UPIBI-IPN

Biotecnología Farmacéutica]
[Manual de Laboratorio

[2018]

http://www.unav.es/adi/servlet/Web?nexus=4000006049

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA

Departamento de Bioprocesos

Academia de Biotecnología

Realizado por:
M. en e. Hernán Gortés
M. en C. Flor Selene Villalobos
Dra. Estela Flores Gómez

PROPIEDAD DE :___________________________________

Grupo:________________Equipo:___________________
 Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica

REGLAMENTO DEL LABORATORIO

El laboratorio representará el 30% de la calificación final de la materia de Biotecnología

Farmacéutica

La calificación de laboratorio se distribuirá de la siguiente manera:

1. TRABAJO PRÁCTICO 30%

- Asistencia al laboratorio.
- Puntualidad. Se dará un máximo de tolerancia de 10 minutos.
- Limpieza de su mesa de trabajo y tarja al inicio y fin de clase.
- Cada alumno deberá presentarse a la sesión de laboratorio con bata y con su manual de
prácticas engargolado en el cual deberán anotar todos los resultados obtenidos en las
prácticas.
- El material se entregará una vez llenado de manera correcta el vale correspondiente.
- El comportamiento del alumno dentro del laboratorio estará regido por el reglamento general
del laboratorio de biotecnología.
- Cooperación con el grupo (esterilización de material, lavado y preparación de reactivos así
como asistencia extraclase)
- Cumplir con el reglamento interno para laboratorios del departamento de Bioprocesos.

2. BITÁCORA 10%
La bitácora tiene como finalidad escribir lo realizado en cada sesión de laboratorio con fecha
para que ésta sirva de guía en la realización del reporte final, deberá llevar:

Titulo 0.5%
Objetivos 0.5%
Hipótesis 1%
Diagrama de flujo de la metodología
con modificaciones al protocolo anotadas a un costado
y puntos críticos marcados con simbología de triangulo
con signo de admiración 2%
Resultados 3%
Discusión 2%
Conclusiones 1%

NOTA IMPORTANTE: Si la sesión no tiene fecha de realización la bitácora tendrá un valor de

cero.

3. INFORME POR EQUIPO 30%

Este porcentaje se divide en:
- Introducción 10%
- Objetivo General y objetivos específicos 5%
-Metodología 10%
- Resultados 20%
- Discusión de resultados 30%
- Cuestionario 10%
- Conclusiones 10%
- Referencias bibliográficas 5%
( De acuerdo a formato APA)

4. EXAMEN DE LABORATORIO 20%

Consistirá en una evaluación del conocimiento adquirido durante las prácticas

5. DISCUSIÓN 10%
Consistirá en traer resuelta una guía previa y un cuestionario final el día de inicio de la práctica
y en la sesión de discusión con la finalidad de obtener la participación individual durante la
sesión de discusión.

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PRACTICA 1. OBTENCIÓN DE ADN GENÓMICO DE HONGOS

I. OBJETIVO GENERAL

Extracción de ADN genómico de Hongos de importancia Farmacéutica.

II. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Comprender los fundamentos del proceso de extracción de ADNg

b) Analizar la calidad del DNAg a través de la electroforesis en gel de agarosa.
c) Analizar la pureza y concentración del DNAg.
d) Obtener el Peso Molecular del DNAg
e) Discutir la importancia de la Ing. Genética dentro de la Farmacéutica

III. INTRODUCCIÓN

La producción de antibióticos ha resultado ser una de las más lucrativas actividades de la

