Práctico de Introducción a las Ciencias Biológicas 2018

Módulo: Diseño Experimental. Fermentación de diversos sustratos por levaduras

I) Resumen

En este práctico de laboratorio se pretende introducir a la biología como ciencia

experimental, y acercar al estudiante al diseño experimental. Para ello usted dispondrá de cierta
información acerca de la capacidad de la levadura de panificación comercial, Saccharomyces
cerevisiae, de fermentar determinados sustratos. A partir de esta información se plantearán
determinadas hipótesis de trabajo, de las cuales cada subgrupo trabajará sólo con una.

II) Objetivos

1. Diseñar y realizar los experimentos que permitan validar, reformular o desechar la hipótesis
de trabajo elegida.
2. Ser capaz de expresar los resultados obtenidos de manera clara y concisa (por ej. con
gráficos).
3. Analizar racionalmente los resultados obtenidos, compararlos con datos de la literatura o de
experimentos control. A partir de este análisis establecer conclusiones en cuanto a la
hipótesis original planteada. Sugerir, eventualmente, nuevas hipótesis de trabajo.
4. Elaborar un informe sobre las actividades realizadas, incluyendo los resultados obtenidos y
las conclusiones a las que se llegó.
5. Entender cómo se usa una observación con un microscopio para calcular el tamaño real del
objeto en observación.

III) Evaluación
En esta instancia, la evaluación será grupal, a través de la entrega de un informe de
laboratorio. Sin embargo, la calificación de este podrá ser ponderada por una valoración conceptual
del docente, la cual tendrá carácter individual, y se basará en el desempeño general del estudiante
durante la práctica y la presentación y discusión de los resultados obtenidos.

IV) Conocimientos previos al práctico

Es importante que Ud. lea y comprenda el material de este repartido antes de asistir al
laboratorio. Asimismo, deberá leer el repartido “EL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO”. Deberá
entender cómo funciona el “fermentómetro”, dispositivo que utilizaremos en este práctico, y tener
presente las principales rutas metabólicas que las células utilizan para obtener energía (glucólisis,
respiración y fermentación). Repase entonces el tema metabolismo; para ello puede recurrir al
teórico de Introducción a las Ciencias Biológicas I (Unidad 3) y a la siguiente bibliografía de apoyo:
Alberts y otros. Introducción a la Biología Celular. Barcelona: Ediciones Omega S.A., 1999, Capítulo
4 y Purves y otros. Life. The Science of Biology, 5th edition. Massachusetts: Sinauer Associates, 1999,
Capítulo 7. También puede serle útil repasar los conceptos de cinética de reacción (Química, 8ª ed.
Whitten et al. 2008. Págs. 604-651. Cengage Learning).
Por otro lado, para preparar el informe a entregar en la clase 2, puede utilizar cualquiera de
los libros de Bioquímica disponibles en biblioteca.

Página 1 - Módulo Diseño Experimental de ICB II - Práctico

V) Introducción

Breve repaso de metabolismo

Las células precisan de un aporte constante de energía para generar y mantener el orden
biológico que las mantiene vivas. Esta energía deriva de la energía de enlaces químicos de
moléculas, que sirven de esta forma como nutrientes a la célula. Un ser vivo extrae energía, átomos
y poder reductor de los nutrientes mediante diferentes rutas metabólicas. Esta energía, átomos y
poder reductor son a su vez utilizadas para sintetizar nuevas moléculas que la célula precisa.
Dentro de las moléculas de nutrientes, un grupo muy importante son los azúcares. Las plantas
sintetizan sus propios azúcares mediante la fotosíntesis (son autótrofos), mientras que las células
animales obtienen los azúcares y otras moléculas alimentándose de otros organismos (son
heterótrofos) (Figura 1). Las proteínas, los lípidos y los polisacáridos, que constituyen la mayor parte
de los alimentos que ingerimos, deben ser hidrolizados a moléculas más pequeñas para poder ser
utilizados por nuestras células. Esta primera etapa de rotura enzimática de las moléculas de
alimentos a los monómeros que las constituyen es la digestión, y se da en el exterior celular, o en
un organelo especializado, el lisosoma. De esta forma, los polisacáridos son degradados a azúcares,
las grasas a ácidos grasos y glicerol, y las proteínas a aminoácidos, pudiendo entrar así al citosol
donde son posteriormente metabolizadas o utilizados.

Figura 1: Formas de obtención de energía por parte de los organismos (de Purves et al., 1998).

