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Noyau, nucléole, chromatine

I) Le noyau
1) Introduction
- Le noyau occupe environ 10 % du volume cellulaire total.
- Il est délimité par une enveloppe formée de deux membranes concentriques percées de
pores.
- L'enveloppe est emprisonnée entre deux réseaux de filaments intermédiaires.

- Le noyau peut être observé au MET et c'est par cryofracture que l'on distingue mieux les
éléments : ribosomes, microfilaments et microtubules fixés sur la membrane externe, lamina
sur la membrane interne.
- La présence du noyau différencie les cellules procaryotes des cellules eucaryotes.
- Le noyau contient le matériel génétique sous forme d'un ensemble de chromosomes (2 m de
double hélice d'ADN). Au cours des différentes phases de la mitose et de la méiose, le noyau
change de forme et de volume.

- Le matériel nucléaire peut être isolé par lyse cellulaire puis, par centrifugation.
- Les noyaux sont directement accessibles à la micromanipulation.

2) L'enveloppe nucléaire
- L'enveloppe nucléaire est constituée d'une double membrane lipidique comportant de
nombreuses protéines.
- Elle comporte des pores nucléaires, enchâssés dans une structure protéique volumineuse de
125 millions de daltons, constituée de plus de 100 protéines.
- Les deux membranes, externe et interne, délimitent un espace de 10 à 50 nm.
- La lamina est formée de protéines fibrillaires interagissant à la fois avec la membrane
interne, la chromatine et les complexes du pore nucléaire.
2.1.) Les lipides et dérivés de lipides
- La composition en lipides : 10 % de cholestérol, 55 % de phosphatidyl choline, 20 % de
phosphatidyl éthanolamine.
- La membrane est étanche, mais fluide.
2.2.) Les protéines
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- Il y a deux fois plus de protéines que de lipides ; ces protéines sont essentiellement celles qui
constituent les pores nucléaires.

3) Les pores nucléaires


- Il existe 3 à 4000 pores nucléaires par noyau, donnant une densité de 2 à 60 pores par m2.
Le nombre de pores varie en fonction de l'activité cellulaire.
3.1) Structure
- Le complexe de pore nucléaire apparaît comme une structure cylindrique de 100 nm de
diamètre. Il correspond à une zone de fusion des membranes interne et externe et délimite un
canal aqueux central de 9 nm de diamètre et de 15 nm de long.

3.2) Composition
- On distingue, du cytoplasme vers le nucléoplasme :
- Un anneau cytoplasmique de 32 MDa auquel sont rattachées 8 fibrilles courtes.
- Un anneau nucléoplasmique de 21 MDa auquel est rattachée une sorte de panier
formé de 8 filaments se rassemblant en anneau
- Une structure centrale de 55 MDa de la taille d'un ribosome et formé de 8 domaines
répétés.
- Cette structure, de symétrie d'ordre 8, est retrouvée conservée chez tous les eucaryotes.

3.3) Rôle des pores


- Ils permettent le passage par diffusion libre des petites molécules. Pour les molécules plus
grosses il faudra un transport actif via des récepteurs spécifiques.
- Le passage des sous unités ribosomiques ou des polymérases se fera par un transport actif
par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques localisés dans les complexes des pores.
3.3.1) Nucléoporines et karyophérines
- Les nucléoporines comportent un motif répété FG.
- Certaines ont une localisation variable, dynamique dans la structure du pore.
- Elles ont un rôle dans le transport et le maintien de la structure du nucléopore.

- Les karyophérines forment trois classes de protéines : les importines, les exportines et les
transportines.
- En présence de RanGTP, les exportines fixent les transporteurs, et les importines relâchent
les transporteurs.
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- Le transport nucléaire est une suite d'importations et d'exportations de protéines gouvernées


par un gradient de RanGTP, faiblement concentré dans le cytoplasme et fortement concentré
dans le noyau.

3.3.2) Interaction des nucléoporines avec la membrane


- Les protéines qui possèdent des domaines transmembranaires interagissent directement avec
la membrane.
- D'autres sont enchâssées au niveau de l'anneau cytosolique ou par l'intermédiaire du réseau
de lamine.