industria farmacéutica en los últimos cincuenta años, razón por la cual en este tiempo se han
conseguido los mayores avances en el conocimiento de la biosíntesis de la mayoría de dichos
compuestos (la penicilina es un buen modelo y un ejemplo, a este respecto). El conocimiento
de los mecanismos básicos de biosíntesis de antibióticos (fundamentalmente los denominados
beta-lactámicos) ha permitido la puesta a punto de importantes procesos de producción a gran
escala. A medida que se optimizaron la composición del medio de cultivo, las condiciones de
temperatura, aireación, etc. o se mejoraron las cepas productoras, por medio de técnicas de
mutagénesis al azar, se consiguió aumentar en varios órdenes de magnitud la producción de
antibiótico.
La Biología Molecular supone una herramienta avanzada en cuanto a la posibilidad de mejora
genética de las cepas de producción industrial. Estas técnicas posibilitan la modificación
controlada del genoma del microorganismo, permitiendo en todo momento asignar una relación
causa-efecto entre la alteración introducida y el resultado observado (algo mucho más
complicado de analizar en el caso de las mutaciones inducidas por “métodos clásicos”).Gracias
a esta disciplina, se puede observar el efecto de cambios introducidos en todos los niveles de
la ruta de biosíntesis (incorporación de los compuestos precursores, ensamblaje de los
productos intermediarios de la vía y secreción al medio). Pueden observarse, asimismo, los
efectos de la introducción de factores que afecten de forma global al proceso e incluso
obtenerse compuestos que anteriormente no eran producidos por el microorganismo.
La utilización de las técnicas de Ingeniería Genética ha permitido dar un nuevo impulso al
desarrollo de cepas con mayor producción de antibióticos, pero también ha servido para
conocer en detalle la naturaleza de los cambios ocurridos durante los procesos de mutagénesis
al azar (tanto en los casos en los que se consigue aumentar la producción como en los que
ésta resulta disminuida) y la localización específica de tales cambios en el genoma del
microorganismo.Se puede hablar a este nivel de dos tipos de mecanismos relacionados con la
producción de antibióticos: por un lado los mecanismos directamente relacionados con este
proceso, es decir los que intervienen de modo fundamental en la producción del antibiótico y
por otro los que podríamos denominar como indirectamente relacionados (que afectarían de
modo pleiotrópico al proceso o modificarían éste por completo).

IV. MATERIAL Y REACTIVOS

- Mortero estéril y altamente frío.

- Pistilo para mortero estéril previamente enfriado.
- Micropipeta 1 ml, 20 ul
- Puntas para micropipeta 1 ml y 20 ul estériles
- Tubos eppendorf estériles
- un cuadrito de parafilm
- Cepa de hongo de importancia farmacéutica.
- Guantes

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EQUIPO
- Microcentrífuga
- Espectrofotómetro
- Celdas de cuarzo.
- Cámara de Electroforesis
- Campana de extracción

REACTIVOS
- Arena de cuarzo blanca
- Buffer de extracción (100 mM TrisHCl pH 8.0, 20 mM Na2EDTA, 0.5M NaCl, 1% SDS)
- Fenol (25 partes): Cloroformo (24 partes): Isoamilico (1 parte)
- Isopropanol frío
- Acetato de sodio 3.0 M pH 5.2
- EtOH 70 %
- Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0)
- Buffer de corrimiento TAE 50X (Trisbase, Ac. acético glacial, Na 2EDTA pH 8.0)
- Buffer de carga (Tris, azul de bromofenol y glicerol)
- Bromuro de Etidio.
- Marcador de peso de 1Kb como control.

Asignación por equipo

ACTIVIDAD MATERIAL OBSERVACIONES ELECTROF EQUIPO
ORESIS ASIGNADO
1 Arena/isopropanol frío alicuotas 5 tubos con 1g/ 5 de 5ml cada una LAVAR y
de 5 ml /ETOH 70% alicuotas en alicuotas en falcon 15ml para MONTAR
de 5 ml/ 10 alicuotas de agua isopropanol y ETOH 70% (nota, CAMARA
MILIQ en un frasco gerber, esterilizar 1.5 ml de agua destilada
rotular 2 por equipo en falcon de 15 ml y completar
después de estrilizar con ETOH
70%)
2 Buffer de extracción 5 alicuotas de 15 ml cada HACER
PREPARAR CAJA PARA GEL
CONTENER MUESTRAS EN AGAROSA
TUBOS EPPENDORF, 0.7% CON
ROTULADO PARA EL 2ul Rojo
CONGELADOR A Texas
-20ºC y serán responsables
de guardar las de todo el
grupo
3 1 frasco con 10 eppendorf 5 frascos de cada uno por equipo Recoger y
limpios sin sales por equipo guardar
1 frasco con puntas azules cámara y
limpias sin sales buffer 1X
1 frasco con puntas amarillas y
blancas pequeñas limpias sin
sales

4 1 Mortero y pistilo por 5 de cada uno/ 5 alicuotas de Preparar

equipo /Acetato de sodio 500 ul acetato de sodio Buffer TAE
por equipo 1X
IMPORTANTE: partiendo
DEJAR EN CONGELADOR los de un 50X
morteros y pistilos
A -20ºC
5 Esterilizar material limpio y Tomar foto
limpiar y acomodar gaveta del gel y
subir a sitio
Colocar mantel para fenol en de internet
campana y recoger fenol y
mantel dejando limpia
campana de extracción
IMPORTANTE: TODO MATERIAL DEBERÁ ESTAR ROTULADO PARA CADA EQUIPO

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V. METODOLOGIA

5.1 Obtención de ADN genómico de hongos

Método modificado de Chow and Kafer (Fungal Genet. Newsl. 40:25-27) utilizando Arena de
cuarzo blanca usada como agente pulverizante.

