidroxilación en los animales tratados con
ABT, aunque a un ritmo más lento que en ausencia de ABT. Por otra parte, no aumento
en el retraso del crecimiento tumoral dependiente de CPA y P450 se observó en un
xenoinjerto de gliosarcoma 9L / P450 2B1 modelo, lo que sugiere que el tratamiento ABT
in vivo no aumentar la proporción de partición tumor / hígado para metabo- CPA lismo (
Huang y Waxman, 2001 ) Lo más probable es que ABT lo haga no tener suficiente
selectividad de forma P450 para lograr el especificidad deseada de inhibición de P450 en
hígado in vivo. Un más se necesita una investigación sistemática para identificar
inhibidores que son realmente selectivos y se pueden usar para inhibir la acción
profiláctica vación en el hígado sin inhibir la activación del profármaco catalizado por un
transgén P450 expresado en células tumorales. 4.3. Uso de factores antiapoptóticos para
retrasar la muerte celular tumoral 4-Hydroxy-CPA induce la muerte de células tumorales
por un meca- nismo que involucra la transición mitocondrial estimulada por daño en el
ADN inducido por medicamentos seguido de la activación de la vía apoptótica
dependiente de caspasa 9 ( Schwartz y Waxman, 2001 ). Esta vía de muerte celular está
bloqueada en células tumorales que sobreexpresan el anti-apop mitocondrial factor tic
Bcl-2, que inhibe la liberación de citocromo C de las mitocondrias y por lo tanto confiere
resistencia a los medicamentos a células tumorales tratadas con CPA. Por el contrario,
cuando la caspase La ruta 9 está bloqueada en células tumorales que expresan P450 en
un paso que está abajo del paso crítico de mitochon- transición drial / liberación de
citocromo C, célula inducida por CPA la muerte se retrasa pero, en última instancia, no
está bloqueada ( Schwartz) et al., 2002 ) Por lo tanto, no se requiere activación de
caspasa para CPA para inducir la muerte de células tumorales. Aunque el uso de factores
proapoptóticos, tales como Bax, p53 y diversos 180 P. Roy, DJ Waxman / Toxicology in
Vitro 20 (2006) 176-186

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ases, para estimular que las células tumorales sufran apoptosis se presiona muchos
laboratorios en terapias génicas diseñado para mejorar la muerte de células tumorales,
esta estrategia no es adecuado para GDEPT ( Waxman y Schwartz, 2003 ) En el caso de
la terapia génica de activación de profármacos, como P450 GDEPT, cualquier aceleración
de la muerte apoptótica de un célula tumoral transducida con una enzima activadora de
profármaco disminuirá la formación neta de metabolitos activos de drogas. Esto, a su vez,
comprometerá el efecto espectador que es fundamental para el éxito de la estrategia
global GDEPT. Estudios recientes demuestran, sin embargo, que el antiapoptótico los
factores se pueden combinar con P450 GDEPT para prolongar la longevidad de las
células tumorales activadoras de profármaco. En particular, la expresión retroviral de la
inhibición de pan-caspasa se demostró que p35 p35 retrasa sustancialmente la muerte de
Células tumorales que expresan P450 tratadas con CPA, por lo tanto aumentar la muerte
de espectadores por el profármaco activado por P450. Por otra parte, la introducción de
p35 retrasó, pero no lo hizo bloquear por completo, la muerte definitiva de las células
tumorales ( Schwartz y otros, 2002 ) La inhibición de la caspasa-dependiente dent
apoptosis en células tumorales que expresan p35 puede desencadenar las células
tumorales a someterse a muerte celular necrótica en respuesta al tratamiento con CPA,
en lugar de muerte apoptótica en respuesta al tratamiento de CPA, y esto puede mejorar
potencialmente los sis- actividad espectadora temic (basada en el sistema inmune) (
Waxman y Schwartz, 2003 ) 5. Vectores para la administración del profármaco que activa
los genes P450 Los vectores utilizados para la administración de genes son
fundamentales para el éxito proceso de cualquier estrategia de terapia genética. En el
caso de P450 y otros genes de activación de profármaco, expresión génica en el tumor
debe ser lo suficientemente alto como para generar una intratumoral nivel de metabolitos
activados que es suficiente para inducir muerte de células tumorales y muerte celular de
células tumorales eficientes. Se han investigado tanto vectores virales como no virales y
han mostrado diversos grados de éxito en P450 GDEPT aplicaciones. 5.1. Replicación de
retrovirus defectuosos Los retrovirus con replicación defectuosa son atractivos para la
terapia de genes cer debido a su selectividad intrínseca para división de poblaciones de
células. CYP2B1 y CYP2B6 han sido utilizado en vectores retrovirales ecotrópicos para
transducir varios líneas celulares de tumores de roedores ( Wei y otros, 1994; Jounaidi y
otros, 1998 ). Los vectores retrovirales que llevan un ADNc P450 pueden ser directamente
inyectado en masas tumorales sólidas, lo que lleva a expresarse sion de CYP2B6 y una
respuesta antitumoral inducida por CPA ( Kan et al., 2001 ). Los retrovirus presentan
varios desafíos eso puede limitar su utilidad final en aplicaciones P450 GDEPT cationes
en la clínica. Estos incluyen: (1) la dificultad de obtener altos títulos virales, lo que puede
traducirse en un bajo eficacia de transducción y requieren tratamientos repetidos con
retrovirus in vivo para lograr un nivel suficiente de trans- expresión y eficacia génica; (2) el
riesgo de infección retroviral en las células de la línea germinal, lo que puede conducir a la
oncogénesis ( Yi et al., 2005 ); y (3) la restricción de la infección viral a replicación de
células tumorales. Este último problema puede ser dirigido utilizando vectores lentivirales
para la entrega de genes a tanto células tumorales replicantes como no replicantes. 5.2.