3.4) Le transport actif


- Il nécessite un système de reconnaissance et de l'ATP.
- On a pu ainsi mettre en évidence la présence de séquences signal spécifiques (Nuclear
Localisation Signal, NLS) de 4 à 8 a.a., riches en Lys et Arg, spécifiques de l'adressage à
travers les pores nucléaires. Ces séquences signal ne sont pas détruites pour pouvoir être
réadressées en fin de mitose.
- Les ARN et les sous unités ribosomales passent dans le sens inverse des protéines nucléaires
: le pore fonctionne dans les deux sens.

3.5) Différentes étapes du transport actif des protéines vers le noyau


1. Reconnaissance : formation d'un complexe entre une ou plusieurs protéines cytosoliques et
la NLS.

2. Transport : interaction avec les fibrilles protéiques intracytoplasmiques fixées sur la


membrane externe et transport.

3. Dissociation du complexe : le complexe et les protéines Ran se retrouvent dans le


nucléoplasme et se dissocient.

4. Recyclage vers l'extérieur : retour dans le cytoplasme des importines et des Ran.
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- La succession des phénomènes d'importation reste identique à l'exportation : formation d'un


complexe initiateur – transport – recyclage des protéines de transport.

- Les facteurs cytosoliques responsables de la reconnaissance et du transport des protéines à


faire passer à travers les pores sont des Hsp.
3.6) Transport des ARNm
- Pour le transport des ARNm, il y a nécessité de fixation de protéines de transport dès la
synthèse : complexe nucléoprotéique.
- C'est la structure de coiffe en 5' qui est requise pour le passage du pore et l'engagement dans
la machinerie d'épissage.
- Les signaux d'exportation nucléaires se trouvent dans ces protéines de transport.

4) La lamina nucléaire
- La lamina est un treillis de filaments intermédiaires qui double la face interne de la
membrane nucléaire, les lamines.
- Elle fait de 10 à 20 nm d'épaisseur.
- La lamina stabilise l'enveloppe nucléaire dans son volume et dans sa forme et est en
interaction avec à la fois la membrane, mais aussi la chromatine.
- Les lamines qui la composent ont un PM de 70 000. Elles font partie de la famille des
protéines des filaments intermédiaires.
- Elles contiennent un signal de transport nucléaire, un domaine d'interaction avec
l'enveloppe, un domaine de liaison avec la chromatine et un site de phosphorylation.
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5) La matrice nucléaire
- C'est un réseau de protéines filamenteuses insolubles que l'on peut isoler après délipidation
du noyau en présence de détergent et après dégradation de l'ADN et de l'ARN.
- Elle permettrait la structuration du matériel nucléaire.

6) Membrane nucléaire et division cellulaire


- La phosphorylation des lamines par les Cdk entraîne leur dépolymérisation au moment de la
prométaphase.
- Les complexes de pores se dissocient aussi partiellement par les mêmes mécanismes de
phosphorylation sur certaines nucléoporines.
- La fragmentation de la lamina est responsable de la formation de vésicules membranaires
aplaties.
- Lors de la télophase, la déphosphorylation des lamines permet leur repolymérisation et la
reconstitution de la lamina.
- Les vésicules membranaires sont alors rassemblées, s'attachent à la surface des
chromosomes, puis fusionnent.

II) Le nucléole
- C'est une structure localisée dans le noyau, de quelques m de diamètre et visible au
microscope optique.
- Il n'est pas limité par une membrane.
- C'est le siège de la transcription des ARNr.
- Le nucléole disparaît au cours de la mitose.
1) Observation en microscopie électronique
Composante granulaire
- Ce sont des grains plus ou moins denses de 15 à 20 nm de diamètre.
- Ils contiennent des particules préribosomiques (ribonucléoprotéines).
Centres fibrillaires
- De tailles plus petites, ils sont présents en multiples copies.
- Ils contiennent l'ADN qui n'est pas activement transcrit.
Composantes fibrillaires denses
- Elles entourent les centres fibrillaires.
- Elles contiennent de la chromatine et des complexes contenant des transcrits néosynthétisés.
Des agglomérats
- Ce sont des mottes de chromatine condensée, situées en périphérie.

2) Organisation moléculaire
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L'étude des constituants du nucléole montre la présence d'ADN, d'ARN et de protéines.