Página 2 - Módulo Diseño Experimental de ICB II - Práctico

 Una vez en el interior celular, las moléculas de glucosa son degradadas por glucólisis (o vía
glucolítica). Cada molécula de glucosa es degradada a dos moléculas de piruvato. La glucólisis es la
vía principal de degradación de la glucosa para la mayoría de los organismos, incluido
Saccharomyces cerevisiae, la levadura de panificación, que es el organismo que utilizaremos en este
práctico. El piruvato así formado es translocado al interior de la mitocondria donde es
descarboxilado formando acetil-CoA, que es luego transformado a CO2 por el ciclo del ácido cítrico.
Durante este proceso, se generan a su vez ATP y cofactores reducidos (NADH y FADH2). Finalmente,
estos cofactores reducidos, en el caso de la respiración aerobia, se oxidan por medio de una cadena
respiratoria que usa como aceptor final de electrones el O2, regenerando los cofactores oxidados y
produciendo H2O. Es a todo el proceso global, que comienza con la glucólisis y culmina en la
regeneración de cofactores a nivel de la cadena respiratoria, que se lo conoce como respiración
aerobia (existen otros procesos respiratorios en los que se usan otros aceptores finales de
electrones). La respiración aerobia sólo ocurre en presencia de O2 y produce la mayor cantidad de
energía posible a partir de una molécula de glucosa. En ausencia de aceptores externos de
electrones para la cadena respiratoria, en algunos organismos, el piruvato es reducido a otra
molécula, por ejemplo, ácido láctico o etanol. Estos tipos de procesos, en los que un nutriente como
la glucosa pasa por la vía glucolítica, y luego el producto final de esa vía – el piruvato – es reducido,
se conocen como fermentaciones. En el caso particular que no haya O2 disponible para la célula
(anaerobiosis), el piruvato y los electrones del NADH generados en la glucólisis se encuentran y
reaccionan, en forma catalizada por enzimas, en el citosol celular. El piruvato es transformado en
productos que la célula excreta; por ejemplo, lactato en el caso del músculo, o etanol y CO2 en el
caso de las levaduras. En este proceso, se regenera el NAD+ necesario para continuar con el proceso
de glucólisis. Observe que mientras la respiración es en esencia una reacción redox entre dos
compuestos, uno de los cuales (glucosa) es un dador y otro (O2) un aceptor de electrones, la
fermentación es una dismutación: como falta el aceptor de electrones (O2), la glucosa es convertida
a un compuesto más oxidado (CO2) y otro más reducido (lactato o etanol) (Esquema I).

C6H12O6 + 6 O2  6 CO2 + 6 H2O

36 ATP

(a) Respiración aerobia

C6H12O6  2 CH3CH2OH +2 CO2

2 ATP

(b) Fermentación etanólica

Esquema I

Los organismos aerobios estrictos (que no pueden vivir sin oxígeno) obtienen la energía para
crecer y dividirse de la respiración, en cambio los organismos anaerobios estrictos (para los cuales
el oxígeno es tóxico y no pueden vivir en presencia de este gas) obtienen energía de la fermentación.
Algunos microorganismos denominados anaerobios facultativos, como las levaduras, en presencia
de oxígeno respiran, y en condiciones anóxicas (con poco oxígeno) pueden utilizar la fermentación
para obtener energía. También son capaces de fermentar algunos tejidos animales, como el músculo
esquelético, que pueden continuar funcionando durante cierto tiempo cuando el oxígeno es
limitante.

Página 3 - Módulo Diseño Experimental de ICB II - Práctico

 Finalmente, otros azúcares, distintos de la glucosa, son transformados en piruvato de una
forma similar; estos azúcares primero son convertidos en alguno de los compuestos intermediarios
de la vía glucolítica, los cuales son luego llevados a piruvato. Además de los azúcares, otras
moléculas como los ácidos grasos y los aminoácidos también pueden ser utilizadas como fuentes de
energía si son conducidas a través de rutas enzimáticas apropiadas hasta entrar en alguna etapa de
la glucólisis o del ciclo del ácido cítrico.

Acerca de las levaduras

Las levaduras son hongos unicelulares. Las más importantes desde el punto de vista económico
son las de la especie Saccharomyces cerevisiae (levadura del pan), que se usan como agente
leudante y en la producción de bebidas alcohólicas tanto fermentadas como destiladas (vino,
cerveza, whisky, etc.). Se tiene registro de que ambas tecnologías - la panificación y la elaboración
de bebidas alcohólicas- ya se usaban alrededor del 2.600 AC. Las levaduras usadas hoy
comercialmente para estos fines son producto de una selección exhaustiva y del mejoramiento
genético de cepas salvajes.
Las levaduras son, como antes mencionábamos, organismos anaerobios facultativos; por tanto,
en presencia de oxígeno pueden oxidar completamente la glucosa a CO2 (respiración), y en su
ausencia pueden usar la glucólisis para obtener energía y fermentar el piruvato a etanol. El tipo de
metabolismo predominante depende lógicamente de la concentración de oxígeno del medio, pero
también de otras condiciones, como por ejemplo la concentración de glucosa del medio: a altas
concentraciones de glucosa prevalece el metabolismo fermentativo.
Como se dijo anteriormente la glucosa no es la única fuente de carbono a partir de la cual las
células pueden obtener energía. En particular, otros azúcares son capaces de ser convertidos en
glucosa o bien en otro(s) intermediario(s) de la vía glicolítica, ingresando así a esta vía metabólica.
Saccharomyces cerevisiae en particular, es capaz de fermentar entre otros, además de la glucosa, el
monosacárido galactosa, y los disacáridos sacarosa (azúcar de mesa) y maltosa. En el Esquema II se
muestran las estructuras de estos sustratos fermentables, así como de otros compuestos (fructosa,
1-metil glucosa, lactosa y almidón) que estudiaremos si son o no fermentables por la levadura del
pan. Observe con detenimiento las moléculas y trate de visualizar relaciones entre ellas.

Breve introducción acerca al Diseño Experimental

La ciencia busca entender cómo funciona el mundo natural. Si bien los científicos estudian
diferentes aspectos de la naturaleza, todos usan el mismo enfoque intelectual para conducir su
trabajo. En esencia, los investigadores formulan preguntas a partir de ciertos conocimientos
preexistentes y determinado marco conceptual y luego buscan respuestas a estas preguntas. Al
formular preguntas los científicos realizan generalizaciones, establecen regularidades, relaciones y
conexiones entre distintos fenómenos; para responder las preguntas formulan hipótesis de trabajo
–suposiciones lógicas- que son o bien comprobables o bien refutables. Una vez formuladas las
hipótesis de trabajo, los investigadores diseñan y realizan los experimentos que verificarán o
rechazarán la hipótesis de trabajo original, generando nuevos conocimientos y preguntas.
Finalmente, es importante enfatizar que los experimentos deben siempre estructurarse de tal
modo que la información recabada esté exenta de parcialidades y errores de muestreo. Deben ser
reproducibles: otros científicos deben poder repetir los experimentos y obtener los mismos
resultados. Para ello, se deben controlar y registrar las condiciones de trabajo, así como todo evento
que pueda influir en los resultados. La validez de los experimentos depende de una cuidadosa
selección de los controles para que la interpretación de los resultados sea la correcta. Asimismo, es
conveniente, chequear que los resultados reportados por otros científicos en bibliografía puedan
reproducirse en nuestras condiciones de trabajo.

