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Dégradation de protéines – le protéasome

CONTENU
• INTRODUCTION ET RAPPEL
• Comment détruire une protéine?
• Mécanismes de sauvetage UPR
• ERAD et destruction de protéines
• L’Ubiquitination, trafic et protéasome
• Le protéasome: assemblage, structure et
fonction
• lien entre protéasome et chaperone (pliage
et destruction)
• la déchetterie cellulaire
PLIAGE DE PROTEINES Cours1

Repliement spontané

Chaperonnes Protéine native

Aggrégation

Dégradation
• Eukaryotes ca 30% protéines « misfold » à un moment ou l’autre
• Aggrégats toxiques; formes « dominants négatives
• mutations
• oligomères
• postsynthetic damage, e.g., by oxidation, glycationand deamidation
PLIAGE DE PROTEINES Cours1
pliage et destruction – »les agents doubles »

Pliage Dégradation
DEGRADATION ET PROTEASOME
la question
Extracellulaire
Ex.: trypsine etc

Protéolyse intracellulaire
Lysosome

protéasome

Comment protéger les autres composants?


(bactéries sans compartiments!)
Comment organiser une machine efficace?
(auto-assemblage et auto-organisation)
Comment sortir du RE?
Dégradation de protéines – le protéasome
CONTENU
• INTRODUCTION ET RAPPEL
• Comment détruire une protéine?
• Mécanismes de sauvetage UPR
• ERAD et destruction de protéines
• L’Ubiquitination, trafic et protéasome
• Le protéasome: assemblage, structure et
fonction
• lien entre protéasome et chaperone (pliage
et destruction)
• la déchetterie cellulaire
DEGRADATION ET PROTEASOME
Répliage des protéines et contrôle de qualité I
Capacité ER =
Charge ER

Surcharge =
Stress

Dérangement ER
influence toute la cellule

Stress:
-Protéines mutées
-Augmentation synthèse
(infection, différenciation)
-Stress métabolique
(p.e. diabète)
Contrôle protéines
résidents
DEGRADATION ET PROTEASOME
Répliage des protéines et contrôle de qualité II
Exemple de l’importance/conséquence ERAD
Une cinquantaine de maladies sont actuellement liées à des
problèmes UPR/ERAD et peut induire l’ apoptose

-Class I: Perte de fonction d’une protéine sécrétée


(récepteur insuline diabète; facteurs coagulation hémophilie)
-Class II: Accumulation de protéines « fautives » (mutations/PGD etc)
-Class III: déficit de la machinerie UPR
-Class IV: déficit distal de l’UPR (par exemple protéasome)

Observation
CFTR, transport chlorure membrane plasmique; mucoviscidose
CFTR DF506; pliage nécessaire avant ER-Golgi
CFTR DF506 pas au niveau de la membrane plasmique
(chaperonnes chimiques)
DEGRADATION ET PROTEASOME
UPR
Induction de la transcription

# « UPR » unfolded protein response

# chaperonnes, Bip, PDI etc

UPR: agrandissement de l’ER


(phospholipides cholestérol)

microarrays: >380 gènes régulés


remodelage de la voie biosynthétique?
ER: 1er étape, éviter accumulation
DEGRADATION ET PROTEASOME
UPR

Trois voies

# IRE1 (inositol requiring kinase 1)

# ATF6 (activating transcription factor 6)

# PERK (RNA activated protein kinase like ER kinase)


DEGRADATION ET PROTEASOME
ACTIVATION DE L’EXPRESSION DES CHAPERONNES I

IRE1: deux voies ATF: regulation? proteolyse?


DEGRADATION ET PROTEASOME
ACTIVATION DE L’EXPRESSION DES CHAPERONNES II

PERK:
similarité avec IRE
kinase (eIF2-a)
-/- cellules: plus
sensitive

PERK pas dans la


levure, mais droso etc

Rôle de BiP dans


l’activation
Dégradation de protéines – le protéasome
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• Mécanismes de sauvetage UPR
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• L’Ubiquitination, trafic et protéasome
• Le protéasome: assemblage, structure et
fonction
• lien entre protéasome et chaperone (pliage
et destruction)
• la déchetterie cellulaire
DEGRADATION ET PROTEASOME
Considérations
Dégradation:
homéostasie dynamique, altérations de structures
déterminer la vie de protéines régulatrices
système immunitaire/dégradation d’antigènes

Risques:
contrôle spatiale/temporelle
compartimentalisation (lysosomes)
procaryotes: absence d’endomembranes
(proteasome; archae, pro-, eucaryotes)

Besoins de:
« dépliage » passage
« chaperonnes reverses »

ER n’est pas un compartiment de dégradation !