Adenovirus defectuosos de replicación Los genes adenovirales E1A y E1B son necesarios
para la replicación viral, y la eliminación de estos genes genera una vector adenoviral
defectuoso de replicación. Distinta ventaja de adenovirus con replicación defectuosa para
gen incluyen: (1) su capacidad para infectar ambos rápidamente células tumorales en
división y en reposo; (2) el ADN viral no no integrarse en el ADN cromosómico del
huésped, eliminando el riesgo de mutagénesis insercional asociada a la retrovi artimañas;
y (3) los adenovirus se pueden producir fácilmente en grandes cantidades y en títulos
altos. Un transgen P450 puede ser incorporado en el genoma adenoviral bajo el trol de un
fuerte promotor viral, por ejemplo, el citomegalovirus promotor, para garantizar una fuerte
expresión en una amplia gama de células tumorales El adenovirus defectuoso de
replicación ha sido utilizado para entregar genes P450 en una variedad de líneas
celulares humanas ( Chen y otros, 1996 ) Un serio inconveniente, sin embargo, es que
partículas adenovirales se eliminan rápidamente de la circulación y provocar una fuerte
respuesta inmunogénica innata, que limita la oportunidad para la administración repetida
del virus ( Muruve, 2004 ). Varias estrategias se están desarrollando para superar esta
dificultad, incluidos los avances en vectores para- (p. ej., PEGilación para enmascarar
episodios virales inmunogénicos topes), el uso de serotipos adenovirales alternativos y la
ingeniería de vectores adenovirales dependientes de ayuda con deleciones de porciones
altamente inmunogénicas de la gen ome. Vectores adenovirales con cápside
genéticamente modificada las proteínas también se han desarrollado para eludir el
requisito para el receptor coxsackie-adenovirus para virus entrada, en vista de los bajos
niveles de esta proteína receptora encontrado en muchas células tumorales ( Kanerva y
Hemminki, 2004 ). 5.3. Condicionalmente replicar virus oncolíticos Los virus que replican
células tumorales han sido diseñados para facilitar la entrega selectiva de genes a células
malignas in vivo. Estos virus generalmente tienen la capacidad de lisar las células en que
replican, proporcionando un agregado terapéutico ventaja, de ahí su designación como
virus oncolíticos ( Everts y van der Poel, 2005; Lin y Nemunaitis, 2004 ). Los virus
Oncolytic se pueden diseñar de varias maneras. Un enfoque implica la eliminación de
genes virales requeridos para la replicación en células normales pero no en células
tumorales. Un pozo- ejemplo estudiado es el adenovirus replicante designado Onyx-015,
que tiene una eliminación del adenovirus E1B- Gen de 55 kDa ( Cohen y Rudin, 2001) )
Normalmente, el La proteína E1B-55kDa inactiva el pro- cesador de supresores de
tumores tein p53, que previene las células infectadas por adenovirus de activar la
respuesta apoptótica dependiente de p53 que sirve para limitar la replicación viral. En
consecuencia, cuando P. Roy, DJ Waxman / Toxicology in Vitro 20 (2006) 176-186 181

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las células huésped normales están infectadas con el virus Onyx-015, el la respuesta
apoptótica dependiente de p53 se activa y el huésped la célula se mata antes de la
replicación viral. Como resultado de esto respuesta, los tejidos del huésped no pueden
soportar una infección sostenida por Onyx-015. Por el contrario, las células tumorales
deficientes en una función vía p53 tional no sufren apoptosis dependiente de p53 y es
compatible con la replicación Onyx-015 y viral untado ( McCormick, 2003; Bischoff y otros,
1996 ). Casi El 90% de los tumores humanos son deficientes en p53 o en p53 función.