Página 4 - Módulo Diseño Experimental de ICB II - Práctico

 Esquema II: Estructura de sustratos (posibles) ofrecidos a S. cerevisiae en el curso del ejercicio de
laboratorio.

CH2OH
H O hemiacetal
O
1 C aldehído
2 -D-glucosa
H C OH CH2OH OH
5 OH
OH OH
3 H
HO C H OH
4
OH 1
H C OH O CH2OH
OH
O
5 OH OH
H C OH -D-glucosa
6 OH
CH2OH
OH
D-glucosa OH

 El grupo aldehído o cetona de un azúcar puede reaccionar con un grupo hidroxilo.

 En los azúcares de 6C esto puede ocurrir dentro de la misma molécula, generando las
formas hemiacetálicas cíclicas, por ejemplo:

CH2OH
CH2OH
O HOCH2 O
O HO
HO
OH
OH
OH CH2OH
OH OH
OH
OH OH
OH
-D-glucosa -Galactosa -Fructosa

 Si el grupo aldehído o cetona de un azúcar de 6C reacciona con el grupo hidroxilo de una

segunda molécula se forman acetales o cetales de carbohidratos o glicósidos, este enlace
se denomina glicosídico. Algunos ejemplos son:

CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH

O O O O HOCH2 O
OH OH O

O OH
OH OH OH OH OH
O OH CH2OH
OH O
OH
OH OH OH OH OH
OH
-Maltosa Lactosa enlace glicosídico Sacarosa
enlace glicosídico
(
1-4) entre dos (
1-4) entre -galactosa y enlace glicosídico
moléculas de glucosa -glucosa (
 1-2) entre glucosa
y fructosa

Página 5 - Módulo Diseño Experimental de ICB II - Práctico

 Esquema II, continúa.

 Existen además azúcares modificados o pseudo azucares o glicósidos de otro tipo de

moléculas, como:
CH2OH OH
O
OH
HO
OH OH OH
OCH3
OH OH
OH
Glucósido de metilo myo-Inositol
(1-metilglucosa)

 Cuando se polimerizan varias unidades de monosacáridos mediante este tipo de enlaces,

se forman los polímeros, que se denominan polisacáridos. El almidón es un polisacárido,
polímero de n unidades de glucosa que se unen entre sí por dos tipos de enlaces:

CH2OH CH2OH
O O
Almidón: (glu)n
OH OH enlace glicosídico (
 1-6)
O
O
OH OH enlace glicosídico (
1-4)
CH2OH CH2OH 6 CH2 CH2OH
O O O O

1 4 1
OH OH OH OH
O O O

OH OH OH OH

Página 6 - Módulo Diseño Experimental de ICB II - Práctico

 CLASE 1

I) Actividades a realizar en clase

Se plantearán hipótesis de trabajo diferentes, relacionadas con la capacidad de las levaduras

de fermentar determinados sustratos. A cada subgrupo se le asignará una de ellas y planificará los
experimentos necesarios para evaluar la hipótesis elegida.

 Se realizará el trabajo experimental para evaluar las hipótesis planteadas.

 Previo al comienzo de la parte experimental, el docente demostrará el uso del
“fermentómetro”.
 Luego se realizará la parte experimental. Se procederá de acuerdo con la técnica descrita en
“Procedimiento”, utilizándose los distintos sustratos que el grupo desea evaluar, más los
sustratos correspondientes a los experimentos de control.
 Mientras transcurre la actividad, se realizará un preparado de Saccharomyces cerevisiae
para observar al microscopio utilizando la Técnica de Azul de metileno (vea el Apéndice). Se
realizará también una observación de un fresco (sin tinción).
 Una vez culminada la recolección de datos los estudiantes deberán limpiar el material
utilizado, así como el lugar de trabajo.

II) Hipótesis de trabajo y diseño experimental

Hipótesis 1.
Conocimiento previo: La levadura del pan es capaz de fermentar la glucosa y la galactosa.
Al observar con detenimiento las estructuras de estos compuestos y la de la lactosa (un disacárido
presente en la leche), vemos que esta última está formada por dos monosacáridos: glucosa y
galactosa. Una hipótesis de trabajo que podemos formular a partir de esta información es que la
levadura del pan fermentará el disacárido lactosa. ¿Qué experimentos realizaría para evaluar esta
hipótesis? Para evaluar esta hipótesis disponemos, además de las soluciones que se detallan más
abajo, de la enzima β-galactosidasa, que hidroliza la lactosa a galactosa y glucosa. ¿Qué
experimentos adicionales incluiría?

Hipótesis 2.
Conocimiento previo: La levadura del pan es capaz de fermentar la sacarosa y la maltosa.
Una hipótesis de trabajo razonable es que la levadura fermentará disacáridos en general, entre ellos
la lactosa. ¿Qué experimentos realizaría para evaluar esta hipótesis?