1. PONTE TUS GUANTES y CUBREBOCAS

2. Se coloca 1 gr del micelio y esporas en un mortero se añade N 2 líquido y se muele la
muestra, en caso de no tener N2 líquido se coloca el mortero en un recipiente con hielo.
3. Antes de que se descongele se añade 2 gr de arena por gramo de tejido.
4. Posteriormente se añade 4 ml de buffer de extracción y se muele durante 5 minutos.
5. Se corta una punta azul estéril para micropipeta de 1 ml con unas tijeras (alrededor de 0.5
cm de la punta).
6. Se pasa 1.0 ml de ésta suspensión de hongo y arena a tubos para micro centrifuga
(eppendorf) estériles. Mínimo 4 tubos por equipo

7. Se añade a cada tubo eppendorf 0.5 ml de la mezcla fenol:cloroformo:isoamilico.

8. Se mezcla vigorosamente durante 30 segundos con un pistilo estéril ó se agita el tubo en el
vórtex. NOTA: El fenol es corrosivo y quema la piel. Usa guantes.
9. Los tubos se centrifugan a 13 krpm por 5 min a T amb.
10. El debris celular y la arena se van al fondo del tubo formando un pellet. Por encima
de éste se encuentra la mezcla de fenol:cloroformo:isoamílico y encima se forma una
capa de proteínas que no debes romper cuando tomes la fase de acuosa que ésta hasta
arriba.
11.Ésta fase acuosa se transfiere a un tubo eppendorf nuevo (ADN).

NOTA: Se puede hacer otra extracción con fenol:cloroformo:isoamilico si se desea antes

de la precipitación con isopropanol
12.Se añade 0.1 V de acetato de sodio, se agita suavemente y se añade 0.6 V de
isopropanol frío.
13.Se incuban las muestras a 4°C (hielo) ó en un ultracongelador (-20°C ó -80°C) por
15 min.
14.Centrifugar a 12krpm por 10 min para recuperar el precipitado.
15.Se lava el pellet con 500 µl de EtOH 70%, agitando en el vórtex.
16.Centrifugamos 13krpm, 1 min para recuperar la pastilla.

17.Decantamos sobrenadante y se deja secar el pellet por 20 min. (si se desea se vuelve a
realizar el lavado)

18.Una vez seco el pellet (ADN) se resuspende en 200 ul de buffer TE ó agua estéril.

5.2 Electroforesis en gel de agarosa.

La calidad de ADN se determina mediante una corrida de electroforesis en gel de agarosa al

1%.

1. Pesar 1 gr de agarosa y añadir Buffer TAE 1X para completar 100 ml.

2. Se funde en un horno de microondas, se enfría un poco y se añade 1 ul de Rojo Texas
10000X.
Nota: La adición del Rojo Texas puede hacerse de diferentes formas.
3. Se deposita en el carro con el peine para crear los pozos en el gel.
4. Se deja solidificar en una campana de extracción.
5. Se desmonta y se coloca en la cámara de corrimiento con Buffer TAE 1X cuidando
que cubra el gel de agarosa.
6. Para cargar la muestra, se coloca 5 ul de ADN y una gota de buffer de carga (6X) sobre
un cuadrito de parafilm, se mezclan y se cargan en el gel. Nota: se puede colocar
marcador de peso en el primer carril (1Kb).

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7. Se carga el gel de agarosa.

8. Se conecta la fuente de poder y se corre el gel a un voltaje de 70-90 V según el tamaño
de la cámara.
9. Una vez que se separaron los dos colorantes y estos llegaron ¾ partes del gel, se saca
el gel de la cámara de corrimiento y se observa en el transiluminador con la luz UV.
10. Reportar tu imagen con pie de figura indicando el PM (pb) de cada banda del Marcador
de Peso Molecular 1kb; indicar la muestra de cada carril.

5.3 Estimación de la concentración de ADN

a. Diluir 20 ml de muestra de ADN en 980 ml de agua desionizada y estéril (dilución

1/50)
b. Medir absorbancia por espectrofotometría a 260 nm usando celdas de 1 ml de
cuarzo.
c. La concentración de ADN a A260 = 1.0 en una celda de 1 cm equivale a 50 mg de
ADN por ml de agua. Para calcular la concentración de la muestra:
[ADN] = 50 mg / ml x A260 x factor de dilución (50)
[ADN total] = [ADN] x volumen eluído en ml

5.4 Estimación de la pureza del ADN

El grado de pureza o ausencia de proteínas y otros contaminantes de una disolución de ADN

puede estimarse calculando el cociente A260/A280.

Cuando este se encuentra entre 1.8-2.0 la muestra contiene casi exclusivamente ADN.