Como resultado, Onyx-015, o el relacionado Onyx-017 (E3-wild-type y E1B-55kDa-
deleted) ( Jounaidi y Waxman, 2004 ) se puede utilizar para entregar genes P450 a un
amplia gama de células tumorales humanas. El gen P450 puede ser incorporado
directamente en el genoma de la replicación adenovirus, o alternativamente, puede
administrarse a través de un segundo y adenovirus con replicación defectuosa que se
inyecta junto con el virus replicante. En esta última estrategia, el virus replicante sirve
como un virus auxiliar que co-amplifica fies y facilita la propagación de la célula tumoral de
la replicación virus P450 defectuoso ( Jounaidi y Waxman, 2004 ) Ensayos clínicos que
usan el adenovirus oncolítico Onyx-015 han demostrado seguridad sin aparente limitación
de dosis toxicidad. Se observa actividad anticancerosa superior cuando esto virus se
combina con la quimioterapia basada en cisplatino en xenoinjertos de tumores humanos (
Nemunaitis et al., 2001) ) Un segundo ejemplo de onco- condicionalmente replicativo el
virus lítico es el virus del herpes simple con una eliminación del virus gen ribonucleótido
reductasa. Este último gen es esencial para la replicación viral en células que no se
dividen. Inserción de la ADNc de CYP2B1 en lugar de la ribonucleótido reductasa gene
genera un vector viral oncolítico replicante, designado nated rRp450 ( Chase et al., 1998 ).
Este virus muestra bienactividad preclínica P450 GDEPT cuando se utiliza en
combinación con CPA para tratar gliomas, carcinomas hepatocelulares y metástasis
hepáticas ( Aghi et al., 1999; Pawlik et al., 2000; Pawlik et al., 2002 ) Es importante
destacar que el tratamiento de CPA tiene efecto real en la replicación de este virus. Este
virus dis- juega un alto grado de selectividad tumoral y mejora efectividad terapéutica (
Pawlik et al., 2000 ) Es probable que la replicación de un virus lítico en los tejidos del
huésped inducir toxicidad seria en el huésped y potencialmente ser letal para el paciente
En consecuencia, es esencial para el ingeniero salvaguardias apropiadas en cualquier
vector viral replicante para prevenir la infección sistémica Se proporciona un buen ejemplo
por el virus de herpes replicante rRp450, que conserva el gen endógeno de la timidina
quinasa del virus del herpes, y consecuentemente con frecuencia, la replicación de este
virus puede ser fuertemente inhibida por el profármaco ganciclovir. Cualquier replicación
viral de la célula huésped por lo tanto, puede bloquearse mediante tratamiento con
ganciclovir una vez que se completa la terapia profármaco dependiente de P450. Gene la
terapia que usa este virus puede llevarse a cabo usando un combinación de dos
profármacos, CPA y ganciclovir. Otra estrategia que puede explotarse para P450 GDEPT
es utilizar reguladores de ADN específicos de células tumorales elementos, tales como
secuencias promotoras y potenciadoras, para impulsar la expresión de los genes virales
necesarios para la replicación resultando en la replicación del virus específico del tumor (
Saukkonen y Hemminki, 2004 ). Esta estrategia ha sido implementada usando el promotor
de antígeno específico de prostrate para regular la expresión de adenovirus E1 genes de
una manera que limita la replicación viral a la próstata ( Chen y otros, 2001 ) Otros han
utilizado el gen regulador de alfa-fetoproteína secuencias para lograr la replicación
selectiva en hepatocelular células de carcinoma ( Hallenbeck et al., 1999) ) Estas
estrategias imparten una especificidad tumoral sustancial, pero pueden no eliminar nate
replicación viral basal en tejidos no diana. 6. Ventajas únicas de GDEPT basado en P450
A continuación se comentan varias ventajas que P450 GDEPT tiene más de otros
sistemas activadores de profármacos. 6.1. Uso de genes humanos P450 GDEPT basado
en P450 usando el gen CYP2B1 de rata tiene demostrado mejorar la selectividad y la
citotoxicidad de profármacos de oxazafosforina en una variedad de roedores y modelos
de tumores humanos ( Wei y otros, 1994; Chen y Waxman, 1995a; Chen et al., 1997,
1996 ) Jounaidi et al. después estableció la viabilidad de usar genes humanos P450 para