Hipótesis 3.
Conocimiento previo: La levadura del pan es capaz de fermentar la maltosa y la glucosa.
Al observar con detenimiento las estructuras de estos compuestos vemos que la primera está
formada por dos unidades de un mismo monosacárido: la glucosa. Así la levadura es capaz de
fermentar a la glucosa y a un dímero de glucosa (maltosa). Una hipótesis de trabajo que podemos
formular a partir de esta información es que la levadura del pan fermentará almidón; un polímero
de glucosa, producido por las plantas, presente en altas concentraciones en los granos de cereales.
¿Qué experimentos realizaría para evaluar esta hipótesis?

Página 7 - Módulo Diseño Experimental de ICB II - Práctico

Hipótesis 4.
Conocimiento previo: La levadura del pan es capaz de fermentar la sacarosa y la glucosa.
Al observar con detenimiento las estructuras de estos compuestos vemos que la primera está
formada por dos monosacáridos, uno de los cuales es la glucosa. El otro monosacárido es la
fructosa. Una hipótesis de trabajo que podemos formular a partir de esta información es que la
levadura del pan fermentará la fructosa. ¿Qué experimentos realizaría para evaluar esta hipótesis?

Hipótesis 5.
Conocimiento previo: La levadura del pan es capaz de fermentar la glucosa.
La 1-metil glucosa es similar a la glucosa, se diferencia en que aquella posee un grupo metilo en la
posición 1 de la glucosa. El inositol, en tanto, es un seudoazúcar: contiene un anillo de 6 carbonos
cada uno de ellos hidroxilados (ver fórmula). Una hipótesis de trabajo que podemos pensar es que
las moléculas de 1-metil glucosa y de inositol serán también sustratos fermentables para la levadura
del pan. ¿Qué experimentos realizaría para evaluar esta hipótesis?

Hipótesis 6.
Conocimiento previo: La levadura del pan es capaz de fermentar la glucosa, pero no compuestos
inorgánicos como el NaF.
Una hipótesis de trabajo razonable es que la levadura fermentará la glucosa de la misma manera en
presencia de NaF que en ausencia.

Hipótesis 7. Esta hipótesis se realiza por duplicado (ver abajo “Asignación de hipótesis”)
Conocimiento previo: La levadura del pan es capaz de fermentar la glucosa a diferentes
concentraciones.
Una hipótesis de trabajo razonable es que la levadura del pan cambiará el patrón de
desprendimiento de CO2 al ofrecerle la glucosa a diferentes concentraciones. ¿Qué experimentos
realizaría para evaluar esta hipótesis?

 A cada subgrupo se le asigna una hipótesis de trabajo. ¿Qué experimentos realizaría para
evaluar la hipótesis que se le asignó? Utilice las siguientes líneas para describir brevemente los
experimentos que realizará para evaluar la hipótesis de trabajo elegida (incluya todos los
controles pertinentes):
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________

Asignación de hipótesis en el salón de clase:

Pizarrón
Mesa 1: Hipótesis 1 Mesa docente Mesa 6: Hipótesis 6

Mesa 2: Hipótesis 2 Mesa 4: Hipótesis 4 Mesa 7: Hipótesis 7 a*

Mesa 3: Hipótesis 3 Mesa 5: Hipótesis 5 Mesa 8: Hipótesis 7 b*

* Las mesas 7 y 8 DEBEN compartir baño termostatizado e iniciar los experimentos
al mismo tiempo (de manera de estar siempre en iguales condiciones de
temperatura). Ambas mesas registran únicamente su conjunto de datos.
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III) Materiales y Métodos

1. Materiales
Las soluciones de las que dispone para evaluar las hipótesis mencionadas se listan a continuación
(recuerde que la concentración expresada como % indica gramos cada 100 mL):

Almidón 10% Inositol 10 % 1-metil glucosa 10% Glucosa 10 %

Fructosa 10% Lactosa 10% Lactosa 10% + β-galactosidasa Glucosa 0.5 %
Agua destilada Maltosa 10 % Sacarosa 10% Glucosa 5%
Galactosa 10% NaF 10% Glucosa 10% + NaF 10% Glucosa 2.5%

Además de las soluciones de sustratos antes mencionadas y de los fermentómetro Ud. dispondrá
en el práctico de:
 Tubos de ensayo  Frascos con soluciones
 Pipetas Pasteur  Conservadoras
 Levadura Pre-incubada (solución stock: 1.5 % levadura, 0.5 % en sacarosa)

En las condiciones experimentales que usaremos la levadura tiene capacidad de fermentar,

pero no de oxidar por respiración los sustratos. La capacidad de la levadura del pan de fermentar
los sustratos elegidos se analizará utilizando un dispositivo muy sencillo denominado
“fermentómetro” (Figura 2), éste es un fermentador en miniatura que permite medir los niveles de
gas liberados durante la fermentación. El mismo consiste en una pipeta de plástico sellada en su
extremo inferior, y un tubo de ensayo. Cuando la pipeta llena se cubre con el tubo de ensayo y el
fermentómetro se invierte, el CO2 generado en la fermentación se acumula en el extremo cerrado
de la pipeta, desplazando la mezcla de levadura y sustrato hacia el tubo de ensayo. De esta forma
se puede medir el CO2 producido utilizando directamente la graduación de la pipeta.

9 1 9 1
Se agregan con pipeta Pipeta invertida con 8 2 8 2
Pasteur: levadura + sustrato
1) la solución
7 3 7 3
de sustrato y 6 4 6 4
2) la levadura 5 5 5 5
Tubo de ensayo

Pipeta graduada
con punta sellada

V1 = 1 mL V 2 = 3 mL

(a) (b) (c)

Figura 2: Esquema del “Fermentómetro”: (a) llenado; (b) inicio del experimento; (c) lectura.