DEGRADATION ET PROTEASOME
« marche arrière »

- solubilité (chaperonnes, glycosylation)


- dépliage
- canal
(sec61? Sec63? Derlin? autre?)

- »extracteur » Cdc48 (ATPase)

- escorts (Rad23)

- ubiquitination – ou?
DEGRADATION ET PROTEASOME
ERAD
ER-associated degradation
Contrôle de qualité
Envoyer substrat malreplié vers la dégradation
« proteasome »
ERAD: interaction de système d’induction et
de dégradation
induction nécessaire pour dégradation

1) Induction, Atténuation
2) Rétrotransport
3) Dégradation

ER rapidement saturé
« Le système est conçu pour le bon fonctionnement »
Dégradation de protéines – le protéasome
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• Comment détruire une protéine?
• Mécanismes de sauvetage UPR
• ERAD et destruction de protéines
• L’Ubiquitination, trafic et protéasome
• Le protéasome: assemblage, structure et
fonction
• lien entre protéasome et chaperone (pliage
et destruction)
• la déchetterie cellulaire
UBIQUITINE
Prix Nobel 2004
• "for the discovery of ubiquitin-mediated protein
degradation”

• Aaron Ciechanover
– Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel,
• Avram Hershko
– Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel and
• Irwin Rose
– University of California, Irvine, USA

– Ubiquitination:
 Signal localisation
 Destruction de protéines ERAD; transcription
Dégradation de protéines – le protéasome
exemples de fonctions biologiques
DEGRADATION ET PROTEASOME
ubiquitination et protéasome – la vue générale

Modèle hypothétique
Ubiquination pour diriger vers le « protéasome »
Relation translocon/protéasome?
Protéolyse:
« housekeeping », éradication des erreurs
Déterminer la vie des protéines régulatrices
Cyclines (cycle cellulaire); Facteurs de transcription; Transduction de signaux; Système immunitaire
Processus dangereux

PROTEASOME:« compartimentalisation de la protéolyse »


Pas de lysosomes dans les bactéries/archae
DEGRADATION ET PROTEASOME
Ubiquitination - description
Modification Posttranslationelle :

-protéolyse spécifique
-glycosylation
-lipidation
-phosphorylation etc.

Ubiquination:
Attachement d’une protéine a une
autre protéine!
« modificateur stérique »
Négatif: obstacle stérique
Positif: nouvelles interactions

« le phosphate de Darwin »
(possibilités d’évolution)
DEGRADATION ET PROTEASOME
Ubiquitination – la réaction

Thioester haute énergie; cible thérapeutique

« bucket brigade »
complexe de multienzymes
isoformes multiples

e-NH2 de Lys

E3: spécificité cible thérapeutique


DEGRADATION ET PROTEASOME
Ubiquitination: Mono, Multi et Poly
Ubiquitin, Ubl (ubiquitin like; UBA domains)
Desubiquination

Cf.: système de kinases et phosphorylases

Spécificité:E3 lie une domaine spécifique du substrat


différentes isoformes de E3

Mono/Multi- et polyubiquination
Ubiquitine possède 7 LYS

Mono/Multi-ubiquination:
Endocytose et réapparition a la surface (4 Ubi)
TGN
Signaux « 3 dimensionnels »

Polyubiquination:
(« réseau » via différents Lys d’ubiquitine)
Riche en information 3D
Protéasome
Fonction de signalisation
(« facteur de réparation des erreur commis par l’ADN »)
DEGRADATION ET PROTEASOME
MONO/MULTI-UBIQUITINATION
Internalisation et métabolisme/recyclage d’un RTK
Le récepteur EGF Ub-Ligase

Différents récepteurs

Ub-Récepteur

Ubiquitine
DEGRADATION ET PROTEASOME
MONO/MULTI-UBIQUITINATION

Ubiquination de protéines
Membranaires

Absent dans les bactéries


DEGRADATION ET PROTEASOME
Ubiquitin like
相撲
SUMO (small ubiquitin-related modifier)

NEDD8 (neural-precursor-cell-expressed developmentally down-regulated 8)

Atg (autophagy-related proteins)