2.1) Les organisateurs nucléolaires


- Les gènes ribosomaux sont localisés au niveau des extrémités de 5 chromosomes : 13, 14,
15, 21 et 22.
- Ce sont les séquences d'ADN correspondant à ces groupes de gènes situés dans les boucles
qu'on appelle organisateur nucléolaire.

2.2) Les gènes ribosomiques et la transcription en ARN pré-ribosomiques


- L'ADN comporte, sur chaque chromosome un motif répété de 18 000 pb codant pour un
premier transcrit de 45 S (13 000nucléotides) qui sera ensuite clivé en trois ARN :
18S + 5.8 S + 28 S
- Les protéines impliquées dans la transcription des gènes ribosomiques sont des protéines
nucléolaires solubles : UBF (Upstream Binding factor) et SL1.
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- La synthèse, la maturation, l'assemblage et la compaction sont réalisés simultanément et


aboutissent à la formation de particules de ribonucléoprotéines.

- La maturation du précurseur 45 S en 28, 5.8 et 18 S est complexe et comprend : excision,


méthylation sur le ribose et pseudouridinylation.

Différentes étapes :
- Transcription de l'ARN45 S
- Empaquetage de chaque transcrit par un granule riche en protéines : première interaction
protéine / ARN dans le nucléole.
- Intégration du transcrit 45 S dans un complexe contenant de nombreuses protéines
différentes importées dans le noyau à partir du cytoplasme.
- Incorporation de la majorité des 80 protéines ribosomales et de l'ARN 5 S.

- L'assemblage final en sous unités ribosomiques se fait dans le cytoplasme.


- L'ARN 18 S est incorporé dans la petite sous unité.
- Les ARNs 5 S, 5.8 S et 28 S sont incorporés dans la grosse sous unité.

3) Organisation fonctionnelle
- Au microscope électronique, on peut reconnaître trois structures : fibrillaire, fibrillaire dense
et granulaire.

3.1) Fonction des différentes structures


- On utilise des AC marqués contre les différentes structures.
- Le centre fibrillaire : contient des fibrilles correspondant aux séquences non transcrites des
ADNr.
- La jonction des centres fibrillaires et de la composante fibrillaire dense : initiation et début
de la transcription des gènes.
- L'ARN pol I et la topoisomérase I se localisent au niveau du centre fibrillaire et en
périphérie.
- La composante granulaire : maturation, stockage des particules pré-ribosomiques formées
après association avec les protéines importées du cytosol.
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4) Organisateurs nucléolaires chromosomiques et mitose


- Il y a disparition progressive du nucléole en fin de G2 et reformation du nucléole à partir du
début de G1.
1. Disparition de la composante fibrillaire dense
2. Disparition de la composante granulaire, structure responsable de la maturation.
3. Persistance, mais séparation des centres fibrillaires :
- Empaquetage des facteurs de transcription UBF, SL1, ARN Pol I et topo I
- Inactivation des complexes SL1 et UBF par phosphorylation par la cdc2 – cycline B
4. A la télophase : redémarrage de la transcription : réapparition de la structure dense autour
des centres fibrillaires puis de la structure granulaire.

5) Maturation et transport des pré-ribosomes


- Les trois fragments d'ARN ne sont pas libres, mais associés à des protéines recyclées ou
nouvellement synthétisées et importées dans le noyau.

Conclusion :
- Dans le nucléole, transcription des séquences d'ADN du gène 45 S et synthèse d'un
précurseur 45 S
- Formation de particules préribosomiques qui vont migrer indépendamment dans le
cytoplasme.
- L'adjonction de l'ARN 5S, qui est synthétisé dans le nucléoplasme et pas dans le nucléole,
par l'ARN Pol III se fait sous forme d'une particule ribonucléoprotéique dans le nucléole, sur
la grande sous unité, qui n'est pas encore mature.
- Les deux sous unités sont maturées et associées dans le cytosol.
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III) La chromatine
- La chromatine se présente sous forme de mottes condensées ou dispersées situées en
périphérie du nucléole et le long de l'enveloppe nucléaire.
- La chromatine contient deux fois plus de protéines que d'ADN.