5.5Realizar Regresión Lineal para el Cálculo aproximado del PM (pares de bases, pb)

a)Gráficar en el eje de las Y, el log 10 del PM (pb) y en el eje de las X, la distancia en cm a cada
banda. Es importante medir de arriba hacia abajo tomando como base el borde superior del gel.
Sacar la ecuación de la regresión lineal y=mx+b, sustituir la distancia a la banda del DNAg y
sacar el antilogaritmo del valor Y para tener el PM en pb.

VI. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS

a) Lleve a cabo un diagrama de flujo del procedimiento efectuado y coloca del lado derecho
la función de cada solución utilizada en el proceso de obtención de ADN.

b) Discute los resultados obtenidos en tu práctica:

 Obtención de ADN
 Electroforesis en gel (FOTO GEL con ubicación de tu carril de corrimiento)
 Espectrofotometría (Concentración y pureza del ADN)

c) Elabore un dibujo de la cámara de electroforesis donde muestras el corrimiento de tu gel y

las características de la corrida.

VII. CUESTIONARIO PREVIO

1. ¿Cual es la importancia de los hongos en la Industria Farmaceútica (IF)?

2. ¿Como utilizarías la Ing. Genética en el ADN obtenido en ésta práctica?
3. ¿Para que se usa el buffer de corrimiento TAE?
4. ¿Cuales son las características del buffer de carga?
5. ¿Cómo funciona el Rojo Texas?

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6. ¿Existen otros colorantes además del Rojo Texas para hacer visible el ADN en el gel de
agarosa?
7. ¿Por que se utilizan celdas de cuarzo y no de plástico para leer ADN en el
espectrofotómetro?
8. ¿Por que se lee el ADN a una absorbancia de 260 y 280 para valorar su pureza?
9. ¿Cómo se llama el equipo que te permite visualizar el DNAg?
10.¿Cuál es el porcentaje adecuado de agarosa para realizar tu gel de acuerdo al PM (pb)?

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

http://www.fgsc.net/fgn44/weiland.html
http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/extraccionADN.htm
Fernández-Perrino F.J.. Sobreproducción de antibióticos en hongos filamentosos utilizando
técnicas de Ing. Genética Depto de Biotecnología. UAM-Iztapalapa. México D.F. (PDF)

PRACTICA 2 . TIPIFICACIÓN ABO Y FACTOR RH

I. OBJETIVO GENERAL

Analizar a reacción antígeno- anticuerpo a través de la tipificación ABO y Factor Rh con

reactivos de diagnóstico comerciales

II. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Tipificar el grupo sanguíneo de una población (clase)

b) Comprender el fundamento de la reacción Ag-Ac en la tipificación ABO
c) Discutir el beneficio de la tipificación ABO y factor Rh

III. INTRODUCCIÓN

El descubrimiento del grupo sanguíneo ABO en el año 1900 por el científico austriaco Karl
Landsteiner, causó gran entusiasmo en la comunidad científica de la época. Hasta entonces,

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toda la sangre se consideraba igual en todas las personas y no se entendían las consecuencias
a menudo trágicas de las transfusiones de sangre.(1).

Los antígenos ABO son glúcidos unidos a proteínas y lípidos de la superficie celular que
sintetizan enzimas glucosiltransferasas polimórficas, cuya actividad varía en función del alelo
heredado. Los sujetos que expresan un antígeno ABO particular toleran ese antígeno, pero los
sujetos que no expresan ese antígeno producen anticuerpos naturales que reconocen el
antígeno. (2)

Los reactivos para tipificar los antígenos del sistema ABO, se basan en anticuerpos
monoclonales producidos por líneas celulares de hibridomas murinos y ofrecen todas las
ventajas de los reactivos monoclonales actuales, es decir, un comportamiento parejo y un
abastecimiento seguro. Dado que estos reactivos no provienen de fuentes humanas, el riesgo
de transmisión de enfermedades tales como Hepatitis o Sida es nulo(3).

En la reacción Ag- Ac, los anticuerpos del sistema ABO son principalmente de clase IgM por lo
que son altamente aglutinantes. Propiedad que se emplea para su identificación (4).