GDEPT, que incluye CYP2B6 y CYP3A4 ( Jounaidi) et al., 1998 ) El uso de genes P450
humanos puede limitar la potencial de respuestas inmunes del huésped contra un
profármaco enzima de activación de origen extranjero. Muchos otros ampliamente las
enzimas GDEPT usadas son de origen no mamífero, incluyendo el sistema viral HSV-TK,
citosina deaminasa de bacterias y hongos, y las enzimas bacterianas carboxipeptidasa G2
y nitrorreductasa ( Kirn et al., 2002 ) 6.2. Compatibilidad con establecido e investigativo
profármacos contra el cáncer GDEPT basado en P450 se puede aplicar a una amplia
gama de profármacos anti-cáncer P450. P450 GDEPT fue originalmente desarrollado
para su uso con los profármacos de oxazafosforina CPA e IFA, que son ampliamente
utilizados en la clínica y tienen farmacocinética y farmacodinámica bien establecidas
propiedades ( Fleming, 1997; Moore, 1991) ) Investigacional Profármacos P450, como
MMDX, un metoximorfolina derivado de doxorrubicina ( Quintieri et al., 2000; Lu y
Waxman, 2005 ) y los profármacos bioreductivos AQ4N ( McErlane y otros, 2005;
McCarthy et al., 2003 ) y tirapaz- amina ( Jounaidi y Waxman, 2000 ) son candidatos
paradesarrollo adicional de GDEPT basado en P450. Varios otros medicamentos
comunes contra el cáncer que son biotransformados por Las enzimas P450 a metabolitos
más activos también son potenciales candidatos para GDEPT basado en P450 ( Chen y
Waxman, 2002 ) Estos incluyen thio-TEPA, que se activa por Desulfuración oxidativa
mediada por CYP2B ( Ng y Wax- hombre, 1990 ); etopósido (VP-16), que se metaboliza a
catecol reactivo mediante reacción de O-desmetilación mediada por P450 ción ( van
Maanen et al., 1987; Relling et al., 1992) ) y tamoxifeno, que es convertido por P4502D6
en 4-hidroxi- 182 P. Roy, DJ Waxman / Toxicology in Vitro 20 (2006) 176-186

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tamoxifeno ( Dehal y Kupfer, 1997 ), mucho más potenteanti-estrógeno que el

medicamento original ( Borgna y Rochefort, 1981 ). 7. Entrega de profármacos La entrega
del profármaco localizado se puede usar potencialmente para aumentar la especificidad
tumoral de P450 GDEPT mientras minimizando la toxicidad del anfitrión. En un estudio,
profármaco localizado la entrega se logró usando un dispositivo controlado por CPA
liberación de polímero implantado en un tumor subcutáneo sólido masa. Un aumento de
250 veces en el nivel intratumoral de 4-hydroxy-CPA se logró en comparación con
intraperitoneal La administración de CPA ( Ichikawa et al., 2001) ), con una correlación un
aumento espontáneo en el efecto antitumoral. En otro estudio, el cronograma de la
administración del CPA demostró ser crítico ical determinante de la efectividad terapéutica
de P450 GDEPT. Administración de CPA en una repetición de 6 días ÕmetronomicÕ
horario ha demostrado inducir un fuerte respuesta anti-angiogénica ( Browder et al., 2000
) Aplica- de este cronograma de tratamiento con CPA a tumores que expresan La
regresión extensa inducida por CYP2B6 y P450 reductasa llevando a la erradicación de
tumores pequeños y grandes con toxicidad mínima del huésped ( Jounaidi y Waxman,
2001 ) La regresión tumoral, pero no la erradicación tumoral, se observó cuando se aplicó
el mismo cronograma de tratamiento de CPA a tumores deficientes en P450. 8. Ensayos
clínicos de GDEPT basado en P450 Varios ensayos clínicos iniciales que utilizan la base
P450 La estrategia GDEPT ha sido reportada. En una clínica de fase I / II ensayo clínico
realizado en Alemania, 14 pacientes con inopera- carcinoma pancreático ble se les
administró celulosa cápsulas de sulfato que contienen células que fueron diseñadas para
expresar CYP2B1, seguido de tratamiento con IFA. El polímero las células encapsuladas
se introdujeron directamente en la vasculatura lature que conduce al tumor, en un
esfuerzo por lograr un alto concentración localizada de la enzima P450 activadora de IFA
( Lohr y otros, 2001, 2003 ) El protocolo de tratamiento estuvo bien tolerado y buenas
indicaciones de eficacia se obtuvieron: de los 14 pacientes sometidos a tratamiento, 2