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2. Procedimiento

1. Simultáneamente al llenado de los fermentómetros arme en la conservadora un baño de agua a

40oC. Asegúrese de mantener esta temperatura durante todo el experimento
2. Agregar con pipeta Pasteur aproximadamente 7 mL de la solución a ensayar a la pipeta sellada
(hasta la marca de 7 mL en la escala ascendente): no mezclar las pipetas de diferentes sustratos
3. Cuando todos los fermentómetros tengan los sustratos y el baño esté termostatizado, con otra
pipeta Pasteur, agregar 6 mL de la suspensión de levadura (hasta -3 mL). Homogenice la
suspensión antes del agregado. Recuerde que esta levadura está preincubada en sacarosa (0.5%)
4. Cubrir la pipeta con el dedo pulgar e invertirla repetidamente para lograr una mezcla homogénea
5. Colocar el tubo de ensayo invertido sobre la pipeta
6. Invertir rápidamente el fermentómetro
7. Golpear suavemente el tubo como para que asciendan las burbujas de aire atrapadas en el cuello
de la pipeta
8. Tomar lecturas de volumen inicial de aire en cada fermentómetro (Tabla 1) y del volumen de
CO2 cada 5 minutos (Tabla 2). Tales tables son parte de su informe.

Este procedimiento deberá hacerse para todos los ensayos a realizar al igual que para los
experimentos control, por lo cual es fundamental que el grupo se distribuya adecuadamente el
trabajo.

3. Experimento

Se realizará un ensayo de acuerdo con el procedimiento descrito para cada una de las
soluciones que el grupo haya decidido ensayar para poner a prueba una de las hipótesis de trabajo.
Además, se realizarán dos experimentos de control. En todo experimento diseñado para evaluar
una hipótesis es necesario incluir experimentos control; o sea, experimentos que garanticen que el
diseño experimental (instrumentos, concentraciones utilizadas, escala de trabajo, etc.) es adecuado
para realizar las observaciones que se desean realizar.

3.1 ¿Qué experimentos de control deberían incluirse en este caso?

_________________________________________
3.2 ¿Qué sustrato podría utilizarse como un seguro control positivo?
_________________________________________
3.3 ¿Qué "sustrato" podría utilizarse como control negativo?
_________________________________________

 ANTES DE RETIRARSE DE LA CLASE 1:

o REALICE EL PREPARADO DE LEVADURA QUE UTILIZARÁ EN LA CLASE 2
o PASE SUS DATOS A LA COMPUTADORA DEL DOCENTE
o LIMPIE EL MATERIAL QUE UTILIZÓ
 ANTES DE LLEGAR A LA CLASE 2:
o ASEGÚRESE DE REALIZAR LAS ACTIVIDADES PREVIAS QUE SE INDICAN A
CONTINUACIÓN
o ELABORE EL INFORME DE LABORATORIO COMPLETO PARA LA CLASE 2. El mismo
puede realizarse en el espacio provisto al final de este repartido o no. Si Ud. no
utiliza el espacio del repartido, DEBE ESTRICTAMENTE mantener el formato e incluir
toda la información solicitada.
o PREPARE UNA EXPOSICIÓN ORAL PARA EXPLICAR LOS RESULTADOS OBTENIDOS Y
SU INTERPRETACION

Página 10 - Módulo Diseño Experimental de ICB II - Práctico

 CLASE 2

I) Actividades a realizar PREVIAMENTE

1. Responda a las siguientes preguntas (puede consultar con un libro de Bioquímica):

 En las condiciones experimentales que usaremos la levadura tiene capacidad de

fermentar, pero no de oxidar los sustratos; por lo tanto, los productos de dicho
metabolismo serán:
etanol __, NADH__, glucosa__, CO2__, glicerol__, sacarosa__, ATP__, NAD+__.
 Considerando lo que Ud. conoce sobre los procesos de oxidación y fermentación: ¿Qué
productos se podrían medir para concluir si un sustrato está siendo metabolizado por
alguna de estas vías? ¿Cómo podríamos distinguir si se trata de una oxidación (por
respiración) o de una fermentación?
 El producto que hace útil a la levadura en la producción de bebidas alcohólicas es el
etanol ¿Cuál piensa Ud. es el producto de la fermentación que hace útil a Saccharomyces
cerevisiae en la panificación?

2. Trabajando en los mismos subgrupos con los que se obtuvieron los datos, grafíquelos (Ver
modelo de informe) Al graficar recuerde corregir el volumen de gas desplazado, con el
volumen medido a tiempo 0.

3. Calcule el volumen teórico total desprendido de CO2 a partir del sustrato ofrecido (el
volumen máximo si se consume todo el sustrato). Asuma un comportamiento de gas ideal y
un proceso de fermentación completo.
Máximo de moles de CO2 desprendido: _______________
Máximo de volumen de CO2 desprendido: _______________
¿Hay diferencia con su lectura? Si la hay, ¿cómo la explica?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________

4. Informe de actividad práctica:

Una parte fundamental del trabajo científico y técnico es la comunicación de los resultados
obtenidos de forma que sean entendibles y de utilidad a toda la comunidad científico-
técnica. Por ello, una vez terminada la recolección de datos y el análisis de estos, cada
subgrupo deberá presentar un informe que incluya el objetivo del práctico que realizó, los
datos de laboratorio, las gráficas y las conclusiones a las que arribaron. En la parte final de
este informe se deberán reportar también los experimentos a repetir, o nuevos
experimentos sugeridos a fin de evaluar mejor o más contundentemente la hipótesis
formulada (Ver modelo de informe).