En 1939 LEVINE y STETSON, luego de que una mujer diera a luz un feto muerto, hallan en el
suero de la misma un anticuerpo que aglutinaba a los glóbulos rojos del marido y a los del 80%
de la población ABO compatible.
En 1940 LANDSTEINER y WIENER inyectan hematíes de Macaco Rhesus a un conejo y
observan que éste desarrolla un anticuerpo que aglutina no solo a los eritrocitos del mono sino
que también, a los eritrocitos, del 85% de la población caucásica de Nueva York. Quienes
suponen que se trata del mismo anticuerpo descubierto el año anterior, por lo tanto, proponen
como nombre "Sistema Rh" por analogía con el antisuero producido por el conejo luego de la
sensibilización con el Rhesus. En 1942 utilizan el suero del animal como suero anti-Rh. Se
necesitaron casi 20 años para demostrar que los anticuerpos humanos y los animales no
reaccionaban con el mismo antígeno (Rho), reasignándole a este nuevo sistema el nombre de
LW en honor a sus descubridores; los antígenos de éste sistema son más frecuentes en
individuos Rh-positivos que en Rh-negativos, de allí la concordancia que originó la confusión.
El anticuerpo humano descubierto por Levine y Stetson está dirigido entonces hacia el antígeno
"D" (Rho) del sistema.(5)

IV. MATERIAL Y REACTIVOS

Reactivos tipificadores monoclonales para tipificación de grupos sanguíneos anti - a, Anti - b,

anti - a,b, anti d
Los reactivos se han formulado de acuerdo a las normas de la FDA de Estados Unidos y se
entregan coloreados de Azul y Amarillo, Anti-A y Anti-B respectivamente, reactivo Anti-A,B.
Todos los reactivos se suministran estandarizados y listos para ser usados en técnicas de
hemoaglutinación en tubo o en lámina.
Reactivo Monoclonal Anti-D (Anti-Rho)
El reactivo Anti-D es una mezcla monoclonal IgM + IgG para técnica en microplaca, en lámina y
en tubo.(3)

 Palillos de madera
 Frasco gerber con un poco de cloro para desechos de torundas con sangre, palillos.
 Un frasco gerber con torundas de algodón con alcohol

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 Un frasco Gerber con torundas de algodón secas

 Portaobjetos desengrasados (con alcohol)
 Lancetas
 Guantes

Nota: Desechar las lancetas en el contenedor de punzocortantes

V. METODOLOGIA

Toma de muestra
a) Lavarse las manos con agua y jabón (analista y paciente)
b) Preparar la lanceta o pinchador.
c) Masajear colocando el dedo hacia abajo
d) Desinfectar con una torunda con alcohol el dedo que se va a picar con la lanceta.
e)Dejar secar el alcohol y pinchar el dedo de forma rápida en la parte lateral
manteniendo la mano hacia abajo (figura 1).
f)Repartir en un portaobjetos desengrasado previamente de 3 a 4 gotas de sangre de
forma equidistante

Figura 1. Técnica para toma de muestra sanguínea.

Fuente: http://www.chospab.es/cursos_on_line/insulino/pagina_25.htm

Aplicación de reactivos para tipificación ABO y Factor Rh

a) Añadir una gota del anticuerpo Anti A, B, AB o Rh al lado de la gota de sangre

según sea el caso. CUIDADO de no tocar con el gotero la gota de sangre
ya que contaminas el reactivo.
b) Mezclar suavemente con un palillo y observar la aglutinación.
c) Reportar positivo en donde se encuentre aglutinación, por ejemplo, si aglutina
con el anticuerpo A será grupo sanguíneo A.
d) Colocar los portaobjetos de cada equipo sobre una hoja blanca y tomar foto
para el reporte.

VI. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS

a) Fotografía rotulada con el nombre del estudiante, anticuerpo

utilizado en cada gota y finalmente el tipo sanguíneo con los
resultados del equipo Figura 2.

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 Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica

Figura 2. Tipificación ABO y Factor Rh.

Fuente:
http://mesa8labd.blogspot.mx/2009/10/pruebas-
pretransfunsionales.html
b) Tabla con los resultados del grupo

Alumno Edad Sexo Grupo sanguíneo Rh

VII. CUESTIONARIO PREVIO

1)- ¿ Qué son los antígenos del grupo sanguíneo ABO? Describe cada uno.
2)-¿ En qué células se encuentran estos antígenos?
3) Realiza un cuadro con el tipo de Ag presente en la célula, que anticuerpo se produce en el
plasma y el tipo sanguíneo
Antígeno A Antígeno B Antígeno AB (*°) Sin Antígeno
(*) (°)

Célula

Anticuerpo en el Anti- Anti- Ninguno ó ambos Ninguno ó

suero Ambos
Tipo Sanguíneo

4)¿ Qué tipos de Ig se producen contra estos antígenos ? ¿Qué importancia tienen estos
anticuerpos en el pasaje a través de la placenta de la madre al feto ?
5)- ¿ Qué tipos de reacciones pueden provocar una incompatibilidad de grupo sanguíneo ABO?
6) ¿Qué significa Rh y como se descubrió? ¿Y el Anti D?