DEGRADATION ET PROTEASOME
UBLs
Structural comparison of UBLsStructural comparison of MoaD, ThiS, Ub, SUMO, NEDD8,
Atg8 and Atg12 with their respective PDB codes shown below each structure [59–65].
DEGRADATION ET PROTEASOME
Cycle de SUMO
• inactive precursor
• cleaved by SENP to
expose a C-terminal di-
glycine motif: mature
form
• activated by the ATP-
dependent formation of a
thioester bond with the
active site of the E1
enzyme
• passed to the active site
cysteine of the E2
conjugating enzyme, Ubc9
• transfer of SUMO to the
target protein
• DeSUMOylation is
mediated by SENP
DEGRADATION ET PROTEASOME
MONO/MULTI-UBIQUITINATION
NEDD8 (neural-precursor-cell-expressed developmentally down-regulated 8)
• NEDD8 is the most similar UBL to Ub (human NEDD8 58% identical to human Ub)
• NEDD8 primarily conjugated to and regulates the activity of cullin proteins
• Cullins: which are subunits of the largest class of Ub E3 enzymes)
• Crucial for the control of many important proteins

SUMO (small ubiquitin-related modifier)


• numerous essential functions in eukaryotes
• multiple isoforms in mammals
• SUMO is recognized by SIMs (SUMO-interacting motifs)
• SUMOylation regulates many essential eukaryotic processes

Atg12 and Atg8


• Autophagy is mediated by >30 autophagy-related (Atg) proteins
• 2 distinct UBLs (Atg12, Atg8) activated same E1, required for autophagosome formation.
• Atg8 ligated to a lipid rather than to another protein
• Atg8 ligation to PE is to mediate delivery of specific cargo to autophagosomes and
lysosomes
• Trafficking machinery
DEGRADATION ET PROTEASOME
Excursion: Autres signaux

DESTRUCTION BOX
Cyclines : RTALGDIGN

PEST : PEST
Dégradation de protéines – le protéasome
CONTENU
• INTRODUCTION ET RAPPEL
• Comment détruire une protéine?
• Mécanismes de sauvetage UPR
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• lien entre protéasome et chaperone (pliage et
destruction)
• la déchetterie cellulaire
DEGRADATION ET PROTEASOME
Le protéasome - introduction
- Découverte initiale: les années 60 In situ
Activités requises:
- dépliage (chaperonnes reverses)
- reconnaissance
- protéolyse

-« self compartmentalizing proteases


Dans les TROIS MONDES
Archae, bactérie, eukaryotes
Découverte dans les bactéries:
Comparaison de séquences (hsIV, prcB)
reconstitué
Du simple au complexe

Bactéries: non-essentielle
Levure: essentielle
Bactéries: sans compartiments
Membranaires/vésicules
« protéasome sans chapeau »
Cible thérapeutique:
Bortezomib: myélome multiple; peptide-acide
boronique
DEGRADATION ET PROTEASOME
Protéasome: les étapes

liaison Depliage Translocation Relargage


Et
protéolyse
DEGRADATION ET PROTEASOME
Protéasome: les structures et composants

Régulateur (IF)

Reconnaissance Des-ubiquitination Protéolyse Relargage


DEGRADATION ET PROTEASOME
Protéasome: assemblages

Activation du pro-peptide b
Autocatalytique

Assemblage alpha: « template »


(moule?)

Inter- et intramoléculaire
DEGRADATION ET PROTEASOME
Protéasome: protéases

Trypsine:chymotrypsine
DEGRADATION ET PROTEASOME
Protéasome: la structures des chambres
Tyr 126 du a (points blancs)
accès

Chambre diamètre 5 nm;


70 nm3:
70 kDa

Hélices et sandwiches;
site interaction;
15x11 nm;
Extension N term a en « top »:
accès ?
Accès restreint aux peptides
depliés

Movie protéasome opening


DEGRADATION ET PROTEASOME
Protéasome: dynamique des chambres

avec PA
Sans PA
DEGRADATION ET PROTEASOME
Protéasome: la mécanique et mètre moléculaire

a [
b
[
b
[
a
[
Comment bouge le peptide?
Sites catalytiques et Mètre géométrique
Jaune: le plus hydrophobe
Processif
Dégradation de protéines – le protéasome
CONTENU
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• Comment détruire une protéine?
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• ERAD et destruction de protéines
• L’Ubiquitination, trafic et protéasome
• Le protéasome: assemblage, structure et fonction
• lien entre protéasome et chaperone (pliage et
destruction)
• la déchetterie cellulaire
DEGRADATION ET PLIAGE
lien entre protéasome et chaperonnes
PROTEASOME

Comment détecter les substrats de l’ubiquitylation?

Protéines sur verre


PROTEASOME

Comment détecter les substrats de l’ubiquitylation?