5. Para ayudarse en los temas a desarrollar en la discusión, piense en lo siguiente:

 ¿Cómo ingresan a las células los azúcares que éstas utilizan como sustratos para la
obtención de energía? Tenga en cuenta el tamaño de las moléculas y su polaridad.
 ¿Cómo ingresan dichos sustratos a la vía glucolítica? ¿En qué punto lo hacen? ¿Qué
transformaciones sufren? ¿Es cinética y termodinámicamente favorable?

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II) Actividades a realizar EN CLASE

1. Estimación del tamaño celular. Se estimará el tamaño de las células de S. cerevisiae;

realizando la actividad de microscopio descrita en el apéndice. Recupere su preparado y siga
las instrucciones de abajo. Usted tiene 20 min para esta actividad. Incluya los resultados de
su ejercicio en el informe que entrega en la clase de hoy.
2. Exposición y discusión de datos: Se presentarán los datos obtenidos en la clase anterior al
resto del grupo y se los comparará entre sí y con datos de literatura. Se elaborarán
conclusiones y se propondrán nuevos experimentos a realizar. Se discutirán en conjunto los
resultados obtenidos por los distintos subgrupos
3. Finalización del informe individual: Se dará un tiempo corto para que cada subgrupo revise
su informe de acuerdo con lo discutido en (2). Recuerde: el informe debe traerse hecho al
inicio de la clase 2.

Estimación del tamaño celular

 Recupere su preparado. No olvide registrar el número de microscopio que está utilizando.

Para esa actividad usted debe entender que las lentes, como las lupas de mano y las gafas,
generan imágenes con un mayor tamaño que el objeto que se observa a través de ellas. Es decir,
estas imágenes se encuentran aumentadas o magnificadas con respecto a los objetos. En lenguaje
técnico el poder de aumento o magnificación de una lente se expresa como la cantidad de veces
que se magnifica la imagen seguida de la letra X. Por tanto, si una lente tiene un aumento de 10X
quiere decir que esa lente genera una magnificación del objeto 10 veces mayor que si se observara
al mismo objeto sin lente (“a ojo desnudo”).
El sistema de lentes de los microscopios ópticos que usted utilizará permite magnificar
estructuras celulares de aproximadamente 1 μm de tamaño (1 μm = 0,000001 m). En particular son
el lente objetivo y el lente ocular los que le dan esta capacidad al microscopio. Por tanto, el aumento
total del microscopio va a depender del poder de magnificación de ambos lentes y se calcula con la
siguiente fórmula:

Atot = Aobj × Aocu (1)

Atot : aumento total; Aobj : aumento lente objetivo; Aocu : aumento lente ocular

A su vez, los microscopios cuentan con diferentes lentes objetivos que permiten cambiar el
poder de magnificación total del mismo. Generalmente, los microscopios cuentan con 4 lentes
objetivos diferentes que son el lente de 4X, 10X, 40X y 100X. Estas lentes presentan una restricción:
a medida que aumenta el poder de magnificación disminuye el diámetro del campo de observación
(campo visual o del microscopio) debido a que una lente con mayor aumento disminuye su tamaño
(Figura 3). Por tanto, existe una relación inversamente proporcional entre el aumento y el tamaño
del campo de observación el cual se mantiene constante a medida que se cambia el lente objetivo:

D1 × Atot1 = D2 × Atot2 (2)

Di : diámetro del campo de observación al aumento i; Atoti : aumento total con la lente objetivo i

Es entonces que esta relación entre el aumento y el tamaño del campo observación nos
permitirá determinar el tamaño de un objeto observado. El tamaño de un objeto observado es:

TAMAÑO DE OBJETO = Tamaño de la imagen / aumento total

Página 12 - Módulo Diseño Experimental de ICB II - Práctico

 Figura 3. Relación entre el aumento del lente objetivo, su tamaño y el tamaño del campo de
observación.

¿Cuál es el tamaño real del objeto observado?

Para saber el tamaño del objeto necesitamos entonces tener una escala o una distancia conocida.
Esto se logra con reglas patrón insertas en el ocular o en portas graduados (con cuadriculas). A falta
de estas opciones se utiliza:
a) Regla milimetrada. Recordar que 1 mm = 1000 m
b) Papel milimetrado (cuadrícula)
Ahora bien, en un microscópico compuesto común, los aumentos mayores son tales que aún un
milímetro es mayor que el campo de observación. Entonces, ¿cómo usar este recurso?
1) En el aumento menor, colocar la regla y estimar el diámetro del campo de observación,
sabiendo que la separación menor corresponde a 1 mm. Hacerlo 5 veces
a. Por ejemplo, si estimamos que el diámetro es 1.2 mm, en micras el diámetro del
campo de observación (D) es = 1200 m
2) Al incrementar el aumento, como se mencionara, la magnificación aumenta y el diámetro
del campo de observación disminuye:
D1 × Atot1 = D2 × Atot2 (2)

Por tanto, con la ecuación en (2) se puede estimar el diámetro del campo de observación
en cualquier aumento si conocemos los Atot para cada aumento y el diámetro del campo de
observación para uno de ellos.

Con esta información, observe un frotis de Saccharomyces cerevisiae y registre el tamaño de las
células en su informe, para ello llene la Tabla 3 (asegúrese de poner una leyenda adecuada
en tal tabla) y cada integrante de la mesa debe contar el número de células en un diámetro
en el campo de mayor aumento.
-----------------
La siguiente tabla muestra una guía muy general del tamaño del campo de observación en los
microscopios a usarse en la actividad del laboratorio (https://www.youtube.com/watch?v=Pzx70Y_qxSs)

Aumento del objetivo Aumento total si el ocular es 10x D (m)

10x 100x 2000
40x 400x 400
100x 1000x 200

Página 13 - Módulo Diseño Experimental de ICB II - Práctico

GRUPO Nº:__________
INTEGRANTES DEL SUBGRUPO:
HIPÓTESIS DE TRABAJO Nº:
_____________________________
_____________________________
_____________________________
_____________________________
_________

Título:
________________________________________________________________________________

Objetivo:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

Diseño experimental:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Datos obtenidos:
1) Ti = ______ oC Tf = ________ oC
2) Tabla 1: Volumen inicial (Vo, mL) en cada fermentómetro.