10
 Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica

7)¿Qué otras tipificaciones hay y qué importancia clínica tienen?

8) Realiza tu árbol genealógico con 3 generaciones de acuerdo al tipo sanguíneo.
Complementa buscando información del alelo dominante que es heredado. Leyes de Mendel.
9) Investiga el grupo sanguíneo predominante en México y ¿por que és así?
10) Investiga el uso de la Inyección de inmunoglobulina Rho (D) (RhoGAM)
11)¿Qué es un donante y receptor universal?
12) Describe la reacción Ag-Ac que ocurre en la tipificación ABO y factor Rh

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. http://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2009/myl097-8c.pdf
2. http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/guia-11.pdf
3. http://ingemeci.com/productos.html
4. http://microeinmuno.files.wordpress.com/2011/10/grupos-sanguineos-e-
isohemaglutininas.pdf
5. http://www.aathi.com.ar/pdfs/sis_rh_lo_que_hay_que_saber.pdf
6. http://www.galactose.org
7. http://www.joel-sistem-xd.blogspot.mx/2007/10/herencia-gentica-cromosomas.html
8. http://mesa8labd.blogspot.mx/2009/10/pruebas-pretransfunsionales.html
9. http://www.cnts.salud.gob.mx/

De aquí en adelante hay que dar el formato a las prácticas par homogenizar

Práctica 1 y 2 ---Estela

Práctica 3 Lectinas -----Hernán

Práctica 4 Producción de Penicilina ----Héctor

Práctica 5 Screening---- Es la que dejamos que diseñen los alumnos, Estela (ésta me falta)

Práctica 6 ELISA --- Flor ( KIT )

PRACTICA 3 . EXTRACCIÓN DE LECTINAS

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 Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica

IX. OBJETIVO GENERAL

X. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

XI. INTRODUCCIÓN
XII. METODOLOGÍA

PREVIO A LA PRÁCTICA

1.Se selecciona una leguminosa por equipo, pesar 10 g lavar y enjuagar para quitar
carga microbiana
2.Dejar en remojo con sol. salina 0.85% (NaCl) 2 días antes de la práctica, se deben
cubrir las semilla y un volúmen más de sol. salina.
3. El día posterior al remojo descascarillar con las manos limpias las semillas
4. Separar en falcon, 5 ml de agua de remojo, cascarilla y endospermo.
5. GUARDA 2 TUBOS EPPENDORF CON 1 ML DE AGUA DE REMOJO, ESTA MUESTRA
NO SERÁ PROCESADA CON ACETONA

DIA DE LA SESION 1

1. Moler cascarilla y endospermo por separado en un mortero cada uno con 10 ml de sol.
salina 0.85%
2. Filtrar con 2 gasas encontradas Y RECUPERAR 1.5 ML DE CADA MUESTRA EN 2
TUBOS.
3. Centrigugar 10 min a 13 krpm
4. Transferir 500 ul de sobrenadante de cada muestra a un nuevo tubo eppendorf
3. Añadir 1 ml de acetona
4. Mezclamos
5. Dejamos en campana de extracción a que se evapore acetona a temperatura ambiente
6. Se guardan refrigeradas

SESION 2

Procesar para hemoaglutinacion

Procesar para Bradford
Procesar para Electroforesis

XIII. RESULTADOS

FIGURA 1 EN UN PORTAOBJETOS COLOCA 3 GOTAS DE SANGRE A, B Ó AB Y

REACCIONA CON UNA GOTA DE CADA EXTRACTO, OBSERVA AGLUTINACI´N Y LLENA
LA TABLA 1.

TAbla 1

EQUIPO ESPECIE H2O REMOJO CASCARILLA ENDOSPERMO

LENTEJA
FRIJOL NEGRO
HABA
CHICHARO
RICINO
AYOCOTE

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 Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica

- NO HAY
PRESENCIA DE
LECTINAS
+POCA
++MEDIA
+++MUCHA

BRADFORD

250 UL DE MUESTRA ( AGUA DE REMOJO, CASCARILLA O ENDOSPERMO)

750 UL DE REACTIVO DE BRADFORD
______
1000 UL

REACCIONAR 10 MIN A TEMPERATURA AMBIENTE

LEER A 595 NM

LLENAR TABLA 2

TABLA 2.