1) Les histones
1.1) Définition et caractéristiques
- Il existe cinq classes d'histones : H2 A, H2 B, H3, H4 et H1.
- Les histones sont des protéines de faible poids moléculaire : H 2 A, H2 B, H3, H4 font entre 10
et 15 kD ; H1 a une masse de 21 kD.
- Elles sont toutes basiques car riches en Lys et Arg.
- Les gènes d'histones sont présents en multiples copies et sont transcrits de façon coordonnée
en liaison avec le cycle cellulaire, lors de la phase S.

1.2) Modifications post transcriptionnelles des histones


- L'acétylation est induite, au niveau des lysines, lors de la stimulation de la transcription.
- La phosphorylation des histones H1 accompagne des mécanismes du cycle cellulaire.
- La méthylation se fait au niveau des Arg et des Lys et intervient dans des processus très
divers : formation et maintenance de l'hétérochromatine et régulation transcriptionnelle.

1.3) Structure des gènes d'histones


- Il y a plusieurs copies de gènes.
- H1 a son propre promoteur ; H2A et H2B ont un promoteur commun, de même que H3 et H4.

1.4) Organisation des histones dans la chromatine


1.4.1) L'octamère d'histones
- Les quatre histones forment spontanément, après leur synthèse un double hétérotétramère
formé du tétramère de base (H 3 H4)2 sur lequel se positionnent les deux dimères (H 2A)2 et
(H2B)2.
- Les histones sont très conservées dans l'évolution.

1.4.2) Fonctionnement de l'octamère :


- L'octamère d'histones s'assemble à partir de régions non basiques ; les régions basiques
restent donc disponibles pour l'interaction avec l'ADN.
- Jusqu'à 1 M NaCl, l'octamère n'est pas dissocié et peut encore interférer avec l'ADN ; il
s'agit d'une interaction ionique forte.
- Cette interaction entraîne l'enroulement de la double hélice de l'ADN autour du coeur
d'histones : c'est la compaction linéaire de l'ADN.
- H1 interagit avec l'ADN et le complexe octamère – ADN par des liaisons ioniques moins
fortes (dissociables à 0.6 M Na Cl).
- Les histones assurent une protection vis à vis des DNAses, mais cette protection n'est pas
aléatoire.
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2) Structure du nucléosome
2.1) Mise en évidence
- Dans toutes les cellules eucaryotes, il existe une structure répétée, formée par les
interactions histones-ADN.
- Quand une cellule fait disparaître son noyau par apoptose, il y a dégradation par coupure non
aléatoire de l'ADN et génération de fragments de plus en plus petits jusqu'à des fragments de
206 kDa et 146 pb d'ADN.
- Cette structure unitaire représente le nucléosome, petit disque de 120 A de diamètre sur 70 A
d'épaisseur.
2.2) Structure
- Les extrémités N terminales des histones émergent de la surface de l'octamère et sont donc
exposées vers l'extérieur du nucléosome, où elles sont l'objet de modifications : acétylation
des lysines.
- L'extrémité N term de H4 participe directement aux interactions entre nucléosomes.
- La structure nucléoprotéique résistante à la digestion est le coeur du nucléosome auquel
l'histone H1 n'appartient pas.

- La cellule eucaryote gère les torsions de l'ADN simplement par l'existence de structures
fixées d'ancrage des boucles et grâce à la topoisomérase qui relâche les contraintes.
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2.3) Localisation et rôle de l'histone H1

- L'histone H1 est localisée aux points d'entrée


et de sortie du nucléosome, à l'extérieur de la
structure nucléosomique.

- Rôle :
- elle stabilise la fibre chromatinienne, en la
rendant moins dynamique et donc, plus stable.
- elle participe à la compaction de la fibre chromatinienne (de la
chaîne polynucléosomique) et interagit notamment avec H4.
- H1 est la seule histone à être facilement interchangeable (à
force ionique entre 0.4 et 0.6 M NaCl.
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3) La fibre chromatinienne
3.1) Structure et caractéristiques :
- Dans certaines conditions, elle se présente comme un collier de perles de 11 nm.
- Une organisation supérieure sous forme d'un empaquetage donne des filaments de 30 nm de
diamètre : le solénoïde.
- Cette compaction des nucléosomes est due aux interactions nucléosome – nucléosome
(octamère – octamère) et aux histones H1 et H4.