Sustrato Vo (mL)

¿Qué registra el Vo en cada fermentómetro? _________________________________

3) Tabla 2: Gas producido en cada fermentómetro (mL) en función del tiempo.

Volumen de CO2 registrado en función del tiempo (minutos)

Sustrato 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90

Informe Módulo Diseño Experimental de ICB II Página 1 de 3

Comentarios:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Volumen de gas (ml)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tiempo (minutos)

Figura 1: ________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

Discusión y conclusiones (incluye cualquier información que ayude a interpretar sus datos y el
posible trabajo futuro):
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

(Agregue hasta 1 carilla si es necesario; no más)

Informe Módulo Diseño Experimental de ICB II Página 2 de 3
 Estimación del tamaño celular

1) Dibuje aquí el preparado observado al microscopio.

2) ¿Observó levaduras gemando? ¿Cuándo una levadura gema?

__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________

3) Informe del tamaño de las células

Tabla 3: ____________________________________________________________________
___________________________________________________________________________

Número de microscopio:
Aumento del ocular:
Aumento del objetivo Aumento total Diámetro del campo (mm) Diámetro del campo (m)

Muestre sus cálculos para la Tabla 3:

________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Cuente el número de células en un diámetro (en el mayor aumento) por integrante de grupo y
regístrelo a continuación:
Lectura # células Diámetro de Muestre el cálculo del diámetro de células:
las células ___________________________________________
1 ___________________________________________
2 ___________________________________________
3 ___________________________________________
4 ___________________________________________

¿Cuál es el diámetro de una célula de S. cerevisiae? (informe promedio, incluya unidades)

_________________________________________________________________

Informe Módulo Diseño Experimental de ICB II Página 3 de 3

 APÉNDICE I: PREPARACIÓN Y TINCIÓN DE FROTIS

Importante: Para realizar esta actividad usted debe haber leído también el material
complementario: “EL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO”.

A) Preparación de un frotis

1. Colocar una gota pequeña de la suspensión de Saccharomyces cerevisiae sobre un portaobjetos

limpio y extenderla con un portaobjeto.
2. Secar al aire o manteniendo el portaobjetos por arriba de la llama del mechero 15 cm o más (la
mínima distancia en que Ud. no se queme).
3. Fijar el preparado una vez seco pasando el portaobjetos por la llama del mechero cinco veces.

B) Tinción de Saccharomyces cerevisiae con Azul de Metileno

1. Realizar un frotis según A)

2. Colocar el portaobjetos sobre el soporte de tinciones
3. Cubrir el preparado con Azul de Metileno por 30 segundos
4. Lavar con H2O corriente (del grifo, con un flujo suave)
5. Secar (con toalla de papel primero y luego a 15 cm por encima de la llama del mechero)
6. Numere su preparado de la siguiente manera: Grupo de practico/No de Mesa de trabajo
7. Guarde el preparado en la caja provista por el docente. Usted continuará trabajando con el
mismo en la siguiente clase.

Foto de un frotis de Saccharomyces cerevisiae con tinción de Azul de Metileno

Apéndices Módulo Diseño Experimental de ICB II

 APÉNDICE II: EL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

1 Partes del microscopio óptico

Partes de un microscopio óptico

OCULAR OBJETIVO CONDENSADOR DIAFRAGMA FOCO

Lente situada cerca Lente situada Lente que Regula la cantidad Dirige los rayos
Sistema del ojo del cerca de la concentra los rayos de luz que entra en luminosos hacia el
óptico observador. preparación. luminosos sobre la el condensador. condensador.
Amplía la imagen Amplía la imagen preparación.
del objetivo. de ésta.

SOPORTE PLATINA CABEZAL REVÓLVER TORNILLOS de

ENFOQUE
Mantiene la parte Lugar donde se Contiene los Contiene los
óptica. Tiene dos deposita la sistemas de lentes sistemas de lentes Macrométrico que
Sistema partes: el pie o oculares. Puede objetivos. Permite,
aproxima el
preparación.
mecánico base y el brazo. ser monocular o, al girar, cambiar enfoque y
micrométrico que
binocular. los objetivos.
consigue el
enfoque correcto.

El microscopio óptico es una herramienta de observación fundamental en las ciencias biológicas, utilizado
para aumentar la capacidad de observación del ojo humano. Para esto utiliza un sistema de lentes y la
radiación visible para producir la imagen observada. En el caso del microscopio compuesto esta imagen se
produce por transmisión de la luz a través de un preparado muy fino.

La mejora en la capacidad de observación por el uso del microscopio viene dada por dos características
fundamentales: su capacidad de aumento (como una lupa) y su límite de resolución:
 La capacidad de aumento viene dada por el aumento del ocular (en general 10x) y el aumento del
lente objetivo (variable, usualmente de 8x hasta 100x).
 El límite (o poder) de resolución se expresa como la distancia mínima entre dos objetos (o puntos)
que son distinguibles entre sí. Esto es, por debajo de ese poder de resolución ambos puntos se ven
como uno solo. Dado que en este repartido no cubriremos la física involucrada en el uso del
microscopio óptico, aceptemos que el poder de resolución (PR) es de 0.5  (siendo  la longitud de
onda utilizada para la observación). Dado que el ojo humano ve la luz de longitud de onda entre
400 y 700 nm, el poder de resolución del microscopio óptico queda limitado a objetos que están
Apéndices Módulo Diseño Experimental de ICB II
 separados entre sí 200 nm (0.5 x 400 nm). Si pensamos que el ojo humano puede resolver como
diferentes dos puntos separados entre sí 0.1 mm, es fácil deducir que mediante el uso del
microscopio óptico se aumenta 500 veces ese límite de resolución.