H2O REMOJO CASCARILLA ENDOSPREMO

EQUIPO ABS (MG/ ML) ABS (MG/ ML) ABS (MG/ ML)
1
2
3
4
5
6

CURVA TIPO BRADFORD CON

CONCENTRACIÓN ABS 595 NM

(MG/ML)
0 0
0 0
20 0.221
20 0.239
40 0.436
40 0.422
60 0.478
60 0.555
80 0.693
80 0.668
100 0.782
100 0.770
120 0.860
120 0.902

Y =0.0071x + 0.0747 R2= 0.9713

GRAFICAR EN X PROTEÍNA (UG/ML) Y EN EL EJE DE LA Y ABSORBANCIA

si se sale tu valor de la curva tipo.....realiza una dilución 1:3

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ELECTROFORESIS VERTICAL

Preparación de la muestra

10 ul de azul de bromofenol
5 ul de b mercaptoetanol
60 ul de buffer de carga
25 ul de muestra (importante analizar la concentracion de su muestra ya que pueden salir
barridos en lugar de bandas, se recomienda carga la dilucion que entro en la curva tipo)

Discusion de Resultados

Figura 1 Hemoaglutinación con Lectinas de __________________. -, +. ++ ó +++

Figura 2 Reacción de Bradford

Tabla 1. Concentración de proteínas en diferentes especies de leguminosas con Bradford.

Curva tipo BSH Y=mx+b
Equipo Especie Agua cascarilla Endospermo
de
remojo
Abs Concentración Abs Concentración Abs Concentración
(microg/ml) (microg/ml) (microg/ml)

Discusión
1. Define una Lectina, fuentes de extracción, tipos de lectinas
2. ¿Por qué acetona en su protocolo de extracción de lectinas? Lipidos
3. ¿Por qué evaporamos la muestra?
4. Que tipo de sangre de se utiliza y por que
5 Fundamento del método
6.Què tipo de proteínas y cuál es la sensibilidad del método
7. Que es la electroforesis SDS-PAGE
8. Fundamento del SDs-PAGE
9.Por que usar acrilamida y no agarosa
10. Identificar el PM de su proteina de lectina

Cuestionario

1. Investigar qué es una lectina y tipos de Lectinas

2. Caracterìsticas de las Lectinas, mínimo 3
3. Investigar 3 aplicaciones farmacéuticas de las lectinas
4. Investigar el fundamento del SDS PAGE
5. Investigar el fundamento de cada reactivo del SDS-PAGe
6. Utilidad del SDS-PAGE en la Industria Farmacéutica
7.Existe algun método de conservación de lectinas...cuál?
8. Fundamento del Bradford y qué otros métodos existen para proteínas , cual es la diferencia
Discutir
si observas bandas en el gel estas corresc

Diferencia entre SDS-PAGE y PAGE

En bradford se usa azul de comasie G 250 y en el gel de acrilamina R-250

CONCLUSIONES

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 Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
Academia de Ciencia y Tecnología Farmacéutica
Biotecnología Farmacéutica II
Ingeniería Farmacéutica

PRODUCCIÓN DE PENICILINA EN DIFERENTES

SISTEMAS DE FARMENTACIÓN
PRACTICA 4

OBJETIVO GENERAL
Obtener penicilina por varios sistemas de fermentación
Objetivos específicos
Comparar el rendimiento de la fermentación sólida y la fermentación líquida
Determinar ventajas y desventajas de la extracción del antibiótico
INTRODUCCIÓN
Existen diferentes clases de antibióticos los cuales tienen un valor económico importante
debido a su aplicación clínica, sobre todo en los países como México en el cual actualmente las
enfermedades de etiología infecciosa representan el tercer lugar de causa de mortalidad (1),
siendo los de mayor demanda la cefalosporina , penicilinas y tetraciclinas, estas últimas
representan el 17.5% en ventas del mercado mundial de antibióticos (2) y están considerados
dentro del Cuadro Básico de Medicamentos del Sector Salud.
La producción de tetraciclina se realiza por fermentación líquida con altos costos de operación
lo que se refleja en el valor agregado de los productos, por lo que resulta interesante generar
procesos de producción de antibióticos con aplicación de biotecnologías alternativas que

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 Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica

resulten más rentables como en el caso de la fermentación en estados sólidos o con el uso de
soportes semisólidos, las cuales son ampliamente utilizadas en los países orientales y
presenta ventajas sobre la fermentación sumergida (4)
La fermentación sólida se realiza sobre soportes que generalmente son seleccionados de
acuerdo a sus características , utilización y abundancia regional, siendo México un país con
generación de una gran cantidad de residuos agroindustriales con poca o ningún
aprovechamiento de los mismos, la utilización de estos residuos como soportes en
fermentaciones sólidas para la producción de metabolitos microbianos , representa una
alternativa para su aprovechamiento y una mejora ambiental como económica de las regiones
en las que se producen.
El salvado de trigo por su consistencia y bajo costo, ha sido utilizado como soporte para la
producción de metabolitos en estado sólido de enzimas, ácidos orgánicos.

MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismo . Penicillium Chrysogenum, como productor de penicilina
Inoculo: A un cultivo previamente esporulado de P. chrysogenum se adiciona solución salina al
0.85% hasta obtener una solución de 108 esporas por mililitro, lo anterior puede conseguirse
ajustando a una absorbancia de 0.5 a una longitud de onda de 540nm.
Soporte solido: Salvado de trigo
Medio - Producción de penicilina
Lactosa al 3%
Agua de cocimiento de maíz 5%,
Farmamedia 1%
Minerales: Fosfato de potasio monobásico de 0.3%, fosfato de potasio dibasico 0.2%, CaCl 2
0.01% (preparar por separado). Ajustar a pH 5.0.
Sistema sólido: En matraces erlenmeyer de 125 colocar 5 gramos de salvado, 10 ml del
medio de cultivo. Inocular con el 3% de la solución de esporas y adicionar 5ml de agua estéril
para conseguir una humedad relativa del 58%.
Sistema Células libres o sumergida: En matraces erlenmeyer de 500 mL colocar 200mL del
medio 1 e inocular con 3% de la solución de esporas e incubar a 28°C con agitación orbital de
150 rpm.
Toma de muestra: Se toman una muestra cada 24 horas, en el caso de la fermentación sólida
tomar se toma un matraz cada 24 horas, en caso de la fermentación sumergida se toman 10
ml en condiciones estériles.
Tratamiento de la muestra: En ambos casos de eliminan los sólidos ya sea biomasa y restos
del medio. Para el medio sólido se adiciona agua estéril en una proporción 1:5 agitar durante
10 minutos y filtrar, el filtrado medir el pH y guardarlo en refrigeración para cuantificación de
azucares y antibiótico. En al caso de la sumergida se toman los 10mL y se elimina la biomasa
por medio de filtración o centrifugación el sobrenadante guardar en refrigeración hasta su uso.

ENSAYO PARA ANTIBIOTICOS

Antibióticos
Penicilina

Microorganismos
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis

Medios de cultivo
Medio para antibióticos No. 1 agar y medio líquido
Medio para antibióticos No. 2

Diluyente:
Solución Buffer No. 1 ( Disolver 2.0 g de fosfato dibásico de potasio y 8.0 g de fosfato
monobásico de potasio en 1000 ml de agua. Ajustar el pH con ácido fosfórico 18N ó Hidróxido
de potasio 10 N a pH 6.0 +/-0.05)

PROCEDIMIENTO:

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 Manual de Laboratorio de Biotecnologíía Farmaceí utica

Preparación del estándar

Estándar de penicilina
Pesar la cantidad necesaria para obtener una solución de 100 U/ml y realizar las diluciones
necesarias para obtener por lo menos 5 puntos de la curva de manera que el punto medio sea
1.0 U/ml

Preparación del inóculo

En un tubo de agar nutritivo sembrar el microorganismo de prueba e incubarlo 24 h. Añadir
solución salina estéril suficiente para obtener una solución ajustada al 25% de transmitancia a
580 nm.

Método del cilindro-placa

1. Añadir 20 ml del medio No. 2 en cada caja de petri, una por cada dlilución y dejar solidificar.
2. Añadir al medio No. 1, 0.1 ml de S. aureus de la suspensión del inóculo (ajustada al 25%)
por cada 100 ml.
3. Añadir 10 ml del medio inoculado sobre la placa gelificada de agar No. 2 y dejar solidificar
nuevamente.
3. Colocar 2 cilindros sobre las placas gelificadas y añadir 50 ml de cada una de las diluciones,
incubar a 37oC por 24 h, medir el halo de inhibición.

RESULTADOS Y DISCUSION
1. Calcule el rendimiento del metabolito con respecto al sustrato

2. Para el análisis de la fermentación y el comportamiento de los parámetros de pH, el

incremento de biomasa, consumo de azucares y su relación con la producción del
analito.

3. Análisis de todos los parámetros en función del las características del soporte utilizado.

CUESTIONARIO
1. Investigar los tipos de fermentación utilizada para la obtención de antibióticos en la
industria

2. Investigar los métodos de purificación para el antibiótico obtenido

3. Investigar el mecanismo de acción para las penicilinas

4. Investigar cuales son los microorganismos de prueba para este antibiótico, según la
farmacopea de Estados Unidos

BIBLIOGRAFIA
Bowman, W.C. and M.J. Rand, Farmacología, Ed. Interamericana.
Manuales de Productos Naturales
Farmacopea Nacional de los Estados Unidos

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