- La structure supérieure est la formation des domaines chromatiniens qui correspondent à une
longueur d'ADN entre 30 et 100 000 pb.

"Collier de perles"

Solénoïde

Boucles et fibre condensée

Chromosome supercondensé
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Selon Mr Oudet, le terme de fibre chromatinienne s'applique à toutes les structures quelque
soit leur agencement et leur degré de compaction. Il distingue : la fibre sous forme de "collier
de perles", la fibre sous forme de solénoïde, la boucle et la fibre condensée et le chromosome
super condensé.

- Certaines séquences d'ADN sont résistantes aux DNAses : ce sont les séquences SAR ou
MAR, riches en AT qui correspondent aux zones d'ancrage dans le noyau. Elles sont isolables
après digestion DNAsique poussée et purification en présence de force ionique élevée.

3.2) Domaines chromatiniens


- Les domaines chromatiniens, de 30 à 100 000 pb, sont des domaines structuraux et
fonctionnels présents dans le noyau interphasique ; c'est le squelette des chromosomes.

4) Rôle des topoisomérases


- Les domaines chromatiniens forment des boucles de fibres chromatiniennes équivalents à
des molécules d'ADN circulaires fermées.
- Toute modification de torsion de l'ADN dans un domaine génère un entortillement.
- Toutes ces contraintes sont gérées par les topoisomérases.
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4.1) La topoisomérase I
- Elle génère des coupures transitoires simple brin : cette coupure permet à l'un des brins de
tourner autour de l'autre afin de retrouver la structure relâchée.
- Elle n'utilise pas d'ATP.
4.2) La topoisomérase II
- Elle génère des coupures double brin et se situe au niveau des points d'ancrage.
- Elle fonctionne en créant une liaison covalente entre l'enzyme et l'ADN et nécessite
l'hydrolyse de l'ATP.
- Elle permet le passage d'un deuxième double brin à travers la coupure.
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IV) La chromatine active


1) Introduction
- L'essentiel du génome (plus de 80 %) est empaqueté dans les fibres chromatiniennes.
- Tous les nucléosomes ou toutes les régions des fibres chromatiniennes ne présentent pas la
même accessibilité aux DNAses.
- Il y a modification dynamique des structures et de leurs interactions lors de la transcription
et de la synthèse de l'ADN.

2) Mécanismes permettant la transcription des gènes de la structure chromatinienne


Les gènes transcrits présentent des niveaux différents d'empaquetage
2.1) Inhibition de la transcription par les histones
- Les ARN Pol peuvent transcrire un ADN empaqueté dans une structure chromatinienne,
mais la présence des histones freine la progression de la transcription de l'ADN
- C'est l'initiation de la transcription qui est affectée, plus que l'élongation.
- La modification des interactions entre H1 et la fibre chromatinienne aboutit à une structure
décondensée et la transcription pourra se faire plus facilement.

Départ de H1 et / ou séparation
de l'octamère

Une partie des études concernant les interactions avec les histones et les protéines de la
transcription a été réalisée sur les chromosomes polytènes.
- Chromosomes polytènes : structure polyploïde amplifiée 1000 fois à la suite de l'existence
de 10 cycles de réplication sans séparation des chromosomes ni des cellules.
- Dans les chromosomes polytènes, on peut localiser la chromatine active en transcription
dans les puffs. On peut activer ou au contraire inhiber les mécanismes de transcription.

2.2) Décompaction des domaines chromatiniens


- Des domaines chromatiniens de plusieurs milliers de paires de bases, contenant les gènes
transcrits, sont décompactés et deviennent sensibles aux DNAses.
- Expérience de digestion de l'ADN d'un gène réprimé et d'un gène transcrit : elle se fait en
comparant la synthèse de la globine dans des érythroblastes d'embryons de poulet où cette
synthèse a lieu à une période bien précise de l'embryogenèse, par rapport à des érythrocytes
adultes.
- La sensibilité aux DNAses précède la transcription et persiste quelques temps après l'arrêt de
la transcription.
- Un gène devient sensible aux DNAses spécifiquement dans les tissus où il s'exprime.
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2.3) Modification des histones


- Les modifications chimiques des histones sont responsables de la décompaction de l'ADN.
- Durant la phase S, le coeur d'histone est acétylé et H1 porte des groupements P.
- L'acétylation et la phosphorylation vont diminuer la force de l'interaction électrostatique
entre la structure basique et l'ADN.
- Il existe un ensemble de régulations enzymatiques organisant les mécanismes séquences
spécifiques.