Los preparados observados bajo el microscopio óptico pueden estar aún viables (por ej. células vivas) o haber
sido fijados y teñidos (por ejemplo, el preparado de mitosis observado en esta clase).

II.2 Manejo y uso del microscopio óptico

1. Coloque la preparación sobre la platina sujetándola con el dispositivo móvil. Compruebe previamente que
el objetivo de menor aumento está en posición de empleo.
2. Coloque el objetivo de 10 aumentos (10x) y enfoque:
2.1 Acerque al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el macrométrico. No haga esta
operación mirando por el ocular, pues correría el riesgo de "clavar" el objetivo en la preparación con
el consiguiente destrozo de ambos.
2.2 Suba el tubo lentamente con el macrométrico observando por el ocular hasta que obtenga un
enfoque nítido.
3. Pase al objetivo de 40 aumentos (40x). Suba ligeramente el condensador. La imagen debe estar casi
enfocada: afine el foco con el micrométrico. Si la imagen no está enfocada, es preferible volver a un
enfoque con el objetivo de x10. El objetivo de x40 trabaja muy cerca de la preparación y por ello es
susceptible de dos tipos de accidentes: ser "golpeado" en la preparación cuando se descuidan las
precauciones descritas para su enfoque (por ej. empleando el macrométrico) y resultar manchado con
aceite de inmersión si se observa una preparación ya usada con este último.
4. Cambie el objetivo nuevamente a 10x, cubra su preparación con una gota de aceite de inmersión. Cambie
el objetivo al de inmersión (usualmente 100x).

Bibliografía y material de apoyo de Apéndices:

 De Robertis & De Robertis. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo. Bs. As. 1996
 Video correspondiente a aumentos y cálculos con microscopio óptico:
https://www.youtube.com/watch?v=Pzx70Y_qxSs)

Apéndices Módulo Diseño Experimental de ICB II

 ICB II: Laboratorio 2018
Cronograma general ICB 2 laboratorio 2018
1. Programa y Cronograma: Semana Fecha Práctico Lugar
1 30/7 al 3/8 No hay 0
2 clases/módulo 2 6 al 10/8 No hay 0
3 13 al 17/8 No hay 0
4 20 al 24/8 Diseño Experimental Clase 1 LUM 1
1.1. Módulo 1: Diseño experimental 5 27 al 31/8 Diseño Experimental Clase 2 LUM 1
1.2. Módulo 2: Ciclo celular y genética 6 3 al 7/9 Ciclo Celular y Genética Clase 1 LUM 1
7 10 al 14/9 Ciclo Celular y Genética Clase 2 LUM 1
1.3. Módulo 3: Proteínas 8 semana 17/9 Parciales 0
1.4. Módulo 4: Evolución 9 semana 24/9 Parciales 0
10 1 al 5/10 Proteínas Clase 1 Sala Informática
11 8 al 12/10 * Proteínas Clase 2 Sala Informática
12 15 al 19/10 No hay
13 22 al 26/10 No hay
2. Funcionamiento 14 29/10 al 2/11 ** Evolución Clase 1 Sala informática
15 5 al 9/11 Evolución Clase 2 LUM 1
16 12 al 16/11 No hay 0
 Habrá 3 instancias de preguntas individuales, 17 semana 19/11 Parciales 0
18 semana 26/12 Parciales 0
pre-práctico
 Se elaborará 1 informe grupal * El feriado del viernes 12/10 se para el lunes 15/10, y no se recupera porque no hay clases esa semana
** El feriado del viernes 2/11 no se corre, y se recupera el miercoles 31/10 en los mismos horarios que el viernes
 No se recuperan clases por inasistencias no
justificadas
 Se recuperarán clases por inasistencia justificada (en Bedelía) o por autorización de los docentes
encargados del curso
 Esta autorización se dará solamente en forma excepcional y PREVIAMENTE a la fecha de recuperación
 Máximo 1 falta

3. Ganancia Global
Puntos teórico Puntos Práctico
Laboratorio -- 4
1er Parcial 20 8
2do Parcial 30 8

Total 50 20

 Total de puntos de teórico = 50 (dos parciales de múltiple opción)

 Total de puntos del práctico = 20 (dos parciales de desarrollo + preguntas pre-práctico)
o Puntos teóricos ≥ 25 y Puntos prácticos ≥ 10 - EXONERA con nota 6 a 12
o Puntos teóricos ≥ 15 y Puntos prácticos ≥ 10 - APRUEBA el curso y queda habilitado a dar
examen por tiempo indefinido.
o Puntos teóricos < 15 y Puntos prácticos ≥ 10 - Queda habilitado a dar examen hasta el período
anterior al siguiente dictado del curso. De no aprobarse el mismo, debe re-cursar. En su
escolaridad figurará que perdió el curso.
o Puntos prácticos < 10 - PIERDE el curso (cualquiera sea la suma en el teórico)

 Examen: Se requiere para aprobar más del 50% de los puntos (nota de 3 a 12). Puede ser de múltiple
opción o preguntas de desarrollo.

Apéndices Funcionamiento de ICB II