mostraron parcial remisión y 11 tenían enfermedad estable, es decir, sin tumor adicional
crecimiento. Por otra parte, un aumento de tres veces en un año sur- se informó sobre la
supervivencia en comparación con los controles históricos. Los datos obtenidos en esta
pequeña fase de ensayo clínico I / II son prometedores e indican que los ensayos clínicos
adicionales que involucran a número de pacientes están garantizados Un ensayo clínico
por separado, patrocinado por Oxford BioMedica en el Reino Unido, utilizó un vector de
administración de genes retrovirales que codifica CYP2B6, designado MetXia ( Kan et al.,
2001 ). Resultados de una prueba inicial de Fase I / II de MetXia en pacientes con cáncer
de mama avanzado o indicios de melanoma que el producto era seguro y que la
administración de genes era fácil detectado en los tumores tratados ( Caza, 2001 )
Además beneficio clínico asociado con un aparente antitumoral respuesta inmune se
observó en un subconjunto de los pacientes tratados ( Kan et al., 2002; Braybrooke et al.,
2005 ) Si el sistémico las respuestas inmunitarias antitumorales observadas en estos
estudios son firmes, vectores como MetXia pueden ser potencialmente útiles para el
tratamiento de una amplia gama de tumores sólidos, potencialmente incluida la
enfermedad metastásica diseminada. Un seguimiento Fase I / II de prueba en pacientes
con cáncer de mama, melanoma y el carcinoma de células uretrales se ha llevado a cabo,
con el resultados que confirman la seguridad y la actividad inmune antitumoral visto en la
prueba inicial, estableciendo así una prueba de concepto para este enfoque. 9. Trabajo
futuro GDEPT basado en P450 se ha convertido en un gen prometedor terapia de
activación de profármacos basada en el tratamiento del cáncer. Esta terapia se puede
probar fácilmente en la clínica en combinación nación con profármacos
quimioterapéuticos establecidos y puede conducir a respuestas terapéuticas mejoradas.
Preclínico estudios, tanto in vitro como in vivo, han demostrado la potencial de esta
estrategia, y los ensayos clínicos recientes con fuerza apoyar su utilidad clínica como un
adyuvante para los convencionales quimioterapia. En el futuro, la efectividad de P450
GDEPT puede aumentarse aún más utilizando vectores mejorados para la administración
del gen P450 y promotores dirigidos a la enfermedad para expresión de genes enfocados
en el sitio objetivo. Además, hay es el potencial para diseñar P450 modificado
específicamente para el sitio enzimas que muestran una cinética enzimática mejorada con
profármaco sustratos ( Chen et al., 2004) ) Novela P450 prodrug sub- strates también
pueden ser desarrollados. Tratamientos combinados basado en una terapia basada en
P450 junto con radiación, terapias antiangiogénicas, terapia con citocinas u otras Las
estrategias GDEPT también pueden ser visualizadas y mantener ise para futuras
investigaciones y desarrollo. Expresiones de gratitud Los autores desean agradecer a
Nayra Gad y Mary Penwarden por proporcionar asistencia excelente durante la
preparación de este manuscrito Apoyado en parte por la concesión CA49248 del NIH (a
DJW) Referencias Aghi, M., Chou, TC, Suling, K., Breakefield, XO, Chiocca, EA, 1999.
Tratamiento de cáncer multimodal mediado por un virus oncolítico replicante que
administra oxazafosforina / citocromo de rata P450 2B1 y terapias con gen de timidina
quinasa del ganciclovir / herpes simplex. Cancer Res. 59, 3861-3865. Aghi, M., Hochberg,
F., Breakefield, XO, 2000. Activación del profármaco enzimas en la terapia génica del
cáncer. J. Gene. Medicina. 2, 148-164. Ayash, LJ, Wright, JE, Tretyakov, O., Gonin, R.,
Elias, A., Wheeler, C., Eder, JP, Rosowsky, A., Antman, K., Frei, Ed, 1992.
Farmacocinética de ciclofosfamida: correlación con toxicidad cardíaca y respuesta tumoral
J. Clin. Oncol. 10, 995-1000. Bischoff, JR, Kirn, DH, Williams, A., Heise, C., Horn, S.,
Muna, M., Ng, L., Nye, JA, Sampson-Johannes, A., Fattaey, A., McCormick, F., 1996. Un
mutante de adenovirus que se replica selectivamente en p53- células tumorales humanas
deficientes. Science 274, 373-3