2.4) Sites hypersensibles


- Ce sont des sites non aléatoires, localisés sur quelques pb.
2.4.1) Sites dépourvus de nucléosomes
- Certains nucléosomes occupent des sites séquences spécifiques. Ils sont généralement
positionnés de part et d'autre de séquences préférentiellement sensibles aux DNAses.
- Il existe des régions dépourvues de nucléosomes dans la chromatine correspondant à des
séquences spécifiques répétées de quelques dizaines de pb.
- Exemples : gènes du virus SV 40 et gènes d'histones.
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2.4.2) Modulation des sites hypersensibles


- Les sites hypersensibles sont modulés lors de l'induction et de l'arrêt de la transcription.

Expérience : étude de l'expression de gènes induite par une hormone, comme la conalbumine
ou l'ovalbumine dans les cellules d'oviductes de poule.
- Certains sites sont induits par la transcription du gène, d'autres vont être supprimés par le
gène transcrit.
- Il y a généralement persistance de sites hypersensibles en amont ou au voisinage des sites
d'initiation de la transcription.

3) Mécanismes agissant sur la structure nucléosomique et la fibre chromatinienne


3.1) Inhibition modulée de la transcription par les histones
- In vivo, les ARN polymérases peuvent transcrire un ADN empaqueté par des octamères
d'histones.
- L'initiation de la transcription in vitro est inhibée par la présence d'octamère d'histones ce
qui prouve l'existence, in vivo, de facteurs de transcription spécifiques.

3.2) Déplacement des histones par les activateurs


Exemple de l'activation de la transcription du gène de la phosphatase acide :
Structure inactive :
- Le promoteur du gène de la phosphatase acide contient 4 nucléosomes positionnés
spécifiquement par rapport à la séquence et un de ces nucléosomes est positionné sur deux
séquences reconnues par les facteurs de transcription Pho 3 et Pho 4.
- Une troisième séquence, reconnue par Pho 4 est située entre les deux séquences masquées
par les nucléosomes.
Structure active :
- Fixation du facteur Pho 4 qui va interagir avec sa séquence spécifique et va diminuer la
stabilité des interactions protéines – ADN du nucléosome voisin.

Pho 3 Pho 4

1 2 3 4

Pho 4

3.3) Mécanismes d'activation de la transcription


Les activateurs de la transcription envahissent les nucléosomes.

Compétition dynamique :
- Les sites de fixation des activateurs de la transcription sont :
- localisés entre les nucléosomes
- localisés au point d'entrée ou de sortie du nucléosome
- proches de l'axe de symétrie du nucléosome (déplacement de l'histone H1)

Fixation préventive des transactivateurs :


- Changement de la structure chromatinienne durant la réplication.
- Obtention d'une programmation cellulaire : stabilisation d'une structure active ou inactive.
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Modifications des histones :


- Les acétyl transférases et désacétylases font partie des complexes enzymatiques régulant
l'expression des gènes.

3.4) Rôle des régions de contrôle de la transcription à distance


- Les LCR (Localised Control Regions) sont des séquences hypersensibles de contrôle à
distance agissant en cis, se trouvant sur le même brin d'ADN.
- Elles sont situées à distance des gènes, jusqu'à 20 000 pb des gènes transcrits (enhancers).

4) Chromatine active en réplication


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Le cycle cellulaire :
- G1 : synthèse d’organites
- S : synthèse de l’ADN
- G2 : préparation à la mitose
- M : séparation des chromosomes et des cellules ; généralement pas de transcription
ni de réplication
Synthèse de l’ADN et entrée en mitose sont régulées par les kinases associées aux cyclines.
En début de réplication, les complexes enzymatiques de la réplication sont immobilisés sur la
matrice.